CN108368477B - 修饰的膜渗透性 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了遗传修饰的微生物，其过表达孔蛋白多肽以增强微生物的赖氨酸和赖氨酸衍生物的产生。本发明还提供了产生此类微生物的方法以及使用该遗传修饰的微生物产生赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

Description

修饰的膜渗透性
背景技术
因为转运蛋白将化合物向细胞内、外转运，从而影响这些分子的细胞内浓度，所以转运蛋白在氨基酸和氨基酸衍生产物的产生中是重要的。细胞内的高浓度导致反馈抑制，这对产生有负面影响。例如，虽然在赖氨酸生物合成期间在lysC中观察到反馈抑制，但反馈抗性突变体能够在高浓度赖氨酸存在下发挥功能(Kikuchi等人,FEMS MicrobiologyLetters 173：211-215,1999；Ogawa-Miyata等人,Biosci.Biotechnol.Biochem.65：1149-1154,2001)。这样的反馈抗性突变体能够产生更高的赖氨酸滴度。将分子向细胞外转运也可以降低反馈抑制的影响。
产生氨基酸(如赖氨酸)和氨基酸衍生产物(如尸胺)的先前研究聚焦于参与细胞代谢的基因的过表达或减少。这些修饰增加了导致所需产物产生的通量(fluxes)，并降低了导致副产物或其他对于形成所需产物不是必需的代谢物产生的通量。然而，需要增加氨基酸及其衍生产物产生的其他方法。
发明内容
本发明部分基于令人惊讶的发现，即对氨基酸非特异的外膜孔蛋白如OmpA、OmpC、OmpF、OmpX、OmpE、OmpG和OmpW蛋白影响氨基酸(例如赖氨酸及其衍生产物例如尸胺)的产生。因此，在一个方面，本发明提供了一种遗传修饰的微生物，其中相对于不包含遗传修饰的相同菌株的对应微生物，该遗传修饰的微生物中外膜孔蛋白多肽(例如OmpA、OmpC、OmpF、OmpX、OmpE、OmpG和OmpW)过表达。在一些实施方案中，通过将包含编码孔蛋白多肽的核酸序列的表达载体导入微生物中来对微生物进行遗传修饰。在一些实施方案中，例如通过将编码内源孔蛋白多肽的基因的多个拷贝导入基因组中和/或通过使用异源启动子增加内源基因的表达来对微生物进行遗传修饰以过表达内源外膜孔蛋白多肽。
一方面，本发明提供了一种遗传修饰的宿主细胞，其包含编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸，其中宿主细胞过表达OMP孔蛋白多肽且相对于未修饰的对应宿主细胞具有增加的氨基酸或其衍生物的产生。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF、OmpX、OmpE、OmpG或OmpW孔蛋白多肽。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽与编码成熟OMP孔蛋白多肽的SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16的区域具有至少70％同一性，或至少75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中表达载体包含有效地连接至启动子的异源核酸。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽对于宿主细胞是内源的。在一些实施方案中，异源核酸整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，遗传修饰的宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，宿主细胞过表达TetA多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在一些实施方案中，Omp孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF或OmpW多肽。在一些实施方案中，宿主细胞过表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和TetA多肽。在一些实施方案中，氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺。
另一方面，本发明提供了产生氨基酸或其衍生物的方法，所述方法包括在OMP孔蛋白多肽过表达的条件下培养如本文所述的遗传修饰的宿主细胞，例如，如前段所述。在一些实施方案中，氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺。
另一方面，本发明提供工程化宿主细胞以增加氨基酸或其衍生物的产生的方法，所述方法包括将编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸导入宿主细胞中，并在异源OMP孔蛋白(prion)多肽表达的条件下培养宿主细胞，其中相对于未修饰的对应对照宿主细胞，OMP孔蛋白多肽的表达增加赖氨酸或赖氨酸衍生物的产生。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF、OmpX、OmpE、OmpG或OmpW孔蛋白多肽。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽与编码成熟OMP孔蛋白多肽的SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16的区域具有至少70％同一性，或至少75％、80％、85％、90％或95％同一性。在一些实施方案中，编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中表达载体包含有效地连接至启动子的异源核酸。在一些实施方案中，OMP孔蛋白多肽对于宿主细胞是内源的。在一些实施方案中，异源核酸整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，宿主细胞过表达TetA多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。在一些实施方案中，Omp孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF或OmpW多肽。在一些实施方案中，宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶多肽和LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和/或AspC；和TetA多肽。在一些实施方案中，氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺。
附图说明
图1是显示使用酶将赖氨酸转化为氨基戊酸的通路的示意图
图2是显示使用酶和化学催化剂将赖氨酸转化为己内酰胺的通路的示意图。
发明的详细描述
在描述本发明之前，应该理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因为它们当然可以改变。还应该理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意图限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物和登录号通过引用并入本文，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
定义
如本文所用，术语“外膜孔蛋白”多肽或“OMP”多肽是指将氨基酸(例如赖氨酸)或氨基酸衍生物(例如尸胺)向细胞内、外转运的外膜转运蛋白多肽，但对氨基酸或其衍生物的转运不具特异性。外膜孔蛋白多肽是众所周知的并且已被广泛地表征(参见例如Galdiero等人，2012的综述)。结构特征包括存在8-、14-、16-或18-链反平行β桶状结构。一般而言，β链通过细胞质侧上的β转角和另一侧上的氨基酸长环连接在一起。几种细菌孔蛋白的X射线结构分析显示包含跨膜孔的8-、12-、14-、16-或18-链反平行β桶状结构。术语“OMP多肽”包括本文所述的特定多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同系物。编码OMP孔蛋白多肽的核酸指基因、前mRNA、mRNA等，包括编码本文所述的特定氨基酸序列的变体、等位基因、突变体和种间同系物的核酸。在一些实施方案中，本发明的Omp孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF、OmpE、OmpG、OmpX或OmpW孔蛋白多肽。
“OmpA孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的大肠杆菌OmpA多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpA多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_000750416.1；志贺氏菌属(Shigellasp.)蛋白质序列登录号WP_005047463.1；法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)蛋白质序列登录号GAL49133.1；肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)蛋白质序列登录号EHB41176.1；和Cronobacter muytjensli蛋白质序列登录号WP_038863759.1。“OmpA孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：4的成熟OmpA多肽的至少约100、200、250或300或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，通常至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpA孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpA孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpC孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的大肠杆菌OmpC多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpC多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_000865568.1；志贺氏菌属(Shigellasp.)蛋白质序列登录号WP_00865596.1；弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)蛋白质序列登录号WP_032944041.1；和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)蛋白质序列登录号WP_004103993.1。“OmpC孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：6的成熟OmpC多肽的至少约100、200、250或300或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpC孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpC孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpF孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的大肠杆菌OmpF多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpF多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_001340338.1；志贺氏菌属(Shigellasp.)蛋白质序列登录号WP_000977934.1；柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)蛋白质序列登录号WP_012132994.1；和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)蛋白质序列登录号WP_032974332.1。“OmpF孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：8的成熟OmpF多肽的至少约100、200、250或300或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpF孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpF孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpX孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的大肠杆菌OmpX多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpX多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_001295296.1；弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)蛋白质序列登录号WP_025757391.1；沙门氏菌属(Salmonella sp.)蛋白质序列登录号WP_000716762.1；法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)蛋白质序列登录号GAL49278.1；和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)蛋白质序列登录号WP_002895845.1。“OmpX孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：10的成熟OmpX多肽的至少约100或150或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpX孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpX孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpE孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的大肠杆菌OmpE(也称为PhoE)多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpE多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_000749863.1；志贺氏菌属(Shigella sp.)蛋白质序列登录号WP_000749871.1；柠檬酸杆菌属(Citrobactersp.)蛋白质序列登录号WP_003830831.1；和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)蛋白质序列登录号WP_000749852.1。“OmpE孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：12的成熟OmpE多肽的至少约100、200、250、300或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpE孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpE孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpG孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的大肠杆菌OmpG多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpG孔蛋白多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_000735257.1；志贺氏菌属(Shigella sp.)蛋白质序列登录号WP_000735251.1；杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)蛋白质序列登录号WP_006684355.1；和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)蛋白质序列登录号WP_023176364.1。“OmpG孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：14的成熟OmpG多肽的至少约100、200或250或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpG孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpG孔蛋白多肽的多核苷酸。
“OmpW孔蛋白”多肽是指具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的大肠杆菌OmpW多肽的生物活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。来自其他物种的示例性OmpW孔蛋白多肽包括肠杆菌属(Enterobacteriaceae sp.)蛋白质序列登录号WP_000737226.1；弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)蛋白质序列登录号WP_000737239.1；柠檬酸杆菌属(Citrobactersp.)蛋白质序列登录号WP_016153263.1；肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)蛋白质序列登录号WP_000714802.1；和克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)蛋白质序列登录号WP_004121296.1。“OmpW孔蛋白”多肽优选在SEQ ID NO：16的成熟OmpW多肽的至少约100或150或更多氨基酸的区域上、或在其长度上具有至少60％氨基酸序列同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性。如本文所用的“OmpW孔蛋白多核苷酸”是指编码OmpW孔蛋白多肽的多核苷酸。
术语OMP多肽的“增加的表达”和“过表达”在本文中可互换使用，以指与不具有遗传修饰的对应细胞(即没有修饰的相同菌株的细胞)中OMP多肽的量相比，在遗传修饰的细胞(例如已经导入编码OMP的表达构建体的细胞)中OMP多肽的量的增加。为了本申请的目的，与对应的未修饰细胞相比，增加的表达水平为至少5％，或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。未修饰的细胞不需要表达OMP多肽。因此，术语“过表达”还包括其中OMP多肽在不天然表达OMP多肽的宿主细胞中表达的实施方案。OMP多肽表达的增加可以通过许多测定法来评估，包含但不限于，测量从OMP多肽基因转录的RNA水平、OMP多肽水平和/或OMP多肽活性的水平。
在产生氨基酸(例如赖氨酸)或赖氨酸衍生物(例如尸胺)的上下文中，术语“增强的”如本文所用是指与不具有遗传修饰以增加OMP多肽表达的对照对应细胞相比，增加赖氨酸或衍生物的产生。与对照细胞相比，氨基酸或其衍生物的产生增加至少5％、通常至少0％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
当在给定氨基酸或多核苷酸序列编号的上下文中使用时，术语“参考编号”或“对应于”或“参考确定”是指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时，特定参考序列残基的编号。例如，当残基在最大比对中与SEQ ID NO：4和同源物或变体比较中的氨基酸比对时，OmpA多肽变体或同源物中的残基“对应于”SEQ ID NO：4中位置的氨基酸。
如本文所用的“OMP孔蛋白多核苷酸”是指编码OMP孔蛋白多肽的核酸。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且是指从5'至3'末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。如本发明中使用的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可以使用可具有可选骨架的核酸类似物，所述骨架包含例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotidesand Analogues：A Practical Approach,Oxford University Press)；阳性骨架；非离子骨架和非核糖骨架。核酸或多核苷酸还可以包括允许聚合酶正确通读(read-through)的修饰的核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括作为单个单链或双链体的核酸的正义链和反义链。如本领域技术人员将理解的，单链的描述还限定了互补链的序列；因此本文所述的序列也提供了该序列的互补序列。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。核酸可以是基因组和cDNA的DNA、RNA或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。
在两个核酸或多肽的上下文中使用的术语“基本上相同”是指与参考序列具有至少40％、45％或50％序列同一性的序列。同一性百分比可以是50％至100％的任何整数。一些实施方案包括使用本文所述程序(优选使用标准参数的BLAST，如下所述)与参考序列相比较，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如下所述，进行最大对应比对时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别相同，则说两个核酸序列或多肽序列是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当在比较窗口进行最大对应比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或手动比对和目视检查所测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比是相同的。当序列同一性百分比用于蛋白质或肽时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基取代具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基，并因此不改变分子的功能性质。当因保守取代而序列不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。通常这涉及将保守取代评分为部分而不是完全的错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同的氨基酸被赋予1分并且非保守取代被赋予0分的情况下，保守取代被赋予0至1之间的分数。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可用于确定孔蛋白多肽与SEQ ID NO：4、6、8、12、14或16，或另一多肽参考序列是否具有序列同一性的算法是BLAST算法，其被描述在Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215：403-410，在此引入作为参考。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(在全球网络ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字长(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。可以使用的其他程序包括Needleman-Wunsch程序(J.MoI.Biol.48：443-453(1970)，其使用BLOSUM62、空位起始罚分7和空位延伸罚分1)和空位的BLAST 2.0(参见Altschul,等人1997,Nucleic Acids Res.,25：3389-3402)两者。
如本文所用，“比较窗口”包括涉及选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的连续位置数目中的任一个的区段，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与连续位置数目相同的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法、通过这些算法的计算机实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，在Wisconsin Genetics SoftwarePackage,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中)或通过手动比对和目视检查进行。
与参考序列基本上相同的核酸或蛋白质序列包括“保守性修饰的变体”。就特定的核酸序列而言，保守性修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子指定是丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。这类核酸变异是“沉默变异”，其是保守性修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异隐含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，在改变编码序列中单个氨基酸或小百分比氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质序列中的单个取代是“保守性修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。以这种方式定义的氨基酸组的实例可以包括：“带电荷/极性组”包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳族或环状组”包括Pro(脯氨酸或P)、Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)和Trp(色氨酸或W)；和“脂肪族组”包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每个组中，也可以区分亚组。例如，带电荷/极性氨基酸组可以被细分成亚组，包括：“带正电荷的亚组”(包括Lys、Arg和His)；“带负电荷的亚组”(包括Glu和Asp)；和“极性亚组”(包括Asn和Gln)。在另一个实例中，芳族或环状组可以被细分为亚组，包括：“氮环亚组”(包括Pro、His和Trp)；和“苯基亚组”(包括Phe和Tyr)。在另一个实例中，脂肪族组可以被细分为亚组，包括：“大脂肪族非极性亚组”(包括Val、Leu和Ile)；“脂肪族微极性亚组”(包括Met、Ser、Thr和Cys)；和“小残基亚组”(包括Gly和Ala)。保守突变的实例包括上述亚组内的氨基酸的氨基酸取代，如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，使得可保持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可保持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可保持游离的-OH；和Gln取代Asn或反之亦然，使得可保持游离的-NH2。以下六组各含有进一步提供彼此的示例性保守取代的氨基酸。1)Ala、Ser、Thr；2)Asp、Glu；3)Asn、Gln；4)Arg、Lys；5)Ile、Leu、Met、Val；和6)Phe、Try和Trp(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
如本文所用，术语“启动子”是指能够驱动细胞中DNA序列转录的多核苷酸序列。因此，用于本发明多核苷酸构建体的启动子包括参与调控或调节基因转录时间和/或速率的顺式和反式作用的转录控制元件和调控序列。例如，启动子可以是顺式作用的转录控制元件，包括增强子、阻遏子结合序列等。这些顺式作用的序列通常与蛋白质或其他生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调控、调节等)基因转录。很多时候核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更经常位于翻译起始位点的1kbp内并且经常位于500bp或200bp或更少内。按照惯例，启动子序列通常作为其所控制的基因的编码链上的序列提供。在本申请的上下文中，启动子通常由其天然调节表达的基因的名称来指代。在本发明的表达构建体中使用的启动子由基因名称来指代。由名称指代的启动子包括野生型天然启动子以及保留诱导表达能力的启动子变体。由名称指代的启动子不限于特定物种，还包括来自其他物种中相应基因的启动子。
本发明上下文中的“组成型启动子”是指能够在细胞中在大多数条件下(例如在无诱导分子的情况下)启动转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导分子的存在下启动转录。
如果多核苷酸来源于外来物种，或者如果来自从其原始形式被修饰的相同物种，则多核苷酸对于生物体或第二多核苷酸序列是“异源的”。例如，当指出编码多肽序列的多核苷酸有效地连接至异源启动子时，这意味着编码多肽的多核苷酸编码序列源自一个物种，而启动子序列源自另一个不同物种；或者如果两者都源自相同物种，则编码序列不与启动子天然相关(例如，是基因工程化的编码序列，例如来自相同物种的不同基因，或来自不同生态型或品种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生多肽，则该多肽对于宿主细胞是“异源的”。
术语“外源的”通常指多核苷酸序列或多肽，其不是天然存在于野生型细胞或生物体中，而是通常通过分子生物学技术导入细胞中，即工程化以产生重组微生物。“外源的”多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质或酶的载体、质粒和/或人工核酸构建体。
术语“内源的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列或多肽。就此而言，还应注意的是，即使生物体可包含给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，导入编码该序列的质粒或载体，例如以过表达或以其他方式调控编码的蛋白质的表达，代表了该基因或多核苷酸序列的“外源的”拷贝。本文所述的任意通路、基因或酶可利用或依赖“内源的”序列，可作为一个或多个“外源的”多核苷酸序列提供，或两者。
如本文所用的“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指核酸的聚合物，其中以下至少一种是正确的：(a)核酸的序列对于给定的宿主细胞是外来的(即不是天然发现于给定的宿主细胞中)；(b)序列可以天然发现于给定的宿主细胞中，但是以非天然(例如大于预期)的量存在；或(c)核酸序列包含在自然界中未发现彼此具有相同关系的两个或更多个子序列。例如，关于实例(c)，重组核酸序列将具有来自不相关基因的两个或更多个序列，所述序列被排列以制备新的功能核酸。
术语“有效地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。通常，它指的是转录调控序列与被转录序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节DNA或RNA序列的转录，则其有效地连接至DNA或RNA序列。一般而言，有效地连接至被转录序列的启动子转录调控序列与被转录序列是物理上连续的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列，如增强子，不必是物理上连续的或位于它们所增强转录的编码序列附近。
术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”是指核酸构建体，当其被导入宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在表达转基因的情况下，技术人员将认识到插入的多核苷酸序列不必与其所来源的基因序列相同，而可以仅仅是基本上相同。如本文所解释的，通过参考特定的核酸序列来具体覆盖这些基本相同的变体。表达盒的一个实例是包含编码本发明蛋白质多肽的多核苷酸序列的多核苷酸构建体，所述多核苷酸序列有效地连接至启动子，例如其天然启动子，其中表达盒被导入异源微生物中。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中靶向微生物基因组中位置的多核苷酸使得多核苷酸序列的表达由存在于微生物中的启动子驱动。
如本发明上下文中使用的术语“宿主细胞”是指微生物并且包括可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、意外的或故意的突变和/或改变，后代可能不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态学上或总DNA互补中)。宿主细胞包括已经导入(包括通过转化、转染等导入)本发明的重组载体或多核苷酸的细胞。
术语“分离的”是指基本上或实质上不含通常在其天然状态中伴随的组分的物质。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”可以指已经从其天然存在或基因组状态中其两侧的序列中分离的多核苷酸，例如已经从通常与该片段相邻的序列中移除的DNA片段，例如通过克隆到载体中。如果例如将多核苷酸克隆到不是天然环境一部分的载体中，或者如果多核苷酸以不同于其天然存在的状态的方式人工导入到细胞基因组中，则认为该多核苷酸是分离的。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指不含细胞其他组分的多肽分子，即其与体内物质无关。
介绍
本发明部分基于如下发现：增加微生物例如革兰氏阴性菌中一种或多种OMP孔蛋白多肽的表达增强氨基酸例如赖氨酸的产生和/或氨基酸衍生物如尸胺的产生。根据本发明过表达的OMP孔蛋白多肽通常是具有8、14或16链的β-桶状结构多肽。
被工程化以过表达OMP孔蛋白多肽的宿主细胞通常也被工程化以过表达合成氨基酸衍生物的酶(如赖氨酸脱羧酶多肽)和/或参与氨基酸生物合成的另外的多肽。赖氨酸脱羧酶和赖氨酸生物合成多肽和核酸序列在本领域中是公知的。
编码孔蛋白多肽的多核苷酸
本发明采用多种常规重组核酸技术。通常，下面描述的重组DNA技术中的命名法和实验室程序是本领域中众所周知和常用的那些。许多为进行重组DNA操作提供指导的手册是可用的，例如Sambrook&Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版,2001)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,等人，John Wiley andSons,New York,2009-2014)。
适合用于本发明的OMP孔蛋白核酸和多肽序列包括编码如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16中任意所示的孔蛋白多肽或其基本相同的变体的孔蛋白核酸序列。这样的变体通常与SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16或替代的OMP孔蛋白多肽(例如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16的已知同源物)之一具有至少70％、或至少75％、80％、85％或90％同一性。如本文所用，术语“变体”包括相对于OMP孔蛋白多肽参考序列如SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14或16具有一个或多个取代、缺失或插入的生物活性多肽。因此，术语“变体”包括生物活性片段以及取代变体。
OMP孔蛋白多肽在本领域中是公知的，并且OMP孔蛋白的结构已被广泛地表征。这些蛋白质的孔结构几乎完全由β-桶状结构组成。OMP孔蛋白的β-桶状结构范围为从8到18链的反平行β-桶状结构。单体蛋白通常(虽然不总是)形成整合到外膜中的三聚体结构。OMP孔蛋白共享的另外的共同结构特征包括信号序列，通常在蛋白质N-末端长度为21个氨基酸，其在输出期间被切割；没有长的疏水性伸展(stretches)；缺少半胱氨酸残基；和C-末端苯丙氨酸。示例性OMP孔蛋白多肽序列提供于SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和16中。Omp孔蛋白多肽的结构特征还在Galdiero等人,Curr.Prot.Peptide Sci.13：843-854,2012中综述了，其通过引用并入本文。
技术人员可以通过使用本领域可用的序列比对和结构分析来鉴定预期保留孔蛋白多肽转运功能以及耐受取代的保守结构内的残基，从而获得OMP孔蛋白多肽变体。
可使用任何数量的测定法来评估OMP孔蛋白多肽活性，包括评估氨基酸或氨基酸衍生的化合物的转运的测定法。示例性测定法测量经修饰以共表达OMP多肽与CadA的大肠杆菌中的尸胺的产生。将CadA和OMP多肽在具有抗生素抗性选择标记物的相同质粒上导入大肠杆菌中。选择并培养抗生素抗性菌落。然后使培养物在0.1mL赖氨酸-HCl和PLP(至最终浓度分别为40g/L和0.1mM)存在下于37℃生长2小时。使用NMR对来自每个样品的尸胺产生进行定量，并且通过将所产生的尸胺的摩尔量除以所添加的赖氨酸的摩尔量来计算产率。用于本发明的OMP孔蛋白多肽增加尸胺的产率。或者，评估菌落的增加的赖氨酸产生或另一赖氨酸衍生物的产生。
可以通过许多技术来完成OMP孔蛋白多核苷酸序列的分离或产生。这些技术将在OMP孔蛋白基因的上下文中讨论。然而，技术人员理解可以使用相同的技术来分离和表达其他所需的基因。在一些实施方案中，基于本文公开的序列的寡核苷酸探针可用于在来自所需的细菌种属的cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需的多核苷酸。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种中的同源基因。
或者，可以使用常规扩增技术从核酸样品中扩增感兴趣的核酸。例如，可以使用PCR直接从mRNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库扩增基因的序列。PCR和其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，使核酸用作探针以检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其他目的。
用于鉴定细菌中OMP孔蛋白多核苷酸的合适引物和探针可以从比较本文提供的序列来产生。有关PCR的一般概述参见PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications.(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.和White,T.,编.),Academic Press,SanDiego(1990)。示例性引物序列显示在实施例部分的引物表中。
用于本发明中的外膜孔蛋白核酸序列包括通过如使用示例性核酸序列进行杂交和/或序列分析的技术鉴定和表征的基因和基因产物，所述示例性核酸序列例如SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：15。在一些实施方案中，通过导入与包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的多核苷酸具有至少60％同一性、或至少70％、75％、80％、85％或90％同一性或100％同一性的核酸序列来遗传修饰宿主细胞。
编码OMP孔蛋白多肽的多核苷酸包含编码信号肽的区域。信号肽可以是异源信号肽，例如OmpA孔蛋白多核苷酸可以编码来自另一OMP孔蛋白多肽的信号肽或可以编码另一细菌的信号肽。
编码赋予宿主细胞增加的氨基酸(例如赖氨酸)或氨基酸衍生产物(例如尸胺)的产生的孔蛋白多肽的核酸序列可针对在所需宿主细胞中的表达另外经密码子优化。可以使用的方法和数据库是本领域已知的。例如，可以根据单个基因、具有共同功能或起源的一组基因、高表达的基因中的密码子使用，整个生物体的聚集蛋白质编码区中的密码子频率，相关生物体的聚集蛋白质编码区中的密码子频率，或其组合确定优选的密码子。参见例如，参见例如Henaut and Danchin in"Escherichia coli and Salmonella,"Neidhardt,等人编辑,ASM Pres,Washington D.C.(1996),第2047-2066页；Nucleic Acids Res.20:2111-2118；Nakamura等人,2000,Nucl.Acids Res.28:292。)
重组载体的制备
可以使用本领域公知的方法来制备用于表达孔蛋白多肽的重组载体。例如，编码OMP孔蛋白多肽(以下进一步描述)的DNA序列可与将在预期的细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌)中指导基因序列转录的转录和其他调控序列组合。在一些实施方案中，包含表达盒(所述表达盒包含编码OMP孔蛋白多肽的基因)的表达载体进一步包含有效地连接至孔蛋白基因的启动子。在其他实施方案中，指导OMP孔蛋白基因转录的启动子和/或其他调控元件对于宿主细胞是内源的，并且例如通过同源重组导入包含孔蛋白基因的表达盒，使得外源基因有效地连接至内源启动子并且由内源启动子驱动表达。
如上所述，可以通过多种调控序列来控制编码孔蛋白多肽的基因的表达，所述调控序列包括启动子，其可以是组成型或诱导型；并且，如果需要，可选地包括阻遏子序列。合适的启动子(特别是在细菌宿主细胞中)的实例是获得自大肠杆菌lac操纵子的启动子和源自参与其他糖例如半乳糖和麦芽糖代谢的基因的其他启动子。其他实例包括如trp启动子、bla启动子、噬菌体λPL和T5的启动子。另外，可以使用合成启动子，如tac启动子(美国专利号4,551,433)。启动子的进一步实例包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因。合适的启动子也描述在Ausubel和Sambrook&Russell，二者均同上。另外的启动子包括Jensen&Hammer,Appl.Environ.Microbiol.64:82,1998；Shimada,等人,J.Bacteriol.186:7112,2004；和Miksch等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:312,2005中描述的启动子。
在一些实施方案中，可以修饰影响天然OMP孔蛋白多肽表达的启动子以增加表达。例如，内源OmpA、OmpF、OmpC、OmpE、OmpG、OmpX或OmpW启动子可被提供与天然启动子相比增加表达的启动子置换。
表达载体还可以包含影响编码OMP孔蛋白多肽的基因表达的另外的序列。这样的序列包括增强子序列、核糖体结合位点或其他序列如转录终止序列等。
表达编码本发明的OMP孔蛋白多肽的核酸的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被导入宿主时整合到基因组中并与已整合到其中的染色体一起复制的载体。因此，表达载体可以另外含有允许载体整合到宿主基因组中的元件。
本发明的表达载体优选含有一种或多种允许容易地选择转化的宿主的选择标记物。例如，表达载体可以包含赋予重组宿主生物体(例如细菌细胞如大肠杆菌)抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。
尽管可以使用任何合适的表达载体来整合所需的序列，容易获得的细菌表达载体包括但不限于：质粒如pSClOl、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pET、pEX、pMRlOO、pCR4、pBAD24、p15a、pACYC、pUC(例如pUC18或pUC19)，或源自这些质粒的质粒；和噬菌体如M13噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定的表达载体是否适合于任何给定的宿主细胞。例如，可将表达载体导入宿主细胞中，然后针对载体中所含序列的活力和表达监测宿主细胞。
可以使用任何数目的众所周知的方法将本发明的表达载体导入宿主细胞，所述方法包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其他方法。
宿主细胞
本发明提供了经工程改造以过表达OMP孔蛋白多肽的遗传修饰的宿主细胞。这样的宿主细胞可以包含编码异源OMP孔蛋白多肽(包括任何非天然存在的OMP孔蛋白多肽变体)的核酸；或可以被遗传修饰以相对于野生型宿主细胞过表达天然的或内源的OMP孔蛋白多肽。
遗传修饰宿主细胞以过表达OMP孔蛋白多肽通常与修饰宿主细胞以过表达赖氨酸脱羧酶多肽和/或一种或多种氨基酸生物合成多肽一起进行。
赖氨酸脱羧酶是指将L-赖氨酸转化为尸胺的酶。该酶被分类为E.C.4.1.1.18。赖氨酸脱羧酶多肽是充分表征的酶，其结构在本领域中是公知的(参见例如Kanjee,等人,EMBO J.30:931-944,2011；和Lemmonier&Lane,Microbiology 144；751-760,1998的综述；以及其中所述的参考文献)。赖氨酸脱羧酶的EC编号是4.1.1.18。请参阅其他生物体的赖氨酸脱羧酶附件。示例性赖氨酸脱羧酶序列是来自克雷伯菌属(Klebsiella sp.)，WP012968785.1；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，YP 004592843.1；肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，WP 020936842.1；沙雷氏菌属(Serratia sp.)，WP 033635725.1和鸟氨酸解脂耶氏菌(Raoultella ornithinolytica)，YP 007874766.1的CadA同系物；和来自志贺氏菌属(Shigella sp.)，WP 001020968.1；柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)，WP016151770.1；和肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)，WP 001021062.1的LdcC同系物。如本文所用，赖氨酸脱羧酶包括具有赖氨酸脱羧酶酶活性的天然赖氨酸脱羧酶的变体。另外的赖氨酸脱羧酶描述于PCT/CN2014/080873和PCT/CN2015/072978中。
在一些实施方案中，宿主细胞可以被遗传修饰以表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。赖氨酸生物合成多肽的实例包括大肠杆菌基因SucA、Ppc、AspC、LysC、Asd、DapA、DapB、DapD、ArgD、DapE、DapF、LysA、Ddh、PntAB、CyoABE、GadAB、YbjE、GdhA、GltA、SucC、GadC、AcnB、PflB、ThrA、AceA、AceB、GltB、AceE、SdhA、MurE、SpeE、SpeG、PuuA、PuuP和YgjG，或来自其他生物体的相应基因。这样的基因在本领域中是公知的(参见例如Shah等人,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents on Biotechnol.1:11-24,2007)。还参见Kind,等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011关于尸胺产生中涉及的基因的综述。编码赖氨酸生物合成多肽的示例性基因提供如下。
Figure BDA0001654508690000201
Figure BDA0001654508690000211
编码赖氨酸脱羧酶或氨基酸生物合成多肽的核酸可与OMP孔蛋白多核苷酸一起导入宿主细胞中，例如编码在单个表达载体上，或同时导入多个表达载体中。或者，可以对宿主细胞进行遗传修饰以在遗传修饰的宿主细胞过表达孔蛋白多肽之前或之后过表达赖氨酸脱羧酶或一种或多种氨基酸生物合成多肽。
在可选的实施方案中，过表达天然存在的OMP孔蛋白多肽的宿主细胞可通过其他技术获得，例如通过诱变细胞例如大肠杆菌细胞、并筛选细胞以鉴定与诱变前的细胞相比以更高水平表达OMP孔蛋白多肽(例如OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpE、OmpW或OmpX)的那些细胞。
包含如本文所述的OMP孔蛋白多肽的宿主细胞是细菌宿主细胞。在典型的实施方案中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性菌宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，细菌是肠细菌。在本发明的一些实施方案中，细菌是棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、斯瓦尼氏菌属(Shewanella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、哈夫尼菌属(Hafnia)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、摩根氏菌属(Morganella)、爱德华菌属(Edwardsiella)或克雷伯菌(Klebsiella)分类学分类的物种。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)宿主细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性菌宿主细胞，如芽孢杆菌属(Bacillussp.)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)；或另一种芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，如嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、嗜胺芽孢杆菌(B.aminovorans)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜热葡萄糖苷酶地衣芽孢杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或普通芽孢杆菌(B.vulgatis)。
如本文所述，可针对增加的氨基酸(如赖氨酸)或氨基酸衍生物(如尸胺)的产生筛选根据本发明修饰的宿主细胞。
产生氨基酸或氨基酸衍生物的方法。
遗传修饰以过表达OMP孔蛋白多肽的宿主细胞可用于产生氨基酸或其衍生物。在一些实施方案中，宿主细胞产生赖氨酸。在一些实施方案中，宿主细胞产生尸胺。为了产生氨基酸或氨基酸衍生物，可以在适合允许多肽表达和编码用于产生氨基酸或氨基酸衍生物的酶的基因的表达的条件下培养如本文所述遗传修饰以过表达OMP孔蛋白多肽的宿主细胞。根据本发明修饰的宿主细胞相对于以天然水平表达OMP孔蛋白多肽的未修饰的对应宿主细胞提供更高的氨基酸或氨基酸衍生物产率。
可以使用众所周知的技术(例如，实施例部分中提供的示例性条件)培养宿主细胞。
然后可以使用已知技术分离和纯化氨基酸或氨基酸衍生物。然后可以在任何已知的方法中使用根据本发明产生的赖氨酸或赖氨酸衍生物(例如尸胺)，例如来产生聚酰胺。
在一些实施方案中，可通过使用酶将赖氨酸转化为氨基戊酸(图1)或使用酶和化学催化剂转化为己内酰胺(图2)。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。下面的实施例是为了说明的目的而提供，并不意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键参数，以产生基本上相同的结果。
具体实施方式
实施例
实施例1：编码CadA的质粒载体的构建。
使用PCR引物cadA-F和cadA-R(图1)从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增含有编码赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ ID NO：2)的野生型大肠杆菌cadA(SEQ ID NO：1)的质粒载体，使用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18中以产生质粒pCIB60。
实施例2：表达外膜蛋白的质粒载体的构建。
使用PCR引物ompA-F和ompA-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增编码膜孔蛋白蛋白质OmpA(SEQ ID NO：4)的大肠杆菌基因ompA(SEQ ID NO：3)，用限制酶SacI和XbaI消化，并连接到pUC18质粒载体中以产生pCIB88。类似地，使用引物ompC-F和ompC-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpC(SEQ ID NO：6)的ompC(SEQ ID NO：5)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB89。类似地，使用引物ompF-F和ompF-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpF(SEQ ID NO：8)的ompF(SEQ ID NO：7)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB87。类似地，使用引物ompX-F和ompX-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpX(SEQ ID NO：10)的ompX(SEQ ID NO：9)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB86。类似地，使用引物ompE-F和ompE-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpE(SEQ ID NO：12)的ompE(SEQ ID NO：11)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB91。类似地，使用引物ompG-F和ompG-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpG(SEQ ID NO：14)的ompG(SEQID NO：13)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB80。类似地，使用引物ompW-F和ompW-R将编码膜孔蛋白蛋白质OmpW(SEQ ID NO：16)的ompW(SEQ ID NO：15)克隆到pUC18质粒载体中以产生质粒pCIB81。
实施例3：编码四环素输出泵的质粒载体的构建。
使用PCR引物psyn-1和psyn-2合成合成的启动子序列(SEQ ID NO：17)。引物psyn-1含有启动子序列和与pUC18同源的序列，引物psyn-2含有与pUC18同源的序列。这两个PCR引物用于扩增pUC18的部分，包括从合成的启动子序列下游插入的质粒多克隆位点。使用限制酶EcoRI和ScaI消化含有合成的启动子的扩增DNA，将其进一步连接到pUC18中以构建pCIB10。
使用PCR引物tetA-F和tetA-R从大肠杆菌克隆载体pBR322扩增编码四环素输出泵TetA(SEQ ID NO：19)的tetA基因(SEQ ID NO：18)。用限制酶SacI和XbaI消化扩增的DNA，并连接到pCIB10质粒载体中以产生pCIB20。
实施例4：共表达含有三种来自赖氨酸生物合成通路的蛋白质(LysC、DapA、LysA)的合成操纵子I的质粒载体的构建。
来自大肠杆菌的三个基因lysC、dapA和lysA编码参与大肠杆菌赖氨酸生物合成通路的蛋白质：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)。将这三个基因克隆到质粒载体中，并将三种蛋白LysC(SEQ ID NO：21)、DapA(SEQ ID NO：23)和LysA(SEQ ID NO:25)在大肠杆菌中过表达。使用引物lysC-F和lysC-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因lysC，并使用SacI和BamHI消化扩增的片段，并连接到pUC18中以产生pCIB7。使用引物dapA-F和dapA-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因dapA，并使用BamHI和XbaI消化扩增的片段，并连接到pCIB7中以产生pCIB8。使用引物lysA-F和lysA-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因lysA，并且使用XbaI和SalI消化扩增的片段，并连接到pCIB8中以产生pCIB9。使用引物lysC-F和lysA-R从pCIB9扩增三基因操纵子。使用SacI和SalI消化扩增产物，并将消化的片段连接到pCIB10中以产生pCIB32。使用引物tetA-F3和tetA-R3从pCIB20扩增基因tetA，并使用SbfI和XhoI消化扩增的片段并连接到pCIB32中以产生质粒pCIB42。
实施例5：共表达各种天冬氨酸激酶的质粒载体的构建。表达各种天冬氨酸激酶以增加赖氨酸产生。
选择使得大肠杆菌天冬氨酸激酶III(LysC或AKIII，由lysC(SEQ ID NO：20)编码)对赖氨酸具有增加的反馈抗性的两对突变。使用引物318-F、318-R、323-F、323-R构建编码第一突变体LysC-1(M318I，G323D)(SEQ ID NO：27)的基因。将编码LysC-1(M318I，G323D)的基因克隆到pCIB32中并替换野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC以产生质粒pCIB43。先前提出能够产生聚赖氨酸的来自链霉菌(Streptomyces)菌株的天冬氨酸激酶与大肠杆菌天冬氨酸激酶相比对赖氨酸的反馈抗性更强，但未被证实。如此，密码子优化来自变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的天冬氨酸激酶基因，使用引物SlysC-F和SlysC-R合成并克隆，代替pCIB32中的野生型lysC，以产生质粒pCIB55。所得到的表达的天冬氨酸激酶蛋白质被命名为S-LysC(SEQ ID NO：29)。
实施例6：共表达含有来自赖氨酸生物合成通路的三种蛋白质(Asd、DapB、DapD、AspC)的合成操纵子II的质粒载体的构建。
接下来，增强了参与大肠杆菌赖氨酸生物合成通路的四个另外的基因asd、dapB、dapD和aspC的表达。这些基因编码以下酶：由asd编码的天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd(SEQ IDNO：31))、由dapB编码的二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO：33))、由dapD编码的四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(DapD(SEQ ID NO：35))和由aspC编码的天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ ID NO：37))。使用引物asd-F和asd-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因asd，并使用SacI和BamHI消化扩增的片段，并连接到pUC18中以产生pCIB12。使用引物dapB-F和dapB-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因dapB，并使用BamHI和XbaI消化扩增的片段，并连接到pCIB12中以产生pCIB13。使用引物dapD-F和dapD-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因dapD，并且使用XbaI和SalI消化扩增的片段，并连接到pCIB13中以产生pCIB14。类似地，使用引物aspC-F和aspC-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因aspC，并且使用XbaI和SalI消化扩增的片段，并连接到pCIB13中以产生pCIB31。使用引物tetA-F3和tetA-R3从pCIB20扩增基因tetA，并且使用XhoI和SphI消化扩增的片段并分别连接到pCIB14和pCIB31中以产生质粒pCIB15和pCIB59。
实施例7：共表达含有来自赖氨酸生物合成通路的蛋白质的合成操纵子I和II的质粒载体的构建。
将由基因lysC、dapA、lysA、asd、dapB和aspC组成的两个合成操纵子：合成操纵子I和合成操纵子II组合成单个载体。使用引物LAL-F和LAL-R从pCIB32扩增由基因lysC、dapA和lysA组成的操纵子。使用引物ABC-F和ABCT-R从pCIB59扩增由基因asd、dapB和aspC和tetA基因组成的操纵子。用限制酶ApaI和KpnI消化产物。将pCIB32和pCIB59的消化产物连接以形成pCIB103-1。类似地，将含有不同天冬氨酸激酶的合成操纵子I的变体与合成操纵子II组合。使用引物LAL-F和LAL-R从pCIB43扩增含有LysC-1的合成操纵子I的变体，消化并与消化的pCIB59产物连接以形成pCIB103-2。使用引物SAL-F和SAL-R从pCIB55扩增含有S-LysC的合成操纵子I的变体，消化并与消化的pCIB59产物连接以形成pCIB103-3。
实施例8：从过表达赖氨酸合成操纵子I和II的大肠杆菌产生赖氨酸。
用以下质粒之一转化大肠杆菌MG1655K12：pCIB20、pCIB103-1、pCIB103-2或pCIB103-3，以便制备相应的菌株：CIB20、CIB103-1、CIB103-2或CIB103-3(图2)。每种转化的三个单菌落在37℃下于3mL含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸和四环素(10μg/mL)的培养基中过夜生长。第二天，将每种培养物接种到100mL具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2和四环素(10μg/mL)的新鲜培养基中，在37℃下生长72小时，在此时测定每种培养物中赖氨酸的浓度(表1)。
表1.含有合成操纵子I和II的大肠杆菌菌株的赖氨酸产生。
Figure BDA0001654508690000261
Figure BDA0001654508690000271
如表1所示，与野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶(LysC)的表达相比，天冬氨酸激酶的不同变体(LysC-1、LysC-2、S-LysC)的过产生增加赖氨酸的产生-相比较，对于CIB103-1为1.0g/L，对于对于CIB103-2为6.6g/L，对于CIB103-3为6.0g/L。
实施例9：从共过表达编码外膜蛋白和赖氨酸合成操纵子I和II的基因的大肠杆菌产生赖氨酸。
用过表达以下外模蛋白质之一的质粒之一转化CIB103-3：pCIB80、pCIB81、pCIB86、pCIB87、pCIB88、pCIB89或pCIB91，以产生相应的菌株：CIB80、CIB81、CIB86、CIB87、CIB88、CIB89或CIB91。
每种转化的三个单菌落在37℃下在3mL含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH 4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/mL)和四环素(10μg/mL)的培养基中过夜生长。第二天，将每种培养物接种到100mL具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和四环素(10μg/mL)的新鲜培养基中，在37℃下生长72小时，在此时测定每种培养物中赖氨酸的浓度(表2)。
表2.含有赖氨酸合成操纵子I和II并过产生外膜蛋白的大肠杆菌菌株的赖氨酸产生。
菌株 蛋白质 赖氨酸(g/L)
CIB103-3 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA 6.0±0.1
CIB80 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpG 6.3±0.2
CIB81 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpW 7.1±0.2
CIB86 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpX 6.7±0.3
CIB87 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpF 7.0±0.1
CIB88 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpA 7.6±0.2
CIB89 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpC 7.3±0.1
CIB91 S-LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC,TetA,OmpE 6.0±0.3
如表2所示，过表达编码外膜蛋白的某些基因增加了赖氨酸的产生。OmpG或OmpE的过产生并不显著增加赖氨酸产生-相比较，对于CIB103-3为6.2g/L，对于CIB80为6.0g/L和对于CIB91为5.9g/L。OmpW、OmpX、OmpF、OmpA和OmpC的过产生增加了赖氨酸的生产，过产生OmpA导致最大的增加–与对于CIB103-3为6.2g/L相比较，对于CIB88为7.0g/L。
实施例10：共表达外膜蛋白和CadA的质粒载体的构建。
如实施例2所述，使用合适的引物(ompA-F2、ompA-R2、ompC-F2、ompC-R2、ompE-F2、ompE-R2、ompF-F2、ompF-R2、ompG-F2、ompG-R2、ompW-F2、ompW-R2、ompX-F2、ompX-R2)扩增大肠杆菌外膜基因ompA、ompC、ompE、ompF、ompG、ompW和ompX，使用XbaI和HindIII消化并连接到pCIB60中以与赖氨酸脱羧酶基因cadA共表达外膜基因。共表达cadA和ompA的质粒是pCIB120、共表达cadA和ompC的质粒是pCIB132、共表达cadA和ompE的质粒是pCIB169、共表达cadA和ompF的质粒是pCIB133、共表达cadA和ompG的质粒是pCIB179、共表达cadA和ompW的质粒是pCIB180、共表达cadA和ompX的质粒是pCIB172。
实施例11：共表达YbjE和CadA的质粒载体的构建。
ybjE是来自大肠杆菌的基因，之前显示其通过潜在地作为转运蛋白来增加赖氨酸产生(WO/2005/073390)。我们测试了是否过表达ybjE也可以增加尸胺的产生。
使用PCR引物ybjE-F和ybjE-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增编码膜孔蛋白蛋白质YbjE(SEQ ID NO：39)的大肠杆菌基因ybjE(SEQ ID NO：38)。用限制酶XbaI和HindIII消化扩增的DNA，并连接到pCIB60质粒载体中以产生pCIB106。
实施例12：从共表达外膜蛋白和CadA的大肠杆菌产生尸胺。
用pCIB60、pCIB106、pCIB120、pCIB132、pCIB169、pCIB133、pCIB179、pCIB180或pCIB172转化大肠杆菌MG1655K12。每种转化的三个菌落在37℃在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中以3mL培养物过夜生长。第二天，将0.9mL每种过夜培养物添加到0.1mL赖氨酸-HCl和PLP中，使终浓度分别为40g/L和0.1mM。将各混合物在37℃下孵育2小时。使用NMR对来自每个样品的尸胺产生进行定量，并且通过将所产生的尸胺的摩尔量除以所添加的赖氨酸的摩尔量来计算产率。每个样品的产率显示在表3中。
表3.共产生外膜蛋白和CadA的大肠杆菌菌株的尸胺产生。
质粒 蛋白质 尸胺产率(％)
pCIB60 CadA 37.5±5.2
pCIB106 CadA,YbjE 35.2±3.5
pCIB120 CadA,OmpA 81.0±4.7
pCIB132 CadA,OmpC 79.0±4.4
pCIB169 CadA,OmpE 60.3±3.9
pCIB133 CadA,OmpF 70.2±5.0
pCIB179 CadA,OmpG 64.3±3.1
pCIB180 CadA,OmpW 80.4±5.3
pCIB172 CadA,OmpX 67.4±6.2
如表3所示，与在大肠杆菌中仅过产生CadA的对照相比，除CadA之外还过产生外膜蛋白OmpA、OmpC、OmpE、OmpF、OmpG、OmpW和OmpX增加了尸胺的产生。令人惊讶的是，ybjE(pCIB106)的过表达不增加尸胺的产生，这表明其活性特异于增加赖氨酸产生。
实施例13：从共表达外膜蛋白和CadA的蜂房哈夫尼菌(H.alvei)产生尸胺。
用pCIB60、pCIB120、pCIB132、pCIB169、pCIB133、pCIB179、pCIB180或pCIB172转化蜂房哈夫尼菌。每种转化的三个菌落在37℃下在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中以3mL培养物过夜生长。第二天，将0.9mL每种过夜培养物添加到0.1mL赖氨酸-HCl和PLP中，使终浓度分别为40g/L和0.1mM。将各混合物在37℃下孵育2小时。使用NMR对来自每个样品的尸胺产生进行定量，并且通过将所产生的尸胺的摩尔量除以所添加的赖氨酸的摩尔量来计算产率。每个样品的产率显示在表4中。
表4.由共产生外膜蛋白和CadA的蜂房哈夫尼菌菌株的尸胺产生。
质粒 蛋白质 尸胺产率(％)
pCIB60 CadA 46.7±8.3
pCIB120 CadA,OmpA 70.1±3.4
pCIB132 CadA,OmpC 79.6±5.4
pCIB169 CadA,OmpE 45.5±4.9
pCIB133 CadA,OmpF 59.1±5.1
pCIB179 CadA,OmpG 50.5±3.7
pCIB180 CadA,OmpW 62.5±2.9
pCIB172 CadA,OmpX 45.2±7.3
如表4所示，与仅在蜂房哈夫尼菌中过产生CadA的对照相比，除了CadA以外还过产生外膜蛋白OmpA、OmpC、OmpF和OmpW增加了尸胺的产生。令人惊讶的是，这与在大肠杆菌中观察到的结果不同，在大肠杆菌中OmpA、OmpC、OmpE、OmpF、OmpG、OmpW和OmpX都增加尸胺的产生。
实施例14：尸胺抑制革兰氏阴性菌。
之前由Qian等人,Biotechnology and Bioengineering 108:93-103,2010显示尸胺抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌的生长。我们研究了尸胺对革兰氏阴性菌蜂房哈夫尼菌的影响。首先，用pCIB60转化蜂房哈夫尼菌并于37℃在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的50mL LB培养基中生长24小时。次日，将50mL种子培养物添加到含有7mL发酵培养基(20g/L葡萄糖、30g/L玉米浆、10g/L酵母提取物、5g/L硫酸铵、10g/L MgSO4、0.05g/L FeSO4、0.05g/LMnSO4、5g/L CaCl2、0.1g/L氨苄青霉素))的10L发酵罐中，进行发酵18小时。收集10g发酵液，在室温下以6000rpm离心5分钟，回收生物质。将0.5g生物质添加到含有0％或3％尸胺的50mM磷酸钾缓冲液中持续24小时。培养后，将每个样品在室温下以6000rpm离心5分钟，回收生物质，并添加含有赖氨酸-HCl和PLP的新鲜磷酸钾缓冲液，分别至终浓度为200g/L和0.1mM。将反应初始pH调整至5.0，并使反应在37℃进行120分钟。取1.3mL各样品，煮沸5分钟，并以10,000rpm离心1分钟。使用NMR对每个样品中的尸胺浓度进行定量，并且通过将所产生的尸胺的摩尔量除以所添加的赖氨酸的摩尔量来计算产率。尸胺对孵育细胞的影响显示在表5中。
表5.尸胺抑制革兰氏阴性菌。
Figure BDA0001654508690000311
如表5所示，在使用蜂房哈夫尼菌细胞将赖氨酸转化为尸胺之前，在含有尸胺的溶液中孵育蜂房哈夫尼菌细胞负面影响细胞作为催化剂发挥作用的能力，并且观察到转化能力的显著降低。这些数据支持了之前的观察结果，即尸胺负面影响革兰氏阴性菌，包括蜂房哈夫尼菌。
实施例15：共表达外膜蛋白和CadA的蜂房哈夫尼菌产生尸胺的动力学。
用pCIB60、pCIB120、pCIB132、pCIB169、pCIB133、pCIB179、pCIB180或pCIB172转化蜂房哈夫尼菌。对于每种转化，将一个菌落在37℃下在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的50mLLB培养基中生长24小时。次日，将50mL种子培养物添加到含有7mL发酵培养基(20g/L葡萄糖、30g/L玉米浆、10g/L酵母提取物、5g/L硫酸铵、10g/L MgSO4、0.05g/L FeSO4、0.05g/LMnSO4、5g/L CaCl2、0.1g/L氨苄青霉素)的10L发酵罐中，进行发酵18小时。收集10g发酵液，在室温以6000rpm离心5分钟，回收生物质。将0.5g生物质添加到含有0.1mL赖氨酸-HCl和PLP的50mM磷酸钾缓冲液中，至终浓度分别为200g/L和0.1mM。反应的起始pH调节至5.0，允许反应在37℃进行240分钟。每10-20分钟取1.3mL样品，煮沸5分钟，并以10,000rpm离心1分钟。使用NMR对每个样品中的尸胺浓度进行定量，并且通过将所产生的尸胺的摩尔量除以所添加的赖氨酸的摩尔量来计算产率。通过绘制随时间的尸胺产率，确定每个反应的速度(表6)。每个反应到240分钟时显著减慢(<0.1％/分钟)，在240分钟时的最大产率显示在表6中。
表6.共表达外膜蛋白和CadA的蜂房哈夫尼菌菌株产生尸胺的动力学。
质粒 蛋白质 速度(％/min) 最大产率(％)
pCIB60 CadA 0.31 35
pCIB120 CadA,OmpA 0.64 45
pCIB132 CadA,OmpC 0.67 48
pCIB169 CadA,OmpE 0.30 32
pCIB133 CadA,OmpF 0.54 46
pCIB179 CadA,OmpG 0.48 38
pCIB180 CadA,OmpW 0.59 42
pCIB172 CadA,OmpX 0.44 39
如表6所示，过产生外膜蛋白OmpA、OmpC、OmpF、OmpG、OmpW和OmpX与CadA增加了催化反应的速度。CadA蛋白的浓度在不同菌株间没有变化(通过SDS-PAGE验证)，所以速度的增加归因于外膜蛋白过表达导致的膜对赖氨酸和/或尸胺渗透性的增加。表6还显示，过产生外膜蛋白OmpA、OmpC、OmpF、OmpW和OmpX增加了最大产率，表明这些蛋白质的过产生增加了对尸胺的耐受性。
实施例16：从共过表达编码赖氨酸脱羧酶和赖氨酸合成操纵子I和II的基因的大肠杆菌产生尸胺。
用pCIB60转化CIB103-1、CIB103-2和CIB103-3以构建菌株CIB60-1、CIB60-2和CIB60-3。CIB60-1、CIB60-2和CIB60-3均表达编码赖氨酸脱羧酶基因cadA和六个赖氨酸生物合成基因的基因。然而，CIB60-1表达野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶lysC，CIB60-2表达突变反馈抗性型天冬氨酸激酶lysC-1，以及CIB60-3表达野生型变铅青链霉菌(S.lividans)天冬氨酸激酶S-lysC。
来自每种转化的三个单菌落在37℃下在3mL含有4％葡萄糖、0.1％KH 2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的培养基中过夜生长。第二天，将每种培养物接种到100mL具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜培养基中，并在37℃下生长72小时，此时测定每种培养物中赖氨酸的浓度(表7)。
表7.由含有合成操纵子I和II并共产生CadA的大肠杆菌菌株产生赖氨酸和尸胺。
Figure BDA0001654508690000331
如表7所示，过产生CadA和赖氨酸合成操纵子I和II导致产生赖氨酸和尸胺。此外，随着CadA的过产生，来自葡萄糖的赖氨酸和尸胺的总产生增加。当与对于CIB103-1为1.9g/L和对于CIB60-1为3.8g/L相比较时，这是最明显的。该观察表明，赖氨酸向尸胺的转化也是消除与高赖氨酸浓度相关的反馈抑制的有效工具。
实施例17：从共过表达编码赖氨酸脱羧酶、外膜蛋白和赖氨酸合成操纵子I和II的基因的大肠杆菌的尸胺产生。
用pCIB60、pCIB120、pCIB132、pCIB169、pCIB133、pCIB179、pCIB180或pCIB172转化CIB103-3以制备相应的菌株CIB60-3、CIB120-3、CIB132-3、CIB169-3、CIB133-3、CIB179-3、CIB180-3和pCIB172-3。
来自每种转化的三个单菌落在37℃下在3mL含有4％葡萄糖、0.1％KH 2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的培养基中过夜生长。第二天，将每种培养物接种到100mL具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、四环素(10μg/mL)和氨苄青霉素(100μg/mL)的新鲜培养基中，并在37℃下生长72小时37℃，此时测定每种培养物中赖氨酸的浓度(表8)。
表8.由含有合成操纵子I和II并共产生CadA和外膜蛋白的大肠杆菌菌株的赖氨酸和尸胺产生。
Figure BDA0001654508690000341
Figure BDA0001654508690000351
如表8所示，与在共表达赖氨酸合成操纵子I和II的大肠杆菌中仅过产生CadA的对照相比，除CadA外，过产生外膜蛋白OmpA、OmpC、OmpF、OmpW和OmpX增加了总赖氨酸和尸胺的产生。过产生OmpF和OmpW导致总赖氨酸和尸胺产生的最高增加–与对于CIB60-3为6.4g/L相比较，对于CIB132-3为7.2g/L和对于CIB180-3为7.4g/L。在大多数情况下，赖氨酸和尸胺的产生随着外膜蛋白的过产生而增加。
实施例中使用的质粒的表
Figure BDA0001654508690000352
Figure BDA0001654508690000361
Figure BDA0001654508690000371
Figure BDA0001654508690000381
实施例中使用的引物序列的表
Figure BDA0001654508690000382
Figure BDA0001654508690000391
Figure BDA0001654508690000401
实施例中使用的引物序列的表
Figure BDA0001654508690000411
Figure BDA0001654508690000421
Figure BDA0001654508690000431
示例性序列
SEQ ID NO:1大肠杆菌cadA核酸序列
Figure BDA0001654508690000441
SEQ ID NO:2CadA多肽序列
Figure BDA0001654508690000451
SEQ ID NO:3大肠杆菌ompA核酸序列
Figure BDA0001654508690000452
SEQ ID NO：4OmpA多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000461
SEQ ID NO：5大肠杆菌ompC核酸序列
Figure BDA0001654508690000462
SEQ ID NO：6OmpC多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000463
SEQ ID NO：7大肠杆菌ompF核酸序列
Figure BDA0001654508690000471
SEQ ID NO：8OmpF多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000472
SEQ ID NO：9大肠杆菌ompX核酸序列
Figure BDA0001654508690000473
SEQ ID NO：10OmpX多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000481
SEQ ID NO：11大肠杆菌ompE核酸序列
Figure BDA0001654508690000482
SEQ ID NO：12OmpE多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000483
SEQ ID NO：13大肠杆菌ompG核酸序列
Figure BDA0001654508690000491
SEQ ID NO：14OmpG多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
Figure BDA0001654508690000492
SEQ ID NO：15大肠杆菌ompW核酸序列
Figure BDA0001654508690000493
SEQ ID NO：16OmpW多肽序列(下划线序列为在成熟蛋白质中被切割的信号肽)
SEQ ID NO：17合成的启动子核酸序列
Figure BDA0001654508690000502
SEQ ID NO：18tetA核酸序列
Figure BDA0001654508690000503
SEQ ID NO：19tetA多肽序列
Figure BDA0001654508690000504
SEQ ID NO：20lysC核酸序列
Figure BDA0001654508690000511
SEQ ID NO：21LysC多肽序列
Figure BDA0001654508690000512
SEQ ID NO：22dapA核酸序列
Figure BDA0001654508690000521
SEQ ID NO：23DapA多肽序列
Figure BDA0001654508690000522
SEQ ID NO：24lysA核酸序列
Figure BDA0001654508690000531
SEQ ID NO：25LysA多肽序列
Figure BDA0001654508690000532
SEQ ID NO：26lysC-1核酸序列
Figure BDA0001654508690000541
SEQ ID NO：27LysC-1多肽序列
Figure BDA0001654508690000542
SEQ ID NO：28S-lysC核酸序列
Figure BDA0001654508690000543
Figure BDA0001654508690000551
SEQ ID NO：29S-LysC多肽序列
Figure BDA0001654508690000552
SEQ ID NO：30asd核酸序列
Figure BDA0001654508690000553
Figure BDA0001654508690000561
SEQ ID NO：31Asd多肽序列
Figure BDA0001654508690000562
SEQ ID NO：32dapB核酸序列
Figure BDA0001654508690000563
SEQ ID NO：33DapB多肽序列
Figure BDA0001654508690000571
SEQ ID NO：34dapD核酸序列
Figure BDA0001654508690000572
SEQ ID NO：35DapD多肽序列
Figure BDA0001654508690000573
SEQ ID NO：36aspC核酸序列
Figure BDA0001654508690000574
Figure BDA0001654508690000581
SEQ ID NO：37AspC多肽序列
Figure BDA0001654508690000582
SEQ ID NO：30YbjE多肽序列
Figure BDA0001654508690000583
序列表
<110> 凯赛生物产业有限公司（Cathay Industrial Biotech）
<120> 修饰的膜渗透性
<130> PCT
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 715
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 3
<211> 1041
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 3
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60
gccgctccga aagataacac ctggtacact ggtgctaaac tgggctggtc ccagtaccat 120
gacactggtt tcatcaacaa caatggcccg acccatgaaa accaactggg cgctggtgct 180
tttggtggtt accaggttaa cccgtatgtt ggctttgaaa tgggttacga ctggttaggt 240
cgtatgccgt acaaaggcag cgttgaaaac ggtgcataca aagctcaggg cgttcaactg 300
accgctaaac tgggttaccc aatcactgac gacctggaca tctacactcg tctgggtggc 360
atggtatggc gtgcagacac taaatccaac gtttatggta aaaaccacga caccggcgtt 420
tctccggtct tcgctggcgg tgttgagtac gcgatcactc ctgaaatcgc tacccgtctg 480
gaataccagt ggaccaacaa catcggtgac gcacacacca tcggcactcg tccggacaac 540
ggcatgctga gcctgggtgt ttcctaccgt ttcggtcagg gcgaagcagc tccagtagtt 600
gctccggctc cagctccggc accggaagta cagaccaagc acttcactct gaagtctgac 660
gttctgttca acttcaacaa agcaaccctg aaaccggaag gtcaggctgc tctggatcag 720
ctgtacagcc agctgagcaa cctggatccg aaagacggtt ccgtagttgt tctgggttac 780
accgaccgca tcggttctga cgcttacaac cagggtctgt ccgagcgccg tgctcagtct 840
gttgttgatt acctgatctc caaaggtatc ccggcagaca agatctccgc acgtggtatg 900
ggcgaatcca acccggttac tggcaacacc tgtgacaacg tgaaacagcg tgctgcactg 960
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gtaactcagc cgcaggctta a 1041
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 4
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala
20 25 30
Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn
35 40 45
Gly Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr
50 55 60
Gln Val Asn Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly
65 70 75 80
Arg Met Pro Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln
85 90 95
Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu
100 105 110
Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys
115 120 125
Ser Asn Val Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe
130 135 140
Ala Gly Gly Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu
145 150 155 160
Glu Tyr Gln Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr
165 170 175
Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly
180 185 190
Gln Gly Glu Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Glu Val Gln Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn
210 215 220
Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Ala Ala Leu Asp Gln
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Gln Leu Ser Asn Leu Asp Pro Lys Asp Gly Ser Val Val
245 250 255
Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Tyr Asn Gln Gly
260 265 270
Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Ile Ser Lys
275 280 285
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Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Gln Arg Ala Ala Leu
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 5
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gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120
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ttcaaaggtg aaactcaggt tactgaccag ctgaccggtt acggccagtg ggaatatcag 240
atccagggca acagcgctga aaacgaaaac aactcctgga cccgtgtggc attcgcaggt 300
ctgaaattcc aggatgtggg ttctttcgac tacggtcgta actacggcgt tgtttatgac 360
gtaacttcct ggaccgacgt actgccagaa ttcggtggtg acacctacgg ttctgacaac 420
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gttgacggcc tgaactttgc tgttcagtac cagggtaaaa acggcaaccc atctggtgaa 540
ggctttacta gtggcgtaac taacaacggt cgtgacgcac tgcgtcaaaa cggcgacggc 600
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tccaaacgta ctgatgctca gaacaccgct gcttacatcg gtaacggcga ccgtgctgaa 720
acctacactg gtggtctgaa atacgacgct aacaacatct acctggctgc tcagtacacc 780
cagacctaca acgcaactcg cgtaggttcc ctgggttggg cgaacaaagc acagaacttc 840
gaagctgttg ctcagtacca gttcgacttc ggtctgcgtc cgtccctggc ttacctgcag 900
tctaaaggta aaaacctggg tcgtggctac gacgacgaag atatcctgaa atatgttgat 960
gttggtgcta cctactactt caacaaaaac atgtccacct acgttgacta caaaatcaac 1020
ctgctggacg acaaccagtt cactcgtgac gctggcatca acactgataa catcgtagct 1080
ctgggtctgg tttaccagtt ctaa 1104
<210> 6
<211> 367
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 6
Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu
20 25 30
Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys
35 40 45
Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu
50 55 60
Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln
65 70 75 80
Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val
85 90 95
Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly
100 105 110
Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu
115 120 125
Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln
130 135 140
Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu
145 150 155 160
Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Gly Asn
165 170 175
Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp
180 185 190
Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp
195 200 205
Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr
210 215 220
Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu
225 230 235 240
Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala
245 250 255
Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly
260 265 270
Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe
275 280 285
Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys
290 295 300
Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp
305 310 315 320
Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp
325 330 335
Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly
340 345 350
Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe
355 360 365
<210> 7
<211> 1086
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 7
atgaagcgca atattctggc agtgatcgtc cctgctctgt tagtagcagg tactgcaaac 60
gctgcagaaa tctataacaa agatggcaac aaagtagatc tgtacggtaa agctgttggt 120
ctgcattatt tttccaaggg taacggtgaa aacagttacg gtggcaatgg cgacatgacc 180
tatgcccgtc ttggttttaa aggggaaact caaatcaatt ccgatctgac cggttatggt 240
cagtgggaat ataacttcca gggtaacaac tctgaaggcg ctgacgctca aactggtaac 300
aaaacgcgtc tggcattcgc gggtcttaaa tacgctgacg ttggttcttt cgattacggc 360
cgtaactacg gtgtggttta tgatgcactg ggttacaccg atatgctgcc agaatttggt 420
ggtgatactg catacagcga tgacttcttc gttggtcgtg ttggcggcgt tgctacctat 480
cgtaactcca acttctttgg tctggttgat ggcctgaact tcgctgttca gtacctgggt 540
aaaaacgagc gtgacactgc acgccgttct aacggcgacg gtgttggcgg ttctatcagc 600
tacgaatacg aaggctttgg tatcgttggt gcttatggtg cagctgaccg taccaacctg 660
caagaagctc aacctcttgg caacggtaaa aaagctgaac agtgggctac tggtctgaag 720
tacgacgcga acaacatcta cctggcagcg aactacggtg aaacccgtaa cgctacgccg 780
atcactaata aatttacaaa caccagcggc ttcgccaaca aaacgcaaga cgttctgtta 840
gttgcgcaat accagttcga tttcggtctg cgtccgtcca tcgcttacac caaatctaaa 900
gcgaaagacg tagaaggtat cggtgatgtt gatctggtga actactttga agtgggcgca 960
acctactact tcaacaaaaa catgtccacc tatgttgact acatcatcaa ccagatcgat 1020
tctgacaaca aactgggcgt aggttcagac gacaccgttg ctgtgggtat cgtttaccag 1080
ttctaa 1086
<210> 8
<211> 361
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 8
Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Val
20 25 30
Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly Asn
35 40 45
Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg Leu
50 55 60
Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Gln Trp Glu Tyr Asn Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp Ala
85 90 95
Gln Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Ala
100 105 110
Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp
115 120 125
Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Ala
130 135 140
Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val
165 170 175
Gln Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn Gly
180 185 190
Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly Ile
195 200 205
Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala Gln
210 215 220
Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu Lys
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr Arg
245 250 255
Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe Ala
260 265 270
Asn Lys Thr Gln Asp Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp Phe
275 280 285
Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp Val
290 295 300
Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly Ala
305 310 315 320
Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile Ile
325 330 335
Asn Gln Ile Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp Thr
340 345 350
Val Ala Val Gly Ile Val Tyr Gln Phe
355 360
<210> 9
<211> 516
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 9
atgaaaaaaa ttgcatgtct ttcagcactg gccgcagttc tggctttcac cgcaggtact 60
tccgtagctg cgacttctac tgtaactggc ggttacgcac agagcgacgc tcagggccaa 120
atgaacaaaa tgggcggttt caacctgaaa taccgctatg aagaagacaa cagcccgctg 180
ggtgtgatcg gttctttcac ttacaccgag aaaagccgta ctgcaagctc tggtgactac 240
aacaaaaacc agtactacgg catcactgct ggtccggctt accgcattaa cgactgggca 300
agcatctacg gtgtagtggg tgtgggttat ggtaaattcc agaccactga atacccgacc 360
tacaaacacg acaccagcga ctacggtttc tcctacggtg cgggtctgca gttcaacccg 420
atggaaaacg ttgctctgga cttctcttac gagcagagcc gtattcgtag cgttgacgta 480
ggcacctgga ttgccggtgt tggttaccgc ttctaa 516
<210> 10
<211> 171
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 10
Met Lys Lys Ile Ala Cys Leu Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Ala Phe
1 5 10 15
Thr Ala Gly Thr Ser Val Ala Ala Thr Ser Thr Val Thr Gly Gly Tyr
20 25 30
Ala Gln Ser Asp Ala Gln Gly Gln Met Asn Lys Met Gly Gly Phe Asn
35 40 45
Leu Lys Tyr Arg Tyr Glu Glu Asp Asn Ser Pro Leu Gly Val Ile Gly
50 55 60
Ser Phe Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Arg Thr Ala Ser Ser Gly Asp Tyr
65 70 75 80
Asn Lys Asn Gln Tyr Tyr Gly Ile Thr Ala Gly Pro Ala Tyr Arg Ile
85 90 95
Asn Asp Trp Ala Ser Ile Tyr Gly Val Val Gly Val Gly Tyr Gly Lys
100 105 110
Phe Gln Thr Thr Glu Tyr Pro Thr Tyr Lys His Asp Thr Ser Asp Tyr
115 120 125
Gly Phe Ser Tyr Gly Ala Gly Leu Gln Phe Asn Pro Met Glu Asn Val
130 135 140
Ala Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Gln Ser Arg Ile Arg Ser Val Asp Val
145 150 155 160
Gly Thr Trp Ile Ala Gly Val Gly Tyr Arg Phe
165 170
<210> 11
<211> 1056
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 11
atgaaaaaga gcactctggc attagtggtg atgggcattg tggcatctgc atctgtacag 60
gctgcagaaa tatataataa agacggtaat aaactggatg tctatggcaa agttaaagcc 120
atgcattata tgagtgataa cgccagtaaa gatggcgacc agagttatat ccgttttggt 180
ttcaaaggcg aaacacaaat taacgatcaa ctgactggtt atggtcgttg ggaagcagag 240
tttgccggta ataaagcaga gagtgatact gcacagcaaa aaacgcgtct cgcttttgcc 300
gggttgaaat ataaagattt gggttctttc gattatggtc gtaacctggg ggcgttgtat 360
gacgtggaag cctggaccga tatgttcccg gaatttggtg gcgattcctc ggcgcagacc 420
gacaacttta tgaccaaacg cgccagcggt ctggcgacgt atcggaacac cgacttcttc 480
ggcgttatcg atggcctgaa cttaaccctg caatatcaag ggaaaaacga aaaccgcgac 540
gttaaaaagc aaaacggcga tggcttcggc acgtcattga catatgactt tggcggcagc 600
gatttcgcca ttagtggggc ctataccaac tcagatcgca ccaacgagca gaacctgcaa 660
agccgtggca caggcaagcg tgcagaagca tgggcaacag gtctgaaata cgatgccaat 720
aatatttatc tggcaacttt ctattctgaa acacgcaaaa tgacgccaat aactggcggc 780
tttgccaata agacacagaa ctttgaagcg gtcgctcaat accagtttga ctttggtctg 840
cgtccatcgc tgggttatgt cttatcgaaa gggaaagata ttgaaggtat cggtgatgaa 900
gatctggtca attatatcga cgtcggtgct acgtattatt tcaacaaaaa tatgtcagcg 960
tttgttgatt ataaaatcaa ccaactggat agcgataaca aattgaatat taataatgat 1020
gatattgtcg cggttggcat gacgtatcag ttttaa 1056
<210> 12
<211> 351
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 12
Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Leu Val Val Met Gly Ile Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ser Val Gln Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu
20 25 30
Asp Val Tyr Gly Lys Val Lys Ala Met His Tyr Met Ser Asp Asn Ala
35 40 45
Ser Lys Asp Gly Asp Gln Ser Tyr Ile Arg Phe Gly Phe Lys Gly Glu
50 55 60
Thr Gln Ile Asn Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Arg Trp Glu Ala Glu
65 70 75 80
Phe Ala Gly Asn Lys Ala Glu Ser Asp Thr Ala Gln Gln Lys Thr Arg
85 90 95
Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr Lys Asp Leu Gly Ser Phe Asp Tyr
100 105 110
Gly Arg Asn Leu Gly Ala Leu Tyr Asp Val Glu Ala Trp Thr Asp Met
115 120 125
Phe Pro Glu Phe Gly Gly Asp Ser Ser Ala Gln Thr Asp Asn Phe Met
130 135 140
Thr Lys Arg Ala Ser Gly Leu Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe
145 150 155 160
Gly Val Ile Asp Gly Leu Asn Leu Thr Leu Gln Tyr Gln Gly Lys Asn
165 170 175
Glu Asn Arg Asp Val Lys Lys Gln Asn Gly Asp Gly Phe Gly Thr Ser
180 185 190
Leu Thr Tyr Asp Phe Gly Gly Ser Asp Phe Ala Ile Ser Gly Ala Tyr
195 200 205
Thr Asn Ser Asp Arg Thr Asn Glu Gln Asn Leu Gln Ser Arg Gly Thr
210 215 220
Gly Lys Arg Ala Glu Ala Trp Ala Thr Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn
225 230 235 240
Asn Ile Tyr Leu Ala Thr Phe Tyr Ser Glu Thr Arg Lys Met Thr Pro
245 250 255
Ile Thr Gly Gly Phe Ala Asn Lys Thr Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala
260 265 270
Gln Tyr Gln Phe Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Gly Tyr Val Leu
275 280 285
Ser Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Ile Gly Asp Glu Asp Leu Val Asn
290 295 300
Tyr Ile Asp Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Ala
305 310 315 320
Phe Val Asp Tyr Lys Ile Asn Gln Leu Asp Ser Asp Asn Lys Leu Asn
325 330 335
Ile Asn Asn Asp Asp Ile Val Ala Val Gly Met Thr Tyr Gln Phe
340 345 350
<210> 13
<211> 906
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 13
atgaaaaagt tattaccctg taccgcactg gtgatgtgtg cgggaatggc ctgcgcacag 60
gccgaggaaa ggaacgactg gcactttaat atcggcgcga tgtacgaaat agaaaacgtc 120
gagggttatg gcgaagatat ggatgggctg gcggagcctt cagtctattt taatgccgcc 180
aacgggccgt ggagaattgc tctggcctat tatcaggaag ggccggtaga ttatagcgcg 240
ggtaaacgtg gaacgtggtt tgatcgcccg gagctggagg tgcattatca gttcctcgaa 300
aacgatgatt tcagtttcgg cctgaccggc ggtttccgta attatggtta tcactacgtt 360
gatgaaccgg gtaaagacac ggcgaatatg cagcgctgga aaatcgcgcc agactgggat 420
gtgaaactga ctgacgattt acgtttcaac ggttggttgt cgatgtataa atttgccaac 480
gatctgaaca ctaccggtta cgctgatacc cgtgtcgaaa cggaaacagg tctgcaatat 540
accttcaacg aaacggttgc cttgcgagtg aactattatc tcgagcgcgg cttcaatatg 600
gacgacagcc gcaataacgg tgagttttcc acgcaagaaa ttcgcgccta tttgccgctg 660
acgctcggca accactcggt gacgccgtat acgcgcattg ggctggatcg ctggagtaac 720
tgggactggc aggatgatat tgaacgtgaa ggccatgatt ttaaccgtgt aggtttattt 780
tacggttatg atttccagaa cggactttcc gtttcgctgg aatacgcgtt tgagtggcag 840
gatcacgacg aaggcgacag tgataaattc cattatgcag gtgtcggcgt aaattactcg 900
ttctga 906
<210> 14
<211> 301
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 14
Met Lys Lys Leu Leu Pro Cys Thr Ala Leu Val Met Cys Ala Gly Met
1 5 10 15
Ala Cys Ala Gln Ala Glu Glu Arg Asn Asp Trp His Phe Asn Ile Gly
20 25 30
Ala Met Tyr Glu Ile Glu Asn Val Glu Gly Tyr Gly Glu Asp Met Asp
35 40 45
Gly Leu Ala Glu Pro Ser Val Tyr Phe Asn Ala Ala Asn Gly Pro Trp
50 55 60
Arg Ile Ala Leu Ala Tyr Tyr Gln Glu Gly Pro Val Asp Tyr Ser Ala
65 70 75 80
Gly Lys Arg Gly Thr Trp Phe Asp Arg Pro Glu Leu Glu Val His Tyr
85 90 95
Gln Phe Leu Glu Asn Asp Asp Phe Ser Phe Gly Leu Thr Gly Gly Phe
100 105 110
Arg Asn Tyr Gly Tyr His Tyr Val Asp Glu Pro Gly Lys Asp Thr Ala
115 120 125
Asn Met Gln Arg Trp Lys Ile Ala Pro Asp Trp Asp Val Lys Leu Thr
130 135 140
Asp Asp Leu Arg Phe Asn Gly Trp Leu Ser Met Tyr Lys Phe Ala Asn
145 150 155 160
Asp Leu Asn Thr Thr Gly Tyr Ala Asp Thr Arg Val Glu Thr Glu Thr
165 170 175
Gly Leu Gln Tyr Thr Phe Asn Glu Thr Val Ala Leu Arg Val Asn Tyr
180 185 190
Tyr Leu Glu Arg Gly Phe Asn Met Asp Asp Ser Arg Asn Asn Gly Glu
195 200 205
Phe Ser Thr Gln Glu Ile Arg Ala Tyr Leu Pro Leu Thr Leu Gly Asn
210 215 220
His Ser Val Thr Pro Tyr Thr Arg Ile Gly Leu Asp Arg Trp Ser Asn
225 230 235 240
Trp Asp Trp Gln Asp Asp Ile Glu Arg Glu Gly His Asp Phe Asn Arg
245 250 255
Val Gly Leu Phe Tyr Gly Tyr Asp Phe Gln Asn Gly Leu Ser Val Ser
260 265 270
Leu Glu Tyr Ala Phe Glu Trp Gln Asp His Asp Glu Gly Asp Ser Asp
275 280 285
Lys Phe His Tyr Ala Gly Val Gly Val Asn Tyr Ser Phe
290 295 300
<210> 15
<211> 639
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 15
atgaaaaagt taacagtggc ggctttggca gtaacaactc ttctctctgg cagtgccttt 60
gcgcatgaag caggcgaatt ttttatgcgt gcaggttctg caaccgtacg tccaacagaa 120
ggtgctggtg gtacgttagg aagtctgggt ggattcagcg tgaccaataa cacgcaactg 180
ggccttacgt ttacttatat ggcgaccgac aacattggtg tggaattact ggcagcgacg 240
ccgttccgcc ataaaatcgg cacccgggcg accggcgata ttgcaaccgt tcatcatctg 300
ccaccaacac tgatggcgca gtggtatttt ggtgatgcca gcagcaaatt ccgtccttac 360
gttggggcag gtattaacta caccaccttc tttgataatg gatttaacga tcatggcaaa 420
gaggcagggc tttccgatct cagtctgaaa gattcctggg gagctgccgg gcaggtgggg 480
gttgattatc tgattaaccg tgactggttg gttaacatgt cagtgtggta catggatatc 540
gataccaccg ccaattataa gctgggcggt gcacagcaac acgatagcgt acgcctcgat 600
ccgtgggtgt ttatgttctc agcaggatat cgtttttaa 639
<210> 16
<211> 212
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 16
Met Lys Lys Leu Thr Val Ala Ala Leu Ala Val Thr Thr Leu Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Glu Phe Phe Met Arg Ala Gly
20 25 30
Ser Ala Thr Val Arg Pro Thr Glu Gly Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ser
35 40 45
Leu Gly Gly Phe Ser Val Thr Asn Asn Thr Gln Leu Gly Leu Thr Phe
50 55 60
Thr Tyr Met Ala Thr Asp Asn Ile Gly Val Glu Leu Leu Ala Ala Thr
65 70 75 80
Pro Phe Arg His Lys Ile Gly Thr Arg Ala Thr Gly Asp Ile Ala Thr
85 90 95
Val His His Leu Pro Pro Thr Leu Met Ala Gln Trp Tyr Phe Gly Asp
100 105 110
Ala Ser Ser Lys Phe Arg Pro Tyr Val Gly Ala Gly Ile Asn Tyr Thr
115 120 125
Thr Phe Phe Asp Asn Gly Phe Asn Asp His Gly Lys Glu Ala Gly Leu
130 135 140
Ser Asp Leu Ser Leu Lys Asp Ser Trp Gly Ala Ala Gly Gln Val Gly
145 150 155 160
Val Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Asp Trp Leu Val Asn Met Ser Val Trp
165 170 175
Tyr Met Asp Ile Asp Thr Thr Ala Asn Tyr Lys Leu Gly Gly Ala Gln
180 185 190
Gln His Asp Ser Val Arg Leu Asp Pro Trp Val Phe Met Phe Ser Ala
195 200 205
Gly Tyr Arg Phe
210
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 合成启动子核酸序列
<400> 17
agtttattct tgacatgtag tgagggggct ggtataat 38
<210> 18
<211> 1191
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 18
atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60
ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120
atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180
cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240
cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300
gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360
gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420
ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480
gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540
atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600
agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660
atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720
tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780
ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840
atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900
tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960
caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020
gcggctctta ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080
gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140
tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191
<210> 19
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 19
Met Lys Ser Asn Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu
1 5 10 15
Asp Ala Val Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu
20 25 30
Arg Asp Ile Val His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu
35 40 45
Leu Ala Leu Tyr Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly
50 55 60
Ala Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gly Ala Thr Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu
85 90 95
Trp Ile Leu Tyr Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr
100 105 110
Gly Ala Val Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp
115 120 125
Arg Ala Arg His Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met
130 135 140
Val Ala Gly Pro Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His
145 150 155 160
Ala Pro Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu
165 170 175
Gly Cys Phe Leu Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met
180 185 190
Pro Leu Arg Ala Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly
195 200 205
Met Thr Ile Val Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu
210 215 220
Val Gly Gln Val Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg
225 230 235 240
Phe Arg Trp Ser Ala Thr Met Ile Gly Leu Ser Leu Ala Val Phe Gly
245 250 255
Ile Leu His Ala Leu Ala Gln Ala Phe Val Thr Gly Pro Ala Thr Lys
260 265 270
Arg Phe Gly Glu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Gly Met Ala Ala Asp Ala
275 280 285
Leu Gly Tyr Val Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Gly Trp Met Ala Phe
290 295 300
Pro Ile Met Ile Leu Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly Met Pro Ala Leu
305 310 315 320
Gln Ala Met Leu Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu
325 330 335
Gln Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Ile Gly Pro
340 345 350
Leu Ile Val Thr Ala Ile Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly
355 360 365
Leu Ala Trp Ile Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala
370 375 380
Leu Arg Arg Gly Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr
385 390 395
<210> 20
<211> 1350
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 20
atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60
aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120
tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180
ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240
ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300
gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360
atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420
gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480
gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540
acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600
agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660
accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720
gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780
ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840
gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900
gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960
tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020
ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080
actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140
gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200
ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260
ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 1320
caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350
<210> 21
<211> 449
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 21
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325 330 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 22
<211> 879
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 22
atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt 60
cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt 120
tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg 180
atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240
gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300
ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360
gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420
tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc 480
aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat 540
tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat 600
ggggttattt ccgttacggc taacgtcgca gcgcgtgata tggcccagat gtgcaaactg 660
gcagcagaag ggcattttgc cgaggcacgc gttattaatc agcgtctgat gccattacac 720
aacaaactat ttgtcgaacc caatccaatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggaactgggt 780
cttgtggcga ccgatacgct gcgcctgcca atgacaccaa tcaccgacag tggtcgtgag 840
acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctgtaa 879
<210> 23
<211> 292
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 23
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
20 25 30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn
65 70 75 80
Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly
85 90 95
Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln
100 105 110
Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu
115 120 125
Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile
145 150 155 160
Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu
165 170 175
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
180 185 190
Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn
195 200 205
Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly
210 215 220
His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His
225 230 235 240
Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275 280 285
Ala Gly Leu Leu
290
<210> 24
<211> 1263
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 24
atgccacatt cactgttcag caccgatacc gatctcaccg ccgaaaatct gctgcgtttg 60
cccgctgaat ttggctgccc ggtgtgggtc tacgatgcgc aaattattcg tcggcagatt 120
gcagcgctga aacagtttga tgtggtgcgc tttgcacaga aagcctgttc caatattcat 180
attttgcgct taatgcgtga gcagggcgtg aaagtggatt ccgtctcgtt aggcgaaata 240
gagcgtgcgt tggcggcggg ttacaatccg caaacgcacc ccgatgatat tgtttttacg 300
gcagatgtta tcgatcaggc gacgcttgaa cgcgtcagtg aattgcaaat tccggtgaat 360
gcgggttctg ttgatatgct cgaccaactg ggccaggttt cgccagggca tcgggtatgg 420
ctgcgcgtta atccggggtt tggtcacgga catagccaaa aaaccaatac cggtggcgaa 480
aacagcaagc acggtatctg gtacaccgat ctgcccgccg cactggacgt gatacaacgt 540
catcatctgc agctggtcgg cattcacatg cacattggtt ctggcgttga ttatgcccat 600
ctggaacagg tgtgtggtgc tatggtgcgt caggtcatcg aattcggtca ggatttacag 660
gctatttctg cgggcggtgg gctttctgtt ccttatcaac agggtgaaga ggcggttgat 720
accgaacatt attatggtct gtggaatgcc gcgcgtgagc aaatcgcccg ccatttgggc 780
caccctgtga aactggaaat tgaaccgggt cgcttcctgg tagcgcagtc tggcgtatta 840
attactcagg tgcggagcgt caaacaaatg gggagccgcc actttgtgct ggttgatgcc 900
gggttcaacg atctgatgcg cccggcaatg tacggtagtt accaccatat cagtgccctg 960
gcagctgatg gtcgttctct ggaacacgcg ccaacggtgg aaaccgtcgt cgccggaccg 1020
ttatgtgaat cgggcgatgt ctttacccag caggaagggg gaaatgttga aacccgcgcc 1080
ttgccggaag tgaaggcagg tgattatctg gtactgcatg atacaggggc atatggcgca 1140
tcaatgtcat ccaactacaa tagccgtccg ctgttaccag aagttctgtt tgataatggt 1200
caggcgcggt tgattcgccg tcgccagacc atcgaagaat tactggcgct ggaattgctt 1260
taa 1263
<210> 25
<211> 420
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 25
Met Pro His Ser Leu Phe Ser Thr Asp Thr Asp Leu Thr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu Pro Ala Glu Phe Gly Cys Pro Val Trp Val Tyr Asp
20 25 30
Ala Gln Ile Ile Arg Arg Gln Ile Ala Ala Leu Lys Gln Phe Asp Val
35 40 45
Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu
50 55 60
Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile
65 70 75 80
Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp
85 90 95
Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val
100 105 110
Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp
115 120 125
Gln Leu Gly Gln Val Ser Pro Gly His Arg Val Trp Leu Arg Val Asn
130 135 140
Pro Gly Phe Gly His Gly His Ser Gln Lys Thr Asn Thr Gly Gly Glu
145 150 155 160
Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp
165 170 175
Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile
180 185 190
Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met
195 200 205
Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp
225 230 235 240
Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala
245 250 255
Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe
260 265 270
Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys
275 280 285
Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val
325 330 335
Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu
340 345 350
Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp
355 360 365
Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser
370 375 380
Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala
405 410 415
Leu Glu Leu Leu
420
<210> 26
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> lysC-1核酸序列
<400> 26
atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60
aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120
tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180
ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240
ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300
gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360
atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420
gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480
gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540
acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600
agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660
accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720
gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780
ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840
gacccacgcg caggtggtac gctgatgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900
gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatactgcat 960
tctcgcgatt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020
ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080
actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140
gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgcc aaaagcctgc 1200
ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260
ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg 1320
caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350
<210> 27
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> LysC-1多肽序列
<400> 27
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Ile Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Asp Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325 330 335
Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr
340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355 360 365
Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu
370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
420 425 430
Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 28
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> S-lysC核酸序列
<400> 28
atgggcttag ttgtgcagaa atacggcggt agtagcgtgg ccgatgccga aggcatcaaa 60
cgtgttgcca aacgcattgt tgaagccaaa aagaatggta atcaggttgt ggttgtcgtt 120
tcagcaatgg gcgataccac agatgaactt attgatctgg cccaggaagt tagcccgatt 180
ccgagcggtc gtgaatttga tatgttactt acagccggtg aacgtattag catggcctta 240
ctggccatgg caatcaaaaa tctgggtcac gaagcccaga gcttcacagg ttcacaggcc 300
ggtgttatta cagatagcgt tcataataaa gcgcgcatta tcgatgttac cccgggtcgt 360
attaaagcaa gcctggatga aggcaacatc gccattgtgg caggctttca gggtgttagc 420
caggataaaa aggatattac cacactgggt cgcggtggca gcgatacaac ggcagtggcc 480
ctggcagccg cattaaatgc agatgtttgt gaaatctata ccgatgttga tggtgttttt 540
accgcagatc cgcgcgtggt taagaaagcc cgtaaaattg aatggatctc attcgaagat 600
atgctggaat tagccagcag cggtagcaaa gttctgctgc atcgttgtgt tgaatatgca 660
cgccgttaca atattcctat tcatgttcgt tcaagttttt caggtttaca gggcacatgg 720
gttagcaatg aaccgcaggg tgatcgtccg atggaacagg caatcattag cggtgttgca 780
catgatacct cagaagcaaa agttaccgtt gttggtgttc cggataaacc gggcgaagca 840
gcacgtatct ttcgggccat tgccgattca gaagtgaata tcgacatggt ggttcagaat 900
gttagcgcag caagcaccgg tctgaccgat attagcttta ccctgccgaa agcagaaggt 960
cgtaaagcag ttgcagcact ggagaaaacc cgtgcagccg tgggctttga tagtttacgg 1020
tatgatgatc agattgcaaa aattagcctg gttggtgcag gtatgaaaac caatccgggt 1080
gtgaccgcaa ccttttttga agcattaagc aatgcaggcg ttaatattga actgattagc 1140
accagtgaaa ttcgtatcag cgttgtgacc cgcgcagatg atgttaatga agccgttcag 1200
gcagttcata gcgcatttgg tctggatagc gaaaccgatg aagcagtggt ttatggcggc 1260
acaggtcgtt aa 1272
<210> 29
<211> 425
<212> PRT
<213> 链霉菌属（Streptomyces）
<400> 29
Met Gly Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Val Ala Asp Ala
1 5 10 15
Glu Gly Ile Lys Arg Val Ala Lys Arg Ile Val Glu Ala Lys Lys Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Val Val Ala Val Val Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Ile Asp Leu Ala Glu Gln Val Ser Pro Ile Pro Ala Gly Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Met Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Met Ala Ile Lys Asn Leu Gly His Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Ile Thr Asp Ser Val His Asn Lys Ala Arg
100 105 110
Ile Ile Asp Val Thr Pro Gly Arg Ile Arg Thr Ser Val Asp Glu Gly
115 120 125
Asn Val Ala Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Ser Gln Asp Ser Lys
130 135 140
Asp Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asp Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Thr Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Pro Lys Ala Lys Lys
180 185 190
Ile Asp Trp Ile Ser Phe Glu Asp Met Leu Glu Leu Ala Ala Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Val Leu Leu His Arg Cys Val Glu Tyr Ala Arg Arg Tyr Asn
210 215 220
Ile Pro Ile His Val Arg Ser Ser Phe Ser Gly Leu Gln Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ser Ser Glu Pro Ile Lys Gln Gly Glu Lys His Val Glu Gln Ala
245 250 255
Leu Ile Ser Gly Val Ala His Asp Thr Ser Glu Ala Lys Val Thr Val
260 265 270
Val Gly Val Pro Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Arg Ala
275 280 285
Ile Ala Asp Ala Gln Val Asn Ile Asp Met Val Val Gln Asn Val Ser
290 295 300
Ala Ala Ser Thr Gly Leu Thr Asp Ile Ser Phe Thr Leu Pro Lys Ser
305 310 315 320
Glu Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ala Leu Glu Lys Asn Arg Pro Gly Ile
325 330 335
Gly Phe Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Asp Gln Ile Gly Lys Ile Ser Leu
340 345 350
Val Gly Ala Gly Met Lys Ser Asn Pro Gly Val Thr Ala Asp Phe Phe
355 360 365
Thr Ala Leu Ser Asp Ala Gly Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser
370 375 380
Glu Ile Arg Ile Ser Val Val Thr Arg Lys Asp Asp Val Asn Glu Ala
385 390 395 400
Val Arg Ala Val His Thr Ala Phe Gly Leu Asp Ser Asp Ser Asp Glu
405 410 415
Ala Val Val Tyr Gly Gly Thr Gly Arg
420 425
<210> 30
<211> 1104
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 30
atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60
atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120
ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180
gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240
atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300
ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360
gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420
ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480
taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540
catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600
gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660
ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720
gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780
gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840
aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900
tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960
gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020
ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080
cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104
<210> 31
<211> 350
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 31
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
20 25 30
Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys
50 55 60
Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu
65 70 75 80
Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp
85 90 95
Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp
100 105 110
Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg
115 120 125
Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu
130 135 140
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
145 150 155 160
Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
180 185 190
Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
210 215 220
Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg
225 230 235 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile
275 280 285
Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val
290 295 300
Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala
305 310 315 320
Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn
325 330 335
Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln
340 345 350
<210> 32
<211> 822
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 32
atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60
ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120
ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180
accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240
cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300
atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360
attgcgattg tctttgctgc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420
gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480
agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540
gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600
cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660
accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgt ctggagatca cccataaggc gtccagccgt 720
atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780
ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttgt aa 822
<210> 33
<211> 273
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 33
Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg
1 5 10 15
Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln
20 25 30
Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp
35 40 45
Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser
50 55 60
Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr
65 70 75 80
Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly
85 90 95
Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln
100 105 110
Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn
115 120 125
Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala
130 135 140
Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His
145 150 155 160
Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu
165 170 175
Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr
180 185 190
Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe
195 200 205
Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe
210 215 220
Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg
225 230 235 240
Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly
245 250 255
Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn
260 265 270
Leu
<210> 34
<211> 825
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 34
atgcagcagt tacagaacat tattgaaacc gcttttgaac gccgtgccga gatcacgcca 60
gccaatgcag acaccgttac ccgcgaagcg gtaaatcagg tgatcgccct gctggattcc 120
ggcgcactgc gtgtagcgga aaaaattgac ggtcagtggg tgacgcatca gtggttgaaa 180
aaagcggtgc tgctctcttt ccgtattaat gataatcagg tgatcgaagg ggcagaaagc 240
cgctacttcg acaaagtgcc gatgaaattc gccgactacg acgaagcacg tttccagaaa 300
gaaggcttcc gcgttgtgcc accagcggcg gtacgtcagg gtgcgtttat tgcccgtaac 360
accgtgctga tgccgtctta cgtcaacatc ggcgcatatg ttgatgaagg caccatggtt 420
gatacctggg cgaccgtcgg ttcttgtgcg cagattggta aaaacgtcca cctttccggt 480
ggcgtgggca tcggcggcgt gctggaaccg ctgcaggcta acccaaccat cattgaagat 540
aattgcttca tcggcgcgcg ctctgaagtg gttgaagggg tgattgtcga agaaggttcc 600
gtcatttcca tgggcgtata cattggtcag agcacccgta tttacgaccg tgaaaccggc 660
gaaatccact acggtcgcgt tccggcgggg tctgtggttg tttcaggtaa tctgccgtca 720
aaagatggca aatacagcct ctactgtgcg gttatcgtta agaaagttga cgcgaaaact 780
cgcggcaaag tcggcattaa cgaactgctg cgtaccatcg actaa 825
<210> 35
<211> 274
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 35
Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala
1 5 10 15
Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn
20 25 30
Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu
50 55 60
Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser
65 70 75 80
Arg Tyr Phe Asp Lys Val Pro Met Lys Phe Ala Asp Tyr Asp Glu Ala
85 90 95
Arg Phe Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val Val Pro Pro Ala Ala Val Arg
100 105 110
Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val
115 120 125
Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala
130 135 140
Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr
165 170 175
Ile Ile Glu Asp Asn Cys Phe Ile Gly Ala Arg Ser Glu Val Val Glu
180 185 190
Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile
195 200 205
Gly Gln Ser Thr Arg Ile Tyr Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile His Tyr
210 215 220
Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser
225 230 235 240
Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val
245 250 255
Asp Ala Lys Thr Arg Gly Lys Val Gly Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr
260 265 270
Ile Asp
<210> 36
<211> 1191
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 36
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60
cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120
ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180
accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240
ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300
ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360
aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420
ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480
gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540
tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600
tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660
ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720
gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780
gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840
gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900
gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960
atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020
atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080
ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140
acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191
<210> 37
<211> 396
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 37
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
20 25 30
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
35 40 45
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
130 135 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
180 185 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
275 280 285
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
290 295 300
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 315 320
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
325 330 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
340 345 350
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
355 360 365
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
370 375 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385 390 395
<210> 38
<211> 299
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 38
Met Phe Ser Gly Leu Leu Ile Ile Leu Val Pro Leu Ile Val Gly Tyr
1 5 10 15
Leu Ile Pro Leu Arg Gln Gln Ala Ala Leu Lys Val Ile Asn Gln Leu
20 25 30
Leu Ser Trp Met Val Tyr Leu Ile Leu Phe Phe Met Gly Ile Ser Leu
35 40 45
Ala Phe Leu Asp Asn Leu Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ile Leu His Tyr
50 55 60
Ser Ala Val Ser Ile Thr Val Ile Leu Leu Cys Asn Ile Ala Ala Leu
65 70 75 80
Met Trp Leu Glu Arg Gly Leu Pro Trp Arg Asn His His Gln Gln Glu
85 90 95
Lys Leu Pro Ser Arg Ile Ala Met Ala Leu Glu Ser Leu Lys Leu Cys
100 105 110
Gly Val Val Val Ile Gly Phe Ala Ile Gly Leu Ser Gly Leu Ala Phe
115 120 125
Leu Gln His Ala Thr Glu Ala Ser Glu Tyr Thr Leu Ile Leu Leu Leu
130 135 140
Phe Leu Val Gly Ile Gln Leu Arg Asn Asn Gly Met Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Ile Val Leu Asn Arg Arg Gly Met Ile Val Ala Val Val Val Val Val
165 170 175
Ser Ser Leu Ile Gly Gly Leu Ile Asn Ala Phe Ile Leu Asp Leu Pro
180 185 190
Ile Asn Thr Ala Leu Ala Met Ala Ser Gly Phe Gly Trp Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Gly Ile Leu Leu Thr Glu Ser Phe Gly Pro Val Ile Gly Ser Ala
210 215 220
Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ile Met Leu Ile
225 230 235 240
Pro Gly Leu Ile Arg Arg Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly
245 250 255
Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Thr Gly Gly
260 265 270
Leu Asp Met Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Ile Leu Ser Leu
275 280 285
Leu Val Pro Ile Leu Ile Ala Phe Phe Ser Ala
290 295
<210> 39
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 39
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa cgttattgca atattgaatc ac 52
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 40
ggctctagac cacttccctt gtacgagc 28
<210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 41
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagacagct atcgc 45
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 42
ggctctagaa ccagacgaga acttaagcc 29
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 43
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa agttaaagta ctgtccctc 49
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 44
ggctctagat tagaactggt aaaccagacc 30
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 45
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgat gaagcgcaat attctg 46
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 46
ggctctagag catttaacaa agaggtgtgc 30
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 47
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaaaattgca tgtctttcag 50
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 48
ggctctagat tagaagcggt aaccaacac 29
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 49
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagagcact ctggc 45
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 50
ggctctagat taaaactgat acgtcatgcc aac 33
<210> 51
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 51
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagttatta ccctgtacc 49
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 52
ggctctagat cagaacgagt aatttacgc 29
<210> 53
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 53
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagttaaca gtggcg 46
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 54
ggctctagat taaaaacgat atcctgctga g 31
<210> 55
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 55
ggcgaattca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatgag ctcggtaccc 60
ggggat 66
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 56
ggcagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtg 34
<210> 57
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 57
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa atctaacaat gcgctcatc 49
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 58
ggctctagat caacgacagg agcacgatc 29
<210> 59
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 59
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 引物
<400> 60
ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
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<223> 引物
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
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<223> 引物
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<212> DNA
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<223> 引物
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<212> DNA
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ggcgcatgct caacgacagg agcacgatc 29
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ggcggatcct taacgacctg tgccgccata 30
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ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48
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ggcgcatgct tagtcgatgg tacgcagca 29
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46
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ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47
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ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29
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ggcgggccct gctggccttt tgctcacat 29
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ggcggtacct caacgacagg agcacgatc 29
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ggcggtacca gtttattctt gacatgtagt gagg 34
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ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagacagct atcgc 45
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ggcaagctta ccagacgaga acttaagcc 29
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa agttaaagta ctgtccctc 49
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ggcaagcttt tagaactggt aaaccagacc 30
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgat gaagcgcaat attctg 46
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ggcaagcttg catttaacaa agaggtgtgc 30
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaaaattgca tgtctttcag 50
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ggcaagcttt tagaagcggt aaccaacac 29
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagagcact ctggc 45
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ggcaagcttt taaaactgat acgtcatgcc aac 33
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagttatta ccctgtacc 49
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ggcaagcttt cagaacgagt aatttacgc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagttaaca gtggcg 46
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ggcaagcttt taaaaacgat atcctgctga g 31
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<213> 人工序列（Artificial）
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<223> 引物
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ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt ttctgggctg ttaatca 47
<210> 102
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<213> 人工序列（Artificial）
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<223> 引物
<400> 102
ggcaagcttg atctaccgcc agagaggta 29

Claims (25)

1.一种遗传修饰的宿主细胞，其包含编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸，其中宿主细胞过表达OMP孔蛋白多肽并且相对于未修饰的对应宿主细胞具有增加的氨基酸或氨基酸衍生物的产生，其中氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺；其中OMP孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF或OmpW孔蛋白多肽且其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、6、8或16所示；其中所述宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)的宿主细胞；并且其中宿主细胞还过表达赖氨酸脱羧酶时，宿主细胞还是棒状杆菌属(Corynebacterium)的宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中表达载体包含有效地连接至启动子的异源核酸。
3.根据权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中OMP孔蛋白多肽对于宿主细胞是内源的。
4.根据权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中异源核酸整合至宿主染色体中。
5.根据权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞过表达TetA多肽。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)。
11.根据权利要求1所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶多肽。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰的宿主细胞，其中宿主细胞过表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和TetA多肽。
13.一种产生氨基酸或氨基酸衍生物的方法，所述方法包括在OMP孔蛋白多肽过表达的条件下培养权利要求1-12中任一项所述的宿主细胞，其中氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺。
14.一种工程化宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生的方法，所述方法包括将编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸导入宿主细胞中，并在表达异源OMP孔蛋白多肽的条件下培养宿主细胞，其中相对于未修饰的对应对照宿主细胞，OMP孔蛋白多肽的表达增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生，其中氨基酸是赖氨酸并且氨基酸衍生物是尸胺；其中OMP孔蛋白多肽是OmpA、OmpC、OmpF或OmpW孔蛋白多肽且其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、6、8或16所示；其中所述宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)的宿主细胞；并且其中宿主细胞还过表达赖氨酸脱羧酶时，宿主细胞还是棒状杆菌属(Corynebacterium)的宿主细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中编码OMP孔蛋白多肽的异源核酸由导入细胞中的表达载体编码，其中表达载体包含有效地连接至启动子的异源核酸。
16.根据权利要求14所述的方法，其中OMP孔蛋白多肽对于宿主细胞是内源的。
17.根据权利要求14所述的方法，其中异源核酸整合至宿主染色体中。
18.根据权利要求14所述的方法，其中宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶。
19.根据权利要求14所述的方法，其中宿主细胞过表达一种或多种赖氨酸生物合成多肽。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞过表达TetA多肽。
21.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
22.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
23.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞是蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)。
24.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶多肽。
25.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中宿主细胞过表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和TetA多肽。
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