KR20160117393A - L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 - Google Patents

L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 변이형 RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA) 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

L-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법{A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}
본 발명은 신규한 변이형 RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA) 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.
아미노산 등 유용산물의 대량생산을 위한 균주의 개발을 위해 해당경로(glycolysis) 상의 상위 단계에서 직·간접적으로 관여하는 유전적 요인들을 찾아내어 적절히 이용한다면 보다 높은 생산수율을 가진 균주를 개발할 수 있다. 대표적인 기술로는 RNA 중합효소의 리쿠르팅 단백질(recruiting protein)에 무작위 돌연변이를 일으킴으로써 세포 내 모든 유전자의 발현을 조절하는 gTME(global transcription machinery engineering) 기술이 있다. 일례로 메사추세츠 공과대학(Massachusetts Institute of Technology)의 연구그룹은 gTME 기술을 이용하여 대장균에서 타이로신의 생산량을 크게 증가시키는 데에도 성공한 바 있다(미국등록특허 제8735132호).
미생물의 전사단계에서 쓰여지는 RNA 중합효소(RNA polymerase)는 5개의 소단위체(subunit)로 구성된 거대분자로서, 2개의 알파 인자(α), 베타(β), 베타 프라임(β’) 및 오메가 인자(ω)로 구성되어 있으며, 완전효소(holoenzyme)는 α2ββ'ω로 표시된다. 이들 완전효소와 함께 시그마 인자(σ)는 RNA 중합효소의 프로모터 결합 특이성을 부여하는 전사의 개시 단계에 필수적인 요소이다. 코리네박테리움 속 균주는 7종의 시그마 인자(SigA, SigB, SigC, SigD, SigE, SigH, SigM)를 갖고 있으며 외부 환경 변화에 따라 특정 유전자 그룹들의 전사를 조절한다(Journal of Biotechnology 154. 2011. 101-113). 특히, SigA는 7종의 시그마 인자 중 대부분의 house keeping 유전자들 및 핵심 유전자들을 조절하는 주된 조절자로서, SigA에 무작위로 변이를 주어 목적 물질의 생산성을 높이는 연구들이 보고되었으며(Metabolic Engineering 9. 2007. 258-267), 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 L-라이신 생산성을 증가시킨 연구도 보고된 바 있다(국제공개특허 제WO2003-054179호).
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 숙주 세포의 성장 저해 없이 보다 높은 농도의 L-라이신을 생산하는 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 신규한 변이형 RNA 중합효소의 시그마인자 A(SigA) 폴리펩티드를 개발하여 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속에 도입함으로써 L-라이신의 생산능이 향상된 균주를 개발할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 RNA 중합효소 시그마인자 A 활성을 가지는 폴리펩티드의 일부 아미노산을 치환한 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 포함하도록 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 상기 배양물 또는 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 RNA 중합효소 시그마인자 A 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에서 용어, "RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA)"는 RNA 중합효소와 함께 작용하는 전사시작인자로서 시그마인자(sigma factor) 중의 하나에 해당하는 단백질(SigA)이다. 시그마인자는 특정 프로모터의 상류에 존재하는 upstream DNA(UP element)와 여러 가지 전사조절인자와 상호작용하여 전사조절에 관여한다. 특히 시그마인자 A(SigA)는 핵심 유전자의 대부분을 조절하는 주된 조절자(regulator)로 알려져 있다. 상기 SigA 단백질에 대한 정보는 NCBI GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession number가 NP_601117인 단백질일 수 있다. 구체적으로, SigA 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 SigA와 동일한 활성을 갖는 한 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어, "변이형 폴리펩티드"는 야생형 폴리펩티드의 아미노산 서열 일부 또는 전체가 치환된 것으로, 본 발명에서는 RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA) 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 일부가 치환됨으로써 야생형(wild-type)의 아미노산 서열과 일부 다른 서열을 가진 RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA) 활성을 가지는 폴리펩티드이다. 즉, 야생형인 SigA 폴리펩티드가 아닌, L-라이신 생산능 향상에 기여하는 SigA 변이형 폴리펩티드를 제시하는 것이다.
구체적으로, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 하기 위치의 아미노산 중 1 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, RNA 중합효소 시그마인자 A 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드로서, 상기 변이 위치는시작 메치오닌을 1번째 아미노산으로 하여 이로부터 136번째 아미노산; 254번째 아미노산; 268번째 아미노산; 281번째 아미노산; 381번째 아미노산; 429번째 아미노산; 및 445번째 내지 495번째 아미노산일 수 있다. 즉 상기 변이형 폴리펩티드는 상기 57개의 변이 위치(136번, 254번, 268번, 281번, 381번, 429번, 445-495번) 중에서 1 이상의 위치가 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 445번째 내지 495번째 아미노산 중에서, 447번째 아미노산; 451번째 아미노산; 455번째 아미노산; 479번째 아미노산; 483번째 아미노산; 488번째 아미노산; 및 491번째 아미노산으로 이루어진 아미노산 중 1종 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
구체적인 아미노산 치환은 하기 13종의 아미노산 치환 중 1종 이상이 조합된 것일 수 있으며, 시작 메치오닌으로부터 136번째 아미노산이 글리신으로 치환(D136G); 254번째 아미노산이 아스파라진으로 치환(I254N); 268번째 아미노산이 세린으로 치환(A268S); 281번째 아미노산이 세린으로 치환(T281S); 381번째 아미노산 알지닌으로 치환(L381R); 429번째 아미노산이 알지닌으로 치환(Q429R); 447번째 아미노산이 히스티딘으로 치환(L447H); 451번째 아미노산이 이소류신으로 치환(L451I); 455번째 아미노산이 발린으로 치환(M455V); 479번째 아미노산이 알지닌으로 치환(K479R); 483번째 아미노산이 알지닌으로 치환(K483R); 488번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환(S488T); 및 491번째 아미노산이 알지닌으로 치환(Q491R)으로 이루어진 것일 수 있다.
더욱 구체적으로 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 시작 메치오닌으로부터 136번째 및 281째 아미노산이 각각 글리신 및 세린으로 치환(D136G, T281S); 254번째 아미노산이 아스파라진으로 치환(I254N); 268번째 아미노산이 세린으로 치환(A268S); 381번째 아미노산 알지닌으로 치환(L381R); 429번째 아미노산이 알지닌으로 치환(Q429R); 447번째 아미노산이 히스티딘으로 치환(L447H); 451번째 및 491번째 아미노산이 각각 이소류신 및 알지닌으로 치환(L451I, Q491R); 455번째 아미노산이 발린으로 치환(M455V); 479번째 아미노산이 알지닌으로 치환(K479R); 483번째 아미노산이 알지닌으로 치환(K483R); 488번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환(S488T); 또는 상기 11종의 아미노산 치환 중 1종 이상이 조합된 것인 변이형 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 12 내지 22의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 변이형 폴리펩티드는 상기 서열번호 12 내지 22로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서, 야생형 SigA 단백질에 비하여 L-라이신의 생산능 향상에 기여한 단백질이라면 제한없이 포함하며, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 변이형 SigA 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 단백질을 코딩하는 유전자의 아미노산 또는 염기서열에 있어서, 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬 (align)시킨 후 서열 간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 발명에서 RNA 중합효소 시그마인자 A(SigA)의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 rpoD 유전자이며, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함되며, 구체적으로 서열번호 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 변이형 폴리뉴클레오티드 역시 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 구체적으로 상기 아미노산 서열 12 내지 22의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 및 이의 변이체가 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포 및 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 구체적으로 상기 도입은 형질전환에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 SigA 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물은 야생형 SigA 폴리펩티드를 포함하는 미생물에 비하여 숙주세포의 성장을 저해함이 없이 L-라이신의 생산능이 향상되므로, 이들 미생물로부터 L-라이신을 고수율로 수득할 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함하며, 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. 또한, 상기 벡터는 트랜스포존(Annu Rev Genet. 2003; 37:3-29.), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 구체적으로는 pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, pDZ 및 pMW118 벡터 등을 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다.
상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주세포 또는 미생물은 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 발명의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 SigA 변이형 폴리펩티드를 포함하여 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서는, L-라이신의 생산능을 가진 코리네박테리움 글루타미쿰의 여러 균주(KCCM11016P, KFCC10750, KCCM10770P 및 CJ3P)에 서열번호 12 내지 22의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변이형 폴리펩티드를 도입하여 상기 균주의 L-라이신 생산능을 비교한 결과, 상기 변이형 폴리펩티드를 도입한 모든 균주에서 야생형 SigA 폴리펩티드를 포함한 균주보다 더 많은 L-라이신을 생산함을 확인하였다(실시예 7 내지 10 및 표 8 내지 11). 이와 같은 결과는 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물은 L-라이신의 생산능이 향상된 균주로서, 상기 미생물을 배양함으로써 높은 수율의 L-라이신을 수득할 수 있는 경제적 이점을 시사하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 L-라이신 생산능이 향상된 균주인 KCCM11016P::SigA(L447H)를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2277"이라 명명하였고, 2013년 11월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11479P를 부여받았다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 기술된 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 구체적인 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 당업자의 일반적인 지식 또는 종래에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 이에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 구체적으로는 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 구체적으로는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 등이 포함될 수 있고, 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 구체적으로는 30℃ 내지 35℃이다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속 될 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100시간일 수 있다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법에는 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-라이신 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명으로 L-라이신 생산 능력을 상향 조절할 수 있는 변이체 RNA 중합효소 시그마인자 A의 변이형 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 또한 이를 바탕으로 당해 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물은 L-라이신의 생산수율이 현저히 우수하므로, 산업적인 면에서 생산의 편의성과 함께 제조원가 절감 등의 효과를 기대할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인공 돌연변이법을 이용한 SigA 변이형 폴리펩티드 확보
본 실시예에서는 변이형 SigA를 획득하기 위하여 하기의 방법으로 염색체 내 1차 교차삽입용 벡터 라이브러리를 제작하였다. 코리네박테리움 SigA(서열번호 2)를 암호화하는 rpoD 유전자(서열번호 1)를 대상으로 Error-prone PCR 법을 수행하여 염기 치환변이가 무작위적으로 도입된 rpoD 유전자 변이체 단편(1497bp)들을 획득하였다. 상기 Error-prone PCR은 GenemorphII Random Mutagenesis Kit (Stratagene)을 사용하여 수행하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하였다. 증폭된 유전자 단편 내에 변이가 1kb 당 0 내지 4.5 개가 도입되도록 하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.
프라이머 번호 염기 서열 서열번호
1 GTGGAGAGCAGCATGGTAG 3
2 CGCAGAGGAAAACAGTGGC 4
상기 증폭된 유전자 단편을 pCR2.1-TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(이하 'pCR2.1')에 연결하였고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(25 mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 염기서열을 분석한 결과, 1.5 mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000 개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pCR2.1-rpoD(mt) 라이브러리로 명명하였다.
이후 대조군으로 사용하기 위한 야생형의 rpoD 유전자를 갖는 플라스미드를 제작하였다. 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 상기와 같은 조건으로 PCR하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였고, 이에 따라 제작된 플라스미드를 pCR2.1-rpoD(WT)으로 명명하였다.
실시예 2: L-라이신 생산능이 증가된 SigA 변이주 라이브러리 제작
KCCM11016P(대한민국 등록특허 제10-0159812호) 균주를 모균주로 하여 상기 제작된 pCR2.1-rpoD(mt) 라이브러리를 상동염색체 재조합에 의해 형질전환하고 카나마이신(25 mg/ℓ) 및 하기와 같은 성분이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 25,000개의 콜로니를 확보하였으며, 이를 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1 내지 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-25000으로 명명하였다. 또한, 상기 제작된 pCR2.1- rpoD(WT) 벡터를 KCCM11016P 균주에 형질전환하여 대조군 균주를 제작하였으며, KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT)으로 명명하였다.
상기 확보된 형질전환체들은 염색체 상에 2 카피의 rpoD 유전자를 보유하게 되나, pCR2.1-rpoD(mt) 라이브러리 및 pCR2.1-rpoD(WT) 벡터는 프로모터가 없는 rpoD 유전자 단편이 삽입되어 있기 때문에 균주의 염색체 내로 상동재조합에 의해 삽입될 경우 2 카피의 rpoD 유전자들 중 1 카피만이 발현되어 변이형 또는 야생형의 SigA 단백질을 발현시킬 수 있다.
<복합평판배지 (pH 7.0)>
포도당 10 g, 펩톤 10 g, Beef extract 5 g, 효모추출물 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, Sorbitiol 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)
실시예 3: L-라이신 생산능이 증가된 SigA 변이주 라이브러리 스크리닝
상기 실시예 2에서 확보된 약 25,000개의 콜로니를 각각 하기와 같은 성분이 포함된 300 ㎕의 선별배지에 접종하여 96-deep well plate 에서 32℃, 1000 rpm 으로 약 24시간 동안 배양하였다. 배양 중 생산된 L-라이신의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(J. Biol. Chem. 1948. 176:367?388). 배양이 완료된 후 배양 상층액 10 ㎕ 와 닌하드린 반응용액 190 ㎕(63% 글리세롤, 27% 닌하이드린용액(7.1 g/L in 0.5M citrate buffer pH 5.5))를 65℃에서 30분간 반응시킨 후, 570 nm의 파장에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하고 대조군인 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT) 균주의 흡광도와 비교해 10% 이상 증가된 흡광도를 보이는 약 935개의 변이균주 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조구 대비 유사하거나 감소한 흡광도를 나타내었다.
<선별배지 (pH 8.0)>
포도당 10 g, 5.5 g ammonium sulfate, MgSO4·7H2O 1.2 g, KH2PO4 0.8 g, K2HPO4 16.4 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
상기에서 선별된 935종의 균주를 대상으로 상기의 방법을 반복수행하여 KCCM11016P/PCR2.1-rpoD(WT) 균주 대비 L-라이신 생산능이 15% 이상 향상된 변이균주 중 상위 231종을 선별하였다.
실시예 4: KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt) L-라이신 생산능 분석
상기 실시예 3에서 선별한 231종의 균주들의 L-라이신 생산능을 다음과 같은 방법으로 배양하여 분석하였다.
하기 성분이 포함된 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이후, 하기 성분이 포함된 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. HPLC(고성능 액체크로마토그래피)를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 ·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
상기에서 선별된 231종의 변이균주 중 대조군 대비 L-라이신 농도가 재현성 있게 증가한 17종의 균주를 선별하여 상기 배양 및 분석을 반복수행 하였으며, 분석된 L-라이신의 농도는 하기 표 2와 같다.
균주 L-라이신(g/)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT) 41.5 42.1 41.8 41.8
1 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-158 45.7 45.2 48.1 46.3
2 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1494 44.8 46.2 45.7 45.6
3 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1846 46.8 45.9 47.1 46.6
4 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-2198 49.8 47.8 47.9 48.5
5 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-2513 45.2 47.3 45.6 46.0
6 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-3777 45.8 47.6 45.9 46.4
7 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-4065 50.7 49.8 49.5 50.0
8 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-5329 44.5 42.5 42.8 43.3
9 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-6589 41.8 42.3 41.8 42.0
10 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-9823 47.3 46.8 47.0 47.0
11 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-11267 45.5 45.3 45.1 45.3
12 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-13306 48.5 46.5 46.6 47.2
13 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-14535 48.2 49.3 47.5 48.3
14 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-16323 44.2 44.6 45.8 44.9
15 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-17935 46.5 47.2 44.5 46.1
16 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-18904 42.3 41.5 42.6 42.1
17 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-19803 47.2 45.3 46.3 46.3
상기 선별된 17종 균주의 L-라이신 농도 분석 결과, 17종의 선별주 중 2종(KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-6589, KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-18904)을 제외한 15종 선별주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(WT) 균주 대비 최대 20% 증가함을 확인하였다.
실시예 5: SigA 인공돌연변이 라이브러리 선별주의 rpoD 유전자 변이 확인
상기 실시예 4에서 선별된 17종 중 대조군에 비해 L-라이신 생산능이 증가된 15종 균주들의 SigA에 도입된 변이를 확인하기 위하여, rpoD 변이체의 염기서열을 분석하였다. 염기서열을 결정하기 위해 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 3(서열번호 5)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 번호 염기 서열 서열번호
1 GTGGAGAGCAGCATGGTAG 3
3 AACAGCTATGACCATG 5
확보된 15종 균주 각각의 변이형 rpoD 유전자 단편들의 염기서열 분석을 통하여 미국 국립 보건원 유전자 은행(NIH GenBank)을 근거로 변이형 rpoD 유전자의 염기서열을 확인하였으며, 변이형 SigA의 아미노산 서열을 확인하였다. 선별된 15종 균주의 변이형 SigA 아미노산 서열 분석 결과는 하기 표 4와 같다.
균주 SigA 아미노산 변이
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-158 D136G, T281S
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1494 L381R
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-1846 M230T
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-2198 M455V
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-2513 S488T
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-3777 R279L
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-4065 L447H
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-5329 A268S
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-9823 L451I, Q491R
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-11267 Q429R
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-13306 K90E, K105Y, D250G, I254L
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-14535 I254N
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-16323 K483R
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-17935 K479R
KCCM11016P/pCR2.1-rpoD(mt)-19803 D238V, N263S, E358D
그 결과, 적게는 1개의 아미노산부터 많게는 4개의 아미노산이 치환되었음을 확인하였다. 상기 표 4의 표기에서 숫자는 SigA의 아미노산 번호를 의미하고, 숫자 앞의 알파벳은 치환 전의 아미노산을, 숫자 뒤의 알파벳은 치환된 아미노산을 의미한다.
실시예 6: 고농도 L- 라이신 생산주를 위한 rpoD 변이 염색체 도입용 벡터 제작
상기 실시예 4에서 확인된 SigA 변이 적용 효과를 확인하기 위하여 이를 염색체상에 도입할 수 있는 벡터를 제작하였다.
보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 4(서열번호 6)와 3' 말단에 SalⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머 5(서열번호 7)를 합성하였다. 이 프라이머 쌍을 이용하여, 상기 선별된 15종의 염색체를 각각 주형으로 PCR을 수행하여 15종의 변이형 rpoD(mt) 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 2분 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 번호 염기 서열 서열번호
4 AAGAATTCGTGGAGAGCAGCATGGTAG 6
5 AAGTCGACCGCAGAGGAAAACAGTGGC 7
PCR로 증폭된 15종의 유전자 단편을 제한효소 EcoRⅠ과 SalⅠ으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 EcoRⅠ 및 SalⅠ말단을 가지는 염색체 도입용 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25mg/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고 이 플라스미드의 SigA에 삽입된 변이에 따라 각각 pDZ-SigA(D136G, T281S), pDZ-SigA(L381R), pDZ-SigA(M230T), pDZ-SigA(M455V), pDZ-SigA(S488T), pDZ-SigA(R279L), pDZ-SigA(I254N), pDZ-SigA(A268S), pDZ-SigA(L451I, Q491R), pDZ-SigA(Q429R), pDZ-SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L), pDZ-SigA(L447H), pDZ-SigA(K483R), pDZ-SigA(K479R), pDZ-SigA(D238V, N263S, E358D)으로 명명하였다. 또한 상기 변이체들에 대한 또다른 대조군으로써, L-라이신 생산성 증가에 효과가 있다고 기 보고된(국제공개특허 제WO2003-054179호) SigA 변이 A414V를 염색체상에 삽입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 프라이머 6 내지 9(서열번호 8 내지 11)를 제작하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 프라이머 6 및 프라이머 9 쌍과 프라이머 7 및 프라이머 8 쌍으로 각각 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 5분간 변성 후, 94 ℃ 30초 변성, 56 ℃ 30초 어닐링, 72 ℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72 ℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
프라이머 번호 염기 서열 서열번호
6 GCAGGTCGACTCTAGACTCACCCCAGCCGTCAAGCGT 8
7 CCGGGGATCCTCTAGATCAAGGCGATGTCGGAAAATG 9
8 AAGACTCCGAAGTCGTCGTCGCAGT 10
9 ACTGCGACGACGACTTCGGAGTCTT 11
그 결과, 약 500bp 유전자 단편 2개를 획득하였으며, 증폭된 산물은 Infusion cloning kit(Invitrogen)을 사용하여 pDZ벡터에 접합하였고 제작된 벡터를 pDZ-SigA(A414V)으로 명명하였다.
실시예 7: 고농도 L- 라이신 생산주를 위하여 SigA 변이형 폴리펩티드가 도입된 KCCM11016P 균주 제작 및 L- 라이신 생산능 비교
상기 실시예 6에서 제조한 신규변이 도입 벡터 15종 및 기 보고변이 도입 벡터 1종을 2단계 상동염색체 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. 그 후 염색체 상의 SigA 변이가 도입된 균주를 염기서열 분석에 의하여 선별하였으며, 상기 SigA 변이가 도입된 균주를 KCCM11016P::SigA(D136G, T281S), KCCM11016P::SigA(L381R), KCCM11016P::SigA(M230T), KCCM11016P::SigA(M455V), KCCM11016P::SigA(S488T), KCCM11016P::SigA(R279L), KCCM11016P::SigA(I254N), KCCM11016P::SigA(A268S), KCCM11016P::SigA(L451I, Q491R), KCCM11016P::SigA(Q429R), KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L), KCCM11016P::SigA(L447H), KCCM11016P::SigA(K483R), KCCM11016P::SigA(K479R), KCCM11016P::SigA(D238V, N263S, E358D), KCCM11016P::SigA(A414V)으로 명명하였다.
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였고, 그 결과는 하기 표 7과 같다.
균주 L-라이신(g/)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11016P 42.8 41.6 43.1 42.5
1 KCCM11016P::SigA(D136G, T281S) 46.2 45.8 45.2 45.7
2 KCCM11016P::SigA(L381R) 45.2 45.8 46.7 45.9
3 KCCM11016P::SigA(M230T) 41.8 42.1 41.9 41.9
4 KCCM11016P::SigA(M455V) 50.1 48.1 49.2 49.1
5 KCCM11016P::SigA(S488T), 45.1 44.9 45.8 45.3
6 KCCM11016P::SigA(R279L) 42.5 43.2 40.9 42.2
7 KCCM11016P::SigA(L447H) 51.2 49.9 50.8 50.6
8 KCCM11016P::SigA(A268S) 43.2 44.1 45.5 44.3
9 KCCM11016P::SigA(L451I, Q491R) 47.5 47.1 49.8 48.1
10 KCCM11016P::SigA(Q429R) 44.9 45.2 45.1 45.1
11 KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L) 31.5 28.6 40.5 33.5
12 KCCM11016P::SigA (I254N) 49.1 48.5 47.8 48.5
13 KCCM11016P::SigA(K483R) 45.1 44.1 45.6 44.9
14 KCCM11016P::SigA(K479R) 44.7 45.6 45.8 45.4
15 KCCM11016P::SigA(D238V,N263S,E358D) 21.5 22.9 19.2 21.2
대조군 KCCM11016P::SigA(A414V) 43.2 44 43.5 43.6
그 결과, 2종의 신규 변이 도입주(KCCM11016P::SigA(M230T), KCCM11016P::SigA(R279L))는 모균주 대비 동등한 L-라이신 생산능을 나타내었으며, 다른 2종의 신규 변이 도입주(KCCM11016P::SigA(K90E, K105Y, D250G, I254L), KCCM11016P::SigA(D238V, N263S, E358D))는 성장속도가 현저히 느려지고 L-라이신 생산량이 크게 감소하였다. 그러나 나머지 신규 변이주 11종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 19% 증가하였으며, 기 보고변이(SigA(A414V)) 도입주 KCCM11016P::SigA(A414V)에 비해서도 L-라이신 생산능이 16% 증가된 것을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 L-라이신 생산능이 향상된 균주인 KCCM11016P::SigA(L447H)를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2277"이라 명명하였고, 2013년 11월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11479P 를 부여받았다.
이와 같은 결과는 신규한 11종의 SigA 변이형 폴리펩티드가 L-라이신 생산능이 우수함을 시사하는 것이다.
실시예 8: 고농도 L- 라이신 생산주를 위하여 SigA 변이형 폴리펩티드가 도입된 KFCC10750 균주 제작 및 L-라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서 상기 실시예 7에서 선별된 SigA 변이 11종의 도입효과를 확인하기 위해, 상기 실시예 7과 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750(KCCM11347P. 대한민국등록특허 제10-0073610호) 11종의 SigA 변이가 각각 도입된 균주들을 제작하고 KFCC10750::SigA(D136G, T281S), KFCC10750::SigA(L381R), KFCC10750::SigA(M455V), KFCC10750::SigA(S488T), KFCC10750::SigA(I254N), KFCC10750::SigA(A268S), KFCC10750::SigA(L451I, Q491R), KFCC10750::SigA(Q429R), KFCC10750::SigA(L447H), KFCC10750::SigA(K483R), KFCC10750::SigA(K479R)으로 명명하였다. 또한, 기보고 된 변이 SigA(A414V)를 도입한 균주도 제작하였으며, 이를 KFCC10750::SigA(A414V)으로 명명하였다.
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였고, 그 결과는 하기 표 8과 같다.
균주 L-라이신(g/)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KFCC10750 38.8 38.1 37.9 38.3
1 KFCC10750::SigA(D136G, T281S) 41.1 41.2 40.9 41.1
2 KFCC10750::SigA(L381R) 42.1 41.8 41.1 41.7
3 KFCC10750::SigA(M455V) 43.2 43.8 44.2 43.7
4 KFCC10750::SigA(S488T) 42.1 40.8 41.9 41.6
5 KFCC10750::SigA (L447H) 44.5 45.1 44.9 44.8
6 KFCC10750::SigA(A268S) 39.9 41.1 39.7 40.2
7 KFCC10750::SigA(L451I, Q491R) 42.9 44.1 43.8 43.6
8 KFCC10750::SigA(Q429R) 40.2 41.2 42.1 41.2
9 KFCC10750::SigA(I254N) 44.9 44.5 43.8 44.4
10 KFCC10750::SigA(K483R) 40.5 41 40.9 40.8
11 KFCC10750::SigA(K479R) 39.9 41.5 41.1 40.8
대조군 KFCC10750::SigA(A414V) 39.6 39.1 39.5 39.4
그 결과, 신규 변이 도입주 11종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 17% 증가하였으며, 기 보고변이(SigAA414V) 도입주 KFCC10750::SigA(A414V)에 비해서도 L-라이신 생산능이 약 14% 증가된 것을 확인하였다.
실시예 9: 고농도 L- 라이신 생산주를 위하여 SigA 변이형 폴리펩티드가 도입된 KCCM10770P 균주 제작 및 L- 라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서 상기 실시예 7에서 선별된 SigA 변이 11종의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 7와 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국등록특허 제10-0924065호)에 SigA 변이가 도입된 균주를 제작하고 KCCM10770P::SigA(D136G, T281S), KCCM10770P::SigA(L381R), KCCM10770P::SigA(M455V), KCCM10770P::SigA(S488T), KCCM10770P::SigA(I254N), KCCM10770P::SigA(A268S), KCCM10770P::SigA(L451I, Q491R), KCCM10770P::SigA(Q429R), KCCM10770P::SigA(L447H), KCCM10770P::SigA(K483R), KCCM10770P::SigA(K479R)으로 명명하였다. 또한, 기보고 된 변이 SigA(A414V)를 도입한 균주도 제작하였으며, KCCM10770P::SigA(A414V)으로 명명하였다.
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였고, 그 결과는 하기 표 9와 같다.
균주 L-라이신(g/)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM10770P 47.5 48.1 47.9 47.8
1 KCCM10770P::SigA(D136G, T281S) 51.1 51.6 52.1 51.6
2 KCCM10770P::SigA(L381R) 52.6 50.9 52.1 51.9
3 KCCM10770P::SigA(M455V) 55.1 54.3 54.8 54.7
4 KCCM10770P::SigA(S488T) 52.1 52.4 51.9 52.1
5 KCCM10770P::SigA(L447H) 56.9 57.6 57.1 57.2
6 KCCM10770P::SigA(A268S) 50.5 50.1 49.9 50.2
7 KCCM10770P::SigA(L451I, Q491R) 55.3 54.9 54.1 54.8
8 KCCM10770P::SigA(Q429R) 52.4 52.3 50.9 51.9
9 KCCM10770P::SigA (I254N) 55.9 55.4 54.1 55.1
10 KCCM10770P::SigA(K483R) 51.9 51.3 51.5 51.6
11 KCCM10770P::SigA(K479R) 51 51.7 52.1 51.6
대조군 KCCM10770P::SigA(A414V) 48.9 49.5 50.1 49.5
그 결과, 신규 변이 도입주 11종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 20% 증가하였으며, 기 보고변이(SigAA414V) 도입주 KCCM10770P::SigA(A414V)에 비해서도 L-라이신 생산능이 약 16% 증가된 것을 확인하였다.
실시예 10: 고농도 L- 라이신 생산주를 위하여 SigA 변이형 폴리펩티드가 도입된 CJ3P 균주 제작 및 L-라이신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서의 효과도 확인하기 위해 상기 실시예 7와 같은 방법으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 SigA 변이가 도입된 균주를 제작하고 CJ3P::SigA(D136G, T281S), CJ3P::SigA(L381R), CJ3P::SigA(M455V), CJ3P::SigA(S488T), CJ3P::SigA(I254N), CJ3P::SigA(A268S), CJ3P::SigA(L451I, Q491R), CJ3P::SigA(Q429R), CJ3P::SigA(L447H), CJ3P::SigA(K483R), CJ3P::SigA(K479R)으로 명명하였다. 또한, 기보고 된 변이 SigA(A414V)를 도입한 균주도 제작하였으며, CJ3P::SigA(A414V)으로 명명하였다. CJ3P 균주는 공지된 기술을 바탕으로 야생주에 3종의 변이를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다.
상기 실시예 4과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신의 농도를 분석하였고, 그 결과는 하기 표 10과 같다.
균주 L-라이신(g/)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CJ3P 8.2 8.3 8.0 8.2
1 CJ3P::SigA(D136G, T281S) 9.0 8.8 8.9 8.9
2 CJ3P::SigA(L381R) 8.7 8.9 8.5 8.7
3 CJ3P::SigA(M455V) 9.3 9.5 9.1 9.3
4 CJ3P::SigA(S488T) 9.0 9.1 8.8 9.0
5 CJ3P::SigA(L447H) 9.8 10.1 9.5 9.8
6 CJ3P::SigA(A268S) 8.5 8.7 8.9 8.7
7 CJ3P::SigA(L451I, Q491R) 9.1 9.0 8.8 9.0
8 CJ3P::SigA(Q429R) 8.9 8.8 9.0 8.9
9 CJ3P::SigA (I254N) 9.1 9.7 9.5 9.4
10 CJ3P::SigA(K483R) 8.8 9.1 8.5 8.8
11 CJ3P::SigA(K479R) 8.6 8.9 8.8 8.8
대조군 CJ3P::SigA(A414V) 8.5 8.4 8.6 8.5
그 결과, 신규 변이 도입주 11종은 모균주 대비 L-라이신 생산능이 최대 20% 증가하였으며 기보고변이(SigAA414V) 도입주 CJ3P::SigA(A414V)에 비해서도 L-라이신 생산능이 약 15% 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합해보건대, 본 발명에서 신규 확보된 11종의 SigA 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드(SigA(D136G, T281S), SigA(L381R), SigA(M455V), SigA(S488T), SigA(I254N), SigA(A268S), SigA(L451I, Q491R), SigA(Q429R), SigA(L447H), SigA(K483R), SigA(K479R))들이 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 각각 L-라이신 생산능 증가에 우수한 효과가 있고, 이는 기 보고된 변이 SigA(A414V)보다 L-라이신 생산능 증대 효과가 뛰어남을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11479P 20131122
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same <130> PA131284-KR-D1 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1497 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 gtggagagca gcatggtaga aaacaacgta gcaaaaaaga cggtcgctaa aaagaccgca 60 cgcaagaccg cacgcaaagc agccccgcgc gtggcaaccc cattgggagt cgcatctgag 120 tctcccattt cggccacccc tgcgcgcagc atcgatggaa cctcaacccc tgttgaagct 180 gctgacacca tagagaccac cgcccctgca gcgaaggctc ctgcggccaa ggctcccgct 240 aaaaaggttg ccaagaagac agctcgcaag gcacctgcga aaaagactgt cgccaagaaa 300 gccacaaccg ccaaggctgc acctgcaact gccaaggacg aaaacgcacc tgttgatgac 360 gacgaggaga acctcgctca ggatgaacag gacttcgacg gcgatgactt cgtagacggc 420 atcgaagacg aagaagatga agacggcgtc gaagccctcg gtgaagaaag cgaagacgac 480 gaagaggacg gctcatccgt ttgggatgaa gacgaatccg caaccctgcg tcaggcacgt 540 aaagatgccg agctcaccgc ttccgccgac tctgttcgcg cttacctgaa gcaaatcggt 600 aaagttgccc tgctgaacgc tgaacaggaa gtctccctgg caaagcgcat cgaagcaggc 660 ctttacgcca cccaccgcat ggaggaaatg gaagaagctt tcgcagccgg tgacaaggac 720 gcgaaactca ccccagccgt caagcgtgac ctccgcgcca tcgctcgtga cggccgcaag 780 gcgaaaaacc acctcctgga agccaacctt cgtctggttg tctccctggc aaagcgctac 840 accggccgtg gcatggcatt cctggacctc atccaggaag gcaacctcgg tctgattcgt 900 gccgtagaga agttcgacta ctccaagggc tacaagttct ccacctacgc aacctggtgg 960 atccgtcagg caatcacccg cgccatggcc gaccaagcac gaaccatccg tatcccagtc 1020 cacatggttg aagtgatcaa caaacttggt cgcatccaac gtgaactcct tcaggaactc 1080 ggccgcgaac caaccccaca ggaactgtcc aaagaaatgg acatctccga ggaaaaggta 1140 ctggaaatcc agcagtacgc ccgcgaacca atctccctgg accaaaccat cggcgacgaa 1200 ggcgacagcc agctcggcga cttcatcgaa gactccgaag ccgtcgtcgc agtcgacgcc 1260 gtctcattca ccctgctgca agaccagcta caggacgtcc tagagaccct ctccgaacgt 1320 gaagccggcg tggttaaact ccgcttcgga ctcaccgacg gaatgccacg cactttagac 1380 gaaatcggcc aagtttacgg tgtcacccgt gagcgcatcc gccagattga gtccaagacc 1440 atgtctaagc tgcgccaccc atcacgctcc caggtccttc gcgactacct ggactaa 1497 <210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala 1 5 10 15 Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala 20 25 30 Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile 50 55 60 Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala 65 70 75 80 Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr 85 90 95 Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys 100 105 110 Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp 115 120 125 Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu 130 135 140 Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp 145 150 155 160 Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu 165 170 175 Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val 180 185 190 Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu 195 200 205 Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr 210 215 220 His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp 225 230 235 240 Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg 245 250 255 Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu 275 280 285 Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys 290 295 300 Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp 305 310 315 320 Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile 325 330 335 Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile 340 345 350 Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu 355 360 365 Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln 370 375 380 Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu 385 390 395 400 Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val 405 410 415 Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp 420 425 430 Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg 435 440 445 Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln 450 455 460 Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr 465 470 475 480 Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr 485 490 495 Leu Asp <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 3 gtggagagca gcatggtag 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 4 cgcagaggaa aacagtggc 19 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 5 aacagctatg accatg 16 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 6 aagaattcgt ggagagcagc atggtag 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 7 aagtcgaccg cagaggaaaa cagtggc 27 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 8 gcaggtcgac tctagactca ccccagccgt caagcgt 37 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 9 ccggggatcc tctagatcaa ggcgatgtcg gaaaatg 37 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 10 aagactccga agtcgtcgtc gcagt 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 11 actgcgacga cgacttcgga gtctt 25 <210> 12 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SigA variant <400> 12 Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala 1 5 10 15 Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala 20 25 30 Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile 50 55 60 Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala 65 70 75 80 Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro 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Ile 50 55 60 Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala 65 70 75 80 Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr 85 90 95 Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys 100 105 110 Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp 115 120 125 Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu 130 135 140 Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp 145 150 155 160 Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu 165 170 175 Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val 180 185 190 Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu 195 200 205 Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr 210 215 220 His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp 225 230 235 240 Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg 245 250 255 Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu 275 280 285 Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys 290 295 300 Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp 305 310 315 320 Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile 325 330 335 Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile 340 345 350 Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu 355 360 365 Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln 370 375 380 Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu 385 390 395 400 Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val 405 410 415 Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp 420 425 430 Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg 435 440 445 Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln 450 455 460 Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr 465 470 475 480 Met Ser Arg Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr 485 490 495 Leu Asp <210> 22 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SigA variant <400> 22 Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala 1 5 10 15 Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala 20 25 30 Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala 35 40 45 Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile 50 55 60 Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala 65 70 75 80 Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr 85 90 95 Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys 100 105 110 Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp 115 120 125 Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu 130 135 140 Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp 145 150 155 160 Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu 165 170 175 Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val 180 185 190 Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu 195 200 205 Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr 210 215 220 His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp 225 230 235 240 Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg 245 250 255 Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu 260 265 270 Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu 275 280 285 Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys 290 295 300 Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp 305 310 315 320 Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile 325 330 335 Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile 340 345 350 Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu 355 360 365 Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln 370 375 380 Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu 385 390 395 400 Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val 405 410 415 Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp 420 425 430 Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg 435 440 445 Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln 450 455 460 Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Arg Thr 465 470 475 480 Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr 485 490 495 Leu Asp

Claims (11)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 시작 메치오닌을 1번째 아미노산으로 하여 이로부터 455번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, RNA 중합효소 시그마인자 A 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 추가적으로 하기 위치의 아미노산 중 1 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드;
    시작 메치오닌을 1번째 아미노산으로 하여 이로부터
    136번째 아미노산; 254번째 아미노산; 268번째 아미노산; 281번째 아미노산; 381번째 아미노산; 429번째 아미노산; 451번째 아미노산; 479번째 아미노산; 483번째 아미노산; 488번째 아미노산; 및 491번째 아미노산.
  3. 제2항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기의 아미노산 치환을 가지는 변이형 폴리펩티드;
    136번째 아미노산이 글리신으로 치환; 254번째 아미노산이 아스파라진으로 치환; 268번째 아미노산이 세린으로 치환; 281번째 아미노산이 세린으로 치환; 381번째 아미노산 알지닌으로 치환; 429번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 451번째 아미노산이 이소류신으로 치환; 455번째 아미노산이 발린으로 치환; 479번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 483번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 488번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환; 또는 491번째 아미노산이 알지닌으로 치환.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열인 변이형 폴리펩티드.
  5. 제1항 또는 제2항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  7. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에서 시작 메치오닌을 1번째 아미노산으로 하여 이로부터 455번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, RNA 중합효소 시그마인자 A 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 포함하도록 형질전환된 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 추가적으로 하기 위치의 아미노산 중 1 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물;
    시작 메치오닌을 1번째 아미노산으로 하여 이로부터
    136번째 아미노산; 254번째 아미노산; 268번째 아미노산; 281번째 아미노산; 381번째 아미노산; 429번째 아미노산; 451번째 아미노산; 479번째 아미노산; 483번째 아미노산; 488번째 아미노산; 및 491번째 아미노산.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기의 아미노산 치환을 가지는 것인 L-라이신 생산능이 향상된 코리네 박테리움속 미생물;
    136번째 아미노산이 글리신으로 치환; 254번째 아미노산이 아스파라진으로 치환; 268번째 아미노산이 세린으로 치환; 281번째 아미노산이 세린으로 치환; 381번째 아미노산 알지닌으로 치환; 429번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 451번째 아미노산이 이소류신으로 치환; 455번째 아미노산이 발린으로 치환; 479번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 483번째 아미노산이 알지닌으로 치환; 488번째 아미노산이 쓰레오닌으로 치환; 또는 491번째 아미노산이 알지닌으로 치환.
  10. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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