KR20180081797A

KR20180081797A - 변형된 막 투과성

Info

Publication number: KR20180081797A
Application number: KR1020187016543A
Authority: KR
Inventors: 하워드 초우; 리준 유; 시우차이 리우
Original assignee: 케세이 알&디 센터 코퍼레이션 리미티드; 케세이 인더스트리얼 바이오테크 리미티드
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2018-07-17
Also published as: EP3374491A1; WO2017079872A1; US10501503B2; EP3374491A4; CN108368477A; KR102078732B1; CN108368477B; US20190031726A1

Abstract

본 발명은 미생물에 의한 라이신 및 라이신 유도체의 생성을 향상시키기 위해 폴리펩타이드를 과발현하도록 유전자 변형된 미생물을 제공한다. 또 본 발명은 상기 미생물을 제조하는 방법 및 상기 유전자 변형된 미생물을 사용하여 라이신 및 라이신 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

변형된 막 투과성

본 발명은 변형된 막 투과성에 관련된 것이다.

수송단백질(수송체)은 세포 내외로 화합물을 수송하여 이들 분자의 세포 내 농도에 영향을 끼치기 때문에 아미노산 및 아미노산에서 유도된 생성물의 생성에 중요하다. 세포 내부의 농도가 높으면 피드백 억제가 일어나 생성에 부정적인 영향을 미친다. 예를 들어, 라이신 생합성 동안에 lysC에서 피드백 억제가 관찰되었지만, 피드백 저항성 돌연변이체는 고농도의 라이신 존재하에서 기능을 발휘할 수 있다 (Kikuchi 등, FEMS Microbiology Letters 173 : 211-215, 1999; Ogawa- Miyata 등, Biosci.Biotechnol.Biochem.65 : 1149-1154, 2001). 이러한 피드백 저항성 돌연변이체는 보다 높은 라이신 역가를 생성할 수 있다. 분자를 세포 밖에 수송하는 것을 통해 피드백 억제의 영향을 감소시킬 수도 있다.

종래에, 라이신과 같은 아미노산 및 카다베린과 같은 아미노산 유도체의 생성에 대한 연구는 세포 대사에 관여하는 유전자의 과발현 또는 감소에 주목하여 왔다. 이러한 변형은 원하는 생성물의 생성을 유도하는 플럭스（fluxes）를 증가시키고, 부생성물 또는 원하는 생성물의 형성에 필요하지 않는 다른 대사 산물의 생성을 유도하는 플럭스를 감소시킨다. 하지만, 아미노산 및 이의 유도체의 생성을 증가시키는 기타 방법이 필요하다.

본 발명은 부분적으로는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 및 OmpW 단백질과 같은 아미노산에 특이성이 없는 외부 막 포린 단백질이 아미노산(예를 들어, 라이신 및 이의 유도체, 예를 들어, 카다베린)의 생성에 영향을 미치는 놀라운 발견을 기초로 완성되었다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 유전자 변형된 미생물을 제공하고자 하며, 상기 유전자 변형된 미생물 중 외부 막 포린 폴리펩타이드(예를 들어OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 및 OmpW)는 유전자 변형을 포함하지 않는 동일한 균주의 대응 미생물에 비해 과발현 된다. 일부 실시예에서, 미생물은 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 미생물에 도입함으로써 유전자 변형된다. 일부 실시예에서, 예를 들어, 내인성 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 복수개 카피를 게놈에 도입함으로써 및/또는 이종 프로모터를 사용하여 내인성 유전자의 발현을 증가시킴으로써 미생물을 유전자 변형시켜 내인성 외부 막 포린 폴리펩타이드를 과발현시키고자 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공하며, 여기서 숙주 세포는 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하며, 변형되지 않은 대응하는 숙주 세포에 비해 아미노산 또는 이의 유도체 생성을 증가시킨다. 일부 실시예예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 또는 OmpW 포린 폴리펩타이드이다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 성숙한 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 영역과 적어도 70%의 동일성, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 가진다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산은 세포 내로 도입된 발현 벡터에 의해 인코딩되고, 여기서 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 숙주 세포에 내인성이다. 일부 실시예에서, 이종 핵산은 숙주 염색체에 통합된다. 일부 실시예에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제 및/또는 하나 이상의 라이신 생합성 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 TetA 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균속(Escherichia), 하프니아속(Hafnia) 또는 코리네박테리움속(Corynebacterium)의 숙주 세포이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균, 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다. 일부 실시예에서, Omp 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF 또는 OmpW 폴리펩타이드이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC 및 TetA 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 라이신이고 아미노산 유도체는 카다베린이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 OMP 포린 폴리펩타이드가 과발현되는 조건하에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 아미노산 또는 이의 유도체의 제조방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 라이신이고 아미노산 유도체는 카다베린이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 아미노산 또는 이의 유도체의 생성을 증가시키기 위한 숙주 세포의 조작방법을 제공하며, 상기 방법은 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산을 숙주 세포에 도입시키고, 이종성 OMP 포린 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 변형되지 않은 대응하는 대조군의 숙주 세포에 비해 OMP 포린 폴리펩타이드의 발현은 라이신 또는 라이신 유도체의 생성을 증가시킨다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 또는 OmpW 포린 폴리펩타이드이다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 성숙한 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 영역과 적어도 70%의 동일성, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 가진다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산은 세포 내로 도입된 발현 벡터에 의해 코딩되고, 여기서 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, OMP 포린 폴리펩타이드는 숙주 세포에 내인성이다. 일부 실시예에서, 이종 핵산은 숙주 염색체에 통합된다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제 및/또는 하나 이상의 라이신 생합성 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 TetA 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균속(Escherichia), 하프니아속(Hafnia) 또는 코리네박테리움속(Corynebacterium)의 숙주 세포이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균, 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다. 일부 실시예에서, Omp 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF 또는 OmpW 폴리펩타이드이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제 폴리펩타이드와, LysC, DapA, LysA, Asd, DapB 및/또는 AspC와, TetA 폴리펩타이드를 과발현한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 라이신이고 아미노산 유도체는 카다베린이다.

도 1은 효소를 사용하여 라이신을 아미노발레레이트(aminovalerate)로 전환시키는 경로를 나타내는 개략도이다.
도 2는 효소 및 화학 촉매를 사용하여 라이신을 카프로락탐(Caprolactam)으로 전환시키는 경로를 나타내는 개략도이다.

본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 하기에서 설명하는 특정 실시예에 한정되지 않으며, 당연히 변경될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어는 특정 실시예를 설명하기 위해 사용되는 것으로, 본 발명을 한정하는 것이 아님을 이해해야 할 것이다.

별도로 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기에서 기재한 방법 및 재료는 바람직한 방법 및 재료이며 본 발명을 실천 또는 테스트하는 과정에서 본 명세서에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 언급한 모든 간행물 및 등록 번호는 인용의 방식으로 본 명세서에 병합되어, 인용한 간행물에 관련된 방법 및/또는 재료의 공개와 설명에 사용된다.

정의

본 명세서에서 사용하는 용어 "외부 막 포린" 폴리펩타이드 또는 "OMP" 폴리펩타이드는 세포 내외로 아미노산(예를 들어 라이신) 또는 아미노산 유도체(예를 들어 카다베린)를 수송하는 외부 막 수송단백질 폴리펩타이드를 가리키나, 아미노산 또는 그 유도체의 수송에 특이성을 갖지 않는다. 외부 막 포린 폴리펩타이드는 본 기술분야에 잘 알려져 있는 것으로 광범위하게 특성화되어 있다 (예를 들어, Galdiero 등, 2012 참조). 구조상의 특징으로써 8-, 14-, 16- 또는 18- 가닥의 역 평행 베타 배럴(Beta-barrel) 구조가 있다. 일반적으로 베타 가닥은 세포질 측의 베타 턴(β-turn)을 통해 다른 측의 아미노산의 긴 루프와 연결되어 있다. 복수의 박테리아 포린의 X선 구조 분석에 따르면, 투과 막 기공을 둘러싸는 8-, 12-, 14-, 16- 또는 18- 가닥의 역 평행 베타 배럴구조를 포함하고 있다. 용어 "OMP 폴리펩타이드"는 본 명세서에 기술된 특정 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 포함한다. OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 유전자, 프리-mRNA, mRNA 등을 가리키며, 본 명세서에 기술된 특정 아미노산 서열의 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 Omp 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpE, OmpG, OmpX 또는 OmpW 포린 폴리펩타이드이다.

"OmpA 포린" 폴리펩타이드는 서열번호4의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpA 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종에서 유래한 예시적인 OmpA 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_000750416.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp.); 단백질서열 등록번호 WP_005047463.1인 이질균(Shigella sp .); 단백질서열 등록번호 GAL49133.1인 시트로박터균(Citrobacter farmeri); 단백질서열 등록번호 EHB41176.1인 살모넬라 엔테리카균(Salmonella enterica); 및 단백질서열 등록번호 WP_038863759.1인 Cronobacter muytjensli를 포함한다. 바람직하게, "OmpA 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 4의 성숙한 OmpA 폴리펩티드의 적어도 약 100개, 200개, 250개 또는 300개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 기지며, 통상적으로 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpA 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpA 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpC 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpC 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpC 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_000865568. 1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp .); 단백질서열 등록번호 WP_00865596.1인 이질균(Shigella sp .); 단백질서열 등록번호 WP_032944041.1인 시트로박터 프룬디균(Citrobacter freundii); 및 단백질서열 등록번호 WP_004103993.1인 클렙시엘라균(Klebsiella sp.)을 포함한다. 바람직하게, "OmpC 포린" 폴리펩타이드는 서열번호6의 성숙한 OmpC 폴리펩티드의 적어도 약 100개, 200개, 250개 또는 300개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpC 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpC 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpF 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpF 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpF 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_001340338.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp .); 단백질서열 등록번호 WP_000977934.1인 이질균(Shigella sp .); 단백질서열 등록번호 WP_012132994.1인 시트로박터 코세리균(Citrobacter koseri); 단백질서열 등록번호 WP_032974332.1인 크로노박터 말로나티쿠스균(Cronobacter malonaticus)를 포함한다. 바람직하게, "OmpF 포린" 폴리펩타이드는 서열번호8의 성숙한 OmpF 폴리펩티드의 적어도 약 100개, 200개, 250개 또는 300개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpF 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpF 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpX 포린" 폴리펩타이드는 서열번호10의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpX 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpX 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_001295296.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp .); 단백질서열 등록번호 WP_025757391.1인 플렉스네리이질균(Shigella flexneri); 단백질서열 등록번호 WP_000716762.1인 살모넬라 속(Salmonella sp .); 단백질서열 등록번호 GAL49278.1인 시트로박터 파메리균(Citrobacter farmeri); 및 단백질서열 등록번호 WP_002895845.1인 클렙시엘라균(Klebsiella sp.)을 포함한다. 바람직하게, "OmpX 포린" 폴리펩타이드는 서열번호10의 성숙한 OmpX 폴리펩티드의 적어도 약 100개 또는 150개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpX 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpX 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpE 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpE (PhoE라고도 함) 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpE 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_000749863.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp .); 단백질서열 등록번호 WP_000749871.1인 이질균(Shigella sp .); 단백질서열 등록번호 WP_003830831.1인 시트로박터균(Citrobacter sp .); 단백질서열 등록번호 WP_000749852.1인 살모넬라 엔테리카균(Salmonella enterica)을 포함한다. 바람직하게, "OmpE 포린" 폴리펩타이드는 서열번호12의 성숙한 OmpE 폴리펩티드의 적어도 약 100개, 200개, 250개, 300개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpE 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpE 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpG 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpG 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpG 포린 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_000735257.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp.); 단백질서열 등록번호 WP_000735251.1인 이질균(Shigella sp.); 단백질서열 등록번호 WP_006684355.1인 시트로박터 용게이（Citrobacter youngae）; 단백질서열 등록번호 WP_023176364.1인 살모넬라 엔테리카균(Salmonella enterica)을 포함한다. 바람직하게, "OmpG 포린" 폴리펩타이드는 서열번호14의 성숙한 OmpG 폴리펩티드의 적어도 약 100개, 200개 또는 250개 또는 그 이상의 아미노산 영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpG 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpG 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

"OmpW 포린" 폴리펩타이드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 대장균 OmpW 폴리펩타이드의 생물활성 변이체, 대립 유전자, 돌연변이체 및 종간 동족체를 가리킨다. 기타 종 유래의 예시적인 OmpW 포린 폴리펩타이드는 단백질서열 등록번호 WP_000737226.1인 장내세균(Enterobacteriaceae sp.); 단백질서열 등록번호 WP_000737239.1인 플렉스네리이질균(Shigella flexneri); 단백질서열 등록번호 WP_016153263.1인 시트로박터균(Citrobacter sp .); 단백질서열 등록번호 WP_000714802.1인 살모넬라 엔테리카균(Salmonella enterica); 및 단백질서열 등록번호 WP_004121296.1인 클렙시엘라균(Klebsiella sp.)을 포함한다. 바람직하게, "OmpW 포린" 폴리펩타이드는 서열번호16의 성숙한 OmpW 폴리펩티드의 적어도 약 100개 또는 150개 또는 그 이상의 아미노산영역에서 또는 그 길이에서 적어도 60%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 바람직하게는 적어도 65%、70%、75%、80%、85%、90%의 아미노산 서열의 동일성을 가지며, 더 바람직하게는 91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖는다. 본 명세서에서 사용하는 "OmpW 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OmpW 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 가리킨다.

용어 OMP 폴리펩타이드의 "증가된 발현" 및 "과발현"은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되어 유전자 변형이 없는 대조군세포(즉 변형이 없는 동일한 균주의 세포)에서의 OMP 폴리펩타이드의 양과 비교하여 유전자 변형된 세포(예를 들어 OMP를 인코딩하는 발현구조가 도입된 세포)에서의 OMP 폴리펩타이드의 양이 증가된 것을 가리킨다. 본 출원의 목적을 달성하기 위해 대조군의 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 발현수준은 적어도 5%, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상이다. 변형되지 않은 세포는 OMP 폴리펩타이드를 발현할 필요가 없다. 따라서, 용어 "과발현"은 OMP 폴리펩타이드가 OMP 폴리펩타이드를 자연적으로 발현하지 않는 숙주 세포 중에서 발현하는 실시예를 더 포함한다. OMP 폴리펩타이드 발현의 증가는 여러 측정방법에 따라 평가할 수 있다. 예를 들어 OMP 폴리펩타이드 유전자로부터 전사된 RNA의 수준을 측정하는 방법, OMP 폴리펩타이드의 수준 및/또는 OMP 폴리펩타이드의 활성 수준을 측정하는 방법을 들 수 있지만 이에 한정되는 것이 아니다.

아미노산 (예를 들어, 라이신) 또는 라이신 유도체 (예를 들어, 카다베린)의 생성과 관련된 설명 중에서 용어 "강화된"은 유전자 변형이 없이 OMP 폴리펩타이드의 발현을 증가시키는 대조군의 대응하는 세포와 비교하여 라이신 또는 그 유도체의 생성이 증가된 것을 의미한다. 대조군 세포에 비해 아미노산 또는 그 유도체의 생성은 적어도 5% 증가되며, 보통 적어도 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 그 이상 증가된다.

주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열번호와 관련된 설명 중에서 사용되는 경우, 용어 "참조 번호", 또는 "상응(대응)하는" 또는 "참조로 확정된"은 주어진 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조서열과 비교될 때, 특정 참조서열의 잔기의 번호를 가리킨다. 예를 들어, 잔기가 최대정렬에서 서열번호4와 동족체 또는 변이체 비교중의 아미노산과 정렬되는 경우, OmpA 폴리펩타이드 변이체 또는 동족체의 잔기는 서열번호 4에 위치한 아미노산에 “상응(대응)한다”.

본 명세서에 사용된 "OMP 포린 폴리뉴클레오타이드"는 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 가리킨다.

용어 "폴리뉴클레오타이드"와 "핵산"은 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 5'~3' 말단에서 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중 가닥의 중합체를 가리킨다. 본 발명에서 사용하는 핵산은 일반적으로 인산디에스테르 결합(Phosphodiester bonds)을 함유하지만, 일부 경우에는 포스포로아미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 포스포디티오에이트 또는 O-메틸포스포로아미다이트 결합(O-methylphosphoroamidite linkages)을 포함하는 대체 백본(Eckstein , Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach, Oxford University Press를 참조 ); 양성 백본; 비이온 백본 및 비리보스 백본을 포함하는 핵산 유사체를 사용할 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제에 의한 정확한 통독 (read-through)을 허용하는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "핵산 서열"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 당해 분야의 기술자들에 의해 인식되는 바와 같이, 단일 가닥에 대한 설명은 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서 본 명세서에 기재된 서열은 또한 이 서열의 상보적 서열도 제공하고 있다. 달리 설명하지 않는 한, 특정 핵산서열은 명시한 서열뿐만 아니라 그의 변이체 (예를 들어, 퇴화 코돈의 치환(degenerate codon substitutions)) 및 상보적인 서열을 간접적으로 포함한다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시 리보뉴클레오타이드와 리보뉴클레오티드의 조합물 및 염기의 조합물을 포함할 수 있으며 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 이소 시토신, 이소 구아닌 등을 포함한다.

두개의 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용되는 "실질적으로 동일"이라는 용어는 참조 서열과 적어도 40%, 45% 또는 50%의 서열 동일성을 갖는 서열을 가리킨다. 동일성의 백분율은 50%~100% 중의 임의의 정수일 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 본 명세서에 기술된 프로그램(바람직하게는 하기에서 설명한 표준 파라미터를 사용하는 BLAST)을 사용하여 참조 서열과 비교할 때 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는다.

하기에 기술된 바와 같이, 최대 대응을 위해 정렬될 때 두개 서열 중의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 서열이 각각 동일하면 두 핵산서열 또는 폴리펩타이드 서열이 "동일하다"고 한다. 두개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열에 대한 설명에서 "동일" 또는 백분율의 "동일성"이라는 용어는, 비교 창에서 최대 대응의 비교와 정렬을 진행할 때, 하기 서열비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정하거나 수동 정렬 및 육안 검사를 통해 측정한 두개 이상의 서열 또는 서브서열이 동일하거나 또는 함유하고 있는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 특정 백분율이 동일한 것을 가리킨다. 단백질 또는 펩타이드와 관련하여 서열 동일성의 백분율이 사용되는 경우, 통상적으로 보존적 아미노산의 치환에 의해 부동한 잔기의 위치가 상이하다는 것을 인식한다. 여기서, 아미노산 잔기는 유사한 화학적성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 기타 아미노산 잔기로 치환되며, 따라서 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 보존적 치환에 의해 서열이 부동할 경우, 치환의 보존적 특성을 보정하기 위해 서열 동일성의 백분율을 상향 조절할 수 있다. 이러한 조절을 진행하기 위한 수단은 당업자에 잘 알려져 있다. 통상적으로 보존적 치환을 완전한 불일치가 아닌 부분적 불일치로 평가하여 서열 동일성의 백분율을 증가시킨다. 따라서, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1점을 부여하고 비보존적 치환에 0 점을 부여할 경우 보존적 치환에는 0~1사이의 점수가 부여된다.

서열의 비교에 있어서, 통상적으로 서열 하나는 참조서열로써 테스트서열과 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 테스트서열 및 참조서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 서브서열 좌표를 지정하며, 서열 알고리즘 프로그램의 파라미터를 지정한다. 기본 프로그램 파라미터를 사용하거나 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 근거하여 참조서열에 대한 테스트서열의 서열 동일성 백분율을 계산한다.

포린 폴리펩타이드가 서열번호 4, 6, 8, 12, 14 또는 16과 서 동일성을 갖는지，또는 다른 폴리펩타이드 참조서열과 서열 동일성을 갖는지 여부를 결정하는데 사용할 수 있는 알고리즘은 BLAST 알고리즘이며, 상기 BLAST 알고리즘은 본 명세서에 참고로 인용된 Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공개적으로 획득할 수 있다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 워드 사이즈 (W) 3, 기대 값 (E) 10 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 기본으로 적용한다 (Henikoff & Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915를 참조). 적용할 수 있는 또 다른 프로그램으로는 Needleman-Wunsch 프로그램(J. Mol. Biol. 48 : 443-453 (1970), BLOSUM62, 갭 시작 페널티 7 및 갭 연장 페널티 1를 적용); 및 갭트(gapped) BLAST 2.0 (Altschul, 등, 1997, Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402참조)을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 "비교 창"은 20 내지 600, 통상적으로 약 50 내지 약 200, 보다 통상적으로는 약 100 내지 약 150의 연속위치수 중의 임의의 부분을 포함하며, 여기서 두개의 서열을 최적으로 정렬한 후, 서열을 연속위치수가 동일한 참조서열과 비교할 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482 (1981)의 로컬 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 이루어질 수 있다.

참조서열과 실질적으로 동일한 핵산서열 또는 단백질서열은 "보존적으로 변형된 변이체"를 포함한다. 특정된 핵산서열을 예로, 보존적으로 변형된 변이체는 동일 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 가리키며, 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않을 경우에는 기본상 동일한 서열을 가리킨다. 유전자 코돈의 퇴행에 의해 기능적으로 동일한 대량의 핵산이 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에 있어서, 인코딩하는 폴리펩타이드를 변경하지 않는 상황하에서 코돈은 상기 임의의 대응 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종으로써 "침묵변이"(silent variation)라 한다. 본 명세서에서 폴리펩타이드를 인코딩하는 모든 핵산서열은 또 핵산의 모든 가능한 침묵변이를 포함한다. 당업자는 핵산 중의 각 코돈 (통상적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG를 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 생성하기 위해 변형될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 모든 침묵변이는 기술된 각 서열에 포함되어 있다.

아미노산 서열에 관해서, 당업자는 인코딩 서열 중의 단일 아미노산 또는 낮은 비율의 아미노산을 변경시킨 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에서의 개별적인 치환은 "보존적으로 변형된 변이체"임을 이해해야 할 것이며, 여기서 변경으로 인해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환은 본 기술분야에 잘 알려져있다. 이러한 방식으로 정의된 아미노산 그룹의 예로써 Glu (글루탐산 또는 E), Asp (아스파르트산 또는 D), Asn (아스파라긴 또는 N), Gln (글루타민 또는 Q) Lys (라이신 또는 K), Arg (아르기닌 또는 R) 및 His (히스티딘 또는 H)를 포함하는 “전하/극성을 띤 그룹” ; Pro (프롤린 또는 P), Phe (페닐알라닌 또는 F), Tyr (티로신 또는 Y) 및 Trp (트립토판 또는 W)를 포함하는 "방향족 또는 고리형 그룹"; Gly (글라이신 또는 G), Ala (알라닌 또는 A), Val (발린 또는 V), Leu (류신 또는 L), Ile (이소류신 또는 I), Met (메티오닌 또는 M), Ser (세린 또는 S), Thr (쓰레오닌 또는 T) 및 Cys (시스테인 또는 C) 를 포함하는 “지방족 그룹”이 있다. 각 그룹 내에서 서브 그룹을 나뉠 수도 있다. 예를 들어, 전하/극성을 띤 아미노산 그룹은 하기 서브그룹을 포함하는 것으로 세분될 수 있다. 즉, Lys, Arg 및 His를 포함하는 "양전하를 띤 서브 그룹"; Glu 및 Asp를 포함하는 "음전하를 띤 서브 그룹"; Asn 및 Gln을 포함하는 "극성 서브 그룹"을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 방향족 또는 고리 그룹은 하기 서브그룹을 포함하는 것으로 세분될 수 있다. 즉, Pro, His, Trp를 포함하는 "질소 환 서브그룹"; 및 Phe, Tyr을 포함하는 "페닐 서브그룹"을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 지방족 그룹은 하기 서브그룹을 포함하는 것으로 세분될 수 있다. 즉, Val, Leu, Ile를 포함하는 "대형 지방족 비극성 서브 그룹"; Met, Ser, Thr, Cys를 포함하는 "지방족 경미 극성 서브 그룹"; 및 Gly 및 Ala를 포함하는 "소형 잔기 서브 그룹"을 포함할 수 있다. 보존적 돌연변이체의 실시예로써 상기 서브그룹 내 아미노산의 아미노산 치환체가 있으며, 예를 들어 양전하를 유지할 수 있도록 Lys로 Arg를 치환하거나 반대로 Arg로 Lys를 치환하는 경우; 음전하를 유지할 수 있도록 Glu로 Asp를 치환하거나 반대로 Asp로 Glu를 치환하는 경우; 유리 -OH를 유지할 수 있도록 Ser로 Thr을 치환하거나 반대로 Thr로 Ser를 치환하는 경우; 유리 -NH2를 유지할 수 있도록 Gln으로 Asn을 치환하거나 반대로 Asn으로 Gln을 치환하는 경우를 들 수 있으나 이에 한정되는 것이 아니다. 하기 6개 그룹은 상호 보존 치환을 더 제공하는 아미노산을 각각 함유한다. 1) Ala, Ser, Thr; 2) Asp, Glu; 3) Asn, Gln; 4) Arg, Lys; 5) Ile, Leu, Met, Val; 및 6) Phe, Try, Trp (예를 들어, Creighton，Proteins(1984)를 참조).

본 명세서에서 사용하는 용어 "프로모터"는 세포에서 DNA 서열의 전사를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 폴리 뉴클레오타이드 구조물에 적용되는 프로모터는 유전자 전사의 타이밍 및/또는 속도를 제어하거나 조절하는데 참여하는 시스 작용성 및 트랜스 작용성 전사조절요소 및 조절서열을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 인핸서, 리프레서 결합 서열 등을 포함하는 시스 작용성 전사조절요소일 수 있다. 이러한 시스 작용성 서열은 통상적으로 단백질 또는 기타 생체분자와 상호 작용하여 유전자 전사(턴온/오프, 조정, 조절 등)를 진행한다. 대부분의 핵심 프로모터 서열은 번역 시작 위치의 1-2 kb에 위치하며, 보다 자주 1 kbp 이내에 위치하며, 종종 500 bp 이내 또는 200 bp이내에 위치한다. 통상적으로, 프로모터 서열은 이 프로모터 서열이 조절하는 유전자의 코딩 가닥상의 서열로써 제공된다. 본 출원의 설명에서, 프로모터는 보통 자연적으로 발현을 조절하는 유전자의 명칭으로 표현된다. 본 발명의 발현 구조물에 적용되는 프로모터는 유전자의 명칭으로 표현된다. 명칭으로 표현되는 프로모터는 야생형 천연 프로모터 및 발현을 유도하는 능력을 보유한 프로모터의 변이체를 포함한다. 명칭으로 표현되는 프로모터는 특정 종에 한정되지 않고 다른 종의 해당 유전자 유래의 프로모터도 포함한다.

본 발명에서, "구성형 프로모터"는 세포 중의 대부분 조건하에서(예를 들어 유도 분자가 존재하지 않는 상황하에서) 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 가리킨다. "유도성 프로모터"는 유도 분자의 존재하에서 전사를 개시한다.

폴리뉴클레오타이드가 외래 종에서 유래된 경우, 또는 원래 형태가 변형된 동일종에서 유래된 경우, 폴리뉴클레오타이드가 생체 또는 제2의 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 "이종"이라 한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열이 동일종에서 유래되고, 프로모터 서열은 다른 부동한 종에서 유래된 것을 가리킨다; 또는 양자가 모두 동일종에서 유래된 경우, 코딩 서열은 자연적으로 프로모터와 관련되지 않는다 (예를 들어 유전자 조작화 코딩서열, 예를 들어 동일종에서 유래한 부동한 유전자 또는 부동한 생태형 또는 품종에서 유래한 대립 유전자). 마찬가지로, 천연 야생형 숙주세포가 폴리펩타이드를 생성하지 않으면 상기 폴리펩타이드가 숙주세포에 대해 "이종"이라 한다.

용어 "외인성"은 일반적으로 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드가 야생형 세포 또는 생체에 자연적으로 존재하지 않고, 통상적으로 분자 생물학적 기술을 통해 세포 중에 도입되어, 즉 조작화를 거쳐 재조합 미생물을 생성하는 것을 가리킨다. "외인성" 폴리 뉴클레오타이드의 예로써 목적하는 단백질 또는 효소를 인코딩하는 벡터, 플라스미드 및/또는 인공 핵산 구조체가 포함된다.

용어 "내인성"은 주어진 야생형 세포 또는 생체에서 발견한 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드를 가리킨다. 이와 관련하여, 비록 생체가 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 유전자의 내인성 카피를 포함할 수 있다 하더라도, 과발현 또는 기타 방식으로 인코딩 단백질의 발현을 조절하기 위한 것과 같은 상기 서열을 인코딩하는 플라스미드 또는 벡터의 도입은, 그 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 "외인성" 카피를 가리킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 경로, 유전자 또는 효소는 "내인성" 서열을 활용하거나 의존할 수 있으며, 하나 또는 하나 이상의 "외인성" 폴리뉴클레오타이드 서열로써, 또는 양자 모두로써 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 "재조합 핵산" 또는 "재조합 폴리뉴클레오타이드"는 하기 중 적어도 하나가 사실인 핵산 중합체를 가리킨다 : (a) 핵산 서열이 주어진 숙주 세포에 대해 외인성이다 (즉, 주어진 숙주 세포 중에서 천연적으로 발견된 것이 아님); (b) 서열이 주어진 숙주 세포 중에서 천연적으로 발견될 수 있지만, 비 천연적인 (예를 들어, 예상보다 많은) 양으로 존재한다; 또는 (c) 핵산 서열이 자연계 중에서 상호 동일한 관계를 가지고 있다는 것이 밝혀지지 않은 두개 또는 그 이상의 서브 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 실시예 (c)에서, 재조합 핵산 서열은 비 관련 유전자에서 유래한 두개 또는 그 이상의 서열을 포함하며, 상기 서열은 새로운 기능성 핵산을 제조하도록 배열된다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 두개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 가리킨다. 통상적으로, 이는 전사 조절 서열과 피 전사 서열의 기능적 관계를 가리킨다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서 DNA 또는 RNA 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우, DNA 또는 RNA 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 피 전사 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절서열과 피 전사 서열은 물리적으로 연속되어 있으며, 즉 이들은 시스-작용성을 가진다. 하지만, 인핸서와 같은 일부 전사 조절서열은 물리적으로 연속되어 있을 필요가 없으며, 전사를 향상시키는 코딩 서열의 부근에 위치할 필요가 없다.

용어 "발현 카세트" 또는 "DNA 구조물" 또는 "발현 구조물"은 숙주 세포에 도입될 때 RNA 또는 폴리펩타이드의 전사 및/또는 번역을 각각 초래하는 핵산 구조물을 가리킨다. 전이 유전자의 발현일 경우, 당업자는 삽입된 폴리 뉴클레오타이드 서열이 이 서열이 유래된 유전자의 서열과 동일할 필요가 없이 다만 실질적으로 동일함을 이해해야 할 것이다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, 이들 실질적으로 동일한 변이체는 특이적 핵산서열에 대한 참조에 의해 구체적으로 커버된다. 일 실시예에서 발현 카세트는 본 발명의 단백질의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구조물이며, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 천연 프로모터와 같은 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 여기서 발현 카세트에는 이종 미생물이 도입된다. 일부 실시예에서, 발현 카세트는 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 미생물의 게놈 내의 위치를 표적으로 하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 미생물 내에 존재하는 프로모터에 의해 유도되도록 한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "숙주 세포"는 미생물을 나타내며, 본 발명의 임의의 재조합 벡터 또는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 수용체일 수 있는 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 또는 본 발명의 임의의 재조합 벡터 또는 분리된 폴리뉴클레오타이드의 수용체인 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며 자연적, 우발적 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 자손은 본래의 모 세포에 대해 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다 (형태학 또는 전체 DNA 보체에 있어서). 숙주 세포는 (형질 전환, 형질 감염 등에 의해) 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리 뉴클레오타이드가 도입된 세포를 포함한다.

용어 "분리된"은 천연상태에서 통상적으로 동반되는 성분을 기본상 또는 실질적으로 함유하지 않는 물질을 가리킨다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용하는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 천연적으로 존재하는 상태에서 또는 게놈 상태에서 양측의 서열로부터 이미 분리된 폴리뉴클레오타이드를 가리키며, 예를 들어, 벡터에 클로닝함으로써 단편과 통상적으로 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 가리킨다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 일부분이 자연환경이 아닌 벡터에 클로닝했을 경우, 또는 천연적으로 존재하는 방식과 다른 방식으로 세포 게놈에 인위적으로 도입했을 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드를 분리된 것으로 간주한다. 또는, 본 명세서에서 사용하는 "분리된 펩타이드" 또는 "분리된 폴리펩타이드" 등은 세포의 기타 성분을 포함하지 않는 폴리펩타이드 분자를 가리키는 것으로, 생체 내 물질과 무관하다.

소개

본 발명은 부분적으로, 그람 음성 박테리아와 같은 미생물 중 에서 하나 이상의 OMP 포린 폴리펩타이드의 발현이 증가될 경우 라이신과 같은 아미노산의 생성 및/또는 카다베린과 같은 아미노산 유도체의 생성을 증가시킨다는 발견에 기초하여 달성되었다. 본 발명에 따라 과발현되는 OMP 포린 폴리펩타이드는 통상적으로 8, 14 또는 16 가닥을 갖는 β-배럴형 구조의 폴리펩타이드이다.

OMP 폴린 폴리펩티드를 과발현하도록 조작된 숙주 세포는, 통상적으로 아미노산 유도체(예를들어 라이신 데카르복실라제 폴리펩타이드)를 합성하는 효소 및/또는 아미노산 생합성과 관련된 기타 폴리펩타이드를 과발현하도록 조작된다. 라이신 데카르복실라제(Lysine decarboxylase), 라이신 생합성 폴리펩티드 및 핵산 서열은 당 업계에 잘 알려져 있다.

포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드

본 발명은 다양한 통상의 재조합핵산기술을 사용한다. 일반적으로, 하기에서 기술한 재조합DNA기술의 명명법 및 실험실 절차는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 일반적으로 사용되는 것이다. 재조합DNA조작을 수행하기 위해 제공되는 여러 매뉴얼을 이용 가능하다. 예를 들어 Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (제3판, 2001); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 등, John Wiley and Sons, New York, 2009-2014).

본 발명에 적용될 수 있는 OMP 포린 핵산 및 폴리펩타이드 서열은, 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16으로 표시되는 임의의 포린 폴리펩타이드, 또는 상기 포린폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 변이체를 인코딩하는 포린 핵산 서열을 포함한다. 통상적으로 이러한 변이체는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16, 또는 대체OMP 포린 폴리펩타이드(예를 들어 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16의 공지된 동족체)중 하나와 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90%의 동일성을 가진다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "변이체"는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16과 같은 OMP 포린 폴리펩타이드 참조서열에 대해 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 생물활성 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 용어 "변이체"는 생물활성 단편 및 치환 변이체를 포함한다.

OMP 포린 폴리펩타이드는 당 업계에 잘 공지되어 있으며 OMP 포린의 구조도 광범위하게 특성화되어 있다. 이 단백질의 기공 구조는 거의 완전히 β-배럴형 구조로 구성된다. OMP 포린의 β-배럴 구조는 8~18 가닥의 역 평행 β-배럴 구조이다. 단량체 단백질은 종종(항상은 아니지만) 외부 막에 통합된 삼량체 구조를 형성한다. OMP 포린이 공유하는 기타 공동구조의 특징은 다음과 같다: 수출 중 절단되는 단백질의 N-말단에 길이가 21개 아미노산인 신호서열을 포함; 긴 소수성 신전(stretches)이 없음; 시스테인 잔기가 부족; 및 C-말단의 페닐알라닌. 예시적인 OMP 포린 폴리펩타이드 서열은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16에 제공된다. OMP 포린 폴리펩타이드의 구조적 특징은 Galdiero et al., Curr. Prot. Peptide Sci. 13 : 843-854, 2012에 개시되어 있으며, 인용의 방식으로 본 명세서에 병합된다.

당업자는, 포린 폴리펩타이드의 수송 기능을 보유할 것으로 예상되는 보존된 구조 내의 잔기 및 치환에 내성인 잔기를 동정하기 위해, 당업계에서 이용가능한 서열정렬방법 및 구조분석방법을 이용하여 포린 폴리펩타이드 변이체를 얻을 수 있다.

OMP 포린 폴리펩타이드 활성은 아미노산 또는 아미노산 유래 화합물의 수송을 평가하는 분석법을 포함하는 임의의 수량의 분석법을 이용하여 평가할 수 있다. 예시적인 분석법에서 Omp 폴리펩타이드와 함께 CadA를 공동 발현하도록 변형된 대장균에서의 카다베린의 생성을 측정한다. CadA 및 OMP 폴리펩타이드는 항생제 내성 선택마커를 갖는 동일한 플라스미드 상의 대장균에 도입된다. 항생제 내성 콜로니를 선택하여 배양한다. 그 다음, 배양액을 라이신-HCl 및 PLP(최종 농도가 각각 40g/L 및 0.1mM)의 존재하에서 37℃에서 2시간 동안 성장시킨다. 각각의 샘플로부터의 카다베린 생성물을 NMR을 이용하여 정량하고, 수율은 생성된 카다베린의 몰량을 첨가한 라이신의 몰량으로 나뉘어 계산했다. 본 발명에서 사용하는 OMP 포린 폴리펩타이드는 카다베린의 수율을 증가시킨다. 또는, 콜로니에서의 라이신 생성 또는 라이신 유도체 생성의 증가를 평가한다.

OMP 포린 폴리뉴클레오타이드 서열의 분리 또는 생성은 복수의 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 기술은 OMP 포린 유전자와 관련하여 설명할 것이다. 다만, 당업자는 동일한 기술이 또 다른 필요로 하는 유전자의 분리 및 발현에 사용될 수 있음을 이해해야 할 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명에 개시된 서열에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브는 원하는 박테리아종의 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 폴리뉴클레오타이드를 동정하는데 사용될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화되어 동일하거나 상이한 식물 종에서 상동 유전자를 분리하는 데 사용될 수 있다.

또한, 통상의 증폭기술을 이용하여 핵산 샘플로부터 원하는 핵산을 증폭시킬 수 있다. 예를 들어, PCR을 이용하여 mRNA로부터, cDNA로부터, 게놈 라이브러리로부터, 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 유전자서열을 증폭시킬 수 있다. PCR 및 기타 시험관내 증폭방법은, 예를 들어, 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산서열을 클로닝하는 데 이용될 수 있으며, 핵산을 프로브로 사용하여 샘플 중 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있으며, 핵산에 대한 시퀀싱 또는 기타 목적으로 사용할 수 있다.

박테리아 중 OMP 포린 폴리뉴클레오타이드를 식별하기 위한 적절한 프라이머 및 프로브는 본 명세서에서 제공한 서열의 비교로부터 생성될 수 있다. PCR에 대한 일반적인 개요는 PCR Protocols : Methods and Applications. (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990) 를 참조할 수 있다. 예시적인 프라이머 서열을 실시예부분의 프라이머 표에 나타내었다.

본 발명에 사용되는 외부 막 포린 핵산 서열은, 예시적인 핵산 서열을 사용하여 하이브리드화 및/또는 서열분석을 진행하는 기술에 의해 식별되고 특징화된 유전자 및 유전자 산물을 포함한다. 상기 예시적인 핵산 서열은, 예를 들어 서열번호3, 서열번호5, 서열번호7, 서열번호9, 서열번호11, 서열번호13, 또는 서열번호15를 포함한다. 일부 실시예에서, 서열번호3, 서열번호5, 서열번호7, 서열번호9, 서열번호11, 서열번호13 또는 서열번호15를 포함하는 폴리 뉴클레오타이드와 적어도 60%의 동일성, 또는 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%의 동일성, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열을 도입함으로써 숙주 세포를 유전자 변형시킨다.

OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 신호펩타이드를 인코딩하는 영역을 포함한다. 신호펩타이드는 이종 신호펩타이드일 수 있으며, 예를 들어, OmpA 포린 폴리뉴클레오타이드는 또 다른 OMP 포린 폴리펩타이드 유래의 신호펩타이드를 인코딩할 수 있거나 또 다른 박테리아의 신호펩타이드를 인코딩할 수 있다.

숙주 세포에 아미노산(예를 들어, 라이신) 또는 아미노산유도체(예를 들어, 카다베린)의 증가를 부여하는 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 원하는 숙주 세포에서의 발현에 비추어 별도로 코돈에 의해 최적화될 수 있다. 사용할 수 있는 방법 및 데이터베이스는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단일 유전자 중, 공통 기능 또는 기원을 가지는 유전자 세트 중, 고도로 발현된 유전자 중에서의 코돈의 사용; 전체 생체의 집합단백질 코딩영역에서의 코돈의 빈도; 관련 생체의 집합단백질 코딩영역에서의 코돈의 빈도; 또는 이들의 조합에 따라 바람직한 코돈을 결정할 수 있다. 예를 들어, Henaut and Danchin in "Escherichia coli and Salmonella, " Neidhardt, et al. Eds., ASM Pres, Washington D.C. (1996), pp. 2047-2066; Nucleic Acids Res. 20:2111-2118; Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292.)를 참조할 수 있다.

재조합 벡터의 제조

포린 폴리펩타이드의 발현을 위한 재조합 벡터는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열(하기에서 더 상세히 설명함)은 예측한 세포(예를 들어, 대장균세포와 같은 박테리아 세포) 중에서 유전자 서열의 전사를 지시하는 전사서열 및 기타 조절서열과 결합될 수 있다. 일부 실시예에서, 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터는 포린 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하며, 여기서 발현 카세트는 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, OMP 포린 유전자의 전사를 지시하는 프로모터 및/또는 기타 조절 요소는 숙주 세포에 대해 내인성이며, 예를 들어 상동성 재조합을 통해 포린 유전자를 포함하는 발현 카세트에 도입되어 외인성 유전자를 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결시킴으로써 내인성 프로모터에 의해 발현된다.

전술한 바와 같이, 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 발현은 구성형 또는 유도형 프로모터를 포함하는 각종 조절서열에 의해 조절될 수 있다. 또한, 필요에 따라 리프레서 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 바람직한 프로모터(특히 박테리아 숙주 세포에서)의 예로써 대장균 lac 오페론 유래 프로모터, 예를 들어 갈락토오스 및 말토즈와 같은 기타 당류의 신진대사에 관여하는 유전자 유래의 다른 프로모터를 들 수 있다. 또 다른 실시예로 trp 프로모터, bla프로모터, 박테리오파지 람다 PL 및 T5와 같은 프로모터를 포함한다. 또한, tac 프로모터 (미국 특허 제4,551,433호)와 같은 합성 프로모터를 사용할 수 있다. 프로모터의 또 다른 실시예로 스트렙토마이세스 코엘컬러(Streptomyces coelicolor) 아가레이즈 유전자(dagA), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라아제 유전자(sacB), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)α-아밀라아제 유전자(amyL), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 말토게닉 아밀라아제 유전자(amyM), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)α-아밀라아제 유전자(amyQ), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 페니실린 분해효소 유전자(penP), 고초균(Bacillus subtilis) xylA 및 xylB 유전자를 들 수 있다. 적합한 프로모터는Ausubel 및 Sambrook & Russell에 기재되어 있으며, 양자는 모두 상기와 같다. 또 다른 프로모터로써 Jensen & Hammer, Appl. Environ. Microbiol. 64:82, 1998; Shimada, et al., J. Bacteriol. 186 : 7112, 2004; 및 Miksch et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 69 : 312, 2005에 기재한 프로모터를 들 수 있다.

일부 실시예에서, 천연 OMP 포린 폴리펩타이드의 발현에 영향을 주는 프로모터는 발현을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 내인성 OmpA, OmpF, OmpC, OmpE, OmpG, OmpX 또는 OmpW 프로모터는 천연 프로모터와 비교하여 증가된 발현을 제공하는 프로모터로 대체될 수 있다.

발현 벡터는, OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 발현에 영향을 미치는 다른 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 인핸서 서열, 리보좀 결합부위, 또는 전사 종결 서열 등과 같은 다른 서열을 포함한다.

본 발명의 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 발현하는 벡터는 자율 복제 벡터일 수 있다. 즉 염색체 외 실체로 존재하는 벡터로써, 이의 복제는 염색체 복제와는 독립적인 복제이며, 예를 들어 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니 염색체 또는 인공 염색체를 포함한다. 벡터는 자체 복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 또는, 벡터는 숙주 내에 도입될 때 게놈에 통합되며 또한 이미 그 중에 통합된 염색체와 함께 복제되는 벡터일 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 벡터의 숙주 게놈에로의 통합을 허용하는 요소를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 형질전환된 숙주를 용이하게 선별할 수 있는 하나 이상의 선별마커를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 발현 벡터는 재조합 숙주 생물, 예를 들어 대장균과 같은 박테리아 세포에 항생제 내성 (예를 들어 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성)을 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.

임의의 적합한 발현 벡터를 사용하여 목적하는 서열을 통합할 수 있지만, 용이하게 이용 가능한 박테리아 발현 벡터의 예로써 pSCl01, pBR322, pBBR1MCS-3, pUR, pET, pEX, pMR100, pCR4, pBAD24, p15a, pACYC, pUC (예를 들어, pUC18 또는 pUC19)와 같은 플라스미드, 또는 이들 플라스미드로부터 유래된 플라스미드; 및 Ml3 파지, λ 파지와 같은 박테리오 파지를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것이 아니다. 당업자는 통상적인 실험을 통해 임의의 특정 발현 벡터가 임의의 주어진 숙주 세포에 적합한지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후, 벡터에 포함된 서열의 생존력 및 발현에 따라 숙주 세포를 모니터링할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는, 염화칼슘에 따른 방법, 전기 천공법, 또는 당 업계에 공지된 다른 임의의 방법을 포함하는 임의의 수량의 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다.

숙주 세포

본 발명은 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하도록 조작된 유전자 변형 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는, 임의의 비 자연발생 OMP 포린 폴리펩타이드 변이체를 포함하는 이종성 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 또는 야생형 숙주 세포와 비교하여 천연성 또는 내인성 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하도록 유전자 변형될 수 있다.

OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현시키는 숙주 세포의 유전자 변형은, 통상적으로 라이신 데카르복실라아제 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 아미노산 생합성 폴리펩타이드를 과발현하도록 숙주 세포를 변형시키는 것과 함께 수행된다.

라이신 데카르복실라아제는 L-라이신을 카다베린으로 전환시키는 효소를 가리킨다. 이 효소는 E.C. 4.1.1.18로 분류된다. 라이신 데카르복실라아제 폴리펩타이드는 충분히 특성화된 효소이며, 그 구조는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Kanjee, 등, EMBO J. 30 : 931-944, 2011 및 Lemmonier & Lane, Microbiology 144 ; 751-760, 1998; 및 이 문헌에 기재된 참조문헌을 참고). 라이신 데카르복실라아제의 EC 번호는 4.1.1.18이다. 다른 생체의 라이신 데카르복실라아제에 대한 첨부 파일을 참조한다. 예시적인 라이신 데카르복실라아제 서열은 클레브시 엘라속(Klebsiella sp.), WP 012968785.1; 엔테로박터 애로진스(Enterobacter aerogenes), YP 004592843.1; 살모넬라 엔테 리카(Salmonella enterica), WP 020936842.1; 세라 티아속(Serratia sp.), WP 033635725.1; 및 Raoultella ornithinolytica, YP 007874766.1의 CadA 동족체; 및 이질균 속(Shigella sp. ), WP 001020968.1; 시트로박터균(Citrobacter sp.), WP 016151770.1; 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), WP 001021062.1에서 유래한 LdcC 동족체이다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 라이신 데카르복실라제는 라이신 데카르복실라제 효소활성을 갖는 천연 라이신 데카르복실라제의 변이체를 포함한다. 기타 라이신 데카르복실라아제는 PCT / CN2014 / 080873 및 PCT / CN2015 / 072978에 기재되어 있다.

일부 실시예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 라이신 생합성 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 라이신 생합성 폴리펩타이드의 예로써 대장균 유전자SucA, Ppc, AspC, LysC, Asd, DapA, DapB, DapD, ArgD, DapE, DapF, LysA, Ddh, PntAB, CyoABE, GadAB, YbjE, GdhA, GltA, SucC, GadC, AcnB, PflB, ThrA, AceA, AceB, GltB, AceE, SdhA, MurE, SpeE, SpeG, PuuA, PuuP, 및 YgjG, 또는 다른 생체 유래의 상응하는 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자는 당해 기술 분야에 잘 알려져있다 (예를 들어, Shah 등, J. Med. Sci. 2 : 152-157, 2002, Anastassiadia, S. Recent Patents on Biotechnol.1 : 11-24, 2007 참조). 또한, 카다베린 생성에 관여하는 유전자의 검토( Kind, 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 : 1287-1296, 2011)를 참조할 수 있다. 라이신 생합성 폴리펩타이드를 인코딩하는 예시적인 유전자를 아래와 같이 제공한다.

단백질	유전자	EC 번호	유전자뱅크 등록번호
α-케토글루타르산 탈수소효소(SucA)	sucA	1.2.4.2	YP_489005.1
포스포에놀피루브산 카르복실라제(PPC)	ppc	4.1.1.31	AAC76938.1
아스파테이트 트랜스아민아제(AspC)	aspC	2.6.1.1	AAC74014.1
아스파테이트 키나아제(LysC)	lysC	2.7.2.4	NP_418448.1
아스파테이트 세미알데히드 탈수소효소 (Asd)	asd	1.2.1.11	AAC76458.1
디하이드로디피콜린산 신타제(DapA)	dapA	4.3.3.7	NP_416973.1
디히드로 디피콜리네이트 환원효소 (DapB)	dapB	1.17.1.8	AAC73142.1
테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제(DapD)	dapD	2.3.1.117	AAC73277.1
N-숙시닐디아미노피리메이트 아미노트랜스퍼라제(ArgD, N-succinyldiaminopimelate aminotransferase)	argD	2.6.1.11	AAC76384.1
N-석시닐디아미노피멜산 데석시닐라제(DapE)	dapE	3.5.1.18	AAC75525.1
디아미노피멜레이트 에피머라제(DapF)	dapF	5.1.1.7	AAC76812.2
디아미노피멜레이트 데카르복실라아제(LysA)	lysA	4.1.1.20	AAC75877.1
메소-디아미노피멜레이트 탈수소효소(Ddh)	ddh	NA	P04964.1
피리딘뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제(PntAB)	pntAB	NA	AAC74675.1, AAC74674.1
사이토크롬 옥시다제(CyoABE)	cyoABE	1.10.3.10	AAC73535.1, AAC73534.1, AAC73531.1
글루타메이트 데카르복실라아제(GadAB)	gadAB	4.1.1.15	AAC76542.1, AAC74566.1
L-아미노산배출수송단백질(YbjE, L-amino acid efflux transporter)	ybjE	NA	AAC73961.2
글루타메이트 탈수소효소(GdhA)	gdhA	1.4.1.4	AAC74831.1
시트르산 합성효소(GltA)	gltA	2.3.3.1/2.3.3.16	AAC73814.1
숙시닐 코엔자임 에이 합성효소 (SucC, succinyl-CoA synthetase)	sucC	6.2.1.5	AAC73822.1
글루타메이트-GABA안티포터(GadC)	gadC	NA	AAC74565.1
아코니타제 B (AcnB)	acnB	4.2.1.99	AAC73229.1
피루베이트 포르메이트-리아제(PflB)	pflB	NA	AAC73989.1
아스파테이트 키나아제 / 호모세린 탈수소효소(ThrA)	thrA	2.7.2.4	AAC73113.1
이소시트르산 리아제(AceA)	aceA	4.1.3.1	AAC76985.1
말레이트 신타제(AceB)	aceB	2.3.3.9	AAC76984.1
글루탐산 합성효소(GltB)	gltB	1.4.1.13	AAC76244.2
피루 베이트 탈수소효소 (AceE)	aceE	1.2.4.1	AAC73225.1
숙신산 탈수소효소(SdhA)	sdhA	1.3.5.1	AAC73817.1
UDP-N-아세틸뮤라모일-L-알라 닐-D-글루타메이트: 디아미노피멜레이트 리가아제(MurE)	murE	6.3.2.13	AAC73196.1
퓨트레신/카다베린 아미노프로필트랜스퍼라제(SpeE)	speE	2.5.1.16	AAC73232.1
스퍼미딘아세틸트랜스퍼라제(SpeG)	speG	NA	AAC74656.1
글루타메이트-퓨트레신/글루타메이트-카다베린 리가제(PuuA)	puuA	NA	AAC74379.2
퓨트레신 임포터(PuuP)	puuP	NA	AAC74378.2
퓨트레신/카다베린 아미노 트란스페라제(YgjG)	ygjG	2.6.1.82	AAC76108.3

라이신 탈 카복실화 효소 또는 아미노산 생합성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 OMP 포린 폴리뉴클레오타이드와 함께 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어 단일 발현 벡터 상에 인코딩되거나, 또는 동시에 복수의 발현 벡터에 도입될 수 있다. 또는, 숙주 세포를 유전자 변형시켜, 유전적으로 변형된 숙주 세포가 포린 폴리펩타이드를 과발현하기 전 또는 과발현한 후에 라이신 데카르복실라아제 또는 하나 이상의 아미노산 생합성 폴리펩타이드를 과발현하도록 할 수 있다.

선택적인 실시예에서, 자연발생 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하는 숙주 세포는 또 다른 기술에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 대장균 세포와 같은 세포를 돌연변이시키고 세포를 스크리닝하여, 변이전의 세포와 비교하여 더 높은 수준으로 OMP 포린 폴리펩타이드 (예를 들어 OmpA, OmpC, OmpF, OmpG, OmpE, OmpW, 또는 OmpX)를 발현하는 세포를 식별할 수 있다.

본 명세서에 기재한 OMP 포린 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포는 박테리아 숙주 세포이다. 대표적인 실시예에서, 박테리아 숙주 세포는 그람 음성 박테리아 숙주 세포이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 박테리아는 장내 박테리아이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 대장균(Escherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 자이모모나스(Zymomonas)속, 쉬와넬라(Shewanella)속, 살모넬라(Salmonella)속, 시겔라(Shigella)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 크로노박터(Cronobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 세라티아(Serratia)속, 프로테우스(Proteus)속, 하프니아(Hafnia)속, 예르시니아(Yersinia)속, 모르간엘라(Morganella)속, 에드워드시엘라(Edwardsiella)속 클렙시엘라(Klebsiella)속의 분류학적으로 분류한 세균이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균(Escherichia), 하프니아(Hafnia) 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 구성원이다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 대장균, 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 숙주 세포이다.

일부 실시예에서, 숙주 세포는 바실러스속(Bacillus sp.), 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)와 같은 그람 양성 박테리아 숙주 세포; 또는 바실러스 알칼로필러스(B. alcalophilus), 바실러스 아미노보란(B. aminovorans), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(B. amyloliquefaciens), B. caldolyticus, 바실러스 서큘란스(B. circulans), 바실러스 스테아로더모필러스(B. stearothermophilus), B. thermoglucosidasius, 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis )또는 B. vulgatis와 같은 또 다른 바실러스속(Bacillus sp.)의 균주이다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 아미노산(예를 들어 라이신) 또는 아미노산 유도체(예를 들어 카다베린) 생성의 증가에 따라 본 발명의 변형된 숙주 세포를 스크리닝할 수 있다.

아미노산 또는 아미노산 유도체의 제조 방법

OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포는 아미노산 또는 그의 유도체를 제조하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 라이신을 생성한다. 일부 실시예에서, 숙주 세포는 카다베린을 생성한다. 아미노산 또는 아미노산 유도체를 제조하기 위해, 본 명세서에 기술된 바와 같이 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포를 아미노산 또는 아미노산 유도체를 생산하는데 사용되는 효소를 인코딩하는 폴리펩타이드의 발현 및 유전자의 발현을 허용하기에 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 본 발명에 따라 변형된 숙주 세포는, 천연 수준에서 OMP 포린 폴리펩타이드를 발현하는 비 변형의 대응하는 숙주 세포에 비해 높은 수율의 아미노산 또는 아미노산 유도체를 제공한다.

본 분야에 공지된 기술(예를 들어, 실시예부분에서 제공한 예시적인 조건)을 이용하여 숙주 세포를 배양할 수 있다.

아미노산 또는 아미노산 유도체는 공지된 기술을 사용하여 분리하고 정제할 수 있다. 또한 본 발명에 따라 제조된 라이신 또는 라이신 유도체(예를 들어, 카다베린)를 임의의 공지된 방법에 사용할 수 있다, 예를 들어 폴리아미드를 제조하는데 사용할 수 있다.

일부 실시예에서, 효소를 사용하여 라이신을 아미노발레르산으로 전환시키거나(도1), 효소와 화학촉매를 사용하여 라이신을 카프로락탐으로 전환시킬 수 있다 (도2).

구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 설명의 목적으로 제공하며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하려는 것이 아니다. 당업자는 비 관건적인 파라미터를 변경 또는 변형하는 것을 통해 기본상 동일한 결과를 얻을 수 있음을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1 : CadA를 인코딩하는 플라스미드 벡터의 제작

PCR 프라이머 cadA-F 및 cadA-R (도 1)를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 라이신 데카르복실라제 CadA (서열번호 2)를 인코딩하는 야생형 대장균cad A (서열번호 1)를 함유하는 플라스미드 벡터를 증폭시키며, 제한효소 SacI 및 XbaI로 분해하고, pUC18에 연결시켜 플라스미드 pCIB60을 생성했다.

실시예 2 : 외부 막 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

PCR 프라이머 ompA-F 및 ompA-R 를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 막 포린 단백질인 OmpA (서열번호 4)를 인코딩하는 대장균 유전자 ompA (서열번호3)를 증폭시키고, 제한효소 SacI 및 XbaI로 분해하고, pUC18 플라스미드 벡터에 연결시켜 pCIB88을 생성했다. 유사하게, 프라이머 ompC-F 및 ompC-R을 사용하여 막 포린 단백질인 OmpC (서열번호 6)를 인코딩하는 ompC (서열번호 5)를pUC18 플라스미드 벡터 내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB89를 생성했다. 유사하게, 막 포린 단백질인 OmpF (서열번호 8)를 인코딩하는 ompF (서열번호 7)를, 프라이머 ompF-F 및 ompF-R을 사용하여 pUC18 플라스미드 벡터 내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB87을 생성했다. 유사하게, 막 포린 단백질인 OmpX (서열번호 10)를 인코딩하는 ompX (서열번호 9)를 프라이머ompX-F 및 ompX-R을 사용하여pUC18 플라스미드 벡터 내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB86을 생성했다. 유사하게, 막 포린 단백질인 OmpE (서열번호 12)를 인코딩하는 ompE (서열번호 11)를 프라이머 ompE-F 및 ompE-R을 사용하여 pUC18 플라스미드 벡터 내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB91을 생성했다. 유사하게, 막 포린 단백질인 OmpG (서열번호 14)를 인코딩하는 ompG (서열번호 13)를 프라이머 ompG-F 및 ompG-R을 사용하여 pUC18 플라스미드 벡터내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB80을 생성시켰다. 유사하게, 막 포린 단백질인 OmpW (서열번호 16)를 인코딩하는 ompW (서열번호 15)를 프라이머 ompW-F 및 ompW-R을 사용하여 pUC18 플라스미드 벡터 내에 클로닝하여 플라스미드 pCIB81을 생성했다.

실시예3 : 테트라사이클린 유출 펌프를 인코딩하는 플라스미드 벡터의 제작.

PCR 프라이머 psyn-1 및 psyn-2를 사용하여 프로모터 서열 (서열번호 17)을 합성했다. 프라이머 psyn-1은 프로모터 서열 및 pUC18에 상동인 서열을 포함하며, 프라이머 psyn-2는 pUC18에 상동인 서열을 포함한다. 이 두 PCR 프라이머를 사용하여 합성 프로모터 서열의 하류에 삽입된 플라스미드로부터 다중 클로닝 사이트를 포함하는 pUC18의 일부를 증폭시켰다. 제한 효소 EcoRI 및 ScaI를 사용하여 합성 프로모터를 포함하는 증폭된 DNA를 분해시키고, 이를 또 pUC18에 연결하여 pCIB10을 제작했다.

테트라사이클린 유출 펌프인 TetA (서열번호 19)를 인코딩하는 tetA유전자 (서열번호 18)를, PCR 프라이머 tetA-F 및 tetA-R을 사용하여 대장균 클로닝 벡터 pBR322로부터 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 제한효소 SacI 및 XbaI로 분해하고 pCIB10 플라스미드 벡터에 연결하여 pCIB20을 생성했다.

실시예 4 : 라이신 생합성 경로로부터의 세 단백질 ( LysC , DapA , LysA )을 포함하는 합성 오페론 I를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

대장균 유래의 세 유전자인 lysC, dapA 및 lysA는, 아스파테이트 키나아제(lysC에 의해 인코딩되는 LysC 또는AKIII), 디하이드로디피콜린산 신타제(dapA에 의해 인코딩되는DapA 또는 DHDPS), 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라아제 (lysA에 의해인코딩되는LysA)와 같은 대장균 라이신 생합성 경로에 관여하는 단백질을 인코딩한다. 세 유전자를 플라스미드 벡터에 클로닝하고 LysC (서열번호 21), DapA (서열번호 23) 및 LysA (서열번호 25)의 세 단백질을 대장균에서 과발현시켰다. 프라이머lysC-F 및 lysC-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 유전자 lysC를 증폭시키고, 증폭된 단편을 SacI 및 BamHI을 사용하여 분해하고, pUC18에 연결하여 pCIB7을 생성했다. 유전자 dapA는 프라이머dapA-F 및 dapA-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 증폭시키고 증폭된 단편을 BamHI 및 XbaI를 사용하여 분해하고 pCIB7에 연결하여 pCIB8을 생성했다. 유전자 lysA를 프라이머 lysA-F 및 lysA-R을 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 증폭시키고 증폭된 단편을 XbaI 및 SalI를 사용하여 분해하고 pCIB8에 연결시켜 pCIB9를 생성했다. 프라이머 lysC-F 및 lysA-R을 사용하여 pCIB9로부터 세 유전자 오페론을 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 SacI 및 SalI를 사용하여 분해하고, 분해된 단편을 pCIB10에 연결시켜 pCIB32를 생성했다. 프라이머tetA-F3 및 tetA-R3을 사용하여 pCIB20으로부터 유전자 tetA를 증폭시키고 증폭된 단편을 SbfI 및 XhoI를 사용하여 분해하고 pCIB32에 연결하여 플라스미드 pCIB42를 생성했다.

실시예5 : 다양한 아스파르트키나아제를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작. 다양한 아스파르트키나아제를 발현하여 라이신 생성을 증가시킨다.

대장균 아스파르트키나아제 Ⅲ (서열번호 20인lysC에 의해 인코딩되는 LysC 또는 AKIII)가 라이신에 대해 증가된 피드백 저항성을 가지게 하는 두 쌍의 돌연변이를 선택했다. 프라이머 318-F, 318-R, 323-F, 323-R을 사용하여 제 1 돌연변이체 LysC-1 (M318I, G323D) (서열번호 27)을 인코딩하는 유전자를 제작했다. LysC-1 (M318I, G323D)를 인코딩하는 유전자를 pCIB32에 클로닝하고 야생형 대장균 아스파르트키나아제인 LysC를 대체하여 플라스미드 pCIB43을 생성시켰다. 폴리 라이신을 생성할 수 있는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주의 아스파르트키나아제는 대장균 아스파르트키나아제와 비교하여 라이신에 대한 피드백 저항이 더 크다는 것이 이미 제안되었지만 증명되지는 않았다. 따라서, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 유래의 아스파르트키나아제 유전자를 코돈 최적화시키고, 프라이머SlysC-F 및 SlysC-R를 사용하여 합성 및 클로닝하고, pCIB32 중의 야생형 lysC를 대체하여 플라스미드 pCIB55를 생성시킨다. 수득한 아스파르트키나아제 단백질을 S-LysC (서열번호 29)로 명명했다.

실시예 6 : 라이신 생합성 경로로부터의 세 단백질 ( Asd , DapB , DapD , AspC )을 포함하는 합성 오페론 II를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

다음, 대장균의 라이신 생합성 경로에 관여하는 4개의 또 다른 유전자인 asd, dapB, dapD 및 aspC의 발현을 향상시켰다. 이들 유전자는 다음의 효소를 인코딩한다: asd에 의해 인코딩되는 아스파테이트 세미알데히드 탈수소효소 (Asd (서열번호 31),); dapB에 의해 인코딩되는 디히드로 디피콜리네이트 환원효소 (DapB 또는 DHDPR (서열번호 33)); aspD에 의해 인코딩되는 테트라히드로 디피콜리네이트 숙시닐라제(DapD(서열번호 : 35)) 및 aspC에 의해 인코딩되는 아스파테이트 트랜스아민아제 (AspC (서열번호 37),). 프라이머asd-F 및 asd-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 asd 유전자를 증폭시키고, 증폭된 단편을 SacI 및 BamHI을 사용하여 분해하고 pUC18에 연결하여 pCIB12를 생성했다. 프라이머dapB-F 및 dapB-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 유전자dapB를 증폭시키고 증폭된 단편을 BamHI 및 XbaI을 사용하여 분해하고 pCIB12에 연결하여 pCIB13을 생성했다. 프라이머dapD-F 및 dapD-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 유전자dapD를 증폭시키고 증폭된 단편을 XbaI 및 SalI를 사용하여 분해하고 pCIB13에 연결하여 pCIB14를 생성시켰다. 유사하게, 프라이머aspC-F 및 aspC-R를 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터aspC 유전자를 증폭시키고, 증폭된 단편을 XbaI 및 SalI를 사용하여 분해하고 pCIB13에 연결하여 pCIB31을 생성시켰다. 프라이머tetA-F3 및 tetA-R3을 사용하여 pCIB20으로부터 유전자 tetA를 증폭시키고, 증폭된 단편을 XhoI 및 SphI를 사용하여 분해하고 pCIB14 및 pCIB31에 각각 연결하여 플라스미드 pCIB15 및 pCIB59를 각각 생성했다.

실시예7 : 라이신 생합성 경로로부터의 단백질을 포함하는 합성 오페론 I 및 II를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

lysC, dapA, lysA, asd, dapB 및 aspC 유전자로 구성된 두 합성 오페론, 즉 합성 오페론 I 및 합성 오페론 II를 단일 벡터로 조합했다. 유전자lysC, dapA 및 lysA로 구성된 오페론을 프라이머 LAL-F 및 LAL-R을 사용하여 pCIB32로부터 증폭시켰다. 유전자 asd, dapB 및 aspC 및 tetA 유전자로 구성된 오페론을 프라이머ABC-F 및 ABCT-R를 사용하여 pCIB59로부터 증폭시켰다. 생성물을 제한효소 ApaI 및 KpnI를 사용하여 분해시켰다. pCIB32 및 pCIB59의 분해물을 연결하여 pCIB103-1을 형성했다. 유사하게, 상이한 아스파르트키나아제를 포함하는 합성오페론 I의 변이체를 합성오페론II와 결합시켰다. LysC-1을 포함하는 합성오페론 I의 변이체를 프라이머 LAL-F 및 LAL-R을 사용하여 pCIB43으로부터 증폭시키고, 분해하여 pCIB59의 분해 산물과 연결시켜 pCIB103-2를 형성했다. S-LysC를 포함하는 합성오페론 I의 변이체를 프라이머 SAL-F 및 SAL-R을 사용하여 pCIB55로부터 증폭시키고, 분해하여, pCIB59의 분해 산물과 연결하여 pCIB103-3을 형성했다.

실시예 8 : 라이신 합성 오페론 I 및 II를 과발현하는 대장균으로부터의 라이신의 생성.

대장균 MG1655 K12를 플라스미드pCIB20, pCIB103-1, pCIB103-2 또는 pCIB103-3중의 하나로 형질전환시켜, 대응하는 균주 CIB20, CIB103-1, CIB103-2 또는 CIB103-3을 제조했다(도 2). 37℃에서 4% 글루코스, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% MgSO₄, 1.6% (NH₄) ₂SO₄, 0.001% FeSO₄, 0.001% MnSO₄, 0.2% 효모 추출물, 0.05% L-메티오닌, 0.01% L-쓰레오닌, 0.005% L-이소류신, 및 테트라사이클린 (10㎍/mL)을 함유하는 배지 3mL를 사용하여 형질전환된 세 단일 콜로니를 각각 밤새 배양했다. 다음날, 각각의 배양물을 30g/L글루코스, 0.7% Ca(HCO₃)₂, 및 테트라사이클린 (10㎍/mL)을 포함하는 새로운 배지100mL에 접종하고 37℃에서 72시간동안 배양한 후 즉시 각 배양물 중의 라이신 농도를 측정했다 (표 1).

합성 오페론I 및 II를 포함하는 대장균 균주에 의한 라이신의 생성.

균주	단백질(s)	라이신 (g/L)
CIB20	TetA	n.d.
CIB103-1	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	1.0 ± 0.4
CIB103-2	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	6.6 ± 0.2
CIB103-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	6.0 ± 0.5
n.d.: 감지되지 않음

표1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 아스파르트키나아제(LysC)의 발현과 비교하여, 아스파르트키나아제의 부동한 변이체(LysC-1, LysC-2, S-LysC)의 과잉 생성은 라이신의 생성을 증가시켰다. 즉, CIB103-1이 1.0g/L인 경우와 비교하여, CIB103-2의 경우 6.6g/L, CIB103-3의 경우 6.0g/L이었다.

실시예9 : 외부 막 단백질 및 라이신 합성 오페론 I 및 II을 인코딩하는 유전자를 공동 과발현하는 대장균으로부터의 라이신 생성.

외부 막 단백질을 과발현하는 플라스미드 pCIB80, pCIB81, pCIB86, pCIB87, pCIB88, pCIB89, 또는 pCIB91중 하나를 사용하여 CIB103-3을 형질전환시켜 대응하는 균주CIB80, CIB81, CIB86, CIB87, CIB88, CIB89, 또는 CIB91를 생성했다

37℃에서, 4% 글루코스, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% MgSO₄, 1.6% (NH₄)₂SO₄, 0.001% FeSO₄, 0.001% MnSO₄, 0.2% 효모 추출물, 0.05% L-메티오닌, 0.01% L-쓰레오닌, 0.005% L-이소류신, 암피실린(100μg/mL), 및 테트라사이클린 (10㎍/mL)을 함유하는 배지 3mL을 사용하여 형질전환된 세 단일 콜로니를 각각 밤새 배양했다. 다음날, 각각의 배양물을 30g/L글루코스, 0.7%Ca (HCO₃)₂, 암피실린(100μg/mL), 및 테트라사이클린 (10㎍/mL)을 함유하는 새로운 배지100mL에 접종하고 37℃에서 72시간동안 배양한 후 즉시 각 배양물중의 라이신의 농도를 측정했다 (표 2).

라이신 합성오페론sI과 II를 포함하고 외부 막 단백질을 과잉생성하는 대장균 균주에 의한 라이신의 생성.

균주	단백질(s)	라이신 (g/L)
CIB103-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	6.0 ± 0.1
CIB80	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpG	6.3 ± 0.2
CIB81	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpW	7.1 ± 0.2
CIB86	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpX	6.7 ± 0.3
CIB87	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpF	7.0 ± 0.1
CIB88	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpA	7.6 ± 0.2
CIB89	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpC	7.3 ± 0.1
CIB91	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpE	6.0 ± 0.3

표 2에 나타난 바와 같이, 외부 막 단백질을 인코딩하는 특정 유전자의 과발현은 라이신 생성을 증가시켰다. OmpG 또는 OmpE의 과잉생성은 라이신 생성을 유의적으로 증가시키지 않았다. CIB103-3의 경우 6.2g/L, CIB80의 경우 6.0g/L, CIB91의 경우 5.9g/L이었다. OmpW, OmpX, OmpF, OmpA 및 OmpC의 과잉생성은 라이신의 생성을 증가시켰으며, OmpA의 과잉생성은 라이신의 생성의 가장 큰 증가를 나타냈다. 즉 CIB103-3이 6.2g / L인 경우와 비교하여, CIB88의 경우 7.0g / L이었다.

실시예10 : 외부 막 단백질 및 CadA를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

실시예 2에 기재된 바와 같이, 적당한 프라이머(ompA-F2, ompA-R2, ompC-F2, ompC-R2, ompE-F2, ompE-R2, ompF-F2, ompF-R2, ompG-F2, ompG-R2, ompW-F2, ompW-R2, ompX-F2, ompX-R2)를 사용하여 대장균 외부 막 유전자인 ompA, ompC,ompE, ompF, ompG, ompW, 및 ompX를 증폭시키고, XbaI 및 HindIII를 사용하여 분해한 후, pCIB60에 연결하고 라이신 데카르복실라제 유전자 cadA와 함께 외부 막 유전자를 공동 발현시켰다. cadA 및 ompA를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB120이고, cadA 및 ompC를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB132이고, cad A 및ompE를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB169이고, cadA 및 ompF를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB133이고, cadA 및 ompG를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB179이고, cadA 및 ompW를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB180이고, cadA 및 ompX를 공동 발현하는 플라스미드는 pCIB172이다.

실시예 11 : YbjE 및 CadA를 공동 발현하는 플라스미드 벡터의 제작.

ybjE는 수송체(수송단백질)로서 잠재적인 작용을 통해 라이신 생성을 증가시키는 것으로 이미 밝혀진 대장균 유전자이다 (WO / 2005 / 073390). ybjE의 과발현이 카다베린의 생성을 증가시킬 수 있는지 그 여부를 테스트했다.

막 포린 단백질인 YbjE (서열번호 39)를 인코딩하는 대장균 유전자 ybjE (서열번호 38)를, PCR 프라이머 ybjE-F 및 ybjE-R을 사용하여 대장균 MG1655 K12 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 제한효소 XbaI 및 HindIII로 분해하고 pCIB60 플라스미드 벡터에 연결하여 pCIB106을 생성했다.

실시예 12 : 외부 막 단백질 및 CadA를 공동 발현하는 대장균에 의한 카다베린의 생성.

대장균 MG1655 K12를 pCIB60, pCIB106, pCIB120, pCIB132, pCIB169, pCIB133, pCIB179, pCIB180 또는 pCIB172로 형질전환시켰다. 매 형질전환에 대해 세 콜로니를 선택하여 37℃에서, 암피실린 (100μg/mL)을 포함하는 LB배지 3mL 중에서 배양물을 밤새 배양했다. 다음날, 밤새 배양한 매 배양물 0.9mL를 각각 0.1mL 라이신-HCl 및 PLP에 최종농도가 각각 40g/L 및 0.1mM이 되도록 첨가했다. 각 혼합물을 37℃에서 2시간동안 인큐베이션했다. 각 시료로에서 생성한 카다베린 생성물을 NMR을 이용하여 정량하고, 생성된 카다베린의 몰량을 첨가된 라이신의 몰량으로 나누어서 수율을 계산했다. 각 샘플의 수율은 표3과 같다.

외부 막 단백질과 CadA를 공동 생산하는 대장균 균주에 의한 카다베린의 생성.

플라스미드	단백질(s)	카다베린 수율 ( % )
pCIB60	CadA	37.5± 5.2
pCIB106	CadA, YbjE	35.2± 3.5
pCIB120	CadA, OmpA	81.0± 4.7
pCIB132	CadA, OmpC	79.0± 4.4
pCIB169	CadA, OmpE	60.3± 3.9
pCIB133	CadA, OmpF	70.2± 5.0
pCIB179	CadA, OmpG	64.3± 3.1
pCIB180	CadA, OmpW	80.4± 5.3
pCIB172	CadA, OmpX	67.4± 6.2

표3에 나타난 바와 같이, 대장균에서 CadA뿐만 아니라 외부 막 단백질 OmpA, OmpC, OmpE, OmpF, OmpG, OmpW 및 OmpX도 더 과잉생성되는 경우, 대장균에서 CdA만 과잉생성되는 대조군에 비해 카다베린의 생성을 증가시켰다. 놀랍게도, ybjE (pCIB106)의 과발현은 카다베린의 생성을 증가시키지 않았으며, 이는 그 활성이 라이신 생성의 증가에 특이하다는 것을 나타낸다.

실시예13 . 외부 막 단백질과 CadA를 공동 발현하는 하프니아 알베이 ( H. alvei) 균에 의한 카다베린의 생성.

pCIB60, pCIB120, pCIB132, pCIB169, pCIB133, pCIB179, pCIB180 또는 pCIB172를 사용하여 H. alvei를 형질전환시켰다. 매 형질전환에 대해 세 콜로니를 선택하여 37℃에서, 암피실린 (100μg/mL)을 포함하는 LB배지 3mL 중에서 배양물을 밤새 배양했다. 다음날, 밤새 배양한 매 배양물0.9mL를 각각 0.1mL 라이신-HCl 및 PLP에 최종농도가 각각 40g/L 및 0.1mM이 되도록 첨가했다. 각 혼합물을 37℃에서 2시간동안 인큐베이션했다. 각 시료로에서 생성한 카다베린 생성물을 NMR을 이용하여 정량하고, 생성된 카다베린의 몰량을 첨가된 라이신의 몰량으로 나누어서 수율을 계산했다. 각 샘플의 수율은 표4와 같다.

외부 막 단백질과 CadA를 공동 생성하는 H. alvei 균주에 의한 카다베린의 생성.

플라스미드	단백질(s)	카다베린 수율 ( % )
pCIB60	CadA	46.7± 8.3
pCIB120	CadA, OmpA	70.1± 3.4
pCIB132	CadA, OmpC	79.6± 5.4
pCIB169	CadA, OmpE	45.5 ± 4.9
pCIB133	CadA, OmpF	59.1± 5.1
pCIB179	CadA, OmpG	50.5 ± 3.7
pCIB180	CadA, OmpW	62.5 ± 2.9
pCIB172	CadA, OmpX	45.2 ± 7.3

표4에 나타낸 바와 같이, H. alvei에서 CadA뿐만 아니라 외부 막 단백질인 OmpA, OmpC, OmpF 및 OmpW가 더 과잉생성되는 경우, CadA만 과잉생성되는 대조군에 비해 카다베린의 생성을 증가시켰다. 놀랍게도 이는 대장균 중에서 관찰된 OmpA, OmpC, OmpE, OmpF, OmpG, OmpW 및 OmpX가 모두 카다베린의 생성을 증가시키는 결과와 다르다.

실시예14 : 그람 음성 박테리아에 대한 카다베린의 억제작용.

예를 들어 Qian 등의 "생명공학 및 생물공학 (Biotechnology and Bioengineering)" 108 : 93-103, 2010에 따르면 카다베린은 그람 음성 박테리아 대장균의 성장을 억제한다. 따라서 카다베린이 그램 음성 박테리아 H. alvei에 미치는 영향을 연구했다. 우선, pCIB60를 사용하여 H. alvei를 형질전환시키고 37℃에서 암피실린 (100μg/mL)을 함유한 50mL LB배지에서 24시간동안 성장시켰다. 다음날, 7mL의 발효배지 (20g/L글루코스, 30g/L 옥수수 침지액, 10g/L 효모 추출물, 5g/L 황산 암모늄, 10g/L MgSO₄, 0.05g/L FeSO₄, 0.05g/L MnSO₄, 5g/L CaCl₂, 0.1g/L 암피실린)를 함유하는 10L 발효기에 종배양물(seed culture) 50mL를 첨가하고 18시간 동안 발효시켰다. 발효액 10g을 수집하고, 실온에서 5분 동안 6000 rpm으로 원심 분리하여 바이오매스를 회수했다. 바이오매스 0.5g을, 0% 카다베린 또는 3% 카다베린을 함유하는 인산칼륨 완충액 50mM에 첨가하여 24시간동안 배양했다. 배양 후, 각 샘플을 실온에서 5분 동안 6000 rpm으로 원심 분리하여 바이오매스를 회수하고, 라이신-HCl 및 PLP를 함유하는 새로운 인산칼륨 완충액에 최종 농도가 각각 200g/L 및 0.1mM이 되도록 첨가했다. 반응 초기 pH를 5.0으로 조절하고, 반응을 37℃에서 120분 동안 진행시켰다. 각 시료를 1.3mL씩 취하여 5분간 끓인 후 10,000rpm으로 1분간 원심분리했다. 각 시료의 카다베린 농도는 NMR을 사용하여 정량하고, 생성된 카다베린의 몰량을 첨가된 라이신의 몰량으로 나누어서 수율을 계산했다. 카다베린의 세포배양에 대한 영향은 표 5와 같다.

그람 음성 박테리아에 대한 카다베린의 억제작용.

플라스미드	카다베린 수율 ( % )
플라스미드	0% 카다베린	3% 카다베린
pCIB60	35 ± 4.9	22 ± 2.1

표 5에 나타낸 바와 같이, H. alvei세포를 이용하여 라이신을 카다베린으로 전환시키기 전에 카다베린을 포함하는 용액에서 H. alvei 세포를 배양하는 경우, 세포의 촉매로써의 작용의 발휘에 부정적인 영향을 미치고 전환 능력이 현저하게 감소되는 것이 관찰되었다. 이 데이터는 카다베린이 H. alvei를 포함하는 그람 음성 박테리아에 부정적인 영향을 끼친다는 종래의 관찰결과를 지지한다.

실시예15 : 외부 막 단백질 및 CadA를 공동 발현하는 H. alvei에 의한 카다베린의 생성

pCIB60, pCIB120, pCIB132, pCIB169, pCIB133, pCIB179, pCIB180 또는 pCIB172를 사용하여 H. alvei를 형질전환시켰다. 각 형질전환의 콜로니 하나를, 37℃에서 암피실린 (100μg/mL)을 함유한 LB배지 50mL를 사용하여 24시간동안 성장시켰다. 다음날, 7mL의 발효배지 (20g/L글루코스, 30g/L 옥수수침지액, 10g/L 효모추출물, 5g/L 황산암모늄, 10g/L MgSO₄, 0.05g/L FeSO₄, 0.05g/L MnSO₄, 5g/L CaCl₂, 0.1g/L 암피실린)을 함유하는 10L 발효기에 종 배양물 50mL를 첨가하고, 18시간 동안 발효시켰다. 발효액 10g을 수집하고 실온에서 5분 동안 6000 rpm으로 원심 분리하여 바이오매스를 회수했다. 0.5g 바이오매스를 0.1mL 라이신-HCl 및 PLP를 함유하는 인산칼륨 완충액 50mL에 최종 농도가 각각 200g/L 및 0.1mM이 되도록 첨가했다. 반응 초기 pH를 5.0으로 조절하고, 반응을 37℃에서 240분간 진행했다. 매 10~20분 간격으로 시료 1.3mL를 취하여 5분간 끓인 후 10,000 rpm로 1분간 원심분리했다. 각 시료 중의 카다베린 농도는 NMR을 사용하여 정량하고, 생성된 카다베린의 몰량을 첨가된 라이신의 몰량으로 나누어서 수율을 계산했다. 시간 경과에 따른 카다베린 수율을 플로팅하여, 각 반응의 속도를 결정했다 (표 6). 각 반응은 240분 진행되었을 때에 현저히 느려졌으며(<0.1% /분), 240분 진행되었을 때의 최대 수율을 표 6에 표시했다.

외부 막 단백질 및 CadA를 공동 발현하는 H. alvei 균주에 의한 카다베린의 생성

플라스미드	단백질(s)	속도 ( % /min)	최대 수율 ( % )
pCIB60	CadA	0.31	35
pCIB120	CadA, OmpA	0.64	45
pCIB132	CadA, OmpC	0.67	48
pCIB169	CadA, OmpE	0.30	32
pCIB133	CadA, OmpF	0.54	46
pCIB179	CadA, OmpG	0.48	38
pCIB180	CadA, OmpW	0.59	42
pCIB172	CadA, OmpX	0.44	39

표 6에 나타낸 바와 같이, 외부 막 단백질인 OmpA, OmpC, OmpF, OmpG, OmpW 및 OmpX과 CadA의 과발현은 촉매 반응의 속도를 제고시켰다. CadA 단백질의 농도는 균주의 종류에 따라 변하지 않았다(SDS-PAGE에 의해 검증). 따라서 외부 막 단백질의 과발현으로 인한 라이신 및/또는 카다베린에 대한 막 투과성의 증가로 속도의 제고가 이루어진다. 또 표 6은 외부 막 단백질 OmpA, OmpC, OmpF, OmpW 및 OmpX의 과잉생성은 최대수율을 증가시키고, 이들 단백질의 과잉생성은 카다베린에 대한 내성을 제고시켰음을 보여준다.

실시예16 : 라이신 데카르복실라아제와 라이신 합성 오페론 I 및 II를 인코딩하는 유전자를 공동 과발현하는 대장균으로부터의 카다베린의 생성.

pCIB60으로 CIB103-1, CIB103-2 및 CIB103-3을 형질전환시켜 균주 CIB60-1, CIB60-2 및 CIB60-3을 제조했다. CIB60-1, CIB60-2 및 CIB60-3은 모두 라이신 데카르복실라제 유전자 cadA 및 6개의 라이신 생합성 유전자를 인코딩하는 유전자를 발현한다. CIB60-1은 야생형 대장균 아스파르트키나아제lysC를 발현하고, CIB60-2는 돌연변이 피드백 저항성 아스파르트키나아제lysC-1을 발현하고, CIB60-3은 야생형 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans ) 아스파르트키나아제 S- lysC를 발현한다.

매 형질전환에 대해 세 단일 콜로니를 선택하여, 4% 글루코스, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% MgSO₄, 1.6% (NH₄)₂SO₄, 0.001% FeSO₄, 0.001% MnSO₄, 0.2% 효모추출물, 0.05% L-메티오닌, 0.01% L-쓰레오닌, 0.005% L-이소류신, 테트라사이클린 (10㎍/mL) 및 암피실린(100μg/mL)을 함유하는 배지 3mL를 사용하여 37℃에서 각각 밤새 배양했다. 다음날, 각각의 배양물을 30g/L글루코스, 0.7%Ca (HCO₃)₂, 테트라사이클린(10㎍/mL) 및 암피실린(100μg/mL)을 포함하는 새로운 배지 100mL에 접종하고 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 즉시 각 배양물 중의 라이신의 농도를 측정했다 (표7).

합성 오페론 I 및 II를 함유하고 CadA를 공동 생산하는 대장균 균주에 의한 라이신 및 카다베린의 생성.

균주	단백질(s)	라이신 (g/L)	카다베린 (g/L)	합계 (g/L)
CIB103-1	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	1.9 ± 0.5	n.d.	1.9
CIB103-2	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	6.2 ± 0.4	n.d.	6.2
CIB103-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	5.7 ± 0.3	n.d.	5.7
CIB60-1	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA	1.3 ± 0.2	2.5 ± 0.7	3.8
CIB60-2	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA	2.9 ± 0.4	3.7 ± 0.2	6.3
CIB60-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA	2.6 ± 0.2	3.8 ± 0.6	6.4

표7에 나타낸 바와 같이, 라이신 합성 오페론 I 및 II와 CadA의 과잉생성은 라이신과 카다베린을 생성시킨다. 또한, CadA의 과잉생성에 따라 글루코스로부터의 라이신 및 카다베린의 총 생성량이 증가된다. 이는 CIB103-1이 1.9g/L인 경우 및 CIB60-1이 3.8g/L인 경우와 비교할 때 가장 뚜렷하다. 이는, 라이신의 카다베린에로의 전환은 라이신 고농도와 관련된 피드백 억제를 제거하는 효과적인 수단임을 나타낸다.

실시예 17 : 라이신 탈 카복실화 효소와 외부 막 단백질과 라이신 합성 오페론 I 및 II를 인코딩하는 유전자를 공동 과발현하는 대장균으로부터 카다베린의 생성.

CIB103-3을 pCIB60, pCIB120, pCIB132, pCIB169, pCIB133, pCIB179, pCIB180, 또는 PCI 172를 사용하여 형질전환시켜, 대응하는 균주 CIB60-3, CIB120-3, CIB132-3, CIB169-3, CIB133-3, CIB179-3, CIB180-3, 및 pCIB172-3을 제작했다.

매 형질전환에 대해 세 단일 콜로니를 선택하고, 4% 글루코스, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% MgSO₄, 1.6% (NH₄)₂SO₄, 0.001% FeSO₄, 0.001% MnSO₄, 0.2% 효모추출물, 0.05% L-메티오닌, 0.01% L-쓰레오닌, 0.005% L-이소류신, 테트라사이클린 (10㎍/mL) 및 암피실린(100μg/mL)을 함유하는 배지 3mL를 사용하여 37℃에서 밤새 배양했다. 다음날, 각각의 배양물을 30g/L글루코스, 0.7%Ca (HCO₃)₂, 테트라 사이클린 (10㎍/mL) 및 암피실린(100μg/mL)이 포함된 새로운 배지 100mL에 접종하고 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 곧 각 배양물 중의 라이신 농도를 측정했다 (표8).

합성 오페론 I 및 II를 함유하고 CadA 및 외부 막 단백질을 공동 생성하는 대장균 균주에 의한 라이신 및 카다베린의 생성.

균주	단백질(s)	라이신 (g/L)	카다베린 (g/L)	합계 (g/L)
CIB103-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	6.0 ± 0.2	n.d.	6.0
CIB60-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA	2.8 ± 0.2	3.6 ± 0.3	6.4
CIB120-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpA	2.8 ± 0.2	4.8 ± 0.2	7.6
CIB132-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpC	3.0 ± 0.3	4.9 ± 0.3	7.9
CIB169-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpE	2.5 ± 0.2	3.3 ± 0.2	5.8
CIB133-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpF	3.2 ± 0.3	4.5 ± 0.3	7.7
CIB179-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpG	2.3 ± 0.2	3.5 ± 0.2	5.8
CIB180-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpW	3.0 ± 0.1	4.3 ± 0.2	7.3
CIB172-3	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpX	2.9 ± 0.2	4.4 ± 0.2	7.3

표 8에 나타낸 바와 같이, 라이신 합성 오페론sI 및 II을 공동 발현하는 대장균에서 CadA만 과잉생성되는 대조군과 비교하여, CadA뿐만 아니라 외부 막 단백질인 OmpA, OmpC, OmpF, OmpW 및 OmpX이 과잉생성되는 경우 라이신 및 카다베린의 총 생성량을 제고시켰다. OmpF와 OmpW의 과잉생성에 의해 라이신과 카다베린의 총생성량이 가장 많이 증가했다. CIB60-3이 6.4g/L인 경우와 비교하여 CIB132-3의 경우 7.2g / L 이었고 CIB180-3의 경우 7.4g / L이었다. 대부분의 경우에, 라이신과 카다베린 생성은 외부 막 단백질의 과잉생성에 따라 증가되었다.

실시예에서 사용된 플라스미드 표

숙주	단백질 과발현	플라스미드	균주
	CadA	pCIB60
	OmpA	pCIB88
	OmpC	pCIB89
	OmpE	pCIB91
	OmpF	pCIB87
	OmpG	pCIB80
	OmpW	pCIB81
	OmpX	pCIB86
	TetA	pCIB20
	LysC	pCIB7
	LysC, DapA	pCIB8
	LysC, DapA, LysA	pCIB9
	LysC, DapA, LysA	pCIB32
	LysC, DapA, LysA, TetA	pCIB42
	LysC-1, DapA, LysA	pCIB43
	S-LysC, DapA, LysA	pCIB55
	Asd	pCIB12
	Asd, DapB	pCIB13
	Asd, DapB, DapD	pCIB14
	Asd, DapB, AspC	pCIB31
	Asd, DapB, DapD, TetA	pCIB15
	Asd, DapB, AspC, TetA	pCIB59
	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	pCIB103-1
	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	pCIB103-2
	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA	pCIB103-3
대장균	TetA		CIB20
대장균	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA		CIB103-1
대장균	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA		CIB103-2
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA		CIB103-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpA		CIB88
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpC		CIB89
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpE		CIB91
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpF		CIB87
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpG		CIB80
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpW		CIB81
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, OmpX		CIB86
	CadA, OmpA	pCIB120
	CadA, OmpC	pCIB132
	CadA, OmpE	pCIB169
	CadA, OmpF	pCIB133
	CadA, OmpG	pCIB179
	CadA, OmpW	pCIB180
	CadA, OmpX	pCIB172
	CadA, YbjE	pCIB106
대장균	LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA		CIB60-1
대장균	LysC-1, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA		CIB60-2
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA		CIB60-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpA		CIB120-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpC		CIB132-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpE		CIB169-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpF		CIB133-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpG		CIB179-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpW		CIB180-3
대장균	S-LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC, TetA, CadA, OmpX		CIB172-3

실시예에서 사용된 프라이머 서열 표.

명칭	서열 (5’-3’)
cadA-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccatgaacgttattgcaatattgaatcac
cadA-R	ggctctagaccacttcccttgtacgagc
ompA-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAAAGACAGCTATCGC
ompA-R	ggctctagaACCAGACGAGAACTTAAGCC
ompC-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTC
ompC-R	ggctctagaTTAGAACTGGTAAACCAGACC
ompF-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGATGAAGCGCAATATTCTG
ompF-R	ggctctagaGCATTTAACAAAGAGGTGTGC
ompX-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAAAAATTGCATGTCTTTCAG
ompX-R	ggctctagaTTAGAAGCGGTAACCAACAC
ompE-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAAAGAGCACTCTGGC
ompE-R	ggctctagaTTAAAACTGATACGTCATGCCAAC
ompG-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAAAGTTATTACCCTGTACC
ompG-R	ggctctagaTCAGAACGAGTAATTTACGC
ompW-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAAAAGTTAACAGTGGCG
ompW-R	ggctctagaTTAAAAACGATATCCTGCTGAG
psyn-1	ggcgaattcagtttattcttgacatgtagtgagggggctggtataatgagctcggtacccggggat
psyn-2	ggcagtactcaaccaagtcattctgagaatagtg
tetA-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccATGAAATCTAACAATGCGCTCATC
tetA-R	ggctctagaTCAACGACAGGAGCACGATC
lysC-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccatgtctgaaattgttgtctcc
lysC-R	ggcggatccttactcaaacaaattactatgcag
dapA-F	ggcggatccacacaggaaacagaccatgttcacgggaagtattgtc
dapA-R	ggctctagattacagcaaaccggcatgc
lysA-F	ggctctagaacacaggaaacagaccatgccacattcactgttcagc
lysA-R	ggcgtcgacttaaagcaattccagcgccag
tetA-F3	ggcctcgagagtttattcttgacatgtagtgagg
tetA-R3	ggcgcatgctcaacgacaggagcacgatc
318-F	cagcctgaatatactgcattctc
318-R	gagaatgcagtatattcaggctg
323-F	gcattctcgcgatttcctcg
323-R	cgaggaaatcgcgagaatgc
SlysC-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccatgggcttagttgtgcagaaa
SlysC-R	ggcggatccttaacgacctgtgccgccata
asd-F	ggcgagctcacacaggaaacagaccatgaaaaatgttggttttatcgg
asd-R	ggcggatccttacgccagttgacgaagc
dapB-F	ggcacacaggaaacagaccatgcatgatgcaaacatccg
dapB-R	ggctctagattacaaattattgagatcaagtacatctc-
dapD-F	ggctctagaacacaggaaacagaccatgcagcagttacagaacat
dapD-R	ggcgcatgcttagtcgatggtacgcagca
aspC-F	ggctctagaacacaggaaacagaccatgtttgagaacattaccgcc
aspC-R	ggcgcatgcgacctcgaggtagtcgacttacagcactgccacaatcg
LAL-F	ggcggtaccagtttattcttgacatgtagtgagg
LAL-R	ggcgggcccttaaagcaattccagcgcca
ABC-F	ggcgggccctgctggccttttgctcacat
ABCT-R	ggcggtacctcaacgacaggagcacgatc
SAL-F	ggcggtaccagtttattcttgacatgtagtgagg
SAL-R	ggcgggcccttaaagcaattccagcgcca
ompA-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAAAGACAGCTATCGC
ompA-R2	ggcaagcttACCAGACGAGAACTTAAGCC
ompC-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTC
ompC-R2	ggcaagcttTTAGAACTGGTAAACCAGACC
ompF-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGATGAAGCGCAATATTCTG
ompF-R2	ggcaagcttGCATTTAACAAAGAGGTGTGC
ompX-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAAAAATTGCATGTCTTTCAG
ompX-R2	ggcaagcttTTAGAAGCGGTAACCAACAC
ompE-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAAAGAGCACTCTGGC
ompE-R2	ggcaagcttTTAAAACTGATACGTCATGCCAAC
ompG-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAAAGTTATTACCCTGTACC
ompG-R2	ggcaagcttTCAGAACGAGTAATTTACGC
ompW-F2	ggctctagaacacaggaaacagaccATGAAAAAGTTAACAGTGGCG
ompW-R2	ggcaagcttTTAAAAACGATATCCTGCTGAG
ybjE-F	ggctctagaacacaggaaacagaccATGTTTTCTGGGCTGTTAATCA
ybjE-R	ggcaagcttGATCTACCGCCAGAGAGGTA

실시예에서 사용된 프라이머 서열 표.

예시적인 서열

서열번호 1 대장균cadA 핵산 서열

ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA

서열번호 2 CadA 폴리펩타이드 서열

MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQA DGRYTVKVLKEESKK

서열번호 3 대장균ompA핵산 서열

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCTCCGAAAGATAACACCTGGTACACTGGTGCTAAACTGGGCTGGTCCCAGTACCATGACACTGGTTTCATCAACAACAATGGCCCGACCCATGAAAACCAACTGGGCGCTGGTGCTTTTGGTGGTTACCAGGTTAACCCGTATGTTGGCTTTGAAATGGGTTACGACTGGTTAGGTCGTATGCCGTACAAAGGCAGCGTTGAAAACGGTGCATACAAAGCTCAGGGCGTTCAACTGACCGCTAAACTGGGTTACCCAATCACTGACGACCTGGACATCTACACTCGTCTGGGTGGCATGGTATGGCGTGCAGACACTAAATCCAACGTTTATGGTAAAAACCACGACACCGGCGTTTCTCCGGTCTTCGCTGGCGGTGTTGAGTACGCGATCACTCCTGAAATCGCTACCCGTCTGGAATACCAGTGGACCAACAACATCGGTGACGCACACACCATCGGCACTCGTCCGGACAACGGCATGCTGAGCCTGGGTGTTTCCTACCGTTTCGGTCAGGGCGAAGCAGCTCCAGTAGTTGCTCCGGCTCCAGCTCCGGCACCGGAAGTACAGACCAAGCACTTCACTCTGAAGTCTGACGTTCTGTTCAACTTCAACAAAGCAACCCTGAAACCGGAAGGTCAGGCTGCTCTGGATCAGCTGTACAGCCAGCTGAGCAACCTGGATCCGAAAGACGGTTCCGTAGTTGTTCTGGGTTACACCGACCGCATCGGTTCTGACGCTTACAACCAGGGTCTGTCCGAGCGCCGTGCTCAGTCTGTTGTTGATTACCTGATCTCCAAAGGTATCCCGGCAGACAAGATCTCCGCACGTGGTATGGGCGAATCCAACCCGGTTACTGGCAACACCTGTGACAACGTGAAACAGCGTGCTGCACTGATCGACTGCCTGGCTCCGGATCGTCGCGTAGAGATCGAAGTTAAAGGTATCAAAGACGTTGTAACTCAGCCGCAGGCTTAA

서열번호 4 OmpA 폴리펩타이드 서열 ( 밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다)

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA

서열번호 5 대장균ompC 핵산 서열

ATGAAAGTTAAAGTACTGTCCCTCCTGGTCCCAGCTCTGCTGGTAGCAGGCGCAGCAAACGCTGCTGAAGTTTACAACAAAGACGGCAACAAATTAGATCTGTACGGTAAAGTAGACGGCCTGCACTATTTCTCTGACAACAAAGATGTAGATGGCGACCAGACCTACATGCGTCTTGGCTTCAAAGGTGAAACTCAGGTTACTGACCAGCTGACCGGTTACGGCCAGTGGGAATATCAGATCCAGGGCAACAGCGCTGAAAACGAAAACAACTCCTGGACCCGTGTGGCATTCGCAGGTCTGAAATTCCAGGATGTGGGTTCTTTCGACTACGGTCGTAACTACGGCGTTGTTTATGACGTAACTTCCTGGACCGACGTACTGCCAGAATTCGGTGGTGACACCTACGGTTCTGACAACTTCATGCAGCAGCGTGGTAACGGCTTCGCGACCTACCGTAACACTGACTTCTTCGGTCTGGTTGACGGCCTGAACTTTGCTGTTCAGTACCAGGGTAAAAACGGCAACCCATCTGGTGAAGGCTTTACTAGTGGCGTAACTAACAACGGTCGTGACGCACTGCGTCAAAACGGCGACGGCGTCGGCGGTTCTATCACTTATGATTACGAAGGTTTCGGTATCGGTGGTGCGATCTCCAGCTCCAAACGTACTGATGCTCAGAACACCGCTGCTTACATCGGTAACGGCGACCGTGCTGAAACCTACACTGGTGGTCTGAAATACGACGCTAACAACATCTACCTGGCTGCTCAGTACACCCAGACCTACAACGCAACTCGCGTAGGTTCCCTGGGTTGGGCGAACAAAGCACAGAACTTCGAAGCTGTTGCTCAGTACCAGTTCGACTTCGGTCTGCGTCCGTCCCTGGCTTACCTGCAGTCTAAAGGTAAAAACCTGGGTCGTGGCTACGACGACGAAGATATCCTGAAATATGTTGATGTTGGTGCTACCTACTACTTCAACAAAAACATGTCCACCTACGTTGACTACAAAATCAACCTGCTGGACGACAACCAGTTCACTCGTGACGCTGGCATCAACACTGATAACATCGTAGCTCTGGGTCTGGTTTACCAGTTCTAA

서열번호 6 OmpC 폴리펩타이드 서열 (밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다)

MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVDGLHYFSDNKDVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTGYGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDVGSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGKNGNPSGEGFTSGVTNNGRDALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGGAISSSKRTDAQNTAAYIGNGDRAETYTGGLKYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQNFEAVAQYQFDFGLRPSLAYLQSKGKNLGRGYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDDNQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF

서열번호 7 대장균ompF핵산 서열

ATGAAGCGCAATATTCTGGCAGTGATCGTCCCTGCTCTGTTAGTAGCAGGTACTGCAAACGCTGCAGAAATCTATAACAAAGATGGCAACAAAGTAGATCTGTACGGTAAAGCTGTTGGTCTGCATTATTTTTCCAAGGGTAACGGTGAAAACAGTTACGGTGGCAATGGCGACATGACCTATGCCCGTCTTGGTTTTAAAGGGGAAACTCAAATCAATTCCGATCTGACCGGTTATGGTCAGTGGGAATATAACTTCCAGGGTAACAACTCTGAAGGCGCTGACGCTCAAACTGGTAACAAAACGCGTCTGGCATTCGCGGGTCTTAAATACGCTGACGTTGGTTCTTTCGATTACGGCCGTAACTACGGTGTGGTTTATGATGCACTGGGTTACACCGATATGCTGCCAGAATTTGGTGGTGATACTGCATACAGCGATGACTTCTTCGTTGGTCGTGTTGGCGGCGTTGCTACCTATCGTAACTCCAACTTCTTTGGTCTGGTTGATGGCCTGAACTTCGCTGTTCAGTACCTGGGTAAAAACGAGCGTGACACTGCACGCCGTTCTAACGGCGACGGTGTTGGCGGTTCTATCAGCTACGAATACGAAGGCTTTGGTATCGTTGGTGCTTATGGTGCAGCTGACCGTACCAACCTGCAAGAAGCTCAACCTCTTGGCAACGGTAAAAAAGCTGAACAGTGGGCTACTGGTCTGAAGTACGACGCGAACAACATCTACCTGGCAGCGAACTACGGTGAAACCCGTAACGCTACGCCGATCACTAATAAATTTACAAACACCAGCGGCTTCGCCAACAAAACGCAAGACGTTCTGTTAGTTGCGCAATACCAGTTCGATTTCGGTCTGCGTCCGTCCATCGCTTACACCAAATCTAAAGCGAAAGACGTAGAAGGTATCGGTGATGTTGATCTGGTGAACTACTTTGAAGTGGGCGCAACCTACTACTTCAACAAAAACATGTCCACCTATGTTGACTACATCATCAACCAGATCGATTCTGACAACAAACTGGGCGTAGGTTCAGACGACACCGTTGCTGTGGGTATCGTTTACCAGTTCTAA

서열번호 8 OmpF 폴리펩타이드 서열 (밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다)

MKRNILAVIVPALLVAGTANAAEIYNKDGNKVDLYGKAVGLHYFSKGNGENSYGGNGDMTYARLGFKGETQINSDLTGYGQWEYNFQGNNSEGADAQTGNKTRLAFAGLKYADVGSFDYGRNYGVVYDALGYTDMLPEFGGDTAYSDDFFVGRVGGVATYRNSNFFGLVDGLNFAVQYLGKNERDTARRSNGDGVGGSISYEYEGFGIVGAYGAADRTNLQEAQPLGNGKKAEQWATGLKYDANNIYLAANYGETRNATPITNKFTNTSGFANKTQDVLLVAQYQFDFGLRPSIAYTKSKAKDVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNKNMSTYVDYIINQIDSDNKLGVGSDDTVAVGIVYQF

서열번호 9 대장균ompX 핵산 서열

ATGAAAAAAATTGCATGTCTTTCAGCACTGGCCGCAGTTCTGGCTTTCACCGCAGGTACTTCCGTAGCTGCGACTTCTACTGTAACTGGCGGTTACGCACAGAGCGACGCTCAGGGCCAAATGAACAAAATGGGCGGTTTCAACCTGAAATACCGCTATGAAGAAGACAACAGCCCGCTGGGTGTGATCGGTTCTTTCACTTACACCGAGAAAAGCCGTACTGCAAGCTCTGGTGACTACAACAAAAACCAGTACTACGGCATCACTGCTGGTCCGGCTTACCGCATTAACGACTGGGCAAGCATCTACGGTGTAGTGGGTGTGGGTTATGGTAAATTCCAGACCACTGAATACCCGACCTACAAACACGACACCAGCGACTACGGTTTCTCCTACGGTGCGGGTCTGCAGTTCAACCCGATGGAAAACGTTGCTCTGGACTTCTCTTACGAGCAGAGCCGTATTCGTAGCGTTGACGTAGGCACCTGGATTGCCGGTGTTGGTTACCGCTTCTAA

서열번호 10 OmpX 폴리펩타이드 서열 ( 밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다 )

MKKIACLSALAAVLAFTAGTSVAATSTVTGGYAQSDAQGQMNKMGGFNLKYRYEEDNSPLGVIGSFTYTEKSRTASSGDYNKNQYYGITAGPAYRINDWASIYGVVGVGYGKFQTTEYPTYKHDTSDYGFSYGAGLQFNPMENVALDFSYEQSRIRSVDVGTWIAGVGYRF

서열번호 11 대장균ompE 핵산 서열

ATGAAAAAGAGCACTCTGGCATTAGTGGTGATGGGCATTGTGGCATCTGCATCTGTACAGGCTGCAGAAATATATAATAAAGACGGTAATAAACTGGATGTCTATGGCAAAGTTAAAGCCATGCATTATATGAGTGATAACGCCAGTAAAGATGGCGACCAGAGTTATATCCGTTTTGGTTTCAAAGGCGAAACACAAATTAACGATCAACTGACTGGTTATGGTCGTTGGGAAGCAGAGTTTGCCGGTAATAAAGCAGAGAGTGATACTGCACAGCAAAAAACGCGTCTCGCTTTTGCCGGGTTGAAATATAAAGATTTGGGTTCTTTCGATTATGGTCGTAACCTGGGGGCGTTGTATGACGTGGAAGCCTGGACCGATATGTTCCCGGAATTTGGTGGCGATTCCTCGGCGCAGACCGACAACTTTATGACCAAACGCGCCAGCGGTCTGGCGACGTATCGGAACACCGACTTCTTCGGCGTTATCGATGGCCTGAACTTAACCCTGCAATATCAAGGGAAAAACGAAAACCGCGACGTTAAAAAGCAAAACGGCGATGGCTTCGGCACGTCATTGACATATGACTTTGGCGGCAGCGATTTCGCCATTAGTGGGGCCTATACCAACTCAGATCGCACCAACGAGCAGAACCTGCAAAGCCGTGGCACAGGCAAGCGTGCAGAAGCATGGGCAACAGGTCTGAAATACGATGCCAATAATATTTATCTGGCAACTTTCTATTCTGAAACACGCAAAATGACGCCAATAACTGGCGGCTTTGCCAATAAGACACAGAACTTTGAAGCGGTCGCTCAATACCAGTTTGACTTTGGTCTGCGTCCATCGCTGGGTTATGTCTTATCGAAAGGGAAAGATATTGAAGGTATCGGTGATGAAGATCTGGTCAATTATATCGACGTCGGTGCTACGTATTATTTCAACAAAAATATGTCAGCGTTTGTTGATTATAAAATCAACCAACTGGATAGCGATAACAAATTGAATATTAATAATGATGATATTGTCGCGGTTGGCATGACGTATCAGTTTTAA

서열번호 12 OmpE 폴리펩타이드 서열 (밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다)

MKKSTLALVVMGIVASASVQAAEIYNKDGNKLDVYGKVKAMHYMSDNASKDGDQSYIRFGFKGETQINDQLTGYGRWEAEFAGNKAESDTAQQKTRLAFAGLKYKDLGSFDYGRNLGALYDVEAWTDMFPEFGGDSSAQTDNFMTKRASGLATYRNTDFFGVIDGLNLTLQYQGKNENRDVKKQNGDGFGTSLTYDFGGSDFAISGAYTNSDRTNEQNLQSRGTGKRAEAWATGLKYDANNIYLATFYSETRKMTPITGGFANKTQNFEAVAQYQFDFGLRPSLGYVLSKGKDIEGIGDEDLVNYIDVGATYYFNKNMSAFVDYKINQLDSDNKLNINNDDIVAVGMTYQF

서열번호 13 대장균ompG 핵산 서열

ATGAAAAAGTTATTACCCTGTACCGCACTGGTGATGTGTGCGGGAATGGCCTGCGCACAGGCCGAGGAAAGGAACGACTGGCACTTTAATATCGGCGCGATGTACGAAATAGAAAACGTCGAGGGTTATGGCGAAGATATGGATGGGCTGGCGGAGCCTTCAGTCTATTTTAATGCCGCCAACGGGCCGTGGAGAATTGCTCTGGCCTATTATCAGGAAGGGCCGGTAGATTATAGCGCGGGTAAACGTGGAACGTGGTTTGATCGCCCGGAGCTGGAGGTGCATTATCAGTTCCTCGAAAACGATGATTTCAGTTTCGGCCTGACCGGCGGTTTCCGTAATTATGGTTATCACTACGTTGATGAACCGGGTAAAGACACGGCGAATATGCAGCGCTGGAAAATCGCGCCAGACTGGGATGTGAAACTGACTGACGATTTACGTTTCAACGGTTGGTTGTCGATGTATAAATTTGCCAACGATCTGAACACTACCGGTTACGCTGATACCCGTGTCGAAACGGAAACAGGTCTGCAATATACCTTCAACGAAACGGTTGCCTTGCGAGTGAACTATTATCTCGAGCGCGGCTTCAATATGGACGACAGCCGCAATAACGGTGAGTTTTCCACGCAAGAAATTCGCGCCTATTTGCCGCTGACGCTCGGCAACCACTCGGTGACGCCGTATACGCGCATTGGGCTGGATCGCTGGAGTAACTGGGACTGGCAGGATGATATTGAACGTGAAGGCCATGATTTTAACCGTGTAGGTTTATTTTACGGTTATGATTTCCAGAACGGACTTTCCGTTTCGCTGGAATACGCGTTTGAGTGGCAGGATCACGACGAAGGCGACAGTGATAAATTCCATTATGCAGGTGTCGGCGTAAATTACTCGTTCTGA

서열번호 14 OmpG 폴리펩타이드 서열 ( 밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다 )

MKKLLPCTALVMCAGMACAQAEERNDWHFNIGAMYEIENVEGYGEDMDGLAEPSVYFNAANGPWRIALAYYQEGPVDYSAGKRGTWFDRPELEVHYQFLENDDFSFGLTGGFRNYGYHYVDEPGKDTANMQRWKIAPDWDVKLTDDLRFNGWLSMYKFANDLNTTGYADTRVETETGLQYTFNETVALRVNYYLERGFNMDDSRNNGEFSTQEIRAYLPLTLGNHSVTPYTRIGLDRWSNWDWQDDIEREGHDFNRVGLFYGYDFQNGLSVSLEYAFEWQDHDEGDSDKFHYAGVGVNYSF

서열번호 15 대장균ompW 핵산 서열

ATGAAAAAGTTAACAGTGGCGGCTTTGGCAGTAACAACTCTTCTCTCTGGCAGTGCCTTTGCGCATGAAGCAGGCGAATTTTTTATGCGTGCAGGTTCTGCAACCGTACGTCCAACAGAAGGTGCTGGTGGTACGTTAGGAAGTCTGGGTGGATTCAGCGTGACCAATAACACGCAACTGGGCCTTACGTTTACTTATATGGCGACCGACAACATTGGTGTGGAATTACTGGCAGCGACGCCGTTCCGCCATAAAATCGGCACCCGGGCGACCGGCGATATTGCAACCGTTCATCATCTGCCACCAACACTGATGGCGCAGTGGTATTTTGGTGATGCCAGCAGCAAATTCCGTCCTTACGTTGGGGCAGGTATTAACTACACCACCTTCTTTGATAATGGATTTAACGATCATGGCAAAGAGGCAGGGCTTTCCGATCTCAGTCTGAAAGATTCCTGGGGAGCTGCCGGGCAGGTGGGGGTTGATTATCTGATTAACCGTGACTGGTTGGTTAACATGTCAGTGTGGTACATGGATATCGATACCACCGCCAATTATAAGCTGGGCGGTGCACAGCAACACGATAGCGTACGCCTCGATCCGTGGGTGTTTATGTTCTCAGCAGGATATCGTTTTTAA

서열번호 16 OmpW 폴리펩타이드 서열 ( 밑줄 친 서열은 성숙한 단백질에서 절단되는 신호 펩타이드이다)

MKKLTVAALAVTTLLSGSAFAHEAGEFFMRAGSATVRPTEGAGGTLGSLGGFSVTNNTQLGLTFTYMATDNIGVELLAATPFRHKIGTRATGDIATVHHLPPTLMAQWYFGDASSKFRPYVGAGINYTTFFDNGFNDHGKEAGLSDLSLKDSWGAAGQVGVDYLINRDWLVNMSVWYMDIDTTANYKLGGAQQHDSVRLDPWVFMFSAGYRF

서열번호 17 합성 프로모터 핵산 서열

AGTTTATTCTTGACATGTAGTGAGGGGGCTGGTATAAT

서열번호 18 tetA 핵산 서열

ATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCATTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGA

서열번호 19 TetA 폴리펩타이드 서열

MKSNNALIVILGTVTLDAVGIGLVMPVLPGLLRDIVHSDSIASHYGVLLALYALMQFLCAPVLGALSDRFGRRPVLLASLLGATIDYAIMATTPVLWILYAGRIVAGITGATGAVAGAYIADITDGEDRARHFGLMSACFGVGMVAGPVAGGLLGAISLHAPFLAAAVLNGLNLLLGCFLMQESHKGERRPMPLRAFNPVSSFRWARGMTIVAALMTVFFIMQLVGQVPAALWVIFGEDRFRWSATMIGLSLAVFGILHALAQAFVTGPATKRFGEKQAIIAGMAADALGYVLLAFATRGWMAFPIMILLASGGIGMPALQAMLSRQVDDDHQGQLQGSLAALTSLTSIIGPLIVTAIYAASASTWNGLAWIVGAALYLVCLPALRRGAWSRATST

서열번호 20 lysC 핵산 서열

ATGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATGAACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTTGTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCTGAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATCCGCAACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATCCGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAAGCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAGCTGGTCAGCCACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTTGAGATCCTGCGCGAACGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACCAACGACCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATATAGCCGCGCTGGCGGAACTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGTCTCAATGAAGGCTTAGTGATCACCCAGGGATTTATCGGTAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTTGGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTACACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACCACCGATCCACGCGTAGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCGTTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCATCCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCGGTCTTTGTCGGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGGTGTGCAATAAAACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCTCTGGCGCTTCGTCGCAATCAGACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATGCTGCATTCTCGCGGTTTCCTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGACTTAATCACCACGTCAGAAGTGAGCGTGGCATTAACCCTTGATACCACCGGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCTCTGCTGATGGAGCTTTCCGCACTGTGTCGGGTGGAGGTGGAAGAAGGTCTGGCGCTGGTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGTCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAAGAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTATGGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCCGAGCAGGTGGTGCAAAAACTGCATAGTAATTTGTTTGAGTAA

서열번호 21 LysC 폴리펩타이드 서열

MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNMLHSRGFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE

서열번호 22 dapA 핵산 서열

ATGTTCACGGGAAGTATTGTCGCGATTGTTACTCCGATGGATGAAAAAGGTAATGTCTGTCGGGCTAGCTTGAAAAAACTGATTGATTATCATGTCGCCAGCGGTACTTCGGCGATCGTTTCTGTTGGCACCACTGGCGAGTCCGCTACCTTAAATCATGACGAACATGCTGATGTGGTGATGATGACGCTGGATCTGGCTGATGGGCGCATTCCGGTAATTGCCGGGACCGGCGCTAACGCTACTGCGGAAGCCATTAGCCTGACGCAGCGCTTCAATGACAGTGGTATCGTCGGCTGCCTGACGGTAACCCCTTACTACAATCGTCCGTCGCAAGAAGGTTTGTATCAGCATTTCAAAGCCATCGCTGAGCATACTGACCTGCCGCAAATTCTGTATAATGTGCCGTCCCGTACTGGCTGCGATCTGCTCCCGGAAACGGTGGGCCGTCTGGCGAAAGTAAAAAATATTATCGGAATCAAAGAGGCAACAGGGAACTTAACGCGTGTAAACCAGATCAAAGAGCTGGTTTCAGATGATTTTGTTCTGCTGAGCGGCGATGATGCGAGCGCGCTGGACTTCATGCAATTGGGCGGTCATGGGGTTATTTCCGTTACGGCTAACGTCGCAGCGCGTGATATGGCCCAGATGTGCAAACTGGCAGCAGAAGGGCATTTTGCCGAGGCACGCGTTATTAATCAGCGTCTGATGCCATTACACAACAAACTATTTGTCGAACCCAATCCAATCCCGGTGAAATGGGCATGTAAGGAACTGGGTCTTGTGGCGACCGATACGCTGCGCCTGCCAATGACACCAATCACCGACAGTGGTCGTGAGACGGTCAGAGCGGCGCTTAAGCATGCCGGTTTGCTGTAA

서열번호 23 DapA 폴리펩타이드 서열

MFTGSIVAIVTPMDEKGNVCRASLKKLIDYHVASGTSAIVSVGTTGESATLNHDEHADVVMMTLDLADGRIPVIAGTGANATAEAISLTQRFNDSGIVGCLTVTPYYNRPSQEGLYQHFKAIAEHTDLPQILYNVPSRTGCDLLPETVGRLAKVKNIIGIKEATGNLTRVNQIKELVSDDFVLLSGDDASALDFMQLGGHGVISVTANVAARDMAQMCKLAAEGHFAEARVINQRLMPLHNKLFVEPNPIPVKWACKELGLVATDTLRLPMTPITDSGRETVRAALKHAGLL

서열번호 24 lysA 핵산 서열

ATGCCACATTCACTGTTCAGCACCGATACCGATCTCACCGCCGAAAATCTGCTGCGTTTGCCCGCTGAATTTGGCTGCCCGGTGTGGGTCTACGATGCGCAAATTATTCGTCGGCAGATTGCAGCGCTGAAACAGTTTGATGTGGTGCGCTTTGCACAGAAAGCCTGTTCCAATATTCATATTTTGCGCTTAATGCGTGAGCAGGGCGTGAAAGTGGATTCCGTCTCGTTAGGCGAAATAGAGCGTGCGTTGGCGGCGGGTTACAATCCGCAAACGCACCCCGATGATATTGTTTTTACGGCAGATGTTATCGATCAGGCGACGCTTGAACGCGTCAGTGAATTGCAAATTCCGGTGAATGCGGGTTCTGTTGATATGCTCGACCAACTGGGCCAGGTTTCGCCAGGGCATCGGGTATGGCTGCGCGTTAATCCGGGGTTTGGTCACGGACATAGCCAAAAAACCAATACCGGTGGCGAAAACAGCAAGCACGGTATCTGGTACACCGATCTGCCCGCCGCACTGGACGTGATACAACGTCATCATCTGCAGCTGGTCGGCATTCACATGCACATTGGTTCTGGCGTTGATTATGCCCATCTGGAACAGGTGTGTGGTGCTATGGTGCGTCAGGTCATCGAATTCGGTCAGGATTTACAGGCTATTTCTGCGGGCGGTGGGCTTTCTGTTCCTTATCAACAGGGTGAAGAGGCGGTTGATACCGAACATTATTATGGTCTGTGGAATGCCGCGCGTGAGCAAATCGCCCGCCATTTGGGCCACCCTGTGAAACTGGAAATTGAACCGGGTCGCTTCCTGGTAGCGCAGTCTGGCGTATTAATTACTCAGGTGCGGAGCGTCAAACAAATGGGGAGCCGCCACTTTGTGCTGGTTGATGCCGGGTTCAACGATCTGATGCGCCCGGCAATGTACGGTAGTTACCACCATATCAGTGCCCTGGCAGCTGATGGTCGTTCTCTGGAACACGCGCCAACGGTGGAAACCGTCGTCGCCGGACCGTTATGTGAATCGGGCGATGTCTTTACCCAGCAGGAAGGGGGAAATGTTGAAACCCGCGCCTTGCCGGAAGTGAAGGCAGGTGATTATCTGGTACTGCATGATACAGGGGCATATGGCGCATCAATGTCATCCAACTACAATAGCCGTCCGCTGTTACCAGAAGTTCTGTTTGATAATGGTCAGGCGCGGTTGATTCGCCGTCGCCAGACCATCGAAGAATTACTGGCGCTGGAATTGCTTTAA

서열번호 25 LysA 폴리펩타이드 서열

MPHSLFSTDTDLTAENLLRLPAEFGCPVWVYDAQIIRRQIAALKQFDVVRFAQKACSNIHILRLMREQGVKVDSVSLGEIERALAAGYNPQTHPDDIVFTADVIDQATLERVSELQIPVNAGSVDMLDQLGQVSPGHRVWLRVNPGFGHGHSQKTNTGGENSKHGIWYTDLPAALDVIQRHHLQLVGIHMHIGSGVDYAHLEQVCGAMVRQVIEFGQDLQAISAGGGLSVPYQQGEEAVDTEHYYGLWNAAREQIARHLGHPVKLEIEPGRFLVAQSGVLITQVRSVKQMGSRHFVLVDAGFNDLMRPAMYGSYHHISALAADGRSLEHAPTVETVVAGPLCESGDVFTQQEGGNVETRALPEVKAGDYLVLHDTGAYGASMSSNYNSRPLLPEVLFDNGQARLIRRRQTIEELLALELL

서열번호 26 lysC -1 핵산 서열

TGTCTGAAATTGTTGTCTCCAAATTTGGCGGTACCAGCGTAGCTGATTTTGACGCCATGAACCGCAGCGCTGATATTGTGCTTTCTGATGCCAACGTGCGTTTAGTTGTCCTCTCGGCTTCTGCTGGTATCACTAATCTGCTGGTCGCTTTAGCTGAAGGACTGGAACCTGGCGAGCGATTCGAAAAACTCGACGCTATCCGCAACATCCAGTTTGCCATTCTGGAACGTCTGCGTTACCCGAACGTTATCCGTGAAGAGATTGAACGTCTGCTGGAGAACATTACTGTTCTGGCAGAAGCGGCGGCGCTGGCAACGTCTCCGGCGCTGACAGATGAGCTGGTCAGCCACGGCGAGCTGATGTCGACCCTGCTGTTTGTTGAGATCCTGCGCGAACGCGATGTTCAGGCACAGTGGTTTGATGTACGTAAAGTGATGCGTACCAACGACCGATTTGGTCGTGCAGAGCCAGATATAGCCGCGCTGGCGGAACTGGCCGCGCTGCAGCTGCTCCCACGTCTCAATGAAGGCTTAGTGATCACCCAGGGATTTATCGGTAGCGAAAATAAAGGTCGTACAACGACGCTTGGCCGTGGAGGCAGCGATTATACGGCAGCCTTGCTGGCGGAGGCTTTACACGCATCTCGTGTTGATATCTGGACCGACGTCCCGGGCATCTACACCACCGATCCACGCGTAGTTTCCGCAGCAAAACGCATTGATGAAATCGCGTTTGCCGAAGCGGCAGAGATGGCAACTTTTGGTGCAAAAGTACTGCATCCGGCAACGTTGCTACCCGCAGTACGCAGCGATATCCCGGTCTTTGTCGGCTCCAGCAAAGACCCACGCGCAGGTGGTACGCTGATGTGCAATAAAACTGAAAATCCGCCGCTGTTCCGCGCTCTGGCGCTTCGTCGCAATCAGACTCTGCTCACTTTGCACAGCCTGAATATACTGCATTCTCGCGATTTCCTCGCGGAAGTTTTCGGCATCCTCGCGCGGCATAATATTTCGGTAGACTTAATCACCACGTCAGAAGTGAGCGTGGCATTAACCCTTGATACCACCGGTTCAACCTCCACTGGCGATACGTTGCTGACGCAATCTCTGCTGATGGAGCTTTCCGCACTGTGTCGGGTGGAGGTGGAAGAAGGTCTGGCGCTGGTCGCGTTGATTGGCAATGACCTGCCAAAAGCCTGCGGCGTTGGCAAAGAGGTATTCGGCGTACTGGAACCGTTCAACATTCGCATGATTTGTTATGGCGCATCCAGCCATAACCTGTGCTTCCTGGTGCCCGGCGAAGATGCCGAGCAGGTGGTGCAAAAACTGCATAGTAATTTGTTTGAGTAA

서열번호 27 LysC -1 폴리펩타이드 서열

MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNILHSRDFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE

서열번호 28 S - lysC 핵산 서열

ATGGGCTTAGTTGTGCAGAAATACGGCGGTAGTAGCGTGGCCGATGCCGAAGGCATCAAACGTGTTGCCAAACGCATTGTTGAAGCCAAAAAGAATGGTAATCAGGTTGTGGTTGTCGTTTCAGCAATGGGCGATACCACAGATGAACTTATTGATCTGGCCCAGGAAGTTAGCCCGATTCCGAGCGGTCGTGAATTTGATATGTTACTTACAGCCGGTGAACGTATTAGCATGGCCTTACTGGCCATGGCAATCAAAAATCTGGGTCACGAAGCCCAGAGCTTCACAGGTTCACAGGCCGGTGTTATTACAGATAGCGTTCATAATAAAGCGCGCATTATCGATGTTACCCCGGGTCGTATTAAAGCAAGCCTGGATGAAGGCAACATCGCCATTGTGGCAGGCTTTCAGGGTGTTAGCCAGGATAAAAAGGATATTACCACACTGGGTCGCGGTGGCAGCGATACAACGGCAGTGGCCCTGGCAGCCGCATTAAATGCAGATGTTTGTGAAATCTATACCGATGTTGATGGTGTTTTTACCGCAGATCCGCGCGTGGTTAAGAAAGCCCGTAAAATTGAATGGATCTCATTCGAAGATATGCTGGAATTAGCCAGCAGCGGTAGCAAAGTTCTGCTGCATCGTTGTGTTGAATATGCACGCCGTTACAATATTCCTATTCATGTTCGTTCAAGTTTTTCAGGTTTACAGGGCACATGGGTTAGCAATGAACCGCAGGGTGATCGTCCGATGGAACAGGCAATCATTAGCGGTGTTGCACATGATACCTCAGAAGCAAAAGTTACCGTTGTTGGTGTTCCGGATAAACCGGGCGAAGCAGCACGTATCTTTCGGGCCATTGCCGATTCAGAAGTGAATATCGACATGGTGGTTCAGAATGTTAGCGCAGCAAGCACCGGTCTGACCGATATTAGCTTTACCCTGCCGAAAGCAGAAGGTCGTAAAGCAGTTGCAGCACTGGAGAAAACCCGTGCAGCCGTGGGCTTTGATAGTTTACGGTATGATGATCAGATTGCAAAAATTAGCCTGGTTGGTGCAGGTATGAAAACCAATCCGGGTGTGACCGCAACCTTTTTTGAAGCATTAAGCAATGCAGGCGTTAATATTGAACTGATTAGCACCAGTGAAATTCGTATCAGCGTTGTGACCCGCGCAGATGATGTTAATGAAGCCGTTCAGGCAGTTCATAGCGCATTTGGTCTGGATAGCGAAACCGATGAAGCAGTGGTTTATGGCGGCACAGGTCGTTAA

서열번호 29 S - LysC 폴리펩타이드 서열

MGLVVQKYGGSSVADAEGIKRVAKRIVEAKKNGNQVVAVVSAMGDTTDELIDLAEQVSPIPAGRELDMLLTAGERISMALLAMAIKNLGHEAQSFTGSQAGVITDSVHNKARIIDVTPGRIRTSVDEGNVAIVAGFQGVSQDSKDITTLGRGGSDTTAVALAAALDADVCEIYTDVDGVFTADPRVVPKAKKIDWISFEDMLELAASGSKVLLHRCVEYARRYNIPIHVRSSFSGLQGTWVSSEPIKQGEKHVEQALISGVAHDTSEAKVTVVGVPDKPGEAAAIFRAIADAQVNIDMVVQNVSAASTGLTDISFTLPKSEGRKAIDALEKNRPGIGFDSLRYDDQIGKISLVGAGMKSNPGVTADFFTALSDAGVNIELISTSEIRISVVTRKDDVNEAVRAVHTAFGLDSDSDEAVVYGGTGR

서열번호 30 asd 핵산 서열

ATGAAAAATGTTGGTTTTATCGGCTGGCGCGGTATGGTCGGCTCCGTTCTCATGCAACGCATGGTTGAAGAGCGCGACTTCGACGCCATTCGCCCTGTCTTCTTTTCTACTTCTCAGCTTGGCCAGGCTGCGCCGTCTTTTGGCGGAACCACTGGCACACTTCAGGATGCCTTTGATCTGGAGGCGCTAAAGGCCCTCGATATCATTGTGACCTGTCAGGGCGGCGATTATACCAACGAAATCTATCCAAAGCTTCGTGAAAGCGGATGGCAAGGTTACTGGATTGACGCAGCATCGTCTCTGCGCATGAAAGATGACGCCATCATCATTCTTGACCCCGTCAATCAGGACGTCATTACCGACGGATTAAATAATGGCATCAGGACTTTTGTTGGCGGTAACTGTACCGTAAGCCTGATGTTGATGTCGTTGGGTGGTTTATTCGCCAATGATCTTGTTGATTGGGTGTCCGTTGCAACCTACCAGGCCGCTTCCGGCGGTGGTGCGCGACATATGCGTGAGTTATTAACCCAGATGGGCCATCTGTATGGCCATGTGGCAGATGAACTCGCGACCCCGTCCTCTGCTATTCTCGATATCGAACGCAAAGTCACAACCTTAACCCGTAGCGGTGAGCTGCCGGTGGATAACTTTGGCGTGCCGCTGGCGGGTAGCCTGATTCCGTGGATCGACAAACAGCTCGATAACGGTCAGAGCCGCGAAGAGTGGAAAGGGCAGGCGGAAACCAACAAGATCCTCAACACATCTTCCGTAATTCCGGTAGATGGTTTATGTGTGCGTGTCGGGGCATTGCGCTGCCACAGCCAGGCATTCACTATTAAATTGAAAAAAGATGTGTCTATTCCGACCGTGGAAGAACTGCTGGCTGCGCACAATCCGTGGGCGAAAGTCGTTCCGAACGATCGGGAAATCACTATGCGTGAGCTAACCCCAGCTGCCGTTACCGGCACGCTGACCACGCCGGTAGGCCGCCTGCGTAAGCTGAATATGGGACCAGAGTTCCTGTCAGCCTTTACCGTGGGCGACCAGCTGCTGTGGGGGGCCGCGGAGCCGCTGCGTCGGATGCTTCGTCAACTGGCGTAA

서열번호 31 Asd 폴리펩타이드 서열

MKNVGFIGWRGMVGSVLMQRMVEERDFDAIRPVFFSTSQLGQAAPSFGGTTGTLQDAFDLEALKALDIIVTCQGGDYTNEIYPKLRESGWQGYWIDAASSLRMKDDAIIILDPVNQDVITDGLNNGIRTFVGGNCTVSLMLMSLGGLFANDLVDWVSVATYQAASGGGARHMRELLTQMGHLYGHVADELATPSSAILDIERKVTTLTRSGELPVDNFGVPLAGSLIPWIDKQLDNGQSREEWKGQAETNKILNTSSVIPVDGLCVRVGALRCHSQAFTIKLKKDVSIPTVEELLAAHNPWAKVVPNDREITMRELTPAAVTGTLTTPVGRLRKLNMGPEFLSAFTVGDQ

서열번호 32 dapB 핵산 서열

ATGCATGATGCAAACATCCGCGTTGCCATCGCGGGAGCCGGGGGGCGTATGGGCCGCCAGTTGATTCAGGCGGCGCTGGCATTAGAGGGCGTGCAGTTGGGCGCTGCGCTGGAGCGTGAAGGATCTTCTTTACTGGGCAGCGACGCCGGTGAGCTGGCCGGAGCCGGGAAAACAGGCGTTACCGTGCAAAGCAGCCTCGATGCGGTAAAAGATGATTTTGATGTGTTTATCGATTTTACCCGTCCGGAAGGTACGCTGAACCATCTCGCTTTTTGTCGCCAGCATGGCAAAGGGATGGTGATCGGCACTACGGGGTTTGACGAAGCCGGTAAACAAGCAATTCGTGACGCCGCTGCCGATATTGCGATTGTCTTTGCTGCCAATTTTAGCGTTGGCGTTAACGTCATGCTTAAGCTGCTGGAGAAAGCAGCCAAAGTGATGGGTGACTACACCGATATCGAAATTATTGAAGCACATCATAGACATAAAGTTGATGCGCCGTCAGGCACCGCACTGGCAATGGGAGAGGCGATCGCCCACGCCCTTGATAAAGATCTGAAAGATTGCGCGGTCTACAGTCGTGAAGGCCACACCGGTGAACGTGTGCCTGGCACCATTGGTTTTGCCACCGTGCGTGCAGGTGACATCGTTGGTGAACATACCGCGATGTTTGCCGATATTGGCGAGCGTCTGGAGATCACCCATAAGGCGTCCAGCCGTATGACATTTGCTAACGGCGCGGTAAGATCGGCTTTGTGGTTGAGTGGTAAGGAAAGCGGTCTTTTTGATATGCGAGATGTACTTGATCTCAATAATTTGTAA

서열번호 33 DapB 폴리펩타이드 서열

MHDANIRVAIAGAGGRMGRQLIQAALALEGVQLGAALEREGSSLLGSDAGELAGAGKTGVTVQSSLDAVKDDFDVFIDFTRPEGTLNHLAFCRQHGKGMVIGTTGFDEAGKQAIRDAAADIAIVFAANFSVGVNVMLKLLEKAAKVMGDYTDIEIIEAHHRHKVDAPSGTALAMGEAIAHALDKDLKDCAVYSREGHTGERVPGTIGFATVRAGDIVGEHTAMFADIGERLEITHKASSRMTFANGAVRSALWLSGKESGLFDMRDVLDLNNL

서열번호 34 dapD 핵산 서열

ATGCAGCAGTTACAGAACATTATTGAAACCGCTTTTGAACGCCGTGCCGAGATCACGCCAGCCAATGCAGACACCGTTACCCGCGAAGCGGTAAATCAGGTGATCGCCCTGCTGGATTCCGGCGCACTGCGTGTAGCGGAAAAAATTGACGGTCAGTGGGTGACGCATCAGTGGTTGAAAAAAGCGGTGCTGCTCTCTTTCCGTATTAATGATAATCAGGTGATCGAAGGGGCAGAAAGCCGCTACTTCGACAAAGTGCCGATGAAATTCGCCGACTACGACGAAGCACGTTTCCAGAAAGAAGGCTTCCGCGTTGTGCCACCAGCGGCGGTACGTCAGGGTGCGTTTATTGCCCGTAACACCGTGCTGATGCCGTCTTACGTCAACATCGGCGCATATGTTGATGAAGGCACCATGGTTGATACCTGGGCGACCGTCGGTTCTTGTGCGCAGATTGGTAAAAACGTCCACCTTTCCGGTGGCGTGGGCATCGGCGGCGTGCTGGAACCGCTGCAGGCTAACCCAACCATCATTGAAGATAATTGCTTCATCGGCGCGCGCTCTGAAGTGGTTGAAGGGGTGATTGTCGAAGAAGGTTCCGTCATTTCCATGGGCGTATACATTGGTCAGAGCACCCGTATTTACGACCGTGAAACCGGCGAAATCCACTACGGTCGCGTTCCGGCGGGGTCTGTGGTTGTTTCAGGTAATCTGCCGTCAAAAGATGGCAAATACAGCCTCTACTGTGCGGTTATCGTTAAGAAAGTTGACGCGAAAACTCGCGGCAAAGTCGGCATTAACGAACTGCTGCGTACCATCGACTAA

서열번호 35 DapD 폴리펩타이드 서열

MQQLQNIIETAFERRAEITPANADTVTREAVNQVIALLDSGALRVAEKIDGQWVTHQWLKKAVLLSFRINDNQVIEGAESRYFDKVPMKFADYDEARFQKEGFRVVPPAAVRQGAFIARNTVLMPSYVNIGAYVDEGTMVDTWATVGSCAQIGKNVHLSGGVGIGGVLEPLQANPTIIEDNCFIGARSEVVEGVIVEEGSVISMGVYIGQSTRIYDRETGEIHYGRVPAGSVVVSGNLPSKDGKYSLYCAVIVKKVDAKTRGKVGINELLRTID

서열번호 36 aspC 핵산 서열

ATGTTTGAGAACATTACCGCCGCTCCTGCCGACCCGATTCTGGGCCTGGCCGATCTGTTTCGTGCCGATGAACGTCCCGGCAAAATTAACCTCGGGATTGGTGTCTATAAAGATGAGACGGGCAAAACCCCGGTACTGACCAGCGTGAAAAAGGCTGAACAGTATCTGCTCGAAAATGAAACCACCAAAAATTACCTCGGCATTGACGGCATCCCTGAATTTGGTCGCTGCACTCAGGAACTGCTGTTTGGTAAAGGTAGCGCCCTGATCAATGACAAACGTGCTCGCACGGCACAGACTCCGGGGGGCACTGGCGCACTACGCGTGGCTGCCGATTTCCTGGCAAAAAATACCAGCGTTAAGCGTGTGTGGGTGAGCAACCCAAGCTGGCCGAACCATAAGAGCGTCTTTAACTCTGCAGGTCTGGAAGTTCGTGAATACGCTTATTATGATGCGGAAAATCACACTCTTGACTTCGATGCACTGATTAACAGCCTGAATGAAGCTCAGGCTGGCGACGTAGTGCTGTTCCATGGCTGCTGCCATAACCCAACCGGTATCGACCCTACGCTGGAACAATGGCAAACACTGGCACAACTCTCCGTTGAGAAAGGCTGGTTACCGCTGTTTGACTTCGCTTACCAGGGTTTTGCCCGTGGTCTGGAAGAAGATGCTGAAGGACTGCGCGCTTTCGCGGCTATGCATAAAGAGCTGATTGTTGCCAGTTCCTACTCTAAAAACTTTGGCCTGTACAACGAGCGTGTTGGCGCTTGTACTCTGGTTGCTGCCGACAGTGAAACCGTTGATCGCGCATTCAGCCAAATGAAAGCGGCGATTCGCGCTAACTACTCTAACCCACCAGCACACGGCGCTTCTGTTGTTGCCACCATCCTGAGCAACGATGCGTTACGTGCGATTTGGGAACAAGAGCTGACTGATATGCGCCAGCGTATTCAGCGTATGCGTCAGTTGTTCGTCAATACGCTGCAGGAAAAAGGCGCAAACCGCGACTTCAGCTTTATCATCAAACAGAACGGCATGTTCTCCTTCAGTGGCCTGACAAAAGAACAAGTGCTGCGTCTGCGCGAAGAGTTTGGCGTATATGCGGTTGCTTCTGGTCGCGTAAATGTGGCCGGGATGACACCAGATAACATGGCTCCGCTGTGCGAAGCGATTGTGGCAGTGCTGTAA

서열번호 37 AspC 폴리펩타이드 서열

MFENITAAPADPILGLADLFRADERPGKINLGIGVYKDETGKTPVLTSVKKAEQYLLENETTKNYLGIDGIPEFGRCTQELLFGKGSALINDKRARTAQTPGGTGALRVAADFLAKNTSVKRVWVSNPSWPNHKSVFNSAGLEVREYAYYDAENHTLDFDALINSLNEAQAGDVVLFHGCCHNPTGIDPTLEQWQTLAQLSVEKGWLPLFDFAYQGFARGLEEDAEGLRAFAAMHKELIVASSYSKNFGLYNERVGACTLVAADSETVDRAFSQMKAAIRANYSNPPAHGASVVATILSNDALRAIWEQELTDMRQRIQRMRQLFVNTLQEKGANRDFSFIIKQNGMFSFSGLTKEQVLRLREEFGVYAVASGRVNVAGMTPDNMAPLCEAIVAVL

서열번호 38 YbjE 폴리펩타이드 서열

MFSGLLIILVPLIVGYLIPLRQQAALKVINQLLSWMVYLILFFMGISLAFLDNLASNLLAILHYSAVSITVILLCNIAALMWLERGLPWRNHHQQEKLPSRIAMALESLKLCGVVVIGFAIGLSGLAFLQHATEASEYTLILLLFLVGIQLRNNGMTLKQIVLNRRGMIVAVVVVVSSLIGGLINAFILDLPINTALAMASGFGWYSLSGILLTESFGPVIGSAAFFNDLARELIAIMLIPGLIRRSRSTALGLCGATSMDFTLPVLQRTGGLDMVPAAIVHGFILSLLVPILIAFFSA.

<110> Cathay Industrial Biotech <120> Modified Membrane Permeability <130> PCT <160> 102 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2148 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148 <210> 2 <211> 715 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu 1 5 10 15 Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln 20 25 30 Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn 35 40 45 Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu 50 55 60 Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp 100 105 110 Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile 115 120 125 Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys 130 135 140 Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met 165 170 175 Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp 180 185 190 His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe 195 200 205 Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn 210 215 220 Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile 225 230 235 240 Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp 245 250 255 Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu 260 265 270 Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg 275 280 285 Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys 305 310 315 320 Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr 325 330 335 Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu 355 360 365 Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val 370 375 380 Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser 385 390 395 400 Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met 405 410 415 Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly 435 440 445 Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys 450 455 460 Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp 465 470 475 480 Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro 485 490 495 Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser 500 505 510 Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr 515 520 525 Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr 530 535 540 Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe 545 550 555 560 Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu 565 570 575 Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn 580 585 590 Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg 595 600 605 Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe 610 615 620 Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met 625 630 635 640 Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val 660 665 670 Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 675 680 685 Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr 690 695 700 Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys 705 710 715 <210> 3 <211> 1041 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60 gccgctccga aagataacac ctggtacact ggtgctaaac tgggctggtc ccagtaccat 120 gacactggtt tcatcaacaa caatggcccg acccatgaaa accaactggg cgctggtgct 180 tttggtggtt accaggttaa cccgtatgtt ggctttgaaa tgggttacga ctggttaggt 240 cgtatgccgt acaaaggcag cgttgaaaac ggtgcataca aagctcaggg cgttcaactg 300 accgctaaac tgggttaccc aatcactgac gacctggaca tctacactcg tctgggtggc 360 atggtatggc gtgcagacac taaatccaac gtttatggta aaaaccacga caccggcgtt 420 tctccggtct tcgctggcgg tgttgagtac gcgatcactc ctgaaatcgc tacccgtctg 480 gaataccagt ggaccaacaa catcggtgac gcacacacca tcggcactcg tccggacaac 540 ggcatgctga gcctgggtgt ttcctaccgt ttcggtcagg gcgaagcagc tccagtagtt 600 gctccggctc cagctccggc accggaagta cagaccaagc acttcactct gaagtctgac 660 gttctgttca acttcaacaa agcaaccctg aaaccggaag gtcaggctgc tctggatcag 720 ctgtacagcc agctgagcaa cctggatccg aaagacggtt ccgtagttgt tctgggttac 780 accgaccgca tcggttctga cgcttacaac cagggtctgt ccgagcgccg tgctcagtct 840 gttgttgatt acctgatctc caaaggtatc ccggcagaca agatctccgc acgtggtatg 900 ggcgaatcca acccggttac tggcaacacc tgtgacaacg tgaaacagcg tgctgcactg 960 atcgactgcc tggctccgga tcgtcgcgta gagatcgaag ttaaaggtat caaagacgtt 1020 gtaactcagc cgcaggctta a 1041 <210> 4 <211> 346 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala 20 25 30 Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn 35 40 45 Gly Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr 50 55 60 Gln Val Asn Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly 65 70 75 80 Arg Met Pro Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln 85 90 95 Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu 100 105 110 Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys 115 120 125 Ser Asn Val Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe 130 135 140 Ala Gly Gly Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu 145 150 155 160 Glu Tyr Gln Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr 165 170 175 Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly 180 185 190 Gln Gly Glu Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 195 200 205 Glu Val Gln Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn 210 215 220 Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Ala Ala Leu Asp Gln 225 230 235 240 Leu Tyr Ser Gln Leu Ser Asn Leu Asp Pro Lys Asp Gly Ser Val Val 245 250 255 Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Tyr Asn Gln Gly 260 265 270 Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Ile Ser Lys 275 280 285 Gly Ile Pro Ala Asp Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn 290 295 300 Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Gln 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Ala Phe Phe Asn Asp Leu Ala Arg Glu Leu Ile Ala Ile Met Leu Ile 225 230 235 240 Pro Gly Leu Ile Arg Arg Ser Arg Ser Thr Ala Leu Gly Leu Cys Gly 245 250 255 Ala Thr Ser Met Asp Phe Thr Leu Pro Val Leu Gln Arg Thr Gly Gly 260 265 270 Leu Asp Met Val Pro Ala Ala Ile Val His Gly Phe Ile Leu Ser Leu 275 280 285 Leu Val Pro Ile Leu Ile Ala Phe Phe Ser Ala 290 295 <210> 39 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa cgttattgca atattgaatc ac 52 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ggctctagac cacttccctt gtacgagc 28 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagacagct atcgc 45 <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ggctctagaa ccagacgaga acttaagcc 29 <210> 43 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa agttaaagta ctgtccctc 49 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 ggctctagat tagaactggt aaaccagacc 30 <210> 45 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgat gaagcgcaat attctg 46 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 ggctctagag catttaacaa agaggtgtgc 30 <210> 47 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaaaattgca tgtctttcag 50 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ggctctagat tagaagcggt aaccaacac 29 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagagcact ctggc 45 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 ggctctagat taaaactgat acgtcatgcc aac 33 <210> 51 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagttatta ccctgtacc 49 <210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ggctctagat cagaacgagt aatttacgc 29 <210> 53 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaagttaaca gtggcg 46 <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 ggctctagat taaaaacgat atcctgctga g 31 <210> 55 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ggcgaattca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatgag ctcggtaccc 60 ggggat 66 <210> 56 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ggcagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtg 34 <210> 57 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa atctaacaat gcgctcatc 49 <210> 58 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ggctctagat caacgacagg agcacgatc 29 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33 <210> 61 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggcggatcca cacaggaaac agaccatgtt cacgggaagt attgtc 46 <210> 62 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 ggctctagat tacagcaaac cggcatgc 28 <210> 63 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgcc acattcactg ttcagc 46 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 ggcgtcgact taaagcaatt ccagcgccag 30 <210> 65 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ggcctcgaga gtttattctt gacatgtagt gagg 34 <210> 66 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 ggcgcatgct caacgacagg agcacgatc 29 <210> 67 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 cagcctgaat atactgcatt ctc 23 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 gagaatgcag tatattcagg ctg 23 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gcattctcgc gatttcctcg 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 cgaggaaatc gcgagaatgc 20 <210> 71 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggcgagctca cacaggaaac agaccatggg cttagttgtg cagaaa 46 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ggcggatcct taacgacctg tgccgccata 30 <210> 73 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48 <210> 74 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ggcggatcct tacgccagtt gacgaagc 28 <210> 75 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ggcacacagg aaacagacca tgcatgatgc aaacatccg 39 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ggctctagat tacaaattat tgagatcaag tacatctc 38 <210> 77 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgca gcagttacag aacat 45 <210> 78 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 ggcgcatgct tagtcgatgg tacgcagca 29 <210> 79 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46 <210> 80 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47 <210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 ggcggtacca gtttattctt gacatgtagt gagg 34 <210> 82 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29 <210> 83 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ggcgggccct gctggccttt tgctcacat 29 <210> 84 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 ggcggtacct caacgacagg agcacgatc 29 <210> 85 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 ggcggtacca gtttattctt gacatgtagt gagg 34 <210> 86 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29 <210> 87 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagacagct atcgc 45 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 ggcaagctta ccagacgaga acttaagcc 29 <210> 89 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa agttaaagta ctgtccctc 49 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 ggcaagcttt tagaactggt aaaccagacc 30 <210> 91 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgat gaagcgcaat attctg 46 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 ggcaagcttg catttaacaa agaggtgtgc 30 <210> 93 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaaaattgca tgtctttcag 50 <210> 94 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 ggcaagcttt tagaagcggt aaccaacac 29 <210> 95 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagagcact ctggc 45 <210> 96 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 ggcaagcttt taaaactgat acgtcatgcc aac 33 <210> 97 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagttatta ccctgtacc 49 <210> 98 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 ggcaagcttt cagaacgagt aatttacgc 29 <210> 99 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgaa aaagttaaca gtggcg 46 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 ggcaagcttt taaaaacgat atcctgctga g 31 <210> 101 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt ttctgggctg ttaatca 47 <210> 102 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 ggcaagcttg atctaccgcc agagaggta 29

Claims

OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 유전자 변형된 숙주 세포에 있어서,
상기 숙주 세포는 OMP 포린 폴리펩타이드를 과발현하며,
변형되지 않은 대응하는 숙주 세포에 비해 아미노산 또는 아미노산 유도체의 생성을 증가시키는
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항에 있어서,
상기 아미노산은 라이신이고, 상기 아미노산 유도체는 카다베린인
유전자 변형된 숙주 세포.
제2항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 또는 OmpW 포린 폴리펩타이드인
유전자 변형된 숙주 세포.
제3항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드는 성숙한 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16의 영역과 적어도 70%의 동일성을 가지거나, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 가지는
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산은 세포 내에 도입된 발현 벡터에 의해 인코딩되고,
상기 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산을 포함하는
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드는 숙주 세포에 내인성인
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종 핵산은 숙주 염색체에 통합되는
유전자 변형된 숙주 세포
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제를 과발현하는
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 하나 이상의 라이신 생합성 폴리펩타이드를 과발현하는
유전자 변형된 숙주 세포
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 TetA 폴리펩타이드를 과발현하는
유전자 변형된 숙주 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균속, 하프니아속 또는 코리네박테리움속의 숙주 세포인
유전자 변형된 숙주 세포.
제11항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균, 하프니아 알베이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰인
유전자 변형된 숙주 세포.
제12항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균인
유전자 변형된 숙주 세포.
제 12 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 하프니아 알베이인
유전자 변형된 숙주 세포.
제 14 항에 있어서,
상기 Omp 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF 또는 OmpW 폴리펩타이드 인
유전자 변형된 숙주 세포.
제 15 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제 폴리펩타이드를 과발현하는
유전자 변형된 숙주 세포.
제 16 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC 및 TetA 폴리펩타이드를 과발현하는
유전자 변형된 숙주 세포.
OMP 포린 폴리펩타이드가 과발현되는 조건하에서 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는
아미노산 또는 아미노산 유도체의 제조 방법.
제 18 항에 있어서,
상기 아미노산은 라이신이고, 상기 아미노산 유도체는 카다베린인
방법.
OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산을 숙주 세포에 도입하고, 이종성 OMP포린 폴리펩타이드를 발현하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드의 발현은, 변형되지 않은 대응하는 대조군의 숙주 세포에 비해 라이신 또는 라이신 유도체의 생성을 증가시키는
아미노산 또는 아미노산 유도체의 생성을 증가시키는 숙주 세포의 조작 방법.
제 20 항에 있어서,
상기 아미노산은 라이신이고, 상기 아미노산 유도체는 카다베린인
방법.
제 21 항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF, OmpX, OmpE, OmpG 또는 OmpW 폴리펩타이드인
방법
제 22 항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드는 성숙한 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16의 영역과 적어도 70%의 동일성을 가지거나, 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 가지는
방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 OMP 포린 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산은 세포에 도입된 발현 벡터에 의해 인코딩되고, 상기 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이종 핵산을 포함하는
방법.
제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기OMP 포린 폴리펩타이드는 숙주 세포에 내인성인
방법.
제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이종 핵산은 숙주 염색체에 통합되는
방법.
제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제를 과발현하는
방법
제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주 세포는 하나 이상의 라이신 생합성 폴리펩타이드를 과발현하는
방법.
제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 TetA 폴리펩타이드를 과발현하는
방법.
제 20 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균속, 하프니아속 또는 코리네박테리움속의 숙주 세포인
방법.
제 30 항에 있어서,
성기 숙주 세포는 대장균, 하프니아 알베이 또는 코리네박테리움 글루타미쿰인
방법.
제 31 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 대장균인
방법.
제 31 항에 있어서,
숙주 세포는 하프니아 알베이인
방법.
제 33 항에 있어서,
상기 Omp 포린 폴리펩타이드는 OmpA, OmpC, OmpF 또는 OmpW 폴리펩타이드인
방법.
제 34 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 라이신 데카르복실라제 폴리펩타이드를 과발현하는
방법.
제 35 항에 있어서,
상기 숙주 세포는 LysC, DapA, LysA, Asd, DapB, AspC 및 TetA 폴리펩타이드를 과발현하는
방법.