CN110747217B

CN110747217B - 一种基于费氏弧菌群体感应系统和t7表达系统的迭代基因电路及其应用

Info

Publication number: CN110747217B
Application number: CN201911068687.1A
Authority: CN
Inventors: 吴俊俊; 周朋; 包美娇; 董明盛
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110747217A

Abstract

本发明公开了一个基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白egfp。本发明基因电路是一种不依赖诱导剂，可以在任意宿主菌中利用T7表达系统自发强力启动靶基因表达的基因电路；本发明将基因元件分别构建到不同的表达载体上，在工程菌内部构建了一个迭代基因电路，利用T7表达系统放大费氏弧菌群体感应系统的信号，具有利用T7表达系统自发强力启动靶基因表达的功能并具有更低的渗漏比例和更高的启动强度。

Description

一种基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)的群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用。

背景技术

发酵工程菌需要合成大量重组蛋白，搭建合成通路，如果在培养起点就开始大量表达重组蛋白会和细胞代谢竞争胞内资源，给菌体带来巨大的负担，代谢网络失衡会导致一些有毒的中间产物的积累，也会对菌体生长造成毒害，使菌株无法保持良好的生长状态，影响最终产物的产量。因此前人探索了多种操纵元件，实现对基因的诱导调控，包括：色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子以及许多杂合操纵子等，其中以受IPTG诱导的乳糖操纵子应用最为广泛。受IPTG诱导调控的T7表达系统是目前最主流的大肠杆菌表达系统，启动效率强大且专一性高，是原核表达的首选，其中德国Novagen公司的PET系列表达载体正是使用的T7表达系统，本文中用到的表达载体也都是PET系列。

T7系统中的T7启动子受到T7 RNA聚合酶的特异性诱导启动，且不会被许多外源终止子终止，可以高效表达其他系统不能有效表达的基因；T7 RNA聚合酶的转率效率是大肠杆菌自身RNA聚合酶的五倍，一旦启动，大肠杆菌自身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的胞内资源都被用于目的蛋白的表达。BL21(DE3)菌株是常用的外源基因表达菌株，它的基因组上整合了λ噬菌体DE3区的基因，含有lacI抑制子和位于lacUV5启动子下游的T7RNA聚合酶基因，正常状态下lacI表达的LacI阻遏蛋白抑制T7 RNA聚合酶的表达，T7启动子不启动。当有IPTG存在的情况下，IPTG和LacI竞争性结合，启动下游T7 RNA聚合酶的表达，进一步启动表达载体上T7启动子下游基因的表达。诱导型启动子有许多优点，包括能通过调节诱导剂浓度调节基因表达强度、通过控制诱导剂添加时间控制基因表达的启动时间以平衡菌体的生长和产物的合成等。但是诱导型启动子也存在许多问题，包括无法实现靶基因的动态调控、对细胞状态无法及时反馈等。另外，诱导剂昂贵的价格阻碍了其在大规模工业化生产中的应用。

解决这一问题的方法之一就是在发酵菌株内引入动态的基因开关来控制途径基因的表达，目前已经有许多这方面的尝试。但是这些策略需要响应于特定的中间产物、细胞状态或者培养基组成，缺乏普适性，无法应对复杂多变的产物需求。而群体感应(Quorumsensing)系统作为细胞密度的监控感应系统同时具有动态调节和通用性的优点。因此，基于群体感应的动态调节系统具有很高的研究价值以及应用前景。

来自海洋的发光细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)是一种革兰氏阴性菌，通过高丝氨酸内脂介导的QS调节生物发光，并且借助这一特性和许多真核宿主建立起共生关系。费氏弧菌中的LuxI/R群体感应系统由luxicdabe、luxr两个操纵子组成。luxi负责编码信号分子蛋白LuxI，参与信号分子3-oxo-C₆-HSL的合成，正常情况下痕量表达。luxr负责编码信号分子受体蛋白LuxR，LuxR和信号分子结合后结构发生改变，可以结合到luxr、luxi基因中间的启动子区，启动下游luxab基因负责编码的荧光素酶亚基基因的表达，同时抑制luxr基因的继续表达，形成负反馈。

荧光素酶表达后催化费氏弧菌胞内的分子氧将长链的脂肪醛和还原态的黄素单核苷酸氧化为长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度波长位于450～490nm的蓝绿光。在海水中时，费氏弧菌的浓度较低，其周围的信号分子浓度也较低，因此合成荧光素酶的基因关闭，细菌不发光；当费氏弧菌附着于鱼类或乌贼等海洋生物上时，菌体密度达到一定的程度，荧光素酶基因被强力启动，细菌发出荧光。在费氏弧菌的宿主夏威夷短尾鱿鱼上费氏弧菌可能达到10⁹～10¹⁰细胞/cm³的密度，费氏弧菌利用宿主体内丰富的营养物达到相当高的群落密度，发出的荧光又会为宿主吸引到猎物或者摆脱捕食者追捕。两者借此互利共生^[8]。

现在技术中的有关于费氏弧菌luxI/luxR群体感应系统的报道，一般用来做群体感应抑制剂方面的研究，通过抑制信号分子的合成，促进信号分子的降解和抑制信号分子与受体蛋白的结合等手段抑制微生物的群体感应，防治因群体感应引起的病原菌感染以及食品腐败，但是利用费氏弧菌群体感应系统进行合成生物学设计、实现信号调控的基因电路应用尚未见报道，因为费氏弧菌的群体感应系统自身存在一定的表达渗漏情况，无法实现对靶基因的严谨调控；并且费氏弧菌群体感应系统的启动强度较弱，无法满足下游复杂的电路需求，这限制了群体感应系统的应用。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该基因电路可以不依赖诱导剂，强力自发动态调节靶基因的表达，并利用该基因电路构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的基因工程菌。

本发明通过将基因元件分别构建到不同的表达载体上，在工程菌内部构建了一个基因电路，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，其特征在于，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白基因egfp；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。

其中，所述信号分子蛋白基因luxI和受体蛋白基因luxR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子，当环境中的信号分子积累到一定浓度后和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PluxI(1)启动子区域并启动下游T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly的表达，T7RNApoly可以结合到表达载体的T7启动子区域并强力启动下游靶基因的表达，实现信号的放大。同时T7 RNA聚合酶可以结合到表达载体上的T7启动子区域，进一步放大信号，启动T7启动子下游信号基因绿色荧光蛋白基因的表达。

作为优选，所述基因luxI、luxR、PluxI(1)可以转录翻译合成信号分子蛋白和受体蛋白并调节T7 RNApoly的表达。

进一步地，所述受群体感应调控表达的T7 RNA聚合酶可以结合到T7启动子区域，强力启动信号蛋白绿色荧光蛋白基因egfp的转录和翻译。

本发明所述表达载体，包含所述的迭代基因电路所需元件，并且使基因电路的表达渗漏最低。

进一步地，本发明所述的表达载体包含所述的基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路。本发明基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的表达载体包括E-egfp，pACYC-trc(lostoperon)-luxR-trc(lost operon)-luxI(即A-trc(lost operon)-luxR-trc(lostoperon)-luxI)和pColA-PluxI(1)-T7 RNApoly(即O-PluxI(1)-T7 RNApoly)，优选pColADuet-1作为PluxI(1)的表达载体，最大程度降低T7 RNA poly的渗漏。

其中，所述的表达载体将基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达，并且使基因电路的表达渗漏最低。

本发明所述的基因工程菌，包含所述的基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路或者所述的表达载体。

作为优选，本发明基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的基因工程菌主要是将表达载体pET-egfp(即E-egfp)，A-trc(lostoperon)-luxR-trc(lost operon)-luxI和O-PluxI(1)-T7 RNApoly一起导入基因工程菌内。

其中，所述的基因工程菌可以利用所述的基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，实现绿色荧光蛋白表达的动态调控。

进一步地，所述基因工程菌对费氏弧菌自身的群体感应系统进行了改造，降低了表达渗漏，并且利用T7表达系统对费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统进行信号的放大，实现绿色荧光蛋白表达的强力自发启动。

本发明所述的基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路在实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能中的应用。

其中，所述迭代基因电路在以导入含有基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的工程菌为发酵菌株进行的发酵。，开始阶段不启动靶基因的表达，当发酵液OD₆₀₀达到0.5时启动靶基因的转录与翻译。即所述基因电路在发酵起点不启动靶基因的表达，当发酵液OD₆₀₀达到0.5时启动靶基因的转录与翻译。

本发明针对费氏弧菌启动子进行改造，极大降低了表达渗漏；并且利用T7表达系统对费氏弧菌群体感应系统信号进行放大，极大提高了基因电路的信号强度。

本发明克服现有发酵过程中对诱导剂的依赖，提供一种基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用。本发明提供了迭代基因电路的基因元件序列、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于费氏弧菌(Vibriofischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的工作途径与具体应用。

1、本发明是基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该系统的元件包括信号分子蛋白基因luxI、受体蛋白基因luxR、可以和信号分子-受体蛋白复合体特异性结合的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因T7 RNApoly和绿色荧光蛋白基因egfp。

2、本发明基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的工作原理：费氏弧菌信号分子蛋白基因和受体蛋白基因受组成型启动子trc(lostoperon)调控，组成型表达信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白催化费氏弧菌信号分子3-oxo-C₆-HSL的合成，当环境内的信号分子和受体蛋白浓度达到PluxI(1)的检测阈值后，信号分子和受体蛋白的复合体会结合到PluxI(1)区域并启动启动子下游T7 RNA聚合酶的表达，T7 RNA聚合酶会结合到表达载体的T7启动子区域，强力启动下游绿色荧光单白的表达。

3、本发明费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，启动诱导调控的方式为感应环境中信号分子的浓度，当OD₆₀₀达到0.5时对应的信号分子的浓度足够启动基因开关下游靶基因的表达。

4、本发明的基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的应用，具有实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

本发明利用费氏弧菌群体感应系统可以检测细胞浓度的特性控制T7 RNA聚合酶的表达，再利用T7 RNA聚合酶控制T7启动子下游靶基因的表达，基因是否表达就是受菌浓影响的。本发明具体通过在大肠杆菌体内重构费氏弧菌的群体感应系统和不依赖于宿主菌的T7表达系统，构建可以调节靶基因表达的迭代基因电路，实现对重组蛋白表达的动态调控。

本发明通过在大肠杆菌体内重构费氏弧菌的群体感应系统和不依赖于宿主菌的T7表达系统，构建可以调节靶基因表达的迭代基因电路，在发酵起点，基因电路下游的绿色荧光蛋白不表达，基因工程菌胞内持续积累信号分子和受体蛋白，当信号分子和受体蛋白浓度达到阈值后信号分子-受体蛋白复合体结合到pluxI(1)启动子区域并诱导大肠杆菌的RNA聚合酶结合，启动T7 RNA聚合酶的表达，T7 RNA聚合酶结合到T7启动子区域，强力启动下游靶基因的表达，实现对外源蛋白的动态调控。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次构建了基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，该基因电路具有实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能。本发明在费氏弧菌本身的群体感应系统基础上进行了重新构建，改造了费氏弧菌的启动子，降低了启动子的渗漏，并且提高了费氏弧菌启动子的活力。利用改造后的费氏弧菌群体感应系统控制T7 RNA聚合酶的表达，使T7表达系统可以不依赖特异的宿主菌，利用T7表达系统对费氏弧菌群体感应系统的信号进行放大，以满足启动复杂代谢途径的需求。本发明工艺科学、方法简单、操作容易；可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

本发明的基因电路是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD₆₀₀状态下启动靶基因表达的表达载体和基因工程菌。

本发明将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本发明在工程菌内部构建了一个迭代基因电路，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程且较初始的费氏弧菌群体感应系统具有更低的渗漏比例以及更高的启动强度。

附图说明

图1为费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统启动子改造后渗漏情况变化荧光图；

图2为费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统启动子改造后渗漏情况变化示意图；

图3基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路构建示意图；

图4为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxI)；

图5为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(O-pluxI(1)-T7 RNApoly)；

图6为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(E-egfp)。

图7为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxI，O-pluxI(1)-T7 RNApoly，E-egfp)

图8为共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图片BL21(O-pluxI(1)-T7 RNApoly，E-egfp)

图9为基于不同费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统启动子和T7 RNA聚合酶的基因电路控制绿色荧光蛋白表达强度示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例作进一步说明。

本发明中所有原料、试剂、载体、菌株、限制性内切酶等如无特殊说明，均市售可得。本发明中基因或者氨基酸编号均为NCBI上编号。

实施例1

基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的主要元件克隆

1、菌株和质粒

费氏弧菌(BNCC165003)购买自北纳生物，大肠杆菌(E.coli bl21(DE3))菌株、大肠杆菌(E.coli Jm109)和表达载体pACYCDuet-1、pColADuet-1、pETDuet-1来自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)，PMD19T simple载体购自Takara公司，含有绿色荧光蛋白基因egfp的表达载体干粉购自于双领生物。

2、酶及其他试剂

各种抗生素包括氨苄青霉素和氯霉素均购自于上海生工有限公司。各种化学试剂均为分析纯，购自于上海生工有限公司。各种限制性内切酶和DNA连接酶购自于Thermo公司。1kb DNALadder、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒购自于上海生工有限公司。

3、主要仪器设备

表1本专利使用到的仪器

4、培养基的配制

LB(Luria broth)液体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，PH7.0；121℃高压蒸汽灭菌20min。

LB固体培养基：在LB(Luria broth)液体培养基基础上添加2％琼脂粉；121℃高压蒸汽灭菌20min。

5、费氏弧菌PluxI、luxI、luxR基因的克隆

(1)费氏弧菌基因组DNA的提取

(2)PluxI、luxI、luxR基因序列的扩增

a：引物设计，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2(扩增luxI基因)和SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4(扩增luxR基因)和SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6(扩增PluxI基因)。

SEQ ID NO:1

CCATGGTT ATGATAAAAAAATCGGACTTTTT

SEQ ID NO:2

GAATTCTTAATTTGATACAGCTTTTCTAAAC

SEQ ID NO:3

CCATGGTTATGAACATTAAAAATATAAATGCTAATG

SEQ ID NO:4

GAATTCTTAATTTTTAAGGTATGGACAATTAAT

SEQ ID NO:5

CCTGCATTAGGTTTTTGTTCACCTAGCTTATTGTTATGTTT

SEQ ID NO:6

CTCGAGGAATTCGGATCCCCATGGTACAGCCATGCAACCTCTCTTATTT TACAT

b：扩增体系如下：

表2PCR扩增体系

c:PCR扩增反应：

表3PCR扩增反应

(3)PCR扩增产物凝胶电泳

(4)扩增片段凝胶回收

(5)回收片段与T载体连接反应

(6)转化及测序达到正确的luxI、luxR和PluxI基因；其核苷酸序列分别如GeneID:3280753、Gene ID:3280300和Gene ID:NC_006841.2(1049356..1049570)所示。LuxI氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:YP_206882.1所示，LuxR氨基酸如YP_206883.1所示。

6、T7 RNA聚合酶的克隆

(1)BL21基因组DNA的提取

(2)T7 RNApoly基因序列的扩增

a：引物设计，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8(扩增T7 RNApoly基因)。

SEQ ID NO:7

CCATGGTTATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACG

SEQ ID NO:8

GAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCGACT

b：扩增体系如下：

表4PCR扩增体系

c:PCR扩增反应：

表5PCR扩增反应

(3)PCR扩增产物凝胶电泳

(4)扩增片段凝胶回收

(5)回收片段与T载体连接反应

(6)转化及测序得到正确的T7 RNApoly基因；其核苷酸序列分别如GenBank:M38308.1所示，氨基酸序列如GenBank:AAA32569.1所示。

7、绿色荧光蛋白基因egfp的克隆

(1)含有egfp的表达载体干粉复溶

(2)egfp基因序列的扩增

a：引物设计，SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10(扩增egfp基因)。

SEQ ID NO:9

CATATGGTAAGGGAGAAGAACTTTTC

SEQ ID NO:10

CTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC

b：扩增体系如下：

表6PCR扩增体系

c:PCR扩增反应：

表7PCR扩增反应

(3)PCR扩增产物凝胶电泳

(4)扩增片段凝胶回收

(5)回收片段与T载体连接反应

(6)转化及测序得到正确的egfp基因；其核苷酸序列如Gene ID:20473140所示。

实施例2

费氏弧菌低渗漏群体感应启动子改造

费氏弧菌自身的PluxI启动子本身存在一定的渗漏，对基因无法实现严格的调控，因此，考虑对全长为215bp的启动子PluxI进行定向的改造，降低启动子的渗漏，如图1所示原始PluxI启动子渗漏严重。以基因序列的第一个碱基为1号，上游1个碱基为-1号，分别设计引物SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:13/SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15从-85，-114，-57，-80开始扩增到-1号碱基，得到长度分别为87bp的PluxI(1)、114bp的PluxI(2)、57bp的PluxI(3)和80bp的PluxI(4)，验证LuxR结合位点以及其上游序列对启动子和信号分子-受体蛋白复合体识别以及启动子和RNA聚合酶的识别之间的作用。将得到的启动子经过EcoNI/NdeI双酶切处理连入pCDFDuet-1的EcoNI/NdeI后再将EGFP经过NdeI/XhoI双酶切连入得到的质粒，最终得到pCDF-PluxI(1)-EGFP、pCDF-PluxI(2)-EGFP、pCDF-PluxI(3)-EGFP和pCDF-PluxI(4)-EGFP，将trp和lac的杂合启动子trc(zu)除去lacO操纵子，得到可以在任意碳源条件下组成型启动基因表达的组成型启动子trc(lost operon)，序列如SEQ ID NO:16所示，将经过EcoNI和XhoI双酶切的trc(lost operon)连接到pACYCDuet-1的EcoNI和XhoI处，并在XhoI前加上NcoI/BamHI/EcoRI酶切位点，得到pACYC-trc(lost operon)，将经过NcoI/BamHI双酶切处理的luxI连接到pACYC-trc(lost operon)的NcoI/BamHI处，得到pACYC-trc(lost operon)-luxI，将经过BamHI/EcoRI双酶切的trc(lost operon)连入pACYC-trc(lost operon)-luxI的BamHI/EcoRI处得到pACYC-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)，将经过EcoRI/XhoI双酶切的luxR接到pACYC-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)的EcoRI/XhoI处，得到质粒pACYC-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR(即A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR)。将pCDF-PluxI(1)-EGFP、pCDF-PluxI(2)-EGFP、pCDF-PluxI(3)-EGFP和pCDF-PluxI(4)-EGFP分别和pACYC-trc(lost operon)-luxI-trc(lostoperon)-luxR转入BL21(DE3)感受态，进行发酵并在12h后取样进行全细胞荧光扫描。结果如图1，(1)(2)(4)号启动子的表达渗漏均有降低，具体数值如图2所示，(1)(2)(4)号启动子的表达渗漏分别降低了83.32％、73.24％、75.56％，启动子强度也有小幅提升；当截去LuxR结合位点序列后受体蛋白无法识别启动子，PluxI(3)完全失去启动子活性，没有荧光；截去129bp后的(1)号启动子，即PluxI(1)具有目前最低的表达渗漏，相对荧光强度显示启动子的渗漏降低了83.32％，并且启动子的强度提高了66.07％，因此选择PluxI(1)进行迭代基因电路的构建，PluxI(1)序列如SEQ ID NO:17所示。

SEQ ID NO:11

CCTGCATTAGGAACATTGCAGCTGTAGGATGGTACAGGTTTC

SEQ ID NO:12

CCTGCATTAGGATTTATGCATCTTGGTGGAAACGTGGTGTT

SEQ ID NO:13

CCTGCATTAGGTTCCGTAATGCATCAGTTTGTTATGATC

SEQ ID NO:14

CCTGCATTAGGGGTACAGGTTTCCGTAATGCATCAGTTGTT

SEQ ID NO:15

CATATGTACAGCCATGCAACCTCTCTTATTTTACAT

SEQ ID NO:16

CCTGCATTAGGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACACAGGAAACAGCGCCGCTGAGAAAAAGCGAAGCGGCACTGCTCTTTAACAATTTATCAGACAATCTGTGTGGGCACTCGACCGGAATTATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGGATCCGAGCTGGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTAAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGCTCGAG

SEQ ID NO:17

GAATTAATTGGAAGCGATATCACCAAACCTCCAAATTGGTGTTATATAACACGCAAAAAACATAACAATAAGCTAGGTGAACAAAAA

实施例3

自主动态调节绿色荧光蛋白表达的发酵菌株构建及发酵

基因电路表达载体的构建

具体构建示意图如图3所示。通过EcoNI和XhoI双酶切将PluxI(1)启动子连接到pColADuet-1的EcoNI和XhoI处，并在XhoI前加上NcoI/BamHI/EcoRI酶切位点，得到pColA-PluxI(1)(EcoNI/XhoI)质粒，将T7 RNA聚合酶基因经过NcoI/EcoRI双酶切连接到pColA-PluxI(1)(EcoNI/XhoI)的NcoI/EcoRI处，得到质粒pColA-PluxI(1)-T7 RNApoly(即O-PluxI(1)-T7 RNApoly)。将基因egfp经过NcoI/EcoRI双酶切连入·pETDuet-1的NcoI/EcoRI处得到质粒E-egfp(pET-egfp)。

大肠杆菌感受态制备

本实施例所选用的转基因受体为大肠杆菌(Escherichia coli BL21)，来自于Novagen公司(达姆施塔特，德国)，挑取大肠杆菌(Escherichia coli BL21)单菌落于5mLLB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)过夜(约12h)。取500μL过夜培养物转接于50mL新鲜LB培养基中，摇床培养(37℃,200rmp)至吸光度在600nm处达到0.35-0.6。将0.1mol/L CaCl₂溶液置于冰上预冷。吸取25mL菌液至50mL EP管中，置于冰上冷却10min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1.666mL预冷0.1mol/L CaCl₂溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，冰上放置20min。离心(3000g，5min，4℃)，弃上清，加入1mL预冷混合溶液(0.1mol/LCaCl₂混合10％甘油)，吸打混匀使细胞重新悬浮。每管100μL细胞悬浮液分装于1.5mL EP管中，于-70℃冷冻贮存备用。

质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli BL21)

待感受态细胞融化后，向100μL感受态细胞中转入质粒O-pluxI(1)-T7RNApoly，pACYC-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR和E-egfp各1μL，缓慢轻弹混匀。冰上放置30min后42℃水浴锅中热激90s，冰上放置10min。向感受态细胞EP管中加入1mL新鲜LB培养基，放入摇床培养(37℃,200rpm,1h)。将大肠杆菌全部加入质粒相应的抗性平板中，充分涂布均匀。转化平板放入37℃培养箱倒置培养12-24h，挑取单菌落活化得到BL21(O-pluxI(1)-T7RNApoly，A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR，E-egfp)。在大肠杆菌体内组装得到可以调节基因表达的迭代基因电路，用绿色荧光蛋白基因作为报告基因检验基因电路强度。

发酵

配制菌种活化培养基(LB液体培养基)，将工程菌BL21(O-pluxI(1)-T7RNApoly，A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR，E-egfp)按照体积分数1％的比例加入菌种活化LB培养基中摇床(37℃，200rpm)培养10-12h，将活化的菌种，以OD₆₀₀为0.1的起始接种量接种入发酵培养基中，摇床(37℃，200rpm)培养每隔1h取样测荧光强度。

实施例4

基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路的活性检测

通过能否观察到绿色荧光来表现基因是否表达，外源基因不表达时碳流用于细胞生长，外源基因表达时碳流用于重组蛋白的合成。

以绿色荧光蛋白的荧光强度反应基因开关的活性。细胞密度(OD₆₀₀)在紫外可见分光光度计(UV/VIS)上测量，全细胞的绿色荧光强度由荧光酶标仪在488nm的激发光，510nm的发射光条件下测定，取发酵液离心收集菌体并用磷酸盐缓冲液(PBS)控制至合适的OD₆₀₀后进行荧光测定。以相同条件下未导入迭代基因电路的BL21菌株为背景，从总荧光中减去，得到实际绿色荧光强度。同时采用实施例3的方法，分别转入质粒O-pluxI(1)-T7 RNApoly，A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR和E-egfp的大肠杆菌BL21为对照进行荧光强度检测。如图4、图5、图6所示，只含有O-pluxI(1)-T7 RNApoly，A-trc(lostoperon)-luxI-trc(lost operon)-luxR，E-egfp其中一种的质粒的表达菌株不表达荧光蛋白，此外，含有O-pluxI(1)-T7 RNApoly和E-egfp质粒的菌株荧光图如图8所示，由于费氏弧菌改造后启动子仍然存在一定的渗漏，导致少量信号分子蛋白表达，启动了下游基因的表达，有少量菌启动绿色荧光蛋白的表达；如图7所示，含有完整迭代基因电路的发酵菌株BL21(O-pluxI(1)-T7 RNApoly，A-trc(lost operon)-luxI-trc(lost operon)-luxR，E-egfp)强力表达绿色荧光并在荧光显微镜下可以观察到，这表明基因电路起到了调节基因表达的作用。

只转入单一质粒(O-pluxI(1)-T7 RNApoly，A-trc(lost operon)-luxI-trc(lostoperon)-luxR或E-egfp)的菌株荧光强度保持不变，含有上述任意两种质粒的菌株荧光强度也保持不变；而含有完整基因电路的基因工程菌荧光强度如图9所示，改造后的不仅渗漏明显降低，并且强度高，活力好；在发酵的起点，PluxI(1)启动子下游的T7 RNA聚合酶基因不表达，不启动T7启动子下游的绿色荧光蛋白表达，无法观察到绿色荧光，所有胞内资源用于菌体的生长。当发酵液OD₆₀₀达到0.5后，PluxI(1)启动子感应到信号分子浓度的变化，在不需要人为干扰或者添加诱导剂的情况下自发启动下游T7 RNA聚合酶基因的表达，T7RNA聚合酶结合到T7启动子上，强力启动T7启动子下游靶基因，即绿色荧光蛋白的表达，可以观察到明显的绿色荧光，胞内碳流被定向到外源基因的表达上，避免重组蛋白的表达和细胞生长竞争胞内资源，同时解决了费氏弧菌群体感应系统强度较弱的缺陷以及启动子自身存在的表达渗漏。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种基于费氏弧菌群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccatggttat gataaaaaaa tcggactttt t 31

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcttaa tttgatacag cttttctaaa c 31

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggttat gaacattaaa aatataaatg ctaatg 36

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaattcttaa tttttaaggt atggacaatt aat 33

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgcattag gtttttgttc acctagctta ttgttatgtt t 41

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcgaggaat tcggatcccc atggtacagc catgcaacct ctcttatttt acat 54

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatggttat gaacacgatt aacatcgcta agaacg 36

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcttac gcgaacgcga agtccgact 29

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catatggtaa gggagaagaa cttttc 26

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctcgagttat ttgtatagtt catccatgcc 30

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctgcattag gaacattgca gctgtaggat ggtacaggtt tc 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctgcattag gatttatgca tcttggtgga aacgtggtgt t 41

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctgcattag gttccgtaat gcatcagttt gttatgatc 39

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctgcattag gggtacaggt ttccgtaatg catcagttgt t 41

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catatgtaca gccatgcaac ctctcttatt ttacat 36

<210> 16

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctgcattag gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa 60

ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggtc acacaggaaa cagcgccgct gagaaaaagc 120

gaagcggcac tgctctttaa caatttatca gacaatctgt gtgggcactc gaccggaatt 180

atcgattaac tttattatta aaaattaaag aggtatatat taatgtatcg attaaataag 240

gaggaataaa ccatggatcc gagctggaga tctgcagctg gtaccatatg ggaattcgaa 300

gctttctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc 360

atcatcatca ttgagtttaa acggtctcca gcttggctgt tttggcggat gagagaagat 420

tttcagcctg atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc 480

tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg 540

tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa 600

taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgc tcgag 655

<210> 17

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaattaattg gaagcgatat caccaaacct ccaaattggt gttatataac acgcaaaaaa 60

cataacaata agctaggtga acaaaaa 87

Claims

1.一种基于费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统和T7表达系统的迭代基因电路，其特征在于，该基因电路包括费氏弧菌的信号分子蛋白基因luxI，受体蛋白基因luxR、感应信号分子受体蛋白复合体的启动子序列PluxI(1)、T7 RNA聚合酶基因和用于表征电路强度的绿色荧光蛋白基因egfp；所述PluxI(1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

所述信号分子蛋白基因luxI和受体蛋白基因luxR组成型转录翻译合成对应的信号分子蛋白和受体蛋白，信号分子蛋白可以合成信号分子，信号分子和受体蛋白结合形成信号分子-受体蛋白复合体，信号分子-受体蛋白复合体会结合到PluxI(1)启动子区域并启动下游T7 RNA聚合酶基因的表达，T7 RNA聚合酶结合到表达载体的T7启动子区域并强力启动下游绿色荧光蛋白基因egfp的表达，实现信号的放大。

2.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的迭代基因电路。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体将迭代基因电路构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达，并且使基因电路的表达渗漏最低。

4.一种基因工程菌，其特征在于，包含权利要求1所述的迭代基因电路或者权利要求2所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌对费氏弧菌自身的群体感应系统进行了改造，降低了表达渗漏，并且利用T7表达系统对费氏弧菌(Vibrio fischeri)群体感应系统进行信号的放大，实现绿色荧光蛋白表达的强力自发启动。