WO2018124533A1 - Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신의 생산방법 - Google Patents

Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신의 생산방법 Download PDF

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WO2018124533A1
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lysine
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microorganism
seq
corynebacterium
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허란
최향
김형준
이성근
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present application relates to a microorganism of the genus Corynebacterium producing L-lysine and a method for producing L-lysine using the same.
  • L-lysine is one of the essential amino acids that are not synthesized in vivo is known to be necessary for promoting the growth of children, calcium metabolism involvement, hormone and antibody formation, gastric juice secretion and increased resistance to disease.
  • Industrially it is used in the manufacture of animal feed, medicine and cosmetics, and various studies have been conducted to develop high-efficiency production strains and fermentation process technology for efficient production of L-lysine. In these studies, a target-specific approach such as increasing the expression of genes encoding enzymes involved in L-lysine biosynthesis or removing genes unnecessary for biosynthesis is mainly used (Republic of Korea Patent Registration 10-0838038). number).
  • Korean Patent Application No. 10-2014-0042397 discloses a microorganism of the genus Corynebacterium having enhanced acetic acid kinase activity compared to the intrinsic activity, and a method for producing L-lysine using the same.
  • Korean Patent No. 10-1498630 discloses a microorganism of the genus Corynebacterium which is modified to overexpress the NCg10862 gene of Corynebacterium glutamicum and L-lysine production ability, and a method of producing L-lysine using the same. .
  • the present inventors randomly introduce the endogenous genes of the microorganism of the genus Corynebacterium in order to search for an effective trait that can increase the production capacity of L- lysine, the L- lysine production capacity increases when the expression level of a specific gene is increased It was confirmed that.
  • One aspect of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium to enhance the activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to produce L-lysine.
  • Another aspect of the present application is to provide a method for producing L-lysine using the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium introducing the recombinant vector according to the present application has improved L-lysine production capacity.
  • the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium to enhance the activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to produce L- lysine.
  • L-lysine is an essential amino acid that is one of the basic ⁇ -amino acids that is not synthesized in the body.
  • L-lysine is biosynthesized from oxaloacetate via the lysine biosynthesis pathway, and NADPH dependent reductase catalyzes the intermediate process for lysine biosynthesis.
  • NADPH NADPH dependent reductase
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is to be interpreted to include an amino acid sequence showing a substantial identity (substantial identity) with respect to the amino acid sequence.
  • substantial identity is obtained when the amino acid sequence of the present application and any other sequence are aligned to the maximum correspondence, and when the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art, A sequence exhibiting at least 70% homology, specifically at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, even more specifically at least 95% homology.
  • an amino acid sequence having such homology and exhibiting efficacy corresponding to a polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added, are within the scope of the present application. Inclusion is self-evident. Also included within the scope of this application are amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole. Such techniques are known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York (1979)).
  • the term "substantial identity or homology” refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art. Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10 (1990)) can be accessed from the National Center for Biological Information (NCBI), etc. It can be used in conjunction with sequencing programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLAST can be accessed at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparison methods using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of the present application is the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and polynucleotides which can be translated into the polypeptide by codon degeneracy are also included in the present invention. It may be included. As well as sequences complementary to the sequence.
  • the complementary sequence includes not only a perfectly complementary sequence but also a substantially complementary sequence.
  • Substantially complementary sequence means a sequence that can hybridize with the base sequence of the polynucleotide under stringent conditions known in the art.
  • stringent conditions is disclosed in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001), Stringent conditions can be determined by adjusting temperature, ionic strength (buffer concentration), the presence of compounds such as organic solvents, and the like, and can be determined differently depending on the sequence to be hybridized.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, at least 70% homology, specifically at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, even more Specifically, the sequence may include 95% or more homology.
  • nucleotide is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide that exists in single- or double-stranded form, encompasses RNA genomic sequence, cDNA, and RNA sequence transcribed therefrom, and is specifically mentioned otherwise. Natural nucleotide analogues (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • enhancing activity means that the activity of a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is increased relative to the activity of the intrinsic or non-mutant polypeptide of the corresponding host microorganism.
  • increased activity may be used in combination with “enhanced activity”.
  • enhancing the activity of the polypeptides of the present application may result in the production of L-lysine at higher levels as compared to wild-type, native or unmutated microorganisms.
  • the increase in the number of copies of the polynucleotide 1) is not particularly limited thereto, but may be performed in a form operably linked to a vector or by insertion into a chromosome in a host cell.
  • a polynucleotide encoding a protein of the present application may be performed by operably linked to and introduced into a host cell to a vector capable of replicating and functioning independently of the host, or inserting the polynucleotide into a chromosome in the host cell.
  • the polynucleotide may be operably linked to a vector capable of being introduced into the host cell, thereby increasing the number of copies of the polynucleotide in the chromosome of the host cell.
  • 2) modification of the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of these nucleic acid sequences to further enhance the activity of the expression control sequence or these It can be carried out by inducing a variation in the sequence in combination with or by replacing with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence may include, but is not particularly limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, a sequence that controls the termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong heterologous promoter may be linked to the top of the polynucleotide expression unit, but examples of the strong promoter include CJ7 promoter, lysCP1 promoter, EF-Tu promoter, groEL promoter, aceA or aceB promoter, lysCP1 promoter (WO2009 / 096689) or CJ7 promoters (Korean Patent No. 0620092 and WO2006 / 065095), but are not limited thereto.
  • modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited, and expression control sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. This can be done by inducing a phase shift or by replacing with a polynucleotide sequence that has been modified to have stronger activity.
  • introduction of a foreign polynucleotide sequence may be performed by introducing a foreign polynucleotide encoding a protein exhibiting the same / similar activity as the protein, or a codon-optimized variant polynucleotide thereof, into the host cell.
  • the foreign polynucleotide can be used without limitation in its origin or sequence as long as it exhibits the same / similar activity as the protein.
  • the foreign polynucleotide introduced may be introduced into the host cell by optimizing its codons so that optimized transcription and translation is performed in the host cell. The introduction can be carried out by a person skilled in the art appropriately selected for known transformation methods, the expression of the introduced polynucleotide in the host cell can be produced by the protein to increase its activity.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing the target gene or NDA sequence operably linked to a suitable control sequence to express the target gene or DNA, that is to say to a host cell It means a carrier that can be delivered to be replicated in large numbers or expressed as a protein.
  • the regulatory sequence may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After being transformed into a suitable host cell, the vector can be replicated or function independent of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the vector may further comprise a selection marker for confirming whether it has been introduced into a host cell or inserted into a chromosome, and the selection marker may be drug resistance, nutritional requirement, resistance by a cytotoxic agent or Various markers can be used that confer a selectable phenotype, such as expression of surface proteins. In the environment treated with the selection agent, only cells expressing the selection markers survive or display different expression traits so that the transformed cells can be selected.
  • Vectors of the present application can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression. It is not specifically limited, Any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages. As a phage vector or cosmid vector, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A and the like can be used, and as plasmid vectors, pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ system, pCL system, pET system, etc.
  • a strong promoter capable of promoting transcription for example, a tac promoter, a lac promoter, a lacUV5 promoter, an lpp promoter, a pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoters, rac5 promoters, amp promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.
  • ribosome binding sites for initiation of translation for example, a tac promoter, a lac promoter, a lacUV5 promoter, an lpp promoter, a pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoters, rac5 promoters, amp promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.
  • a vector that can be used in the present application may use plasmids known in the art (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), but are not limited thereto.
  • operatively linked means a functional binding between an expression control sequence (eg, a promoter sequence) of a polynucleotide and another polynucleotide, whereby the control sequence is To regulate transcription and / or translation of other polynucleotides.
  • an expression control sequence eg, a promoter sequence
  • the term "transformation” refers to a method of introducing a polynucleotide into a host to induce the polynucleotide to be cloned as an extra-genome or into the genome so that the desired gene can be replicated.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • the method of carrying the vector or the like into the host cell in the transformation process may include any method of introducing nucleic acid into the cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. .
  • the host cell is a prokaryotic cell
  • the CaCl2 method Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)
  • one method Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)
  • electric pulse methods Dower , WJ et al., Nucleic Acids Res., 16: 6127-6145 (1988) and the like, but is not limited thereto.
  • the host cell it is preferable to use a host having high DNA introduction efficiency and a high expression efficiency of the introduced DNA.
  • the host cell may be a microorganism of the genus Corynebacterium.
  • microorganism that produces L-lysine is a microbial strain capable of producing or secreting L-lysine for the purposes of the present application, and in a larger amount than wild-type or parent strains by manipulations according to the present application. Or a microorganism capable of producing and accumulating L-lysine in a culture medium at high concentration.
  • the microorganism may include all Corynebacterium spp.
  • Microorganisms whose activity of the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present application is enhanced compared to the intrinsic activity for example, Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium) glutamicum), Corynebacterium ammoniagenes to Ness (Corynebacterium ammoniagenes), Corynebacterium thermo amino to Ness (Corynebacterium thermoaminogenes), Brevibacterium Plastic boom (Brevibacterium flavum), or Brevibacterium lactofermentum FER (Brevibacterium fermentum ) may be used, but is not limited thereto.
  • Corynebacterium glutamicum Corynebacterium) glutamicum
  • Corynebacterium ammoniagenes to Ness Corynebacterium ammoniagenes
  • Corynebacterium thermo amino to Ness Corynebacterium thermoaminogenes
  • Brevibacterium Plastic boom Brevibacterium flavum
  • the microorganism of the genus Corynebacterium is Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), and specifically, Corynebacterium glutamicum (Accession No. KCCM11877P) disclosed in the present application may be used. Not limited to these examples, in addition to the microorganisms of the genus Corynebacterium having a known L- lysine production capacity can be used.
  • examples of the microorganism of the genus Corynebacterium having the known L- lysine production ability is Korean Patent No. 10-0397322, Korean Patent No. 10-0924065, Korean Patent No. 10-0073610, or / And Binder et al., Genome Biology 2012, 13: R40, the entire contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the present application comprises the steps of culturing the Corynebacterium genus microorganisms in a medium; And recovering L-lysine from the cultured microorganism, the culture medium or a mixture of the cultured microorganism and the culture medium.
  • the term "culture” refers to the growth of microorganisms under moderately controlled environmental conditions.
  • the method of culturing the microorganism of the present application can be carried out according to the appropriate medium and culture conditions well known in the art, it can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • examples of the culture method include, but are not limited to, batch culture, continuous culture, and fed-batch culture.
  • Various such methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176, 1991).
  • the term "media” is used for the cultivation of bacteria, in particular, the microorganisms of the transformed Corynebacterium, carbon source, nitrogen source and inorganic so that the microorganism can produce L- lysine
  • the medium may include various substances discharged into the medium during the growth of the microorganism together with the medium component prepared for culturing the mutant strain, and specifically, may include a target substance L-lysine.
  • the medium used for cultivation must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner.
  • Culture media for microorganisms of the genus Corynebacteria are known (eg, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology.Washington D.C., USA, 1981).
  • Carbon sources in the medium include, for example, sugars and carbohydrates such as glucose, sugar, sodium citrate, fructose, lactose or maltose, soybean oil, sunflower oil, Oils such as castor oil, coconut oil and the like, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, alcohols such as glycerol, ethanol, organic acids such as acetic acid, but are not limited thereto. These materials can be used individually or as a mixture.
  • the nitrogen source in the medium for example, compounds containing peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn steep liquor, soybean cake, urea, thiourea, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic nitrogen may be used. It is not limited to this.
  • the inorganic salts included in the medium may include compounds including magnesium, manganese, potassium, calcium, iron, zinc, cobalt, and the like, but are not limited thereto.
  • Personnel that can be used in the medium may include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or a corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate required for growth.
  • the compounds may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • nitrogen source and inorganic salts amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be additionally added to the medium of the present application.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously by a suitable method for the medium in the culture process.
  • the pH of the medium can be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture may be 20 to 45 °C but is not limited thereto. Cultivation can be continued until the desired amount of L-lysine is achieved, and can be achieved in 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the resulting L-lysine may be excreted in the culture medium or contained in microorganisms.
  • Recovering L-lysine from the medium in which the microorganism is cultured, the microorganism, or a mixture of the cultured microorganism and the culture medium may be various methods well known in the art, for example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, Crystallization and HPLC may be used, but are not limited thereto.
  • the recovery step may include a purification process.
  • Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium To prepare a wild type DNA library of glutamicum ), the following experiment was carried out.
  • Example 2 by introducing a genomic DNA library Lysine Production capacity Branch Corey Nebacterium spp.
  • the genomic DNA library prepared in Example 1 was introduced into the lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P using a conventionally known electric pulse method (the microorganism was disclosed as KFCC010881 and then deposited under the international treaty of Budapest). Re-established by the institution was given the accession number as KCCM11016P (Korean Registered Patent No. 10-0159812). Then, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P into which the genomic DNA library was introduced was plated on a composite flat medium containing kanamycin (25 mg / L), and cultured at 30 ° C. for 24 hours to obtain about 2,000 colonies.
  • kanamycin 25 mg / L
  • Glucose 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 50 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH 2 PO 4 5 g, K 2 HPO 4 10 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1,000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2,000 ⁇ g, nicotinamide 2,000 ⁇ g, agar 20 g
  • Lysine oxidase (Sigma-Aldrich) 0.02 unit, Peroxidase (Sigma-Aldrich) 0.2 unit, ABTS 2mg
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, and shake-cultured for 20 hours at 30 ° C and 200 rpm to make a seed culture solution. Thereafter, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium, followed by shaking culture for 96 hours at 37 ° C and 200 rpm. After the incubation was terminated, the concentration of L-lysine was analyzed using HPLC (Table 1).
  • Glucose 20 g (NH 4 ) 2 SO 4 40 g, peptone 10 g, yeast extract 5 g, urea 1.5 g, KH 2 PO 4 4 g, K 2 HPO 4 8 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, iotin 100 ⁇ g, thiamine HCl 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2,000 ⁇ g, nicotinamide 2,000 ⁇ g
  • Glucose 100g (NH 4 ) 2 SO 4 40g, Soy Protein 2.5g, Corn Steep Solids 5g, Urea 3g, KH 2 PO 4 1g, MgSO 4 7H 2 OO 0.5g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine Hydrochloride 1,000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2,000 ⁇ g, nicotinamide 3,000 ⁇ g, CaCO 3 30 g
  • KCCM11016P / 2-254 and KCCM11016P / 5-95 which show an effect of increasing lysine production compared to the control group, were selected, and plasmids were extracted by using a commonly known plasmid extraction method. Subsequently, sequencing was performed using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 6, plasmids derived from KCCM11016P / 2-254 were pEC-2-254, and plasmids derived from KCCM11016P / 5-95 were pEC-5-. Named 95.
  • plasmid pEC-2-254 contained the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17, and plasmid pEC-5-95 contained the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, through which the two plasmids contained SEQ ID NO: 1 It was confirmed that the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 encoding the amino acid sequence of and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 were commonly included.
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is named HL1622, and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is named HL1623, and HL1622 and HL1623 are hereinafter referred to.
  • Example 3-1 Construction of vector for HL1622 gene chromosome insertion
  • primers SEQ ID NOs. 7 and 8 inserted with a SpeI restriction enzyme site at the 5 'end were synthesized based on the reported nucleotide sequence, and PCR was performed using the chromosome of ATCC13032 as a template. A DNA fragment of about 1,520 bp was obtained that included about 149 bp of bottom of the stop codon at the top 500 bp site of the HL1622 start codon.
  • PCR was carried out by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, repeating 94 ° C. 30 seconds, 56 ° C. 30 seconds annealing, and 72 ° C. 90 seconds polymerization, and then polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes.
  • DNA fragments amplified by PCR were treated with restriction enzyme SpeI to obtain respective DNA fragments, which were then linked to the pDZTn vector having the restriction enzyme SpeI ends, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and contained 25 mg / L of kanamycin. Plated in a solid LB medium. After colonies transformed with the vector into which the target gene was inserted by PCR, plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, which was named pDZTn-HL1622.
  • Example 3-2 Construction of vector for HL1623 gene chromosome insertion
  • primers SEQ ID NOs. 9 and 10 having a SpeI restriction enzyme site inserted at the 5 'end were synthesized based on the reported nucleotide sequence, and PCR was performed under the same conditions as in Example 3-1. Was performed to obtain a DNA fragment of about 1,304 bp in length from the top 500 bp site of the HL1623 start codon to the bottom 150 bp of the stop codon. This was linked to a pDZTn vector having a restriction enzyme SpeI end, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated in LB solid medium containing 25 mg / L kanamycin.
  • plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, which was named pDZTn-HL1623.
  • Example 3-3 Construction of vectors for simultaneous insertion of HL1622 and HL1623 gene chromosomes
  • PCR was performed on the chromosome of ATCC13032 using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10, and the top 500 bp of the HL1622 start codon and 2,473 bp of HL1622 and HL1623 linked to each other. DNA fragments were amplified. At this time, PCR was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, 94 ° C. 30 seconds denaturation, 56 ° C. 30 seconds annealing, and repeating 120 seconds polymerization at 72 ° C. for 30 times, followed by polymerization at 72 ° C. for 7 minutes. DNA fragments amplified by PCR were transformed into E.
  • coli DH5 ⁇ by connecting to the pDZTn vector in the same manner as above, and plated on LB solid medium containing 25 mg / L kanamycin. After colonies transformed with the vector into which the target gene was inserted by PCR, plasmids were obtained using a commonly known plasmid extraction method, which was named pDZTn-HL1622-HL1623.
  • Example 4 HL1622, HL1623 and the two gene insertion strains Lysine Productivity analysis
  • each of the plasmin Corynebacterium glutamicum KCCM11016P was analyzed using an electric pulse method. Switched. Then, the strain inserted with the target gene on the chromosome was selectively isolated using PCR, and named as KCCM11016P :: HL1622 (Tn), KCCM11016P :: HL1623 (Tn) and KCCM11016P :: HL1622-HL1623 (Tn).
  • the three strains and the KCCM11016P strain were inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, followed by shaking culture at 30 ° C. and 200 rpm for 20 hours to prepare a seed culture solution. Subsequently, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium described below, followed by shaking culture for 96 hours at 37 ° C. and 200 rpm, followed by L-lysine contained in each culture. The concentration of was measured and compared (Table 2).
  • L-lysine production capacity was increased by 6% in the KCCM11016P :: HL1622 (Tn) strain and 5% in the KCCM11016P :: HL1622-HL1623 (Tn) strain compared to the control KCCM11016P strain.
  • the KCCM11016P :: HL1623 (Tn) strain with the HL1623 gene additionally inserted had the same L-lysine production capacity as compared to the control strain. The results confirm that only the HL1622 gene is effective in increasing L-lysine production capacity.
  • Example 5 HL1622 overexpression strain production by potent promoter
  • primers (SEQ ID NO: 11) inserting the XhoI restriction enzyme site at the 5 'end and a primer (SEQ ID NO: 12) inserting the NdeI restriction enzyme site at the 5' end were synthesized, and corynebacterium glutamicum pcj7 PCR was performed with the chromosomal DNA of the strain as a template to amplify a promoter site of about 297 bp in length. At this time, PCR was performed by denaturing at 94 ° C. for 5 minutes, repeating 94 ° C. 30 seconds, 56 ° C. 30 seconds annealing, and 72 ° C. 30 second polymerization, and then polymerizing at 72 ° C. for 7 minutes.
  • a primer (SEQ ID NO: 13) having an NdeI restriction enzyme site inserted into the 5 'end and a primer (SEQ ID NO: 14) having a SpeI restriction enzyme site inserted into the 5' end were synthesized, and the chromosome of ATCC 13032 was used as a template.
  • PCR was performed under the same conditions to amplify a DNA fragment of HL1622 about 495 bp in length.
  • primers (SEQ ID NO: 15) in which the XbaI restriction enzyme site was inserted at the 5 'end and primers (SEQ ID NO: 16) in which the XhoI restriction enzyme site was inserted at the 5' end were synthesized, and the ATCC13032 chromosome was used as the template.
  • PCR was performed to amplify the 496 bp long HL1622 upper region.
  • DNA fragments obtained by treating the HL1622 upper DNA fragment amplified by PCR with XbaI and XhoI, DNA fragments obtained by treating pcj7 DNA fragment with restriction enzymes XhoI and NdeI, and HL1622 DNA fragments with restriction enzymes NdeI and SpeI The obtained DNA fragments were linked together to a pDZ vector having the restriction enzyme XbaI terminus, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated in LB solid medium containing 25 mg / L kanamycin. Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted by PCR were selected, and plasmids were obtained by using a commonly known plasmid extraction method, and named pDZ-pcj7_HL1622.
  • the produced vector pDZ-pcj7_HL1622 was transformed into L-lysine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM11016P by homologous recombination on the chromosome.
  • the colonies where the promoter of the HL1622 gene was replaced with pcj by PCR were selectively isolated and named KCCM11016P :: pcj7_HL1622.
  • the KCCM11016P :: pcj7_HL1622 strain and the control KCCM11016P strain were cultured in the same manner as in Example 2, and the concentrations of lysine contained in each culture were measured and compared. As a result, it was confirmed that the L-lysine production capacity of the KCCM11016P :: pcj7-HL1622 strain increased by 8% compared to the control KCCM11016P strain, which confirms that L-lysine production capacity increases as the amount of HL1622 expression increases. 3).
  • the present inventors named the KCCM11016P :: pcj7-HL1622 strain having an increased L-lysine production capacity as Corynebacterium glutamicum "CA01-2300", and as of August 2, 2016, an international depository organization under the Budapest Treaty. Deposited in the microbial preservation center (KCCM), was given the accession number KCCM11877P.
  • Example 6 From KCCM10770P HL1622 overexpressed microorganisms Lysine production
  • the vector pDZ-pcj7_HL1622 prepared in Example 5 was transformed into Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Korea Patent No. 10-0924065), a lysine producing strain in which three L-lysine biosynthetic pathway related genes were inserted into chromosomes. I was. Colonies were then selectively isolated by PCR and named KCCM10770P :: pcj7-HL1622. The strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the concentration of L-lysine in the culture was analyzed. As a result, as shown in Table 4, it was confirmed that the L-lysine production capacity of the KCCM10770P :: pcj7-HL1622 strain increased by 5% compared to the control KCCM10770P strain (Table 4).
  • Example 7 From CJ3P HL1622 overexpressed microorganisms Lysine production
  • CJ3P Corynebacterium glutamicum CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40), a lysine-producing strain in which the vector pDZ-pcj7_HL1622 prepared in Example 5 was inserted into the chromosome of three genes related to L-lysine production ability )). Thereafter, colonies were selectively isolated by PCR, and named CJ3P :: pcj7-HL1622. The strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the concentration of L-lysine recovered therefrom was analyzed. As a result, it was confirmed that the L-lysine production capacity of the CJ3P :: pcj7-HL1622 strain increased by 32% compared to the control CJ3P strain (Table 5).
  • Example 8 From KFCC10750 HL1622 utilizes overexpressed microorganisms Lysine production
  • the vector pDZ-pcj7_HL1622 prepared in Example 5 was transformed into Corynebacterium glutamicum KCCM11347P, a lysine-producing strain in which three L-lysine production-enhancing genes were inserted into chromosomes (the microorganism was disclosed as KFCC10750.
  • KCCM11347P was re-deposited by the International Depository under the Treaty of Budapest, Republic of Korea Patent No. 10-0073610). Thereafter, colonies were selectively isolated by PCR, named KCCM11347P :: pcj7-HL1622, and cultured in the same manner as in Example 2 to analyze the concentration of L-lysine recovered therefrom.
  • the L-lysine production capacity of the KCCM11347P :: pcj7-HL1622 strain increased by 32% compared to the control KCCM11347P strain (Table 6).

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Abstract

본 출원은 Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신의 생산방법
본 출원은 Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.
L-라이신(L-lysine)은 생체 내에서 합성되지 않는 필수 아미노산 중의 하나로서 소아 발육성장 촉진, 칼슘대사 관여, 호르몬 및 항체 형성, 위액 분비촉진 및 병에 대한 저항력 증가에 필요한 것으로 알려져 있다. 산업적으로는 동물사료, 의약품 및 화장품 제조에 사용되며, L-라이신의 효율적 생산을 위하여 고효율 생산균주 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 이러한 연구에는 L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(대한민국 등록특허 제10-0838038호).
또한, 생합성 경로 관련 유전자 이외에도 특정 유전자의 활성이 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제10-2014-0042397호에는 내재적 활성과 비교하여 아세트산 키나아제 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1498630호에는 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCg10862 유전자가 과발현되도록 변형되어 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 유효 형질을 탐색하기 위하여 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 유전자를 무작위적으로 도입시킴으로써, 특정 유전자의 발현량을 증가시킬 경우 L-라이신 생산능이 증가한다는 사실을 확인하였다.
본 출원의 일 양태는 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화되어 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 양태는 상기 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 L-라이신 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 재조합 벡터를 도입한 코리네박테리움 속 미생물은 향상된 L-라이신 생산능을 가진다.
상기의 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 출원은 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화되어 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 사용된 용어, "L-라이신(L-lysine)"은 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이다. L-라이신은 옥살아세트산(oxaloacetate)으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다. 1 분자의 L-라이신 생합성 과정에서 3 분자의 NADPH가 당 효소들에 의해 직접적으로 소모되며, 1 분자의 NADPH가 간접적으로 이용된다.
구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)를 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 출원의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩타이드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환도 본 출원의 범위내에 포함된다. 상기 기술은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York(1979)).
본 출원에서 사용된 용어, "실질적인 동일성 또는 상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 출원의 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열이며, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 발명에 포함될 수 있음은 자명하다. 뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열(perfectly complementary sequence)뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열(substantially complementary sequence)도 포함한다. 실질적으로 상보적인 서열은 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 용어, "엄격 조건(stringent conditions)"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 상기 엄격 조건은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95%이상의 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어, "뉴클레오티드(nucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로서, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 출원에서 용어, ‘활성의 강화’는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성이 이에 상응하는 숙주 미생물의 내재적 또는 비변이 폴리펩타이드의 활성에 비하여 증가된 것을 의미한다. 본 출원에서, 용어 “활성 증가”는 “활성 강화”와 병용하여 사용될 수 있다. 나아가, 본 출원의 폴리펩티드의 활성을 강화하는 경우 야생형, 천연형 또는 비변이 미생물에 비해 결과적으로 더 높은 수준으로 L-라이신을 생산할 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 활성 증가는,
1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,
4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본 출원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터, lysCP1 프로모터 (WO2009/096689) 혹은 CJ7 프로모터 (대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 용어, "벡터(vector)"는 목적 유전자나 DNA를 발현 시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 유전자나 NDA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하며, 다시 말해 이를 숙주세포로 전달하여 많은 수로 복제되거나, 단백질로 발현될 수 있도록 하는 운반체를 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내로의 도입 또는 염색체 내로 삽입되었는지 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 의한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능한 표현형을 부여하는 다양한 마커들이 사용될 수 있다. 선택제가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있다. 한편, 본 출원에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 공지된 플라스미드 (예를 들어, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등)를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 출원에서 사용된 용어, "형질전환(transformation)"은 폴리뉴클레오티드를 숙주로 도입하여 폴리뉴클레오티드가 게놈 외 인자로서 또는 게놈에 삽입되어 원하는 유전자를 복제 가능하도록 유도하는 방법을 의미한다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
형질전환 과정에 있어서 상기 벡터 등을 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 펄스 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입 효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어, “L-라이신을 생산하는 미생물”은 본 출원의 목적상 L-라이신을 생산 또는 분비할 수 있는 미생물 균주로서, 본 출원에 따른 조작에 의해 야생형 또는 모균주보다 대량으로 또는 고농도로 배양 배지에 L-라이신을 생산하고 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 본 출원의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 또는 브레비박테리움 페르멘툼 (Brevibacterium fermentum) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그 한 예로, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있으며, 구체적으로 본 출원에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰(기탁번호 KCCM11877P)을 사용할 수 있다. 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 이 외에도 공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이 사용될 수 있다.
또한, 상기 공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 예로는 대한민국 등록특허 제10-0397322호, 대한민국 등록특허 제10-0924065호, 대한민국 등록특허 제10-0073610호, 또는/및 Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40에 기술된 미생물이 있으며, 상기 문헌의 내용 전체는 본 출원에 참고자료로서 전문이 포함된다.
다른 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물, 배양 배지 또는 상기 배양된 미생물 및 배양 배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 출원에서 사용되는 용어, "배양(culture)"은 미생물을 적당히 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 적당한 배지와 배양조건에 따라 수행할 수 있으며, 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batchculture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.
본 출원에서 사용되는 용어, "배지(media)"는 박테리아, 특히, 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 것으로서, 상기 미생물이 L-라이신을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다. 상기 배지는 상기 변이주의 배양을 위해 조성된 배지 성분과 함께 미생물이 생육 중에 배지 내로 배출시킨 다양한 물질을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 목적 물질인 L-라이신이 포함된 것일 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 속 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 상기 배지에서 탄소원은 예를 들어, 포도당(glucose), 설탕(sucrose), 구연산염(sodium citrate), 과당(fructose), 젖당(lactose) 또는 엿당(maltose)과 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
상기 배지에서 질소원은 예를 들어, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수 침지액, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소를 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 배지에 포함되는 무기염류는 마그네슘, 망간, 칼륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등을 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 개별적으로 또는 혼합물로써 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 출원의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배지의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예를 들어, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 20 내지 45℃일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-라이신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있으며, 10 내지 160 시간에서 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다. 상기 미생물을 배양한 배지, 상기 미생물, 또는 배양된 미생물 및 배양배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 DNA 라이브러리 제작
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 야생형 DNA 라이브러리를 제작하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 유전체 DNA를 추출한 후, 제한효소 Sau3AI(Takara)를 처리하여 2 내지 4 kb의 DNA 절편들을 선택적으로 획득하였다. 이를 제한효소 BamHI 말단을 가지는 pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 연결한 후 대장균 DH5α에 도입하고, 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 획득하였다. 무작위로 100개의 콜로니를 선택하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 목적한 2 내지 4 kb 가량의 DNA 절편이 삽입된 벡터를 포함하는 콜로니의 비율이 90% 이상임을 확인하였다. 획득한 모든 콜로니를 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 LB 액체배지에 접종하여 혼합 배양하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 추출하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 유전체 DNA 라이브러리를 완성하였다.
서열번호 5: 5'-ACGACGGGATCAGTACCGA - 3'
서열번호 6: 5'-AGCTATCTGTCGCAGCGCC - 3'
실시예 2: 유전체 DNA 라이브러리를 도입하여 라이신 생산능을 가지는 코리 네박테리움 속 균주 제작
상기 실시예 1에서 제작한 유전체 DNA 라이브러리를 통상적으로 알려진 전기펄스법을 이용하여 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하였다(상기 미생물은 KFCC010881로 공개되었다가, 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음. 대한민국 등록특허 제10-0159812호). 이후 유전체 DNA 라이브러리가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P를 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 복합평판 배지에 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 콜로니 약 2,000개를 획득하였다. 이후 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 복합액체배지 200㎕를 분주하고, 획득한 콜로니를 각각 접종한 후 30℃ 및 1,200 rpm의 조건에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하고, 상등액 50㎕를 라이신 옥시데이즈(lysine oxidase)를 함유하는 반응액과 혼합하였다.
<복합평판 배지 조성: 증류수 1L 기준>
포도당 20g, (NH4)2SO4 50g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 5g, K2HPO4 10g, MgSO47H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍, 한천 20g
<복합액체배지 조성: 증류수 1L 기준>
포도당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO47H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍
<반응액 조성: 인산칼륨 완충액(Potassium phosphate buffer) 1ml 기준>
라이신 옥시데이즈(lysine oxidase, Sigma-Aldrich) 0.02 unit, 과산화효소(Peroxidase, Sigma-Aldrich) 0.2 unit, ABTS 2mg
상등액 및 반응액을 혼합한 후, OD405에서의 흡광도를 30분간 분석하여 대조군(KCCM11016P/pECCG117)보다 높은 흡광도를 나타내는 14종의 실험군을 선별하였다. 각 실험군의 라이신 생산능을 확인하기 위해, 종배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃ 및 200 rpm의 조건에서 20시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 만들었다. 이후, 생산배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1㎖을 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 96시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였다(표 1).
<종배지 조성: 증류수 1L 기준>
포도당 20g, (NH4)2SO4 40g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH2PO4 4g, K2HPO4 8g, MgSO47H2O 0.5g, 이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍
<생산배지(pH 7.0) 조성: 증류수 1L 기준>
포도당 100g, (NH4)2SO4 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5g, 요소 3g, KH2PO4 1g, MgSO47H2O O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 3,000㎍, CaCO3 30g
[표 1a]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000001
[표 1b]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000002
상기 결과로부터 대조군 대비 라이신 생산능 증가 효과를 보이는 KCCM11016P/2-254 및 KCCM11016P/5-95를 선택하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 그 후, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 실시하고, KCCM11016P/2-254에서 유래한 플라스미드는 pEC-2-254, KCCM11016P/5-95에서 유래한 플라스미드는 pEC-5-95로 명명하였다.
서열 분석 결과, 플라스미드 pEC-2-254는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 플라스미드 pEC-5-95는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있었으며, 이를 통해 상기 2종의 플라스미드에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열이 공통적으로 포함되어 있음을 확인하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 HL1622, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 HL1623로 명명하고, 이하 HL1622 및 HL1623로 표기하였다.
실시예 3: HL1622, HL1623 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작
상기 실시예 2에서 확인한 HL1622 및 HL1623 유전자의 L-라이신 생산능 증가 효과를 분석하기 위하여, pDZTn 벡터(대한민국 등록특허 제10-1126041호)를 기본 벡터로 사용하여 두 유전자를 각각 또는 함께 코리네박테리움의 염색체에 추가 삽입하였다.
실시예 3-1: HL1622 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작
HL1622 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 7 및 8)를 합성하고, ATCC13032의 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 HL1622 개시코돈의 상단 500 bp 부위에서 종결코돈의 하단 약 149 bp를 포함하는 약 1,520 bp의 DNA 단편을 획득하였다.
서열번호 7: 5'-AAACTAGTGCGGAGTACTAGGTCGTG-3'
서열번호 8: 5'-AAACTAGTTTATGAATTCGGCTCCAA-3'
(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)
PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소 SpeI으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTn 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 이용하여 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1622라 명명하였다.
실시예 3-2: HL1623 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작
HL1623 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 9 및 10)를 합성하고, 실시예 3-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 HL1623 개시코돈의 상단 500 bp 부위에서부터 종결코돈의 하단 150 bp를 포함하는 약 1,304 bp 길이의 DNA 단편을 획득하였다. 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTn 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.
서열번호 9: 5'-AAACTAGTGGAATCGGCGGTTTAGTG-3'
서열번호 10: 5'-AAACTAGTCTGATCAATAACCTCC-3'
(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)
PCR을 이용하여 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1623라 명명하였다.
실시예 3-3: HL1622 및 HL1623 유전자 염색체 동시 삽입용 벡터 제작
HL1622 및 HL1623 동시 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 서열번호 7 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 ATCC13032의 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 HL1622 개시코돈의 상단 500 bp 및 HL1622와 HL1623이 연결된 2,473 bp의 DNA 단편을 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃에서 120초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응하여 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 상기와 동일한 방법으로 pDZTn 벡터에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1622-HL1623라 명명하였다.
실시예 4: HL1622, HL1623 및 상기 두 유전자 삽입 균주의 라이신 생산능 분석
상기 실시예 3에서 제작한 3종의 벡터인 pDZTn-HL1622, pDZTn-HL1623 및 pDZTn-HL1622-HL1623의 라이신 생산능을 분석하기 위하여 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 각각 형질전환시켰다. 이후 염색체상에 목적 유전자가 삽입된 균주를 PCR을 이용하여 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::HL1622(Tn), KCCM11016P::HL1623(Tn) 및 KCCM11016P::HL1622-HL1623(Tn)으로 명명하였다.
상기 균주 3종과 KCCM11016P 균주를 종배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃ 및 200 rpm에서 20시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 만들었다. 그 후, 1㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 96시간 동안 진탕 배양한 후 각 배양물에 포함된 L-라이신의 농도를 측정하여 비교하였다(표 2).
<생산배지(pH 7.0): 증류수 1리터 기준>
포도당 100g, 암모늄 아세트산 7.1g(첨가 혹은 비첨가), (NH4)2SO4 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분 5g, 요소 3g, KH2PO4 1g, MgSO47H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 3,000㎍, CaCO3 30g
[표 2]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000003
L-라이신의 농도 분석 결과, 대조군 KCCM11016P 균주와 비교하여 L-라이신 생산능이 KCCM11016P::HL1622(Tn) 균주는 6%, KCCM11016P::HL1622-HL1623(Tn) 균주는 5% 증가하는 것을 확인하였다. HL1623 유전자가 추가 삽입된 KCCM11016P::HL1623(Tn) 균주는 L-라이신 생산능이 대조군 균주와 비교하여 동등하였다. 상기 결과를 통해 HL1622 유전자만이 L-라이신 생산능 증가에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 5: 강력한 프로모터에 의한 HL1622 과발현 균주 제작 및 효과 확인
HL1622를 과발현하는 경우 L-라이신 생산능이 증가하는지 확인하기 위하여 기존에 보고된 강력한 프로모터인 pcj7 프로모터(WO 2009/096689)를 HL1622 상부에 삽입하였다. pDZ 벡터를 기본 벡터로 하여 염색체 삽입용 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 11) 및 5' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 12)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 pcj7 균주의 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 약 297 bp 길이의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.
서열번호 11: 5'-AACTCGAGATAGGGAGCGTTGACCTT-3'
서열번호 12: 5'-GGCATATGTGTTTCCTTTCGTTGGG-3'
(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)
이후, 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 13) 및 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 14)를 합성하고, ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기와 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 약 495 bp 길이의 HL1622의 DNA 단편을 증폭하였다.
서열번호 13: 5'-CACATATGCCCAAATACATTGCCAT-3'
서열번호 14: 5'-AAACTAGTATCCAGCTTCAGGTTTCGCA-3'
(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)
또한, 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 15) 및 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 16)를 합성하고, ATCC13032 염색체를 주형으로 상기와 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 496 bp 길이의 HL1622 상부 부위를 증폭하였다.
서열번호 15: 5'-AATCTAGAAGTACTAGGTCGTGTGCTGT-3'
서열번호 16: 5'-AACTCGAGTTGGTTCTGCTTTCACTAAA-3'
(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)
PCR로 증폭된 상기 HL1622 상부 DNA 단편을 XbaI 및 XhoI으로 처리하여 얻은 DNA 절편, pcj7 DNA 단편을 제한효소 XhoI 및 NdeI으로 처리하여 획득한 DNA 절편, 및 HL1622 DNA 단편을 제한효소 NdeI과 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA 절편을 함께 제한효소 XbaI 말단을 가지는 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25 mg/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하여 pDZ-pcj7_HL1622라 명명하였다.
제작한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 염색체상에서의 상동 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. PCR을 통해 HL1622 유전자의 프로모터가 pcj로 교체된 콜로니를 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::pcj7_HL1622이라고 명명하였다.
KCCM11016P::pcj7_HL1622 균주 및 대조군 KCCM11016P 균주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 후 각 배양물에 포함된 라이신의 농도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, KCCM11016P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM11016P 균주와 비교하여 8% 증가함을 확인하였으며, 이는 HL1622 발현량이 증가할수록 L-라이신 생산능이 증가함을 다시 한번 확인하였다(표 3).
[표 3]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000004
이에, 본 발명자들은 상기 L-라이신 생산능이 증가한 KCCM11016P::pcj7-HL1622 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2300"로 명명하고, 2016년 8월 2일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11877P를 부여받았다.
실시예 6: KCCM10770P에서 HL1622이 과발현된 미생물을 이용한 라이신 생산
상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생합성 경로 관련 유전자 3종이 염색체에 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 형질전환시켰다. 그 후 PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, KCCM10770P::pcj7- HL1622라고 명명하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주를 배양하고, 배양액 중의 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 KCCM10770P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM10770P 균주와 비교하여 5% 증가함을 확인하였다(표 4).
[표 4]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000005
실시예 7: CJ3P에서 HL1622이 과발현된 미생물을 이용한 라이신 생산
상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3종이 염색체에 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 형질전환시켰다. 그 후 PCR을 통해 콜로니를 선택적으로 분리하여 CJ3P::pcj7-HL1622라고 명명하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주를 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, CJ3P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 CJ3P 균주와 비교하여 32% 증가함을 확인하였다(표 5).
[표 5]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000006
실시예 8: KFCC10750에서 HL1622이 과발현 미생물을 이용한 라이신 생산
상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3종이 염색체 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P에 형질전환시켰다(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11347P를 부여받았음. 대한민국 등록특허 제10-0073610호). 그 후 PCR을 통해 콜로니를 선택적으로 분리하여 KCCM11347P::pcj7-HL1622라고 명명하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, KCCM11347P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM11347P 균주와 비교하여 32% 증가함을 확인하였다(표 6).
[표 6]
Figure PCTKR2017014369-appb-I000007
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 본 출원의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 예시적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 출원의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 변형된 형태는 본 출원에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Figure PCTKR2017014369-appb-I000008

Claims (4)

  1. 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화된 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제1항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 미생물, 배양 배지 또는 상기 배양된 미생물 및 배양 배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신을 생산하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-라이신을 생산하는 방법.
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