CN111978380A

CN111978380A - 野生型气肿疽梭菌细胞毒素a及其制备方法、应用和疫苗

Info

Publication number: CN111978380A
Application number: CN202010914130.1A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 王钢; 任立松; 潘晓梅; 唐慧芬; 张慧敏; 王华荣; 李新萍; 赵兵
Original assignee: Tecon Biological Co ltd
Current assignee: Tecon Biological Co ltd
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-11-24

Abstract

本发明提供了一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域，本发明提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，采用革兰氏阳性菌分泌表达系统，能够将野生型气肿疽梭菌细胞毒素A分泌表达到培养基中，且表达量高、蛋白纯度高，无需额外去除内毒素的步骤。同时，本发明提供的制备方法还具有工艺简单、成本低、过程可控的优点。

Description

野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗。

背景技术

气肿疽梭状芽孢杆菌是引起牛羊等反刍动物急性、热性、败血性传染病的主要病原，主要特征是在腹部、臀部、腰部以及肩部等肌肉丰满的部位发生与恶性水肿相似的炎性气性水肿，又称“黑腿病”。该病病程短，发病急，往往来不及救治就突然死亡。为此，疫苗接种是防控该病的主要手段，而商品化的气肿疽疫苗主要是气肿疽梭菌C54-1和C54-2两株菌种接种适宜培养基，严格厌氧培养后加入甲醛灭活，再与氢氧化铝胶佐剂混合制成的灭活疫苗。该疫苗在预防气肿疽梭菌感染取得了一定的效果，但疫苗在使用和生过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应，注射剂量大，5ml；其在制备过程中涉及厌气肉肝汤制备，由于培养基成分复杂，导致培养基批间差异大和杂质多；还有气肿疽梭菌的灭活，存在菌株外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。

随着科学研究的深入，提取气肿疽梭菌培养物上清作为抗原能够完全抵抗气肿疽梭菌感染，因此鉴定上清中保护性抗原是非常必要(Micalizzi,B.and M.S.D.G.Ana,Immunogenicity of an Extract of Clostridium chauvoei in Guinea Pigs.ClinicalInfectious Diseases,1997.25(s2):p.S171-S172)。2012年，Joachim等人发现了气肿疽梭菌的一种新型毒素，命名为气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)，是主要的毒力因子和保护抗原(Frey,J.,et al.,Cytotoxin CctA,a major virμlence factor of Clostridiumchauvoei conferring protective immunity against myonecrosis.Vaccine,2012.30(37):p.5500-5505.)。因此气肿疽梭菌细胞毒素A的制备是未来的发展方向。

但是目前报道的表达CctA蛋白所用的系统全是采用大肠杆菌表达系统。虽然大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程们；由于大肠杆菌是阴性菌，含有大量的LPS(内毒素)，造成疫苗副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。如一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用(申请号CN201910426739.1)和Frey,J.,et al.,Cytotoxin CctA,a major virμlence factor ofClostridium chauvoei conferring protective immunity againstmyonecrosis.Vaccine,2012.30(37):p.5500-5505.这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组菌的生长情况添加诱导剂，CctA重组蛋白均在胞内表达，绝大部分是以包涵体存在，少部分是可溶蛋白，但是需要进行超声破碎、离心及镍柱纯化、置换洗脱液等复杂的过程。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供应用上述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

本发明的第三个目的在于提供一种生物材料，包括上述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

本发明的第四个目的在于提供上述的制备方法或野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料在制备气肿疽梭菌疫苗、气肿疽梭菌诊断抗原或气肿疽梭菌单克隆抗体中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种气肿疽梭菌疫苗，包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料。

本发明提供了一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

进一步地，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入pYL质粒中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

进一步地，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:

(a)表皮葡萄球菌表达系统；

(b)枯草芽孢杆菌表达系统；

(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；

(d)乳酸杆菌表达系统。

进一步地，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；

优选地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/pYL-CctA；

优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为300～700ng/mL的诱导剂ATC在35℃～40℃诱导16～36小时；

优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为500ng/mL的诱导剂ATC在37℃诱导24小时；

优选地，种子液接种量0.1～5％(v/v)，优选为1％(v/v)；

优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。

本发明还提供了应用上述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料的活性成分包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

本发明还提供了上述的制备方法或野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料在制备如下(A)-(C)中任一项的应用：

(A)气肿疽梭菌疫苗；

(B)气肿疽梭菌诊断抗原；

(C)气肿疽梭菌单克隆抗体。

此外，本发明还提供了一种气肿疽梭菌疫苗，所述气肿疽梭菌疫苗包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料；

优选地，所述气肿疽梭菌疫苗包括野生型气肿疽梭菌细胞毒素A和辅料；

优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的浓度为30～70μg/mL，优选为50μg/mL；

优选地，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；优选使用Montanide ISA系列佐剂；更优选使用ISA35A佐剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，采用革兰氏阳性菌分泌表达系统，能够将野生型气肿疽梭菌细胞毒素A分泌表达到培养基中，且表达量高、蛋白纯度高，无需额外去除内毒素的步骤。同时，本发明提供的制备方法还具有工艺简单、成本低、过程可控的优点。

本发明提供的气肿疽梭菌疫苗包括本发明提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或以野生型气肿疽梭菌细胞毒素A为活性成分的生物材料，该气肿疽梭菌疫苗具有安全有效等优点，有效的避免大肠杆菌表达系统和传统疫苗生产过程制备野生型气肿疽梭菌细胞毒素A抗原的缺点，如生产工艺复杂、副反应大、有效抗原含量低和生产成本较高等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的目的基因片段PCR扩增电泳图，其中1、2为目的基因PCR扩增产物、3为阴性对照、4为气肿疽梭菌a毒素(C54-2)、M为DNA Marker；

图2为本发明实施例1提供的质粒双酶切结果，其中，1、2、3、4为质粒、M1/M2为DNAMarker；

图3为本发明实施例2提供的SDS-PAGE电泳结果，其中M为蛋白分子量Marker、a为BSA(1000μg/ml)、b为BSA(500μg/ml)、c为BSA(250μg/ml)、d为BSA(125μg/ml)、1为目的蛋白；

图4为本发明实施例2提供的重组蛋白Western blot图，其中M为蛋白分子量Marker、1为目的蛋白；

图5为本发明实施例3提供的野生型气肿疽细胞毒素A对MDBK细胞的毒力结果图，其中a为正常MDBK细胞，b为病变MDBK细胞；

图6为本发明实施例4提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A对绵羊红细胞的溶血能力的结果图；

图7为本发明实施例7提供的4次发酵蛋白表达结果图，其中M为蛋白分子量Marker、a为BSA(1000μg/ml)、b为BSA(500μg/ml)、c为BSA(250μg/ml)、d为BSA(125μg/ml)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

目前针对野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备主要是采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组菌的生长情况添加诱导剂，野生型气肿疽梭菌细胞毒素A重组蛋白均在胞内表达，绝大部分是以包涵体存在，少部分是可溶蛋白，但是需要进行超声破碎、离心及镍柱纯化、置换洗脱液等复杂的过程。相比之下，如果采用的表达系统能够将外源蛋白以“胞外分泌”的形式表达，即目的蛋白分泌至细胞外的培养基中，则具有较大的优势：蛋白能够直接以可溶的形式分泌释放到培养基中，获得具有生物活性的蛋白质，从而避免因包涵体复性带来的困难；而且杂蛋白少，目的蛋白的回收相对简单。同时无内毒素的产生，减少疫苗纯化成本和副反应，是研究的热点。

基于此，本发明提供了一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

在一些优选的实施方式中，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

在一些优选的实施方式中，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

其中，本发明中涉及的编码野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因可以为：与SEQ IDNO.2所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.2所示序列的序列，或者SEQ ID NO.2所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.2所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.2所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.2所示序列完全相同的序列。

在一些优选的实施方式中，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入PYL表达载体中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物，通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

其中，pYL质粒，是将Xyl/tet片段、ori区域及Erm抗性基因插入pRB373质粒的多克隆位点及抗性区域中，获得重组质粒pYL，有两个复制子：pUC18的复制子保证此载体能在大肠杆菌中复制；pE194复制子保证质粒在葡萄菌中复制。同时由于在其多克隆位点上游加入了可诱导表达的Xyl/tet片段，为四环素抗性基因表达调控元件，外源基因的表达受四环素诱导，使其下游基因限制性表达(严谨型表达)，避免本底性表达造成表型的不可控性。Erm抗性基因则赋予质粒及克隆子方便快捷的抗生素筛选表型。

RN4220一直以来被广泛的应用于金葡菌基因研究。该菌株来源NCTC8325-4，是一株限制性内切酶缺陷菌株，能够接受来源于外部的其他物种的DNA质粒。RN4220体内没有其他质粒，对大部份抗生素都敏感。RN4220是用来转化大肠杆菌质粒DNA的金黄色葡萄球菌菌株。该菌株在基因Sau1HsdR上有突变，该突变的产生可以导致RN4220成为限制修饰系统基因缺陷型，可以用来作为大肠杆菌质粒DNA和金黄色葡萄球菌质粒转化的中间宿主菌。

在得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，优选还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

通过添加对重组微生物进行培养的步骤，能够得到更大体量的重组微生物，从而在诱导表达的步骤中，能够获得更多的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

在一些优选的实施方式中，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:

(a)表皮葡萄球菌表达系统；

(b)枯草芽孢杆菌表达系统；

(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；

(d)乳酸杆菌表达系统。

选择上述任一种革兰氏阳性菌表达系统进行野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的表达均能够实现“胞外分泌”的表达形式，从而避免了因包涵体复性带来的困难，易于蛋白产物的纯化。

在一些优选的实施方式中，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；表皮葡萄球菌(S.epidermidis)一般不产生外毒素(溶血毒素)、杀白细胞毒素和肠毒素，故侵袭力较弱，属于非致病性葡萄球菌，在中国医学细菌保藏管理中心和ATCC官网中均规定生物安全等级1，非常适合作为受体菌。

相应地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/PYL-CctA。

优选地，当选择葡萄球菌表达系统时，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为300～700ng/mL的诱导剂ATC在35℃～40℃诱导16～36小时；ATC的终浓度例如可以为但不限于为300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL或700ng/mL，诱导时间例如可以为但不限于为16小时、18小时、20小时、22小时、25小时、28小时、30小时、32小时、35小时或36小时。

优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为500ng/mL的诱导剂ATC在37℃诱导24小时。

通过对诱导条件进行调整和优化，能够在保证成本的基础上使得诱导表达的效率更高。

优选地，种子液接种量为0.1～5％(v/v)，例如可以为但不限于为0.1％(v/v)、0.5％(v/v)、1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)或5％(v/v)，优选为1％(v/v)。

优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。

需要说明的是，本发明中的“和/或”表示“和”或者“或”，例如补料碳源可以为葡萄糖，或者为甘油，或者为葡萄糖和甘油的混合物。

应用本发明提供的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A纯度更高。

本发明中的生物材料例如可以为，但不限于表达盒、载体、重组微生物或细胞系等，本发明提供的生物材料均能够实现独立地表达野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

(A)气肿疽梭菌疫苗，本发明提供的气肿疽梭菌疫苗可以为以所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A作为主要活性成分的亚单位疫苗、或者以编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的核酸或表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的生物材料作为主要成分的核酸疫苗；

(B)气肿疽梭菌诊断抗原，本发明提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A能够直接作为气肿疽梭菌诊断抗原；

(C)气肿疽梭菌单克隆抗体，将所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的核酸或表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的生物材料免疫动物后可以用于生产单克隆抗体。

此外，本发明还提供了一种气肿疽梭菌疫苗，所述气肿疽梭菌疫苗包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料。

在一些优选的实施方式中，所述气肿疽梭菌疫苗包括野生型气肿疽梭菌细胞毒素A和辅料；

其中，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的浓度优选为30～70μg/mL，例如可以为，但不限于30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL或70μg/mL，优选为50μg/mL。

优选地，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。

当使用ISA35A佐剂与浓度为50μg/mL的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A配合使用作为气肿疽梭菌疫苗时，其免疫动物后的保护效力最高。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中所用到的主要试验材料、试剂、菌株、细胞与试验动物来源如下：

质粒载体PYL，由本发明人实验室冻存；菌株RN4220购自ATCC，RN4220a感受态细胞由本发明人实验室冻存；E.coli DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；高保真FastPfu DNA聚合酶、dNTPs购自全式金公司；限制性内切酶(AscⅠ；PmeⅠ)、DL2000 DNAMarker、10 ×Loading Buffer、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、PCR产物回收纯化试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；MDBK细胞系由本发明人实验室冻存；绵羊红细胞购自郑州百基生物科技有限公司。气肿疽梭菌C54-1，购自中国兽医药品监察所菌种保藏中心；体重15～20g的小鼠、体重350～450g的豚鼠均购自新疆医科大学实验动物中心。

实施例1重组气肿疽梭菌细胞毒素A表达载体的构建

1.1 PYL表达质粒的构建

1.1.1合成启动子、ori区域和Erm抗性基因

根据对表达载体的需求，人工化学合成可使用四环素进行表达调控的Xyl/tet片段、ori区域及可使用抗生素进行筛选的Erm抗性基因。

1.1.2 PYL表达质粒的构建

将上述1.1.1合成的基因片段通过分子生物学的方法插入到PRB373质粒中，测序正确，获得表达质粒PYL。

1.2重组气肿疽梭菌细胞毒素A表达系统的构建

1.2.1合成气肿疽细胞毒素A基因

本实施例合成了CctA基因，为SEQ ID No.2所示。

1.2.2重组表达载体和重组菌株的构建

上游引物序列为：5’AGCTTTGTTTAAACTATGAGTGAAGGAGTAAAGACTT3’；

下游引物序列为：5’TTGGCGCGCCTTAATATCCTGCATGCTCAACAG3’。

利用相应引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：DNA Temple，1.0μl；Premix Ex Taq，12.5μl；Primer 1，0.5μl；Primer 2，0.5μl；ddH₂O，10.5μl。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，1分30秒，扩增35个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增目的DNA条带并回收(图1)，然后与载体PYL一起进行双酶切(Asc/PmeⅠ)，并将酶切产物回收(图2)。

1.3连接及转化

基因片段与PYL载体连接及转化：

10μl连接体系：吸取DNA Ligase Buffer 1μl，目的片段回收产物4μl，表达载体回收产物2μl，T4DNA Ligase 1μl，双蒸水2μl加入PCR管中，轻弹PCR管管壁，使反应混合液混合均匀，瞬离，置连接仪中16℃连接过夜。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含300μg/ml Erm的LB固体培养板上，置36～38℃恒温培养箱中培养16～24小时。挑选单菌落，提取重组表达质粒并进行PCR鉴定和测序。提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入表皮葡萄球菌(SE)中，构建成功了能表达气肿疽梭菌细胞毒素A的生产用工程菌株SE/pYL-CctA株。

实施例2重组蛋白的表达与鉴定

2.1将制备好的SE/pYL-CctA按1％的比例接种含5μg/ml红霉素的TSB液体培养基中，按300ng/ml加入诱导剂ATC置36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养18～24小时。

2.2收集上清

将培养液高速离心收集上清，进行SDS-PAGE检测，观察记录重组蛋白含量和蛋白纯度。由图3可见，目的蛋白分泌到培养基中，目的蛋白为35kDa左右。通过AlphaEaseFC软件和BSA蛋白SDS-PAGE分析，计算蛋白含量为301μg/ml，蛋白纯度为83％。

2.3重组蛋白Western Blot鉴定

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以气肿疽梭状芽孢杆菌毒素抗血清为一抗，HRP标记的山羊抗豚鼠IgG(1：5000)为二抗进行孵育，按照底物显色试剂盒说明进行显色，检测重组蛋白反应原性。由图4所示可见，培养基上清CctA蛋白有约35KDa大小的目的条带，菌体破碎后无目的蛋白，表明目的蛋白已得到分泌表达，反应原性好。

实施例3细胞毒性试验

3.1细胞培养

将MDBK细胞(1.6×10⁵个/ml)接种于96孔板，100μl/孔，于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

3.2 CCTA毒素蛋白稀释

从负80℃中取出CCTA毒素250μl加入250μl DMEM培养基进行2倍比系列稀释，从2-1一直稀释到2-12。

3.3接种培养

将稀释好的CCTA毒素按稀释度加入细胞培养板中，100μl/孔并重复2孔。于37℃，CO₂培养箱中培养48小时(如图5所示)。

3.4 MTS检测

培养48小时后，弃上清，每孔加入100μL培养基，每孔再加入20μL MTS试剂，于37℃，5％CO₂培养箱中培养1-2小时，在酶标仪上读取A490nm下的OD值来判定细胞死亡情况。

3.5细胞死亡率计算

细胞死亡率(％)＝(1-实验组A490nm/阴性对照组A490nm)100％。

3.6 CCTA毒素蛋白CT50计算

CT50＝㏒-1[Xm-i(∑P-0.5)]+i/4(1-Pm-Pn)

其中：Xm：最大反应率组剂量的对数

i：组间剂量比的对数

P：各组死亡率

Pm：最大死亡率

Pn：最小死亡率

3.7结果rCctA的细胞半数病变量CT50分别为9.11μg/ml。

实施例4绵羊红细胞溶血试验

4.1 5％绵羊血平板溶血试验

将rCctA毒素用BHI液体培养基2倍比系列稀释，从2-1一直稀释到2-12。每个稀释度25μl，分别滴加到血平板，于37℃厌氧培养48h，观察溶血情况。10μg/ml浓度还有明显溶血，见图6。

实施例5 rCctA的动物免疫保护性试验

5.1目的蛋白的表达

将制备好的SE/PYL-CctA株菌种按2％的比例接种含5μg/ml Erm的TSB液体培养基中，按300ng/ml加入诱导剂ATC置36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养16～24小时。将培养液高速离心收集上清，然后将上清液进行SDS-PAGE检测，观察记录重组蛋白含量和蛋白纯度。

5.2蛋白定量以及纯度分析

5.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳

将蛋白Marker、待检样品及BSA标准品依序上样至胶片中，进行SDS-PAGE凝胶电泳，结束后，用考马斯亮蓝R250进行染色30分钟，然后用脱色液脱色至目的条带清晰，拍照保存。

5.2.2蛋白定量和蛋白纯度测定

5.2.2.1标准曲线绘制

打开Launch Vision Works LS软件，依次框选待检样品及BSA标准品目的条带，依次输入BSA标准品蛋白浓度，绘制标准曲线，当R2≥0.99时，可进行待检样品的测定。

5.2.2.2待检样品蛋白含量

测定以标准曲线为参照，Launch Vision Works LS软件分析得出待检样品中的目的蛋白浓度。

5.2.2.3蛋白纯度测定

打开AlphaEaseFC软件，点击“Aanlysis Tools”按钮，再打开“1D-Muti”界面，框选待检样品所有条带，点击“AUTOGRID”按钮，得出待检样品所有条带百分比含量，记录目的蛋白百分比含量，即为目的蛋白纯度结果。

5.3疫苗制备

5.3.1按0.2％比例加入甲醛溶液，置于36～37℃恒温振荡摇床中，以100r/min振荡24～48h，灭活残留菌体。然后放入2～8℃冷藏箱中备用。将气肿疽梭菌细胞毒素A蛋白水包油佐剂(ISA 35A)乳化，制备成抗原含量为100μg/ml的疫苗400ml。

5.3.2灭活检验

5.3.2.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

5.3.2.2灭活检验

用体重16～20g的小白鼠2只，各静脉注射离心上清0.4ml，观察72小时，均应健活。

5.4豚鼠免疫试验

取本疫苗接种体重350～450g的豚鼠4只，每只肌肉注射0.5ml，21日后，连同条件相同的对照豚鼠2只，各肌肉注射致死剂量气肿疽梭状芽孢杆菌菌液(C54-2)至少0.2ml，观察10日，记录死亡情况。

5.5结果

对照豚鼠于72小时内全部死亡，免疫豚鼠全保护。见表1。

表1 豚鼠免疫攻毒结果

分组	试验动物(只)	攻毒剂量(ml)	攻毒结果
				免疫组	4	0.3ml	4/4存活
对照组	2	0.3ml	0/2存活

实施例6 CctA毒素中和抗体检测

6.1 rCctA蛋白毒价测定

6.1. 100％，50％，0％溶血对照制作

6.1.1 A11、A12、B11、B12：80μl 10mM Tris-Hcl(PH 7.5)，20μL Triton-X100和100μL红细胞作为全溶血对照。

6.1.2 C11、C12、D11、D12：10mM Tris-Hcl(PH7.5)，20μL Triton-X100和50μL红细胞作为50％溶血对照。

6.1.3 E11、E12、F11、F12：180μl 10mM Tris-Hcl(PH 7.5)，20μL Triton-X100和无红细胞作为无溶血对照。

6.2阴性对照：100μL assay buffer和100μL红细胞(G11、G12、H11、H12)。

6.3毒价测定

6.3.1加100μl 10mM Tris-Hcl(PH 7.5)到96孔V型反应板A、B行的1到10列。

6.3.2 A1、B1孔各加入100μl毒素，连续2倍倍比稀释至第A10、B10孔。

6.3.3 A、B行1-10列的每一个孔中分别加入100μL红细胞。

6.3.4在37℃孵育2小时。将反应板1000r/min离心10分钟。吸取100μL上清到ELISA板，读取OD550值，以50％溶血稀释倍数为毒素力价单位。

6.4中和抗体检测

6.4.1待检血清56℃灭活30分钟。向96孔微量反应板中每孔加50μl10mM Tris-Hcl(PH 7.5)，第G、H行为空白对照行。第A～F行，第一列分别加50μl待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清，按照对倍稀释的方法从第一排稀释到第十二排。

6.4.2在微量反应板的各孔中加入50μl已稀释至最适力价的毒素，轻轻震荡后，加封板膜，放入湿盒中37℃孵育30分钟，而后加入100μl新鲜制备的1～2％绵羊红细胞，加封板膜，放入湿盒中37℃孵育2小时。

6.4.3结果读取

以1000r/min离心10分钟，肉眼评估可造成红细胞沉淀之最高稀释倍数即为CctA毒素中和抗体效价。

6.5结果

气肿疽梭菌细胞毒素A基因工程疫苗免疫豚鼠血清CctA毒素中和抗体效价达到1024。

实施例7CctA诱导表达条件的优化

7.1发酵罐试验

参考摇瓶培养体条件，采用15L发酵罐进行发酵试验,通过无菌过滤方式装入培养基5L，加入终浓度为5μg/ml的红霉素，加入0.01％的消泡剂。设置发酵参数：培养温度36～37℃，pH值7.0，溶氧20％，打开补料、补碱、补酸三路开关，通过自动添加1mol/L盐酸或30％氨水来控制pH值。手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧。分别补料碳源的选择、种子液的接种比例、诱导剂浓度、诱导表达时间等参数,筛选出菌体生长和蛋白表达的最佳条件，并在最佳条件下进行发酵参数的验证。

7.1.1补料碳源的选择

用15L发酵罐进行发酵试验，初始上作体积为5L，按1％的接种量接种种子液。采用葡萄糖和甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测菌液密度(OD600)和rCctA蛋白的表达量。

7.1.2诱导剂浓度的选择

用15L发酵罐进行发酵试验，初始体积为5L，按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为300、500、700ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测rCctA蛋白的表达量。

7.1.3诱导时间的选择

用15L发酵罐进行发酵试验，初始体积为5L，按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测rCctA蛋白的表达量。

7.1.4种子液接种量的选择

用15L发酵罐进行发酵试验，初始体积为5L，按0.2％、1％、5％的接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测rCctA蛋白的表达量。

7.1.5发酵工艺的验证

参考优化的条件，用15L发酵罐进行4次分批补料发酵试验，初始体积为5L，按1％接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，诱导表达24小时结束发酵，检测rCctA蛋白表达情况和纯度。

7.2结果

本实施例用15L发酵罐进行了SE/PYL-CctA株的发酵表达，分别优化了补料碳源选择、诱导剂浓度、诱导时间、种子液接种量等参数，结果优化出如下参数：补料碳源为甘油、诱导剂浓度为500ng/ml、诱导时间为24h、种子液接种量为1％。其目的蛋白为蛋白含量不低于350μg/ml，蛋白纯度为84％，结果如图7所示。工艺简单，过程可控。

实施例8佐剂筛选试验

8.1疫苗制备

制备四种不同佐剂疫苗，氢氧化铝胶疫苗、油包水佐剂疫苗(ISA 61)、水包油包水佐剂疫苗(ISA 201)、水包油佐剂疫苗(ISA 35A)，rCctA蛋白含量均为100μg/ml。

8.2安全试验

用350～450g的豚鼠8只，分成4组，每组2只，肌肉注射注射部位，每只2ml，观察豚鼠是否存活，注射部分是否有坏死。

8.3效力试验

用350～450g的豚鼠18只，分成4组，每组4只，通过肌肉注射4种疫苗，0.5ml/只，另外2只作为空白对照。免疫后21日进行气肿疽梭菌强毒菌液攻毒。

8.4安全试验

四种不同佐剂疫苗豚鼠均健活，注射部位没有坏死。

8.5效力试验

攻毒试验结果见下表，水包油佐剂疫苗免疫组4/4保护，效果最好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 野生型气肿疽梭菌细胞毒素A

<400> 1

Gln Glu Asn Thr Cys Ile Val Glu Thr Pro Ser Glu Gly Val Lys Thr

1 5 10 15

Phe Thr Ser Ser Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Tyr Asn Cys Phe Lys Thr

20 25 30

Asn Leu Ser Val Thr Phe Ile Glu Asp Gln His Asn Asn Gln Leu Thr

35 40 45

Ala Leu Val Ser Thr Glu Gly Ser Phe Ile Pro Ser Gly Leu Ser Arg

50 55 60

Val Gly Gly Tyr Tyr Gln Ala Asp Met Tyr Trp Pro Ser Lys Tyr Tyr

65 70 75 80

Thr Thr Leu Thr Thr Tyr Asp Arg Asn Asn Arg Val Lys Ile Thr Lys

85 90 95

Ser Ile Pro Thr Asn Gln Ile Asp Thr Val Ser Val Ser Glu Thr Met

100 105 110

Gly Tyr Ser Ile Gly Gly Ser Leu Ser Ile Glu Tyr Gly Lys Glu Gly

115 120 125

Pro Lys Ala Gly Gly Gly Ile Asn Gly Ser Tyr Thr Ala Gln Arg Ser

130 135 140

Val Thr Tyr Asp Gln Pro Asp Tyr Arg Thr Leu Leu Met Lys Asp Ser

145 150 155 160

Val Asn Ser Ala Ser Trp Glu Val Ala Phe Asn Ala Thr Lys Asp Gly

165 170 175

Tyr Asp Arg Asp Ser Tyr His Gly Ile Tyr Gly Asn Gln Leu Phe Met

180 185 190

Arg Tyr Arg Leu Tyr Asn Thr Gly Ile Asn Asn Leu Thr Thr Asp Asn

195 200 205

Asn Leu Ser Ser Leu Ile Val Gly Gly Phe Ser Pro Lys Val Val Ile

210 215 220

Ala Leu Thr Ala Pro Lys Gly Thr Glu Glu Ser Thr Val Lys Val Glu

225 230 235 240

Tyr Asn Arg Phe Asn Asp Gln Tyr Arg Leu Arg Trp Ser Gly Thr Glu

245 250 255

Trp Tyr Gly Glu Asn Asn Arg Asn Ser Arg Ile Asp Ser Ser Ser Glu

260 265 270

Ser Phe Ile Leu Asn Trp Lys Asn His Thr Val Glu His Ala Gly Tyr

275 280 285

<210> 2

<211> 867

<212> DNA

<213> 野生型气肿疽梭菌细胞毒素A

<400> 2

caagaaaata catgtatagt tgaaacacca agtgaaggag taaagacttt tacatcttca 60

gatactgctt atgcagatta taattgcttt aagactaact tatcagttac atttattgaa 120

gatcaacaca ataatcaact tacagcactt gtatcaacag aaggatcatt tattccatca 180

ggattatcac gtgttggtgg gtattatcaa gctgatatgt attggccatc aaaatattac 240

acaacattaa caacttatga tagaaataat agagtaaaaa taactaaaag tatcccaact 300

aatcaaatag atacagtatc agtatcggaa actatgggtt atagcattgg tggaagctta 360

tcaattgaat atggaaaaga aggccctaaa gcagggggag gaataaatgg atcatacact 420

gctcaaagaa gtgtaacata tgatcaacca gattatagaa cattattaat gaaagatagt 480

gtaaatagtg catcttggga agttgctttt aatgcaacta aagatggata tgatagagat 540

tcttatcatg gtatctatgg aaatcaatta tttatgagat atagattata taatacagga 600

ataaataatt taactacaga taacaattta tcttctttaa tagttggtgg tttttctcct 660

aaagtagtaa ttgctcttac agcaccaaaa ggaactgaag aatcaacagt taaagttgaa 720

tataatcgtt ttaatgatca atatagatta agatggtcag gaactgaatg gtatggagaa 780

aataatagaa attctagaat agatagttca agtgagtctt tcatacttaa ttggaaaaac 840

catactgttg agcatgcagg atattaa 867

Claims

1.一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，其特征在于，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入pYL质粒中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物，通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:

(a)表皮葡萄球菌表达系统；

(b)枯草芽孢杆菌表达系统；

(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；

(d)乳酸杆菌表达系统。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；

优选地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/pYL-CctA；

优选地，种子液接种量为0.1～5％(v/v)，优选为1％(v/v)；

优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。

7.应用权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

8.生物材料，其特征在于，所述生物材料的活性成分包括权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。

9.如权利要求1-6任一项所述的制备方法或权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或权利要求8所述的生物材料在制备如下(A)-(C)中任一项的应用：

(A)气肿疽梭菌疫苗；

(B)气肿疽梭菌诊断抗原；

(C)气肿疽梭菌单克隆抗体。

10.一种气肿疽梭菌疫苗，其特征在于，所述气肿疽梭菌疫苗包括权利要求根据权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或权利要求8所述的生物材料；

优选地，所述气肿疽梭菌疫苗包括权利要求7所述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A和辅料；