CN106434730A - 一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌进行表达的无抗表达系统及构建方法。其将利用低背景的木糖操纵子诱导表达的T7 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶再专一性转录T7启动子后目的基因的级联放大表达系统转入芽孢杆菌基因组中，并且删除了中间使用的筛选标记基因。其克服了抗生素筛选标记基因易发生漂移，质粒表达系统不稳定，表达不可诱导表达量不高的缺点，建立了一种低背景可控诱导且高效表达的无抗表达系统。结合枯草芽孢杆菌表达系统本身发酵成本低，可规模化生产，发酵产物可分泌到发酵液中，不含有内毒素等优点，给表达目的蛋白提供了一种全新的表达系统。

Description

一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法。

背景技术

蛋白表达技术是现代生物学的核心技术之一，表达蛋白不仅可用于生物学研究，也可以提供商业化的蛋白制品，如重组疫苗、重组胰岛素、细胞因子等产品。目前常用的表达系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等，但是它们都各有明显的优缺点。大肠杆菌表达系统研究最充分，有多种选择，最常用的是Novagen的pET表达系统，其利用噬菌体的T7RNA聚合酶可专一性地转录T7启动子后的目的基因，在最佳条件下，目的蛋白可以达到大肠杆菌总蛋白的50％以上。尽管具有表达效率高，培养成本低等优点，但是缺点也非常明显：蛋白容易形成包涵体，复性难度和成本较高；大肠杆菌不能对蛋白进行糖基化修饰；细胞壁含有脂多糖(内毒素)，不易完全去除。另外一个常用的表达系统是酵母表达系统，其具有表达量高，可诱导，蛋白分泌到胞外易于纯化，并且具有一定的翻译后修饰能力等优点，但是缺点是部分表达产物易降解，表达量不可控，大于30KDa的蛋白几乎不能分泌。动物细胞和昆虫细胞表达系统的特点是具有完整的修饰系统，表过产物具有或者类似的天然活性，没有内毒素污染，但是表达量低，周期长，技术要求高，生产成本高。这些表达系统还有一个共有的缺点，就是在构建表达系统的过程中需要使用筛选标记，一般都选择抗生素筛选标记，部分表达系统在生产使用的过程中仍然需要使用抗生素筛选标记和抗生素筛选，这都会带来一个问题——抗抗生素基因漂移，尤其是大规模生产的时候，将导致环境中耐药致病菌的产生。

枯草芽孢杆菌是一种广泛存在于水体、空气、土壤中的革兰氏阳性菌，其可以在环境不适宜的时候产生孢子，孢子可以抵御高温、干旱等极端环境，待环境适宜时再萌发进行营养生长。枯草芽孢杆菌的分泌能力强，在进行高密度发酵时，蛋白分泌量可以达到20—25g/L(Developments in the use of Bacillus species for industrial production，2004)。其发酵生产的蛋白酶、淀粉酶、次黄嘌呤核苷、核糖甙等产品，早已经进入我们的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA评委GRAS类添加剂，其生产的益生菌及利用其生产的发酵产品已广泛应用于医药和养殖业中。

上世纪八十年代就开始利用枯草芽孢杆菌进行蛋白表达，其表达产物不仅包括细菌来源的各种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、内葡聚糖酶、脂肪酶等，还包括hEGF、IFN-alpha 2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同来源的蛋白。利用枯草芽孢杆菌的分泌途径，可将表达蛋白分泌到发酵液中，极大地降低了后期分离纯化的难度。枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，不含有脂多糖，便于生产注射用药品。枯草芽孢杆菌的营养要求简单，由于其已经实现规模工业化生产，大规模培养技术成熟，培养成本低。目前，枯草芽孢杆菌中的多个菌株及芽孢杆菌属中的多个种都已经完成了基因组测序工作，遗传背景清楚，安全性高，也便于进行基因组改造。但是枯草芽孢杆菌表达系统并不是一个广泛应用的表达系统，还有许多缺点待克服。

枯草芽孢杆菌的模式菌168菌的野生型菌株已经丢失，目前可以得到的菌株都是其突变体。尽管其满足于科学研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是营养缺陷性突变体的特性，并不能满足建立商业化表达系统的要求。目前建立的转化系统都是基于模式菌株168建立的，尽管野生型来源的菌株和已经生产应用的枯草芽孢杆菌种非常多，不易转化都阻碍了对这些菌株的进一步改造。枯草芽孢杆菌来源的质粒也几乎都是隐蔽性质粒，不易构建载体；来源于其它革兰氏阳性菌的质粒多数都是滚环复制性质粒，在枯草芽孢杆菌中复制不稳定，易丢失，拷贝数较少；这些特性都限制了直接使用质粒构建稳定表达系统的可能性。枯草芽孢杆菌有四种分泌途径，Sec途径、Tat途径、Com系统和ABC转运途径，目前研究较清楚的是Sec途径，一些表达系统也利用Sec途径分泌表达蛋白。但是Sec途径具有调控机制，会抑制不正确折叠的蛋白分泌，而外源蛋白一般折叠较慢，折叠过程需要伴侣蛋白的参与，容易被Sec分泌途径降解。枯草芽孢杆菌还会分泌多达八种蛋白酶到发酵液中，其同样会降解表达的目的蛋白。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法，其将低背景的木糖操纵子诱导表达的T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶再专一性转录T7启动子后目的基因的级联放大表达系统转入芽孢杆菌基因组中，并且删除了中间使用的筛选标记基因。其克服了抗生素筛选标记基因易发生漂移，质粒表达系统不稳定，表达不可诱导表达量不高的缺点，建立了一种低背景可控诱导且高效表达的无抗表达系统。

解决以上技术问题的本发明中的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统，其特征在于：将表达系统元件插入芽孢杆菌的基因组中，删除抗性标记元件，建立无抗的表达系统。避免抗生素筛选标记基因漂移，其次可避免使用不稳定的质粒载体，提高系统稳定性。

优化方案所述表达系统为木糖—T7RNA聚合酶的级联放大表达系统。建立了一种基于低背景的木糖操纵子诱导表达T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶再特异性转录T7启动子后目的基因的级联放大表达系统，可有效解决可控诱导和增加表达量的问题，并且该表达系统利用温度敏感质粒pBAV1K的复制特性，被成功导入芽孢杆菌中的基因组中，删除抗生素标记基因，为低背景可控诱导且高效表达的无抗的表达系统。

所述表达系统的构建方法的具体步骤如下：

(1)PCR扩增wprA基因上游片段wprA-F和wprA基因下游片段wprA下游片段wprA-R，全基因合成xylR操纵子的xylR基因启动子及CDS区域和xylAB的启动子区域(xylR)，全基因合成T7RNA聚合酶基因的CDS片段(T7RP)，通过同源重组构建载体pBTS-T7RP。

pBTS-T7RP载体中的wprA基因片段，可以被芽孢杆菌基因组中的任意片段替换掉，其仅作为xylR-T7RP片段的插入位点，但是最佳片段为wprA基因片段，其可以敲除wprA基因，敲除后可以促进分泌蛋白分泌到发酵液中。

(2)转化pBTS-T7RP质粒进入枯草芽孢杆菌Z12，通过限制性培养和传代培养，分别在wprA-F和wprA-R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP。

(3)PCR扩增xylAB基因上游片段xyl-F和xylAB基因下游片段xyl-R，全基因合成T7启动子(PT7)、xylR结合位点、RBS位点、多克隆位点(MCS)和T7终止子片段(T7ter)，通过同源重组，构建pBTS-FR载体。

pBTS-FR载体中的xylAB基因片段，可以被芽孢杆菌基因组中的任意片段替换掉，其仅作为T7启动子终止子等片段的插入位点，但是最佳的片段为xylAB基因片段，其可以敲除木糖代谢基因，促进诱导表达。

(4)通过PCR扩增或者全基因合成任一需要表达的基因片段，通过酶切或者同源重组等方式插入到pBTS-FR的多克隆位点，构建表达载体pBTS-FR-X。

(5)转化pBTS-FR-X质粒进入枯草芽孢杆菌ZT7RP菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在xyl-F和xyl-R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有PT7-X-T7ter片段的菌株Z-X。

(6)接种Z-X到培养基中，培养温度为25-40℃，接种后0-8h加入0.01％-1％浓度的木糖进行诱导，如果培养基成分中含有木糖，可适当减少木糖添加量或者不添加木糖，培养一定时间后，即可收获菌体或者发酵液中的目标蛋白。

所述步骤(2)中菌株为枯草芽孢杆菌Z12菌株、其它芽孢杆菌和pBTS质粒进行温敏复制的革兰氏阳性菌株。

所述其它芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌。

所述步骤(4)中的表达载体还包括含有信号肽的表达载体，其将枯草芽孢杆菌的信号肽序列，尤其是sec途径中的信号肽，插入到待表达目的基因前，该融合蛋白在表达的时候将通过枯草芽孢杆菌的分泌途径直接将目的蛋白分泌到发酵液中。

所述pBTS-T7RP核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述pBTS-FR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中的表达系统的有益效果如下：

A、该表达系统的表达菌株，不含有抗性标记片段，避免了在大规模发酵生产时，表达菌株中的抗性标记片段通过基因漂移到其它致病菌中，产生耐药性致病菌的危险。

B、该表达系统的的表达系统元件已经插入到芽孢杆菌的基因组中，可以随基因组继续稳定复制，避免采用质粒载体时，表达菌株不能稳定传代的缺点。

C、该表达系统利用木糖诱导T7RNA聚合酶表达，T7RNA聚合酶专一性表达T7启动子后目的基因的级联放大表达系统，其具有表达量大，表达量可通过诱导进行调控的优点。

D、表达系统中含有xylR基因，其可增加芽孢杆菌xylR蛋白的量，在培养基中不含有木糖的情况下，可特异性地结合到T7RNA聚合酶前的xylR结合位点和待表达目的基因前的xylR结合位点，抑制T7RNA聚合酶和待表达目的基因的表达，整个表达系统的背景表达量极低，这样可以利用该表达系统表达一些具有毒性的目的蛋白。

E、该表达系统不仅可以进行胞内蛋白表达，也可以进行胞外表达，具有非常高的灵活性。

F、该表达系统的菌株为枯草芽孢杆菌菌株，其具有生物安全性高的特点。

附图说明

图1：pBTS-T7RP结构图

图2：pBTS-FR结构图

图3：pBTS-FR-GFP结构图

图4：Z12和ZGFP菌株表达效果图

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述:

实施例1

1、通过EcoR I和Apa I内切酶切割pBAV1K-T5-GFP质粒，与合成的MCS片段进行同源重组，得到质粒pBAV1K。

本实验及后续试验中的内切酶采用Thermo公司的快速内切酶，片段回收采用成都福际生物公司的胶回收试剂盒(DE-02011)，MCS片段由金唯智生物科技有限公司合成(序列如SEQ ID NO.4所示)，同源重组采用天根的EsayGeno快速重组克隆试剂盒(VI201-02)，大肠杆菌菌株为top10，制备感受态采用KCM法，质粒抽提采用福际生物的通用质粒小量提取试剂盒(DE-01001)。

2、设计引物，扩增同义突变删除Nde I酶切位点的pBAV1K片段，采用同源重组克隆的方式连接片段，获得质粒命名为pBTS。

本实验及后续实验中的引物由金唯智生物科技有限公司合成提供。

实施例2：

1、设计引物扩增wprA基因上游602bp的片段wprA-F；设计引物扩增wprA下游601bp的片段wprA-R；全基因合成xylR启动子以及CDS和xylAB的启动子区域片段xylR；全基因合成T7RNA聚合酶片段T7RP；通过同源重组构建载体pBTS-T7RP。

高保真酶采用toyobo的KOD-Plus高保真性聚合酶(KOD-201)。

2、电转化pBTS-T7RP进入Z12菌株，得到菌Z12-pBTS-T7RP。

3、取菌Z12-pBTS-T7RP接种到3ml LB培养基中，45℃，180rpm，培养24h；另接菌Z12-pBTS做对照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃过夜培养。若Z12-pBTS没有菌落生长，Z12-pBTS-T7RP有菌落生长，则得到的菌株完成第一次重组，命名为Z12-pBTS-T7RP-45。

5、接菌Z12-pBTS-T7RP-45到3ml LB培养基中，过夜培养，抽提基因组(成都福际生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，DE-05311)，PCR扩增xylR-T7RP片段进行验证(成都福际生物技术有限公司，2×快速PCR反应预混体系，DP-20041)。

6、取5中验证为阳性的Z12-pBTS-T7RP-45菌株，接种到3ml LB培养基中，37℃，180rpm培养，每隔8-16h传代一次，连续传代10次后，取菌液稀释10⁶倍，涂布于无抗的LB平板上，得到单菌落。

7、取5中的单菌落，同时划线到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，筛选无抗的菌落，需要得到5-10株无抗菌落。

8、取7中的无抗菌落，接种到3ml LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养，抽提细菌基因组，通过PCR扩增xylR-T7RP片段验证同源重组结果(野生型或者插入T7RP片段)。取阳性的片段，进行测序验证后得到阳性的菌株即为插入xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP。

实施例3：

1、菌株转化方法参见高渗转化法(High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis andBacillus licheniformis，1999)。取待转化菌株的新划线单菌落，接种到约3ml GM(LB+0.5M山梨糖醇)培养基中，37℃，180rpm过夜培养。第二天早上按1:100接种到50ml GM培养基中，37℃，180rpm培养，待菌液生长到OD达到0.85-0.95之间时，将菌液放到冰上预冷10min；4℃，5000g，5min，离心去上清，用等体积预冷的EM(0.5M山梨糖醇+0.5M甘露糖醇+10％甘油水溶液)重悬菌体，再次4℃，5000g，5min，离心去上清，一共重复洗涤4次；加入约1/40体积的EM重悬菌体，保证菌液浓度在1-1.3×10¹⁰cfu/ml之间。取60ul上述菌液，加入1ul待转化质粒，质粒浓度大于100ng/ul，吹打混匀，然后加入预冷的1mm电击杯。电转化仪(Eppendorf Eporator)参数设定，2.1kV，实际电击时间在4.0-5.0ms时，才可能有转化菌落生长。电击后。立即加1ml RM(LB+0.5M山梨糖醇+0.38M甘露糖醇)，吹打混匀，转入5ml无菌离心管中，37℃，180rpm培养3h。将菌液离心，去上清后按一定比例稀释，取200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，同时涂布未经电转化的菌液做阴性对照。第二天早上观察菌落生长情况，若转化板有菌落生长，阴性对照没有，则表明转化成功。

实施例4：

1、设计引物扩增xylAB基因上游493bp片段xyl-F；设计引物扩增xylAB基因下游585bp片段xyl-R；全基因合成T7启动子、xylR结合位点、RBS位点、多克隆位点、T7 终止子位点片段；通过同源重组上述三个片段与pBTS载体连接，构建质粒pBTS-FR。

实施例5：

1、全基因合成信号肽SPwapA和绿色荧光蛋白(GFP)片段，形成融合蛋白表达片段SPwapA-GFP，通过同源重组插入到pBTS-FR载体中，构建成载体pBTS-FR-GFP。pBTS-FR-GFP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、电转化pBTS-FR-GFP进入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP接种到3ml LB培养基中，45℃，180rpm，培养24h；另接菌ZT7RP-pBTS做对照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃过夜培养。若Z12-pBTS没有菌落生长，ZT7RP-pBTS-FR-GFP有菌落生长，则得到的菌株完成第一次重组，命名为ZT7RP-pBTS-FR-GFP-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP-45到3ml LB培养基中，过夜培养，抽提基因组(成都福际生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，DE-05311)，PCR扩增xyl片段进行验证(成都福际生物技术有限公司，2×快速PCR反应预混体系，DP-20041)。

6、取5中验证为阳性的Z12-pBTS-FR-GFP-45菌株，接种到3ml LB基中37℃，180rpm培养，每隔8-16h传代一次，连续传代10次后，取菌液稀释10⁶倍，涂布于无抗的LB平板上，得到单菌落。

7、取6中的单菌落，同时划线到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，筛选无抗的菌落，需要得到5-10株无抗菌落。

8、取7中的无抗菌落，接种到3ml LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养，抽提细菌基因组，通过PCR扩增GFP片段验证同源重组结果(野生型或者插入GFP基因)。取阳性的片段，送金唯智生物科技有限公司进一步进行测序验证，得到阳性的菌株即为插入GFP基因的菌株ZGFP。

7、取ZGFP菌株同时划线到LB平板和LB平板+0.25％木糖，另划线Z12做对照，37℃过夜培养。观察发现添加木糖诱导的ZGFP菌株有明显的绿色荧光蛋白表达，未添加木糖诱导的ZGFP菌株没有绿色荧光蛋白表达；Z12菌株不管在什么培养基中，都没有绿色荧光蛋白表达。详见附件图4。

8、接种ZGFP菌株到3ml液体LB培养基和3ml液体LB培养基+0.25％木糖，另接种Z12做对照。37℃，180rpm培养24h，离心去掉菌体沉淀，可以看到ZGFP菌添加木糖诱导后，发酵液呈现绿色荧光，但是未诱导的ZGFP菌株和Z12菌株发酵液并未出现绿色荧光。

实施例6：

1、全基因合成绿色荧光蛋白(GFP)片段，通过同源重组插入到pBTS-FR载体中，构建成载体pBTS-FR-GFP2。

2、电转化pBTS-FR-GFP2进入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2接种到3ml LB培养基中，45℃，180rpm，培养24h；另接菌ZT7RP-pBTS做对照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃过夜培养。若Z12-pBTS没有菌落生长，ZT7RP-pBTS-FR-GFP2有菌落生长，则得到的菌株完成第一次重组，命名为ZT7RP-pBTS-FR-GFP2-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2-45到3ml LB培养基中，过夜培养，抽提基因组(成都福际生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，DE-05311)，PCR扩增xyl片段进行验证(成都福际生物技术有限公司，2×快速PCR反应预混体系，DP-20041)。

6、取5中验证为阳性的Z12-pBTS-FR-GFP2-45菌株，接种到3ml LB基中37℃，180rpm培养，每隔8-16h传代一次，连续传代10次后，取菌液稀释10⁶倍，涂布于无抗的LB平板上，得到单菌落。

7、取6中的单菌落，同时划线到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，筛选无抗的菌落，需要得到5-10株无抗菌落。

8、取7中的无抗菌落，接种到3ml LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养，抽提细菌基因组，通过PCR扩增GFP片段验证同源重组结果(野生型或者插入GFP基因)。取阳性的片段，送金唯智生物科技有限公司进一步进行测序验证，得到阳性的菌株即为插入GFP基因的菌株ZGFP2。

7、接种ZGFP2菌株到3ml液体LB培养基和3ml液体LB培养基+0.25％木糖，另接种Z12做对照。37℃，180rpm培养24h，离心去掉上清，可以看到ZGFP2菌添加木糖诱导后，菌体呈现绿色荧光，但是未诱导的ZGFP2菌株和Z12菌株的菌体并未出现绿色荧光。

实施例7：

1、全基因合成BPN蛋白酶基因(BPN是解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶基因，本身含有信号肽，可以直接分泌到发酵液中)片段，通过NdeI和XhoI酶切插入到pBTS-FR载体中，构建成载体pBTS-FR-BPN。

2、电转化pBTS-FR-BPN进入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN接种到3ml LB培养基中，45℃，180rpm，培养24h；另接菌ZT7RP-pBTS做对照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃过夜培养。若Z12-pBTS没有菌落生长，ZT7RP-pBTS-FR-BPN有菌落生长，则得到的菌株完成第一次重组，命名为ZT7RP-pBTS-FR-BPN-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN-45到3ml LB培养基中，过夜培养，抽提基因组(成都福际生物技术有限公司，细菌基因组DNA提取试剂盒，DE-05311)，PCR扩增BPN片段进行验证(成都福际生物技术有限公司，2×快速PCR反应预混体系，DP-20041)。

6、取5中验证为阳性的Z12-pBTS-FR-BPN-45菌株，接种到3ml LB基中37℃，180rpm培养，每隔8-16h传代一次，连续传代8次后，取菌液稀释10⁶倍，涂布于无抗的LB平板上，得到单菌落。

7、取6中的单菌落，同时划线到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，筛选无抗的菌落，需要得到5-10株无抗菌落。

8、取7中的无抗菌落，接种到3ml LB培养基中，37℃，180rpm过夜培养，抽提细菌基因组，通过PCR扩增BPN片段验证同源重组结果(野生型或者插入BPN基因)。取阳性的片段，送金唯智生物科技有限公司进一步进行测序验证，得到阳性的菌株即为插入BPN基因的菌株ZBPN。

7、接种ZBPN菌株到3ml液体LB培养基和3ml液体LB培养基+0.25％木糖，另接种Z12做对照。37℃，180rpm培养24h，离心去掉菌体沉淀，采用SB/T 10317-1999中的方法测定上清液中的酶活，确认ZBPN菌株诱导后酶活达到约1000U/ml，未诱导的ZBPN菌株以及Z12菌株的酶活都低于检测限。

8、针对ZBPN菌株进行发酵优化，最终确定最佳培养条件如下：接种量为1％；培养基为豆粕粉25g/L,玉米浆粉5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH8.5，121℃灭菌；培养温度为30℃；250ml锥形瓶中含有30ml培养基，转速为200rpm；在接种同时加入0.25％的木糖进行诱导；培养36h时，BPN蛋白酶酶活可以达到最大值，可以达到约15000U/ml。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都美溢德生物技术有限公司

<120> 一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统及构建方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8118

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS序列

<400> 1

gacgtcgaattcgaggtacctgcggccgcaaaattcttgcggtcaggtgacaaaattgatattacaattgacccgatcggaacgctgtcaaaccaaattggctgaataaaactggagggcggacccggacccgcccgttttttctgacaatcatctttgtggcagaggacaagttcatggtactataagtggggtaatttatctgatagggggaacatatatgacacacctacatattacaacatgggtggtagcgctgattctgcttttcgtcagctactcgctgtattcgtcaggaagtgcaaagggcgcaaaaatcactcatatgattctgcggttattctatatccttattattttgacaggagctgagctgtttgtccgtttcgccaactggaacggagaatacgccggcaaaatgattctgggcattatcaccatcggcctgatggaaatgctcctcatccgcaagaaaaaagaaaaatcaacaggaggcctgtggatcggcttcgtcgttgtccttttgctgacagtgctgctcggtctgcatttgccaatcggttttcaattgttttaatagaaaaacctatgaacccggctctttgatagttaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacaaatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaggtcaacaagctggaaagcactcaaacagctgtcagagggaacgcgaaggaaggcacacttatcgaggtgatgaacggcaaaaagaaactcggcagcgccaaagccggaaaagacaatgcgttcaaggttaatatcgcgactcaaaaacaggatcaagtactgtatgtgaaagcaacaaaaggcgatgcgaaaacatcgtataaagttgtcgtcgtcaaaggaaaaccttccggcacaccgaaagtaaacgcggtgaaaacgaaggatacggcagtaaaagggaaggcaaacagcaaagcgatgatcagagtgaaaaacaaatcaaagaaagtcattgcttctgccaaagctgacgcaaaaggaacgttttcggtgaaaatcaaaaaacaaaaagccggaacggtgctgtacgtcacggctgcggatacagataaaaaagaaagcaaggaagcaaaagtggttgttgaaaagtaaccaaaaagcggtgctcgatgcaccgcttttttatttgcgcccccgttggactgctgaatacataatggatcgctttccgtttgaagctgtccattcaaaacggtctcctgtcccttcgctgctgtactgcagtgaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 8118

<210> 2

<211> 4089

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS-FR序列

<400> 2

gacgtcgaattccaaaatgtctttcgttatttctggagaattggattccaaatggcagtattgatcaagaacgatcgttccttcaaggtctgttaaaatgccattgatataatccacaccaacatctattcctacggagtatcctgcctttttattaaaaacaagcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccagattttctttcattaacgtgtttacctgtgatgaaacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaataggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcgatatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatgaacatagtacatagcgaatcttccctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgatgaggttaatacgactcactatagggaattgtagttagtttacaattccaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacatatgagtctgcagagttctagactaggtaccatgctcgaggccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgtttgagggcaataatggaaggtatcacattctctttacatgaatcaattgagctattccgcgaagcgggaaaatcagttcatactgttgtttctattggtgggggagctaaaaatgatacgtggctgcaaatgcaagctgatattttcaatacgagggtaattaagttagaaaatgaacaagggccagctatgggggctgcaatgctggctgcctttggaagcggatggtttgaatcccttgaagaatgtgcagagcagttcattcgtgaggctgctgcattttatccaaaggcgcaaaatgttcaaaaatataaaacactatttgatttgtataagaacatttatactcacacaaaggatctcaatcaagctttgaagagctttcgaaaaaactaatgatgttattgtctggagatcaaccgaagaacaattaatgatcaatcatcatcaaaggcctttgatgacatggctgccttcttttgaaaagatggtgagaataaggtatcgcaacctttaaacagtattggagtgtccagcagacaaaacgaacgagcggaaccgtattttgtcagcgaacactaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 4089

<210> 3

<211> 4907

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS-FR-GFP序列

<400> 3

gacgtcgaattccaaaatgtctttcgttatttctggagaattggattccaaatggcagtattgatcaagaacgatcgttccttcaaggtctgttaaaatgccattgatataatccacaccaacatctattcctacggagtatcctgcctttttattaaaaacaagcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccagattttctttcattaacgtgtttacctgtgatgaaacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaataggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcgatatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatgaacatagtacatagcgaatcttccctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgatgaggttatataagatgaataatacgactcactataggggaattgtagttagtttacaattccaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacatatgaaaaaaagaaagaggcgaaactttaaaaggttcattgcagcatttttagtgttggctttaatgatttcattagtgccagccgatgtactagcagccatgcgtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactctgacgtatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacggtatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcccttttgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataatctagagcatctgctgaaaaactcgaggccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgtttgagggcaataatggaaggtatcacattctctttacatgaatcaattgagctattccgcgaagcgggaaaatcagttcatactgttgtttctattggtgggggagctaaaaatgatacgtggctgcaaatgcaagctgatattttcaatacgagggtaattaagttagaaaatgaacaagggccagctatgggggctgcaatgctggctgcctttggaagcggatggtttgaatcccttgaagaatgtgcagagcagttcattcgtgaggctgctgcattttatccaaaggcgcaaaatgttcaaaaatataaaacactatttgatttgtataagaacatttatactcacacaaaggatctcaatcaagctttgaagagctttcgaaaaaactaatgatgttattgtctggagatcaaccgaagaacaattaatgatcaatcatcatcaaaggcctttgatgacatggctgccttcttttgaaaagatggtgagaataaggtatcgcaacctttaaacagtattggagtgtccagcagacaaaacgaacgagcggaaccgtattttgtcagcgaacactaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 4907

<210> 4

<211> 2847

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS（含MCS片段）序列

<400> 4

gacgtcgaattcgaggtacctgcggccgcaggatccatctagacgctcgagagctgcagtgaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 2847

Claims (8)

1.一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统，其特征在于：将表达系统元件插入芽孢杆菌的基因组中，删除抗性标记元件，建立无抗的表达系统。

2.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统，其特征在于：所述表达系统为木糖操作子—T7RNA聚合酶的级联放大表达系统。

3.根据权利要求1所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)PCR扩增wprA基因上游片段wprA-F和wprA基因下游片段wprA下游片段wprA-R，全基因合成xylR操纵子的xylR基因启动子及CDS区域和xylAB的启动子区域，全基因合成T7RNA聚合酶基因的CDS片段，通过同源重组构建载体pBTS-T7RP；

(2)转化pBTS-T7RP质粒进入菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在wprA-F和wprA-R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP；

(3)PCR扩增xylAB基因上游片段xyl-F和xylAB基因下游片段xyl-R，全基因合成T7启动子、xylR结合位点、RBS位点、多克隆位点和T7终止子片段，通过同源重组，构建pBTS-FR载体；

(4)通过PCR扩增或者全基因合成任一需要表达的基因片段，通过酶切或者同源重组等方式插入到pBTS-FR的多克隆位点，构建表达载体pBTS-FR-X；

(5)转化pBTS-FR-X质粒进入ZT7RP菌株，通过限制性培养和传代培养，分别在xyl-F和xyl-R两个片段处完成两次重组，得到不具有抗性的含有PT7-X-T7ter片段的菌株Z-X；

(6)接种Z-X到培养基中，培养温度为25-40℃，接种后0-8h加入0.01％-1％浓度的木糖进行诱导，培养时间>＝12h后，即得菌体或者发酵液中的目标蛋白。

4.根据权利要求3所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中菌株为枯草芽孢杆菌Z12菌株、其它芽孢杆菌和pBTS质粒进行温敏复制的革兰氏阳性菌株。

5.根据权利要求4所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：所述其它芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌。

6.根据权利要求3所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的表达载体还包括含有信号肽的表达载体，其将枯草芽孢杆菌的信号肽序列，尤其是sec途径中的信号肽，插入到待表达目的基因前，该融合蛋白在表达的时候将通过枯草芽孢杆菌的分泌途径直接将目的蛋白分泌到发酵液中。

7.根据权利要求3所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：所述pBTS-T7RP核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.根据权利要求3所述的一种基于芽孢杆菌的无抗表达系统的构建方法，其特征在于：所述pBTS-FR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。