KR101917480B1 - Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ－라이신의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ－라이신의 생산방법{Corynebacteria producing L-lysine and a method of producing L-lysine using the same}

본 출원은 Ｌ－라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법에 관한 것이다.

L-라이신(L-lysine)은 생체 내에서 합성되지 않는 필수 아미노산 중의 하나로서 소아 발육성장 촉진, 칼슘대사 관여, 호르몬 및 항체 형성, 위액 분비촉진 및 병에 대한 저항력 증가에 필요한 것으로 알려져 있다. 산업적으로는 동물사료, 의약품 및 화장품 제조에 사용되며, L-라이신의 효율적 생산을 위하여 고효율 생산균주 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 이러한 연구에는 L-라이신 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(대한민국 등록특허 제10-0838038호).

또한, 생합성 경로 관련 유전자 이외에도 특정 유전자의 활성이 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제10-2014-0042397호에는 내재적 활성과 비교하여 아세트산 키나아제 활성이 강화된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1498630호에는 코리네박테리움 글루타미쿰의 NCg10862 유전자가 과발현되도록 변형되어 L-라이신 생산능이 향상된 코리네 박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법이 개시되어 있다.

본 발명자들은 L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 유효 형질을 탐색하기 위하여 코리네박테리움 속 미생물의 내재적 유전자를 무작위적으로 도입시킴으로써, 특정 유전자의 발현량을 증가시킬 경우 L-라이신 생산능이 증가한다는 사실을 확인하였다.

대한민국 등록특허 제10-0838038호 대한민국 특허출원 제10-2014-0042397호 대한민국 등록특허 제10-1498630호

본 출원의 일 양상은 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화되어 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 양상은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 L-라이신 생산방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 일 양상은 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화되어 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 출원에서 사용된 용어, "L-라이신(L-lysine)"은 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이다. L-라이신은 옥살아세트산(oxaloacetate)으로부터 라이신 생합성 경로를 통해 생합성되며, NADPH 의존성 환원효소가 라이신 생합성을 위한 중간과정을 촉매한다. 1 분자의 L-라이신 생합성 과정에서 3 분자의 NADPH가 당 효소들에 의해 직접적으로 소모되며, 1 분자의 NADPH가 간접적으로 이용된다.

구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 상기 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)를 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 출원의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.

예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 서열번호 1의 아미노산 서열의 폴리펩타이드에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환도 본 출원의 범위내에 포함된다. 상기 기술은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York(1979)).

본 출원에서 사용된 용어, "실질적인 동일성 또는 상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NCBI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 출원의 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열이며, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 출원의 발명에 포함될 수 있음은 자명하다. 뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열(perfectly complementary sequence)뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열(substantially complementary sequence)도 포함한다. 실질적으로 상보적인 서열은 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서 상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 용어, "엄격 조건(stringent conditions)"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 상기 엄격 조건은 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다.

예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.

본 출원에서 사용된 용어, "뉴클레오티드(nucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로서, RNA 게놈 서열, cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 출원에서 용어, '활성의 강화'는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성이 이에 상응하는 숙주 미생물의 내재적 또는 비변이 폴리펩타이드의 활성에 비하여 증가된 것을 의미한다. 본 출원에서, 용어 “활성 증가”는 “활성 강화”와 병용하여 사용될 수 있다. 나아가, 본 출원의 폴리펩티드의 활성을 강화하는 경우 야생형, 천연형 또는 비변이 미생물에 비해 결과적으로 더 높은 수준으로 L-라이신을 생산할 수 있다.

구체적으로, 본원에서 활성 증가는,

1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형,

4) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는

5) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터에 본원의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터, lysCP1 프로모터 (WO2009/096689) 혹은 CJ7 프로모터 (대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

또한, 4) 외래 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

마지막으로, 5) 상기 1) 내지 4)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

본 출원에서 용어, "벡터(vector)"는 목적 유전자나 DNA를 발현 시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 유전자나 NDA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하며, 다시 말해 이를 숙주세포로 전달하여 많은 수로 복제되거나, 단백질로 발현될 수 있도록 하는 운반체를 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 상기 벡터는 숙주세포 내로의 도입 또는 염색체 내로 삽입되었는지 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 의한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능한 표현형을 부여하는 다양한 마커들이 사용될 수 있다. 선택제가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함할 수 있다. 한편, 본 출원에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 공지된 플라스미드 (예를 들어, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등)를 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 폴리뉴클레오티드의 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 폴리뉴클레오티드 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 출원에서 사용된 용어, "형질전환(transformation)"은 폴리뉴클레오티드를 숙주로 도입하여 폴리뉴클레오티드가 게놈 외 인자로서 또는 게놈에 삽입되어 원하는 유전자를 복제 가능하도록 유도하는 방법을 의미한다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.

형질전환 과정에 있어서 상기 벡터 등을 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 펄스 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.

상기 숙주 세포로는 DNA의 도입 효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

본 출원에서 사용된 용어, "L-라이신을 생산하는 미생물"은 본원의 목적상 L-라이신을 생산 또는 분비할 수 있는 미생물 균주로서, 본원에 따른 조작에 의해 야생형 또는 모균주보다 대량으로 또는 고농도로 배양 배지에 L-라이신을 생산하고 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 본원의 서열번호1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화된 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있으며, 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 또는 브레비박테리움 페르멘툼 (Brevibacterium fermentum) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그 한 예로, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있으며, 구체적으로 본 출원에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰(기탁번호 KCCM11877P)을 사용할 수 있다. 이들 예에 한정되는 것은 아니며, 이 외에도 공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물이 사용될 수 있다.

또한, 상기 공지된 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물의 예로는 대한민국 등록특허 제10-0397322호, 대한민국 등록특허 제10-0924065호, 대한민국 등록특허 제10-0073610호, 또는/및 Binder et al., Genome Biology 2012, 13:R40에 기술된 미생물이 있으며, 상기 문헌의 내용 전체는 본원에 참고자료로서 전문이 포함된다.

본 출원의 또 다른 양상은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물, 배양 배지 또는 상기 배양된 미생물 및 배양 배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

본 출원에서 사용되는 용어, "배양(culture)"은 미생물을 적당히 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 적당한 배지와 배양조건에 따라 수행할 수 있으며, 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batchculture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 방법은, 예를 들면, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991) 등에 개시되어 있다.

본 출원에서 사용되는 용어, "배지(media)"는 박테리아, 특히, 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 것으로서, 상기 미생물이 L-라이신을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다. 상기 배지는 상기 변이주의 배양을 위해 조성된 배지 성분과 함께 미생물이 생육 중에 배지 내로 배출시킨 다양한 물질을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 목적 물질인 L-라이신이 포함된 것일 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 속 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 상기 배지에서 탄소원은 예를 들어, 포도당(glucose), 설탕(sucrose), 구연산염(sodium citrate), 과당(fructose), 젖당(lactose) 또는 엿당(maltose)과 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

상기 배지에서 질소원은 예를 들어, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수 침지액, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소를 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 배지에 포함되는 무기염류는 마그네슘, 망간, 칼륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등을 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 개별적으로 또는 혼합물로써 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 출원의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배지의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예를 들어, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 20 내지 45℃일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-라이신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있으며, 10 내지 160시간에서 달성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다. 상기 미생물을 배양한 배지, 상기 미생물, 또는 배양된 미생물 및 배양배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 출원에 따른 재조합 벡터를 도입한 코리네박테리움 속 미생물은 향상된 L-라이신 생산능을 가진다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 DNA 라이브러리 제작

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 야생형 DNA 라이브러리를 제작하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에서 genomic DNA를 추출한 후, 제한효소 Sau3AI(Takara)를 처리하여 2 내지 4 kb의 DNA 절편들을 선택적으로 획득하였다. 이를 제한효소 BamHI 말단을 가지는 pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 연결한 후 대장균 DH5α에 도입하고, 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 획득하였다. 무작위로 100개의 콜로니를 선택하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 목적한 2 내지 4 kb 가량의 DNA 절편이 삽입된 벡터를 포함하는 콜로니의 비율이 90% 이상임을 확인하였다. 획득한 모든 콜로니를 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 LB 액체배지에 접종하여 혼합 배양하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 추출하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 genomic DNA 라이브러리를 완성하였다.

서열번호 5: 5'-ACGACGGGATCAGTACCGA - 3'

서열번호 6: 5'-AGCTATCTGTCGCAGCGCC - 3'

실시예 2: genomic DNA 라이브러리를 도입하여 라이신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 균주 제작

상기 실시예 1에서 제작한 genomic DNA 라이브러리를 통상적으로 알려진 전기펄스법을 이용하여 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하였다(상기 미생물은 KFCC010881로 공개되었다가, 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음. 대한민국 등록특허 제10-0159812호). 이후 genomic DNA 라이브러리가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P를 카나마이신(25㎎/ℓ)이 포함된 복합평판 배지에 도말하고, 30에서 24시간 동안 배양하여 콜로니 약 2,000개를 획득하였다. 이후 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 복합액체배지 200㎕를 분주하고, 획득한 콜로니를 각각 접종한 후 30℃ 및 1,200 rpm의 조건에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하고, 상등액 50㎕를 라이신 옥시데이즈(lysine oxidase)를 함유하는 반응액과 혼합하였다.

<복합평판 배지 조성: 증류수 1L 기준>

포도당 20g, (NH₄)₂SO₄ 50g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 5g, K₂HPO₄ 10g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍, 한천 20g

<복합액체배지 조성: 증류수 1L 기준>

포도당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍

<반응액 조성: Potassium phosphate buffer 1ml 기준>

라이신 옥시데이즈(lysine oxidase, Sigma-Aldrich) 0.02 unit, 과산화효소(Peroxidase, Sigma-Aldrich) 0.2 unit, ABTS 2mg

상등액 및 반응액을 혼합한 후, OD₄₀₅에서의 흡광도를 30분간 분석하여 대조군(KCCM11016P/pECCG117)보다 높은 흡광도를 나타내는 14종의 실험군를 선별하였다. 각 실험군의 라이신 생산능을 확인하기 위해, 종배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30 및 200 rpm의 조건에서 20시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 만들었다. 이후, 생산배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 상기 종배양액 1㎖을 접종하고, 37 및 200 rpm에서 96시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 L-라이신의 농도를 분석하였다(표 1).

<종배지 조성: 증류수 1L 기준>

포도당 20g, (NH₄)₂SO₄ 40g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 2,000㎍

<생산배지(pH 7.0) 조성: 증류수 1L 기준>

포도당 100g, (NH₄)₂SO₄ 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5g, 요소 3g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄7H₂O O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 3,000㎍, CaCO₃ 30g

상기 결과로부터 대조군 대비 라이신 생산능 증가 효과를 보이는 KCCM11016P/2-254 및 KCCM11016P/5-95를 선택하고, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 그 후, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 염기서열 분석을 실시하고, KCCM11016P/2-254에서 유래한 플라스미드는 pEC-2-254, KCCM11016P/5-95에서 유래한 플라스미드는 pEC-5-95로 명명하였다.

서열 분석 결과, 플라스미드 pEC-2-254는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 플라스미드 pEC-5-95는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있었으며, 이를 통해 상기 2종의 플라스미드에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열이 공통적으로 포함되어 있음을 확인하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 HL1622, 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 HL1623로 명명하고, 이하 HL1622 및 HL1623로 표기하였다.

실시예 3: HL1622, HL1623 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작

상기 실시예 2에서 확인한 HL1622 및 HL1623 유전자의 L-라이신 생산능 증가 효과를 분석하기 위하여, pDZTn 벡터(대한민국 등록특허 제10-1126041호)를 기본 벡터로 사용하여 두 유전자를 각각 또는 함께 코리네박테리움의 염색체에 추가 삽입하였다.

실시예 3-1: HL1622 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작

HL1622 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 7 및 8)를 합성하고, ATCC13032의 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 HL1622 개시코돈의 상단 500 bp 부위에서 종결코돈의 하단 약 149 bp를 포함하는 약 1,520 bp의 DNA 단편을 획득하였다.

서열번호 7: 5'-AAACTAGTGCGGAGTACTAGGTCGTG-3'

서열번호 8: 5'-AAACTAGTTTATGAATTCGGCTCCAA-3'

(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)

PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃ 90초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 제한효소 SpeI으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후, 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTn 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 이용하여 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1622라 명명하였다.

실시예 3-2: HL1623 유전자 염색체 추가 삽입용 벡터 제작

HL1623 추가 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 보고된 염기서열에 근거하여 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 9 및 10)를 합성하고, 실시예 3-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 HL1623 개시코돈의 상단 500 bp 부위에서부터 종결코돈의 하단 150 bp를 포함하는 약 1,304 bp 길이의 DNA 단편을 획득하였다. 이를 제한효소 SpeI 말단을 가지는 pDZTn 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.

서열번호 9: 5'-AAACTAGTGGAATCGGCGGTTTAGTG-3'

서열번호 10: 5'-AAACTAGTCTGATCAATAACCTCC-3'

(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)

PCR을 이용하여 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1623라 명명하였다.

실시예 3-3: HL1622 및 HL1623 유전자 염색체 동시 삽입용 벡터 제작

HL1622 및 HL1623 동시 삽입용 벡터를 제작하기 위하여, 서열번호 7 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 ATCC13032의 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 HL1622 개시코돈의 상단 500 bp 및 HL1622와 HL1623이 연결된 2,473 bp의 DNA 단편을 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃에서 120초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응하여 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA 단편을 상기와 동일한 방법으로 pDZTn 벡터에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적 유전자가 삽입된 벡터로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였으며, 이를 pDZTn-HL1622-HL1623라 명명하였다.

실시예 4: HL1622, HL1623 및 상기 두 유전자 삽입 균주의 라이신 생산능 분석

상기 실시예 3에서 제작한 3종의 벡터인 pDZTn-HL1622, pDZTn-HL1623 및 pDZTn-HL1622-HL1623의 라이신 생산능을 분석하기 위하여 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 각각 형질전환시켰다. 이후 염색체상에 목적 유전자가 삽입된 균주를 PCR을 이용하여 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::HL1622(Tn), KCCM11016P::HL1623(Tn) 및 KCCM11016P::HL1622-HL1623(Tn)으로 명명하였다.

상기 균주 3종과 KCCM11016P 균주를 종배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃ 및 200 rpm에서 20시간 동안 진탕 배양하여 종배양액을 만들었다. 그 후, 1㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm에서 96시간 동안 진탕 배양한 후 각 배양물에 포함된 L-라이신의 농도를 측정하여 비교하였다(표 2).

<생산배지(pH 7.0): 증류수 1리터 기준>

포도당 100g, 암모늄 아세트산 7.1g(첨가 혹은 비첨가), (NH₄)₂SO₄ 40g, 대두 단백질 2.5g, 옥수수 침지 고형분 5g, 요소 3g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1,000㎍, 칼슘-판토텐산 2,000㎍, 니코틴아미드 3,000㎍, CaCO₃ 30g

L-라이신의 농도 분석 결과, 대조군 KCCM11016P 균주와 비교하여 L-라이신 생산능이 KCCM11016P::HL1622(Tn) 균주는 6%, KCCM11016P::HL1622-HL1623(Tn) 균주는 5% 증가하는 것을 확인하였다. HL1623 유전자가 추가 삽입된 KCCM11016P::HL1623(Tn) 균주는 L-라이신 생산능이 대조군 균주와 비교하여 동등하였다. 상기 결과를 통해 HL1622 유전자만이 L-라이신 생산능 증가에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5: 강력한 프로모터에 의한 HL1622 과발현 균주 제작 및 효과 확인

HL1622를 과발현하는 경우 L-라이신 생산능이 증가하는지 확인하기 위하여 기존에 보고된 강력한 프로모터인 pcj7 프로모터(WO 2009/096689)를 HL1622 상부에 삽입하였다. pDZ 벡터를 기본 벡터로 하여 염색체 삽입용 벡터를 제작하였다.

구체적으로, 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 11) 및 5' 말단에 Nde 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 12)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 pcj7 균주의 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 약 297 bp 길이의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링 및 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응 하여 수행하였다.

서열번호 11: 5'-AACTCGAGATAGGGAGCGTTGACCTT-3'

서열번호 12: 5'-GGCATATGTGTTTCCTTTCGTTGGG-3'

(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)

이후, 5' 말단에 NdeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 13) 및 5' 말단에 SpeI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 14)를 합성하고, ATCC 13032의 염색체를 주형으로 상기와 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 약 495 bp 길이의 HL1622의 DNA 단편을 증폭하였다.

서열번호 13: 5'-CACATATGCCCAAATACATTGCCAT-3'

서열번호 14: 5'-AAACTAGTATCCAGCTTCAGGTTTCGCA-3'

(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)

또한, 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 15) 및 5' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 16)를 합성하고, ATCC13032 염색체를 주형으로 상기와 동일한 조건에서 PCR을 수행하여 496 bp 길이의 HL1622 상부 부위를 증폭하였다.

서열번호 15: 5'-AATCTAGAAGTACTAGGTCGTGTGCTGT-3'

서열번호 16: 5'-AACTCGAGTTGGTTCTGCTTTCACTAAA-3'

(염기서열상의 밑줄 친 부분은 제한효소에 대한 인식 부위를 나타낸다.)

PCR로 증폭된 상기 HL1622 상부 DNA 단편을 XbaI 및 XhoI으로 처리하여 얻은 DNA 절편, pcj7 DNA 단편을 제한효소 XhoI 및 NdeI으로 처리하여 획득한 DNA 절편, 및 HL1622 DNA 단편을 제한효소 NdeI과 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA 절편을 함께 제한효소 XbaI 말단을 가지는 pDZ 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25㎎/ℓ의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하여 pDZ-pcj7_HL1622라 명명하였다.

제작한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 염색체상에서의 상동 재조합에 의해 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 형질전환시켰다. PCR을 통해 HL1622 유전자의 프로모터가 pcj로 교체된 콜로니를 선택적으로 분리하고, KCCM11016P::pcj7_HL1622이라고 명명하였다.

KCCM11016P::pcj7_HL1622 균주 및 대조군 KCCM11016P 균주를 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 후 각 배양물에 포함된 라이신의 농도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, KCCM11016P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM11016P 균주와 비교하여 8% 증가함을 확인하였으며, 이는 HL1622 발현량이 증가할수록 L-라이신 생산능이 증가함을 다시 한번 확인하였다(표3).

이에, 본 발명자들은 상기 L-라이신 생산능이 증가한 KCCM11016P::pcj7-HL1622 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 "CA01-2300"로 명명하고, 2016년 8월 2일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여, 기탁번호 KCCM11877P를 부여받았다.

실시예 6: KCCM10770P에서 HL1622이 과발현된 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생합성 경로 관련 유전자 3종이 염색체에 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 형질전환시켰다. 그 후 PCR 방법으로 콜로니를 선택적으로 분리하고, KCCM10770P::pcj7- HL1622라고 명명하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주를 배양하고, 배양액 중의 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 KCCM10770P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM10770P 균주와 비교하여 5% 증가함을 확인하였다(표 4).

실시예 7: CJ3P에서 HL1622이 과발현된 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3종이 염색체에 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 형질전환시켰다. 그 후 PCR을 통해 콜로니를 선택적으로 분리하여 CJ3P::pcj7-HL1622라고 명명하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주를 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, CJ3P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 CJ3P 균주와 비교하여 32% 증가함을 확인하였다(표 5).

실시예 8: KFCC10750에서 HL1622이 과발현 미생물을 이용한 라이신 생산

상기 실시예 5에서 제조한 벡터 pDZ-pcj7_HL1622를 L-라이신 생산능 향상 관련 유전자 3종이 염색체 삽입된 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P에 형질전환시켰다(상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11347P를 부여받았음. 대한민국 등록특허 제10-0073610호). 그 후 PCR을 통해 콜로니를 선택적으로 분리하여 KCCM11347P::pcj7-HL1622라고 명명하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 이로부터 회수된 L-라이신의 농도를 분석하였다. 그 결과, KCCM11347P::pcj7-HL1622 균주의 L-라이신 생산능이 대조군 KCCM11347P 균주와 비교하여 32% 증가함을 확인하였다(표 6).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 예시적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 변형된 형태는 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11877P 20160802

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Corynebacteria producing L-lysine and a method of producing L-lysine using the same <130> PN150224 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 339 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Pro Lys Tyr Ile Ala Met Gln Val Ser Glu Ser Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Ala Ala Asn Leu Val Gln Pro Ala Pro Leu Lys Ser Arg Glu Val Arg 20 25 30 Val Glu Ile Ala Ala Ser Gly Val Cys His Ala Asp Ile Gly Thr Ala 35 40 45 Ala Ala Ser Gly Lys His Thr Val Phe Pro Val Thr Pro Gly His Glu 50 55 60 Ile Ala Gly Thr Ile Ala Glu Ile Gly Glu Asn Val Ser Arg Trp Thr 65 70 75 80 Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Gly Trp Phe Gly Gly Asn Cys Gly Asp 85 90 95 Cys Ala Phe Cys Arg Ala Gly Asp Pro Val His Cys Arg Glu Arg Lys 100 105 110 Ile Pro Gly Val Ser Tyr Ala Gly Gly Trp Ala Gln Asn Ile Val Val 115 120 125 Pro Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ile Pro Asp Gly Met Asp Phe Tyr Glu 130 135 140 Ala Ala Pro Met Gly Cys Ala Gly Val Thr Thr Phe Asn Ala Leu Arg 145 150 155 160 Asn Leu Lys Leu Asp Pro Gly Ala Ala Val Ala Val Phe Gly Ile Gly 165 170 175 Gly Leu Val Arg Leu Ala Ile Gln Phe Ala Ala Lys Met Gly Tyr Arg 180 185 190 Thr Ile Thr Ile Ala Arg Gly Leu Glu Arg Glu Glu Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Gly Ala Asn His Tyr Ile Asp Ser Asn Asp Leu His Pro Gly Gln 210 215 220 Ala Leu Phe Glu Leu Gly Gly Ala Asp Leu Ile Leu Ser Thr Ala Ser 225 230 235 240 Thr Thr Glu Pro Leu Ser Glu Leu Ser Thr Gly Leu Ser Ile Gly Gly 245 250 255 Gln Leu Thr Ile Ile Gly Val Asp Gly Gly Asp Ile Thr Val Ser Ala 260 265 270 Ala Gln Leu Met Met Asn Arg Gln Ile Ile Thr Gly His Leu Thr Gly 275 280 285 Ser Ala Asn Asp Thr Glu Gln Thr Met Lys Phe Ala His Leu His Gly 290 295 300 Val Lys Pro Leu Ile Glu Arg Met Pro Leu Asp Gln Ala Asn Glu Ala 305 310 315 320 Ile Ala Arg Ile Ser Ala Gly Lys Pro Arg Phe Arg Ile Val Leu Glu 325 330 335 Pro Asn Ser <210> 2 <211> 1020 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 atgcccaaat acattgccat gcaggtatcc gaatccggtg caccgttagc cgcgaatctc 60 gtgcaacctg ctccgttgaa atcgagggaa gtccgcgtgg aaatcgctgc tagtggtgtg 120 tgccatgcag atattggcac ggcagcagca tcggggaagc acactgtttt tcctgttacc 180 cctggtcatg agattgcagg aaccatcgcg gaaattggtg aaaacgtatc tcggtggacg 240 gttggtgatc gcgttgcaat cggttggttt ggtggcaatt gcggtgactg cgctttttgt 300 cgtgcaggtg atcctgtgca ttgcagagag cggaagattc ctggcgtttc ttatgcgggt 360 ggttgggcac agaatattgt tgttccagcg gaggctcttg ctgcgattcc agatggcatg 420 gacttttacg aggccgcccc gatgggctgc gcaggtgtga caacattcaa tgcgttgcga 480 aacctgaagc tggatcccgg tgcggctgtc gcggtctttg gaatcggcgg tttagtgcgc 540 ctagctattc agtttgctgc gaaaatgggt tatcgaacca tcaccatcgc ccgcggttta 600 gagcgtgagg agctagctag gcaacttggc gccaaccact acatcgatag caatgatctg 660 caccctggcc aggcgttatt tgaacttggc ggggctgact tgatcttgtc tactgcgtcc 720 accacggagc ctctttcgga gttgtctacc ggtctttcta ttggcgggca gctaaccatt 780 atcggagttg atgggggaga tatcaccgtt tcggcagccc aattgatgat gaaccgtcag 840 atcatcacag gtcacctcac tggaagtgcg aatgacacgg aacagactat gaaatttgct 900 catctccatg gcgtgaaacc gcttattgaa cggatgcctc tcgatcaagc caacgaggct 960 attgcacgta tttcagctgg taaaccacgt ttccgtattg tcttggagcc gaattcataa 1020 1020 <210> 3 <211> 267 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Pro Thr Ala Ser Pro Ile Tyr Asp Val Val Val Val Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ile Ser Gly Leu Ile Ala Thr Gln Leu Leu Asp Arg Ala Gly Leu Asn 20 25 30 Ile Lys Cys Phe Glu Ala Cys Ser Arg Val Gly Gly Arg Ala Val Ser 35 40 45 Val Gln Gln Ser Asp Leu Phe Leu Asp Leu Gly Ala Thr Trp Phe Trp 50 55 60 Leu Asn Glu Pro Leu Val Gln Gln Leu Val Asn Asn Leu Gly Leu Gly 65 70 75 80 Thr Phe Pro Gln Ala Ile Glu Gly Asp Ala Leu Phe Glu Thr Leu Val 85 90 95 Asp Ala Pro Ser Arg Leu Arg Gly Asn Pro Ile Asp Ala Ala Ser Gly 100 105 110 Arg Phe Gln Ala Gly Ala Ser Ser Leu Ala Leu Gly Leu Ala Ala Gln 115 120 125 Leu Lys Pro Gly Val Leu Glu Leu Gly Asp Pro Val His Ser Leu Ser 130 135 140 Glu Glu Asp Gly Glu Ile Val Val Lys Ser Ser Lys Gln Ile Val Arg 145 150 155 160 Ala Lys His Val Ile Ile Ala Val Pro Pro Ala Leu Ala Ala Glu Leu 165 170 175 Ile Gly Phe Thr Leu Asp Leu Pro Ala Asp Val Arg Lys Ala Ala His 180 185 190 Pro Gln His Ile Ala Val Met Asn Trp Ala Lys Glu Lys Tyr Thr Leu 195 200 205 Pro Thr Gln Ala Ala Ser Ala Gly Gly Phe Gly His Glu Leu Phe Gln 210 215 220 Gln Pro Leu Gly His Gly Arg Ile His Trp Ala Ser Thr Glu Val Ala 225 230 235 240 Thr Glu Phe Gly Gly His Leu Glu Gly Ala Val Arg Ala Gly Ile Gln 245 250 255 Ala Ala Leu Gln Thr Gly Phe Asn Leu Lys Ser 260 265 <210> 4 <211> 804 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 atgccaacag caagcccaat ttatgatgtc gttgtcgtcg gagccggcat ttctggcctc 60 atcgccacgc aactgttgga ccgcgcaggt ctaaacatca aatgcttcga agcctgctca 120 agagttggcg gccgagcagt gtctgtccaa cagtccgatt tgttcctgga cctcggcgca 180 acatggttct ggctcaacga accacttgtg cagcaactcg tcaataatct cggcctcggc 240 acattccctc aggccatcga gggtgatgcg ctttttgaga cgcttgtcga cgccccgagc 300 cgcctgcggg gtaaccccat agacgctgct tcaggcaggt tccaagcagg ggcctcctcg 360 cttgcgctcg ggcttgcagc ccagctcaag ccaggagttt tagaactcgg ggaccccgtc 420 cattctctca gtgaggaaga tggggaaatc gttgtgaagt cttccaaaca gattgtgagg 480 gcaaagcacg tcatcattgc ggttccaccg gcactcgctg ccgagttgat tggtttcacc 540 ctagatttac cagctgacgt gcgaaaagca gcgcatccac aacatatagc tgtgatgaat 600 tgggcaaagg agaaatacac cttacccaca caagccgcat cggctggggg ttttgggcat 660 gagctgttcc aacaaccact cggacatggg cgaattcatt gggcatcaac ggaagttgcc 720 actgagtttg gtggacacct tgaaggcgca gttcgtgcag gaattcaggc tgcgcttcaa 780 acaggattta atctaaaatc ttaa 804 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 acgacgggat cagtaccga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 6 agctatctgt cgcagcgcc 19 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 7 aaactagtgc ggagtactag gtcgtg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 8 aaactagttt atgaattcgg ctccaa 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 9 aaactagtgg aatcggcggt ttagtg 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 10 aaactagtct gatcaataac ctcc 24 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 11 aactcgagat agggagcgtt gacctt 26 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 12 ggcatatgtg tttcctttcg ttggg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 13 cacatatgcc caaatacatt gccat 25 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 14 aaactagtat ccagcttcag gtttcgca 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 15 aatctagaag tactaggtcg tgtgctgt 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 16 aactcgagtt ggttctgctt tcactaaa 28 <210> 17 <211> 2195 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 17 ttccagtttg gcgatgccgt tggatagcgc aggttgggtg actccgtatt cgcgggctgc 60 tgcgctgaat gagtgagttt ctgcgacggc ctgcgcatag cggagccctt caaggctgag 120 ccgtttggtc ataactatat gttatccccc ttattcagag tgatggtcta ccggagaagt 180 acccagacca atagcatcga ccaacgatag cgcgctcaga agttctttag tgaaagcaga 240 accaaatgcc caaatacatt gccatgcagg tatccgaatc cggtgcaccg ttagccgcga 300 atctcgtgca acctgctccg ttgaaatcga gggaagtccg cgtggaaatc gctgctagtg 360 gtgtgtgcca tgcagatatt ggcacggcag cagcatcggg gaagcacact gtttttcctg 420 ttacccctgg tcatgagatt gcaggaacca tcgcggaaat tggtgaaaac gtatctcggt 480 ggacggttgg tgatcgcgtt gcaatcggtt ggtttggtgg caattgcggt gactgcgctt 540 tttgtcgtgc aggtgatcct gtgcattgca gagagcggaa gattcctggc gtttcttatg 600 cgggtggttg ggcacagaat attgttgttc cagcggaggc tcttgctgcg attccagatg 660 gcatggactt ttacgaggcc gccccgatgg gctgcgcagg tgtgacaaca ttcaatgcgt 720 tgcgaaacct gaagctggat cccggtgcgg ctgtcgcggt ctttggaatc ggcggtttag 780 tgcgcctagc tattcagttt gctgcgaaaa tgggttatcg aaccatcacc atcgcccgcg 840 gtttagagcg tgaggagcta gctaggcaac ttggcgccaa ccactacatc gatagcaatg 900 atctgcaccc tggccaggcg ttatttgaac ttggcggggc tgacttgatc ttgtctactg 960 cgtccaccac ggagcctctt tcggagttgt ctaccggtct ttctattggc gggcagctaa 1020 ccattatcgg agttgatggg ggagatatca ccgtttcggc agcccaattg atgatgaacc 1080 gtcagatcat cacaggtcac ctcactggaa gtgcgaatga cacggaacag actatgaaat 1140 ttgctcatct ccatggcgtg aaaccgctta ttgaacggat gcctctcgat caagccaacg 1200 aggctattgc acgtatttca gctggtaaac cacgtttccg tattgtcttg gagccgaatt 1260 cataatgcca acagcaagcc caatttatga tgtcgttgtc gtcggagccg gcatttctgg 1320 cctcatcgcc acgcaactgt tggaccgcgc aggtctaaac atcaaatgct tcgaagcctg 1380 ctcaagagtt ggcggccgag cagtgtctgt ccaacagtcc gatttgttcc tggacctcgg 1440 cgcaacatgg ttctggctca acgaaccact tgtgcagcaa ctcgtcaata atctcggcct 1500 cggcacattc cctcaggcca tcgagggtga tgcgcttttt gagacgcttg tcgacgcccc 1560 gagccgcctg cggggtaacc ccatagacgc tgcttcaggc aggttccaag caggggcctc 1620 ctcgcttgcg ctcgggcttg cagcccagct caagccagga gttttagaac tcggggaccc 1680 cgtccattct ctcagtgagg aagatgggga aatcgttgtg aagtcttcca aacagattgt 1740 gagggcaaag cacgtcatca ttgcggttcc accggcactc gctgccgagt tgattggttt 1800 caccctagat ttaccagctg acgtgcgaaa agcagcgcat ccacaacata tagctgtgat 1860 gaattgggca aaggagaaat acaccttacc cacacaagcc gcatcggctg ggggttttgg 1920 gcatgagctg ttccaacaac cactcggaca tgggcgaatt cattgggcat caacggaagt 1980 tgccactgag tttggtggac accttgaagg cgcagttcgt gcaggaattc aggctgcgct 2040 tcaaacagga tttaatctaa aatcttaaac ctcgtatttt ccctgatagg ctcagatgcg 2100 cctgaaatcg ggcttgttga ggggagaggt gtgtgacatg aaagagttgg aactgggcga 2160 ggcgagggac gtcgctgcaa cgttggaagc gatgc 2195 <210> 18 <211> 2792 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 18 cgagtccaag tgtggcccac tgttcgagta cttggtagct ggctgcttcg ccggaatagg 60 cgtttaatgc caggtcattt gtttcaaaca gttgattggt gaaagtggtt aaaccgcatg 120 tgtcgggtac cagaatgaac ggttcgtgct gagtctcgcg aagttctatg gggtcggtgc 180 tgtcctgggt ggattcgacg ataacgactg gttcggagtc aatgatgcgg tgttcaaaat 240 ggggtagtgg tttcactgcg ggaatgagaa ttacattaag ttcacctgca agaagtcctt 300 catgtagttc tttcatgttt gcttcgcgga gtactaggtc gtgtgctgtg ggaagctcac 360 gaaccgcggt atatgttcgt gcaaccagtt gagggttgat aagtggggag attccaactc 420 gaatgctgcg tgcttctgag ttaatcaaac ggtgcgcttc cgcggtgatt gcgtcgattt 480 cagtcagcgc gcgttggatc agggggagga tgtggaggcc aaaggacgtc ggggtgacgc 540 cttgagtaga tcgatcgaag agttgttcac cgagccgatc ttccagtttg gcgatgccgt 600 tggatagcgc aggttgggtg actccgtatt cgcgggctgc tgcgctgaat gagtgagttt 660 ctgcgacggc ctgcgcatag cggagccctt caaggctgag ccgtttggtc ataactatat 720 gttatccccc ttattcagag tgatggtcta ccggagaagt acccagacca atagcatcga 780 ccaacgatag cgcgctcaga agttctttag tgaaagcaga accaaatgcc caaatacatt 840 gccatgcagg tatccgaatc cggtgcaccg ttagccgcga atctcgtgca acctgctccg 900 ttgaaatcga gggaagtccg cgtggaaatc gctgctagtg gtgtgtgcca tgcagatatt 960 ggcacggcag cagcatcggg gaagcacact gtttttcctg ttacccctgg tcatgagatt 1020 gcaggaacca tcgcggaaat tggtgaaaac gtatctcggt ggacggttgg tgatcgcgtt 1080 gcaatcggtt ggtttggtgg caattgcggt gactgcgctt tttgtcgtgc aggtgatcct 1140 gtgcattgca gagagcggaa gattcctggc gtttcttatg cgggtggttg ggcacagaat 1200 attgttgttc cagcggaggc tcttgctgcg attccagatg gcatggactt ttacgaggcc 1260 gccccgatgg gctgcgcagg tgtgacaaca ttcaatgcgt tgcgaaacct gaagctggat 1320 cccggtgcgg ctgtcgcggt ctttggaatc ggcggtttag tgcgcctagc tattcagttt 1380 gctgcgaaaa tgggttatcg aaccatcacc atcgcccgcg gtttagagcg tgaggagcta 1440 gctaggcaac ttggcgccaa ccactacatc gatagcaatg atctgcaccc tggccaggcg 1500 ttatttgaac ttggcggggc tgacttgatc ttgtctactg cgtccaccac ggagcctctt 1560 tcggagttgt ctaccggtct ttctattggc gggcagctaa ccattatcgg agttgatggg 1620 ggagatatca ccgtttcggc agcccaattg atgatgaacc gtcagatcat cacaggtcac 1680 ctcactggaa gtgcgaatga cacggaacag actatgaaat ttgctcatct ccatggcgtg 1740 aaaccgctta ttgaacggat gcctctcgat caagccaacg aggctattgc acgtatttca 1800 gctggtaaac cacgtttccg tattgtcttg gagccgaatt cataatgcca acagcaagcc 1860 caatttatga tgtcgttgtc gtcggagccg gcatttctgg cctcatcgcc acgcaactgt 1920 tggaccgcgc aggtctaaac atcaaatgct tcgaagcctg ctcaagagtt ggcggccgag 1980 cagtgtctgt ccaacagtcc gatttgttcc tggacctcgg cgcaacatgg ttctggctca 2040 acgaaccact tgtgcagcaa ctcgtcaata atctcggcct cggcacattc cctcaggcca 2100 tcgagggtga tgcgcttttt gagacgcttg tcgacgcccc gagccgcctg cggggtaacc 2160 ccatagacgc tgcttcaggc aggttccaag caggggcctc ctcgcttgcg ctcgggcttg 2220 cagcccagct caagccagga gttttagaac tcggggaccc cgtccattct ctcagtgagg 2280 aagatgggga aatcgttgtg aagtcttcca aacagattgt gagggcaaag cacgtcatca 2340 ttgcggttcc accggcactc gctgccgagt tgattggttt caccctagat ttaccagctg 2400 acgtgcgaaa agcagcgcat ccacaacata tagctgtgat gaattgggca aaggagaaat 2460 acaccttacc cacacaagcc gcatcggctg ggggttttgg gcatgagctg ttccaacaac 2520 cactcggaca tgggcgaatt cattgggcat caacggaagt tgccactgag tttggtggac 2580 accttgaagg cgcagttcgt gcaggaattc aggctgcgct tcaaacagga tttaatctaa 2640 aatcttaaac ctcgtatttt ccctgatagg ctcagatgcg cctgaaatcg ggcttgttga 2700 ggggagaggt gtgtgacatg aaagagttgg aactgggcga ggcgagggac gtcgctgcaa 2760 cgttggaagc gatgccgatc caggaggtta tt 2792

Claims (4)

1. 서열번호 1의 폴리펩티드의 활성이 강화된 L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 코리네박테리움 속 미생물.
   
3. 제1항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
   상기 배양된 미생물, 배양 배지 또는 상기 배양된 미생물 및 배양 배지의 혼합물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는 L-라이신을 생산하는 방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-라이신을 생산하는 방법.