KR101877286B1

KR101877286B1 - 만노오스 프로모터를 포함하는 벡터 및 만노오스 프로모터

Info

Publication number: KR101877286B1
Application number: KR1020127006337A
Authority: KR
Inventors: 선 타이안퀴; 알텐부흐너 조세프; 카이지악 크리스토프
Original assignee: 론자 아게
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2018-07-11
Also published as: HK1167677A1; AU2010283807B2; SG178292A1; CA2770557C; BR112012002973A2; CA2770557A1; PT2284273E; CN102471774B; CL2012000363A1; EP2284273A1; MX317816B; MX2012001672A; DK2284273T3; WO2011018376A1; BR112012002973B1; EP2284273A9; AU2010283807A1; EA201200186A1; KR20120040740A; ZA201200627B

Abstract

본 발명은 원핵 숙주에서 발현할 수 있는 벡터 및 바실러스 섭티리스의 만노오스 오페론의 만노오스 유도 프로모터를 포함하는 핵산에 관한 것으로, 상기 벡터 및 핵산은 각각 특히 높은 세포농도로 발효 시 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산의 발현을 위해 숙주세포를 형질전환하기 위해 사용될 수 있다.

Description

만노오스 프로모터를 포함하는 벡터 및 만노오스 프로모터 {VECTOR COMPRISING MANNOSE PROMOTER AND MANNOSE PROMOTER}

본 발명은 예를 들면 재조합 단백질과 같은 폴리펩타이드를 암호화(encoding)하는 핵산의 이종 발현을 위한 만노오스 유도 프로모터를 포함하는 원핵 숙주세포에서 발현 가능한 벡터에 관한 것이다.

보다 상세하게, 본 발명은 숙주에 이종인 핵산 서열을 포함하는 전사단위에 작동 가능하게 연결된 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 숙주에서 이종발현을 하기 위한 신규 벡터에 관한 것으로, 상기 핵산 서열의 발현은 상기 만노오스 오페론의 프로모터 영역에 의해 제어된다. 또한 본 발명은 예를 들면 재조합 단백질과 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 이종발현을 위한 이러한 벡터의 사용법에 관한 것이다.

원핵체계에서 예를 들면 폴리펩타이드 (구조유전자)를 암호화하는 핵산을 이종 발현하기 위해 다양한 시스템이 설명되었다. 이러한 목적으로 숙주는 구조 유전자가 전사될 수 있도록 하는 핵산 서열인 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 관심 구조유전자의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 형질 전환된다. 적절한 방법으로 유도함으로써 상기 프로모터는 활성화되어 구조 유전자가 전사되도록 한다. 이러한 유도는 음성 또는 양성적으로 제어하여 이루어질 수 있다.

음성 제어 유도의 경우, 억제자가 프로모터에 결합하여 구조유전자의 전사를 방지한다. 적절한 유도인자가 존재하는 경우, 억제자는 비활성화되고 전사가 이루어진다.

양성 제어 유도의 경우, 프로모터는 활성체와 결합하는 동시에 활성화되고, 이때 활성체가 프로모터에 결합하는 것은 적절한 유도인자에 의해 이루어진다.

전형적인 유도인자로는 원핵 숙주가 물질대사를 위해 필요로 하는 기질이 될 수 있으며, 이러한 예로는 각종 당류를 들 수 있다.

본 발명은 양성적 유도 시스템에 관한 것으로, 적절한 기질, 즉 유도인자의 존재하는 경우 활성체는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시하는 상기 프로모터에 결합한다.

지금까지 원핵 숙주 시스템 내에서의 이종 유전자 발현 시스템 대부분은 오로지 한정된 세균성 프로모터에 의해서 좌우되었다. 그 결과, 유도인자로 사용될 수 있는 기질의 수 또한 제한적이었다.

또한 이종 발현 시스템의 산출량은 사용 가능한 형질 변환된 원핵 숙주의 수에 따라 좌우된다. 따라서 높은 세포 농도로 증가할 수 있는, 즉 세포 분화 후 벡터가 풀리지 않고 빠르게 증식할 수 있도록 하는 원핵 숙주 시스템이 요구된다.

본 발명은 숙주에 이종인 핵산 서열을 포함하는 전사단위에 작동 가능하게 연결된 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 신규 벡터를 제공하며, 상기 핵산 서열의 발현은 상기 만노오스 오페론의 프로모터 영역에 의해 제어된다.

또한, 본 발명은 원핵 숙주에서 핵산서열을 조절하여 이종발현하기 위한 상기 신규 벡터의 사용법, 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 숙주에서 발현 가능한 분리 및 정제된 핵산서열, 상기 벡터 또는 상기 분리 및 정제된 핵산서열로 형질 전환된 원핵 숙주, 상기 벡터 또는 상기 분리 및 정제된 핵산서열을 사용하여 숙주에서 폴리펩타이드를 생산하는 방법, 및 발효 시, 특히 높은 세포농도로 발효 시 상기 벡터 또는 상기 분리 및 정제된 핵산서열을 사용하여 형질 전환된 원핵 숙주의 사용법을 제공한다.

도 1은 하이라이트로 표시된 아데닌 뉴클레오티드에 위치한 전사개시부위, 이탤릭체로 표시한 추정 -35 및 -10 구역, 화살표로 표시한 manR의 종결부 및 lys유전자의 개시부와, 밑줄로 표시한 제한부위 BglII, XbaI, AflII 및 NdeI을 포함하는 manP 프로모터의 전사개시부위를 맵핑하기 위해 사용되는 바실러스 섭티리스(B.subtilis)의 핵산서열을 도시하며,
도 2는 하이라이트로 표시된 구아닌 뉴클레오티드에 위치한 전사개시부위, 이탤릭체로 표시한 추정 -10 및 -35 구역, 화살표로 표시한 manR유전자의 개시부와, 밑줄로 표시한 제한부위 HindIII 및 추정 cre 서열을 포함하는 manR 프로모터를 포함하는 프로모터 영역의 핵산서열을 도시하며,
도 3은 화살표로 표시된 lacZ의 개시부와, 밑줄로 표시된 제한부위를 포함하는, pSUN 291, pSUN 384.1 및 pSUN 385.2에 각각 포함된 바와 같은, manR 프로모터의 프로모터 영역을 포함하는 바실러스 섭티리스의 핵산서열을 도시하며,
도 4는 본 발명에 따른 발현벡터 pSUN 279.2의 플라스미드 지도를도시하며,
도 5는 본 발명에 따른 플라스미드 pSUN 279.2, pSUN 284.1 및 pSUN 291을 각각 포함하고 있는 바실러스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 6은 manR 및manP 사이의 유전자간 영역이며 여기서는 리포터 유전자 lac로 대체되어 있고 전사개시부위를 갖고, 굵은 글씨로 표시되어 있는 -35 및 -10 구역, 화살표로 표시되어 있는 manR의 말단부와 lacZ의 개시부, 그리고 밑줄로 표시되어 있는 제한부위, manR의 C 말단을 포함하는 바실러스 섭티리스로부터의 manP 프로모터의 프로모터 영역을 포함하는 바실러스 섭티리스의 핵산서열을 도시하며,
도 7은 플라스미드 pSUN279.2와 서로 다른 길이의 도 6에 도시된 핵산서열 단편을 포함하는 추가 플라스미드를 포함하는 바실러스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 8은 도 3에 도시된 핵산서열을 포함하는 벡터 pSUN 291, pSUN 384.1 및 pSUN 345.2를 포함하는 바실러스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 9는 본 발명에 따른 발현벡터 pMW 168.1의 플라스미드 지도를 도시하며,
도 10은 세대가 바뀌면서 나타나는 플라스미드를 포함하는 세포의 비율과 함께 바실러스 섭티리스 3NA에서 pMW 168.1의 플라스미드 안정성 시험결과를 나타내는 그래프를 도시하며,
도 11에서 14는 발효단계 1에서 4 기간 동안 대수적으로 나타나는 건조 바이오매스 농도에 대한 그래프와 발효단계 1에서 4기간에서 발효기간 동안 나타나는 형광신호(RFU)에 대한 그래프를 도시하며,
도 15와 16은 발효단계 5와 6의 발효기간 동안 나타난 형광신호 그래프를 도시하며,
도 17은 실험 4a에 따른 플라스미드 pMW 168.1의 구성에서 획득한프로모터 개시 영역의 개략적인 구조를 도시하며,
도 18은 플라스미드 pMW 168.1의 구성을 도시하는 플로우차트이고,
도 19는 SDS PAGE를 도시한다.

본 명세서에서 사용하는 바와 같이 하기에 기재된 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것임을 밝힌다.

'숙주 내에서 발현 가능한 벡터' 또는 '발현벡터'라 함은 재조합 또는 합성하여 생성되는 폴리핵산 구조체를 의미하며, 이는 숙주세포에서 특정 핵산 서열이 전사 가능하도록 하는 일련의 특정 폴리핵산 성분을 포함한다. 일반적으로 이러한 벡터는 프로모터와 작동 가능하게 연결된 특정전사 핵산서열을 포함하는 전사단위를 포함한다. 예를 들면 숙주에서 발현 가능한 벡터로는 자체 혹은 자기 복제 플라즈미드, 코스미드, 파지(pharge), 바이러스 또는 레트로 바이러스 (retrovirus)가 있다.

본 명세서에서 '숙주', '숙주 세포' 및 '재조합 숙주 세포'라는 용어는 서로 대체하여 사용할 수 있으며 본 발명의 하나 이상의 벡터 또는 분리 또는 정제한 핵산 서열이 도입되는 원핵 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상 세포를 의미할 뿐 아니라, 이러한 세포의 자손 (progeny) 또는 잠재적 자손을 일컫는다. 돌연변이나 환경적인 영향으로 후대에서 어떠한 변형이 일어날 수 있기 때문에 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에서 사용되는 용어의 범위에는 이러한 경우도 포함된다.

'구성한다(comprise)'라는 용어는 일반적으로 '포함한다(includie)'는 개념으로 사용되는 것으로, 즉 하나 이상의 특징이나 성분이 존재하는 것이 가능하다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 '프로모터'는 전사단위의 발현을 제어하는 핵산 서열을 지칭한다. '프로모터 영역(promoter region)'은 세포 내에서 RNA 중합효소를 결합시키고 다운스트림 (3'방향) 암호화 부위의 전사를 개시할 수 있는 조절 영역을 의미한다. 프로모터 영역 내에서는 추정 -35번째 구역 및 프리브노 구역 (Pribnow box, -10번째 구역)과 같은 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 영역 (공통서열)이 발견될 것이다. 또한, 프로모터 영역은 전사 개시부위 및 조절 단백질을 위한 결합부위를 포함할 수 있다.

'만노오스 오페론'은 바실러스 섭티리스 (Bacillus subtilis)의 만노오스 오페론을 의미한다. 만노오스 오페론에서는 세 개의 유전자가 확인되었다 ((Kunst F. N. et al., 'The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtilis', Nature 390, pages 249 to 256 (1997)).

첫 번째 유전자인 manP는 과당 투과효소과 (fluctose-permease family)에 속하는 만노오스 특이 효소 성분 (운반체)를 암호화한다. 두 번째 유전자인 manA 는 만노오스 6-인산이성질체화효소를 암호화하며, 세 번째 유전자인 yjdF의 기능은 잘 알려져 있지 않다. 이러한 세 유전자의 업스트림 위치 및 동일한 방향에는 만노오스 오페론의 활성체인 ManR을 암호화하는 조절 유전자인 manR가 위치한다.

세 개의 유전자 manP, manA, yjdF (이하 'manP'로 총칭함)로 이루어진 만노오스 오페론은 자체적으로 양성적으로 조절되는 manP 프로모터의 제어를 받는다. 또 다른 프로모터인 manR 프로모터는 만노오스에 의존하는 manP 프로모터의 유도에 필수적인 manR의 발현을 담당한다.

상기 manR 프로모터 영역은 manR 유전자의 이화생성물 조절 단백질 결합 부위 (이화생성물 반응요소 (cre))를 더 포함한다.

'cre 서열'은 이화 유전자 업스트림 (5'방향)에 위치한 핵산 서열을 의미한다. cre 서열은 탄소 이화대사 억제 (carbon catabolite repression: CCR)시 이화작용 유전자의 발현을 방지하는 이화대사 억제 단백질(catabolite control protein: CCP)을 결합시킨다.

'만노오스 오페론의 프로모터 영역'은 cre 서열이 존재하는 경우나 존재하지 않는 경우 manR 뿐 아니라 manP의 발현을 조절하는 프로모터 영역을 의미한다.

'manP 프로모터'는 본 명세서에서 의미한 바와 같이 적어도 35번째 영역, 프리브노 상자 및 ManR 결합부위를 포함한다.

'manR 프로모터'는 본 명세서에서 의미한 바와 같이 적어도 35번째 추정 영역, 프리브노 상자 및 ManR 결합 부위와 이에 더해 선택적으로 cre 서열을 포함한다.

'만노오스'라고도 불리는 D-만노오스는 글루코오스의 2-에피어(2-epimer)이며 만난 (mannan) 및 헤테로만난 다당류, 당단백질과 다양한 글리코콘주게이트(glycoconjugates)에 존재한다.

'CcpA'는 포괄 조절 단백질인 '이화대사 억제 단백질 A'를 의미하는 것으로 일부 이화대사 오페론을 활성화하거나 활성화를 억제한다. 만노오스 오페론의 경우, CcpA는 cre 서열에 결합함으로써 억제하는 역할을 한다.

'증폭자 (enhancer)'는 전사단위의 종류, 전사단위에 대한 서열의 위치 및 서열의 방향과는 별도로 전산단위의 전사를 증가시키는 역할을 하는 핵산서열이다. 본 발명의 벡터는 선택적으로 증폭자를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 '전사단위'는 정상적으로 하나의 RNA 분자로 전사하는 핵산서열을 의미한다. 전사단위는 기능적으로 관련된 폴리펩타이트 분자를 암호화되는 하나의 유전자 (단일시스트론), 두 개의 유전자 (다이시스트론) 또는 그 이상의 유전자(폴리시스트론)를 포함할 수 있다.

핵산서열은 다른 핵산서열과 기능적으로 연관되게 놓일 때 '작동 가능하게 연결'된다고 한다. 예를 들면, 프로모터가 코딩 서열의 전사에 영향을 끼친다면 상기 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 또는 폴리펩타이드의 번역이 용이하도록 하기 위해 리보솜 결합 부위와 같은 전사 개시 영역이 위치하는 경우, 전사 개시 영역은 예를 들면 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열과 작동 가능하게 연결된다. 연결은 용이한 제한 부위에서 리게이션 (ligation)함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 종래기술에 따라 합성 올리고핵산염 어댑터 또는 링커가 사용된다.

본 발명에서 언급된 '핵산', '핵산서열' 또는 '분리 및 정제된 핵산 또는 핵산서열'은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체를 의미할 수 있다. 핵산 또는 핵산서열이 벡터에 위치하는 경우, 이는 대개 DNA다. 여기서 언급되는 DNA는 예를 들면 이중 사슬 DNA, 단일 사슬 DNA, 하나 이상의 사실이 두 개 이상의 단편 (fragment)으로 이루어진 이중 사슬 DNA, 하나 이상의 사슬이 연속된 인산디에스테르 백본을 포함하는 이중 사슬 DNA, 하나 이상의 단일 사슬 부분 및 하나 이상의 이중 사슬 부분을 포함하는 DNA, DNA 사슬이 모두 상보적인 이중 사슬 DNA, DNA 사슬이 부분적으로만 상보적인 이중 사슬 DNA, 환형 DNA, 공유결합폐형 (covalently-closed) DNA, 선형 DNA, 공유결합으로 가교된 DNA, cDNA, 화학물질 합성 DNA, 반합성 (semi-synthetic) DNA, 생합성 DNA, 자연 분리 DNA, 효소소화 DNA, 절단 DNA, 방사성 동위 원소 식별 DNA 및 형광 색소 식별 DNA와 같은 식별 DNA, 하나 이상의 비자연발생적 종이나 핵산을 포함하는 DNA와 같은 모든 폴리디옥시뉴클레오타이드 서열일 수 있다. DNA 서열은 표준 화학기술에 의해 합성될 수 있는데, 예를 들면 인산트리에스테르 방법이나 자동 합성 방법 및 PCR 방법을 통해 합성될 수 있다. 또한 효소기술을 사용하여 정제 및 분리된 DNA 서열을 생산할 수도 있다.

본 명세서에서 언급된 RNA는 예를 들면 단일 사슬 RNA, cRNA, 이중 사슬 RNA, 하나 이상의 사슬이 둘 이상의 단편으로 이루어진 이중 사슬 RNA, 하나 이상의 사슬이 연속된 인산디에스테르 백본을 포함하는 이중 사슬 RNA, 하나 이상의 단일 사슬 부분 및 하나 이상의 이중 사슬 부분을 포함하는 RNA, RNA 사슬이 모두 상보적인 이중 사슬 RNA, RNA 사슬이 부분적으로만 상보적인 이중 사슬 RNA, 공유결합으로 가교된 RNA, 효소소화 RNA, 절단 RNA, mRNA, 화학 합성 RNA, 반합성 RNA, 생합성 RNA, 자연 분리 RNA, 방사성 동위 원소 식별 RNA 및 형광 색소 식별 RNA 와 같은 식별RNA, 하나 이상의 비자연발생적 종이나 핵산을 포함하는 RNA일 수 있다.

'변종' 또는 '서열의 변종'은 보존 핵산 치환체에 의해 참고 서열로부터 변형된 핵산서열을 의미하며, 이에 의해 하나 이상의 핵산은 동일한 특징을 가진 다른 핵산으로 치환된다. 또한 변종은 변성서열이 참고 서열과 동일한 기능을 나타내는 한 (기능적으로 동일한 경우) 이러한 삭제 및 삽입을 포함하는 서열인 퇴화서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 '폴리펩타이드', '펩타이드', '단백질', '폴리펩타이드의' 및 '펩타이드의'와 같은 용어는 인접한 잔여물의 알파 아미노 및 카르복시 그룹 사이의 펩타이드 결합에 의해 다른 잔여물과 연결된 일련의 아미노산 잔여물을 지칭하기 위해 포괄적으로 사용된다.

'분리 및 정제된 핵산서열'이란 용어는 상기 핵산서열이 본 발명에 따른 상태임을 나타내는 것이다. 핵산서열은 이들의 자연적인 환경 또는 체내 혹은 체외에서 실행되는 재조합 기술에 의해 제조되는 경우 제조되는 환경 (예를 들면, 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 핵산과 같이 자연적으로 연관되는 물질로부터 자유롭거나 실질적으로 자유롭게 될 것이다.

'형질전환', '형질 전환된' 또는 '숙주 세포 내로 핵산을 도입하는' 등의 용어는 벡터와 같은 세포외 핵산이 다른 물질을 수반하거나 수반하지 않고 숙주 세포로 들어가는 모든 과정을 의미한다. '세포가 형질 전환된' 또는 '형질 전환된 세포'라는 표현은 세포 외 핵산이 도입되어 세포 외 핵산이 잠복하고 있는 세포 및 그 자손을 의미한다. 핵산은 염색체 성분이나 추가 염색체 성분으로 복제되기 위해 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어 발현 벡터를 포함하는 적절한 숙주 세포의 형질전환은 현미주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), 입자충격법 (particle bombardment) 와 같은 잘 알려진 공지의 방법이나, 예를 들면 Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory or in Ausubel et al. 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons 에 설명된 인산 칼슘을 매개로 하는 형질전환법과 같은 화학적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

'이종 핵산서열' 또는 '숙주에 이종인 핵산서열'은 예를 들면 숙주에 이질적인 폴리펩타이드와 같은 발현생성물 (이종 발현 또는 이종생성물)을 암호화 하는 핵산, 즉 상기 숙주와는 다른 공여체로부터 유래한 핵산서열이나 예를 들면 상기 숙주에 이질적인 폴리펩타이드와 같은 발현 생성물을 암호화하는 화학적으로 합성된 핵산서열을 의미한다. 상기 숙주가 특정 원핵 종인 경우, 이종 핵산서열은 다른 속 (genus)이나 과 (family)에서 유래한 생물(organisms)인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 다른 목 (order)이나 강 (class), 특히 다른 문 (phylum, division), 가장 세부적으로는 다른 도메인(계) (domain, empire)에서 유래한 생물인 것이 바람직하다.

숙주와는 다른 공여체로부터 유래한 이종 핵산서열은 변형될 수 있는데, 이는 숙주세포에 도입되기 전에 변형될 수 있으며, 상기 참조 서열과 동일한 기능을 나타내는 한 (기능적으로 동일한 경우) 변이, 삽입, 삭제나 치환 또는 단일 핵산이나 이종 핵산서열의 일부분에 의해서 가능하다. 또한 본 명세서에서 언급되는 바와 같이, 이종 핵산서열은 파지 디스플레이 라이브러리에서 사용되고 단일 핵산 또는 핵산서열의 일부가 원핵 숙주의 코돈 사용빈도에 따라 변형되는 인간의 항체와 같은 진핵 생물 (진핵 태생)과 같은 다른 생물 도메인(계)에서 유래한 핵산서열을 포함한다.

또한 본 발명의 범위 내에서 '이종 핵산서열' 또는 '숙주에 이질적인 핵산서열'이란 용어는 상기 숙주에서 유래하고 상기 숙주에서 자연적으로 발현되는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열도 포함하며, 상기 핵산서열은 본 발명의 벡터에 삽입되고 본 발명의 만노오스 오페론의 프로모터 영역에 의해 제어된다.

'전사 개시 영역'은 전사개시를 촉진하며 샤인 달가르노 서열 (Shine-Dalgarno sequence)와 같은 리보솜 결합 부위를 위한 서열을 포함하는 신호 영역이다.

일반적으로 전사 개시 영역은 전사 개시 부위에 대해 다운스트림에 위치하고 발현될 상기 유전자와 작동 가능하게 연결되어 있다.

'전사 종결 영역'은 RNA 중합효소(polymerase)를 발생시켜 전사를 종결하는 서열을 나타낸다. 전사 종결 영역은 보통 원하지 않는 다른 인접 유전자의 전사를 방지하거나 다른 잠재적인 프로모터 형태 전사를 방지하고 mRNA의 안정성을 증가시키는 전사단위 부분을 말한다.

'항체'는 항원에 의해 자극을 받은 후 면역 시스템의 B 세포에 의해 생성되는 플라즈마 단백질류을 일컫는다. 포유류 (즉 사람)의 항원은 면역 글로블린 항체 (Ig) G, M, A, E 또는 D이다. 본 발명의 목적을 위해 사용되는 '항체'라는 용어는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 항유전성 항체, 당뇨, 다발성 경화증, 류머티스성 관절염과 같은 자가 면역 질환에서 나타나는 자가항체 및 키메라 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 숙주에 이질적인 핵산서열을 포함하는 전사단위에 작동 가능하게 연결된 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 호스트에서 발현 가능한 벡터를 제공하는 것으로, 상기 핵산서열의 발현은 상기 만노오스 오페론의 프로모터 영역에 의해 제어된다.

본 발명에 따른 벡터는 자체 또는 자기 복제 플라스미드, 코스미드, 파지(phage), 바이러스 또는 레트로 바이러스 (retrovirus)가 바람직하다. 본 발명의 핵산서열을 발현함에 있어 다양한 범위의 호스트/벡터 조합이 사용될 수 있다.

예를 들면, 유용한 발현 벡터는 염색체, 비염색체 및/또는 합성 핵산서열 부분으로 이루어질 수 있다.

바람직한 벡터는 각각 바실러스 섭티리스 및 대장균 (E.coli)에 특이한 벡터와 같이 특정한 숙주 범위를 갖는 벡터 뿐 아니라 그램 양성 박테리아 및 그램 음성 박테리아에 유용한 벡터와 같이 넓은 범위의 숙주에서 발현될 수 있는 갖는 벡터를 포함한다.

또한, 로카피 (low-copy), 미디움 카피 (medium-copy), 하이카피 (high-copy) 플라스미드도 사용될 수 있다.

예를 들면, 바실러스 섭티리스에서 로카피 플라스미드는 pAMbeta 1이고, 미디움카피 플라스미드는 pBS72유도체이며, 하이카피 플라스미드는 pUB110이다.

본 발명에 따르면, 만노오스 오페론의 프로모터 영역은 각각 manR 프로모터 영역과 manP 프로모터 영역을 포함한다.

리포터 유전자인 리소스타핀 유전자 (lys) 앞에 위치한 manR 및 manP 사이의 유전자간 영역인 manR의 C 말단을 포함하는 바실러스 섭티리스로부터의 핵산서열이 도 1에 도시되어 있다.

manP의 프로모터 영역을 포함하는 본 발명의 핵산서열은 염기 쌍 (bp) -80에서 lys의 개시코돈까지 포함한 도 1의 핵산서열 (서열번호 1)을 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 bp -80에서 bp -1를 포함하는, 즉 bp +1에서 전사 개시 부위의 업스트림 영역을 포함하는 도 1의 핵산서열 (서열번호 2)를 포함한다.

manR의 프로모터 영역, bp +1에서의 전사 개시 부위 G, 추정 cre 서열, bp+1과 manR 사이의 전사 개시 영역 및 manR의 일부를 포함하고 있는 바실러스 섭티리스로부터의 핵산서열은 도 2와 3에 도시되어 있으며, 여기서 manR은 lacZ로 대체된다. manR의 프로모터 영역을 포함하는 본 발명의 핵산서열은 bp -122에서 lacZ의 개시코돈까지의 영역을 포함하는 도 3의 핵산서열 (서열번호 3)을 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 bp -122부터 bp +7까지, 즉 추정 cre 서열을 포함하는 염기서열 (서열번호 4)을 포함하며, 특히 bp -122에서 bp -1, 즉 bp +1에서 전사 개시 부위의 업스트림 영역을 포함하는 도 3의 염기서열 (서열번호 5)를 포함한다.

manP와 manR의 프로모터 영역은 모두 ManR을 위한 결합 부위를 포함한다. 또한 본 발명은 서열번호 1에서 5 및 그 변종체의 어느 하나와 상보적인 서열을 포함한다.

(cre 서열을 포함하거나 포함하지 않는) manP 프로모터 영역, manR 프로모터 영역 및 본 발명에서 사용되는 서열번호 1에서 5의 서열에 따른 프로모터 영역, 이에 상보적인 서열 또는 그 변종체와 같은 만노오스 오페론의 프로모터 영역은 대개 바실러스 섭티리스의 만노오스 오페론이나 그 밖의 기능적으로 동일한 원핵 생물의 프로모터 영역, 특히 간균과 (family of bacilaceae)의 생물체에서 유래한 것이다. 기능적으로 동일한 다른 원핵생물의 프로모터 영역은 D-만노오스에 의해 유래되는 프로모터 영역, 즉 만노오스가 없을 때보다 있을 때 발현 활성이 높은 프로모터 영역을 포함한다.

바실러스 섭티리스와 같은 피르미쿠테스(Firmicutes)와 같은 다양한 원핵생물에서는 만노오스 오페론이 D-만노오스 물질대사에 참여한다.

바실러스 섭티리스는 탄소원 (carbon source)으로서 다양한 당류를 사용할 수 있다. 글루코오스 및 D-만노오스와 같은 6탄당 (hexose)은 주로 포스포에놀피루브산염 (phosphoenolpyruvate)인 탄수화물 포스포트란스페라아제 시스템 (phosphotransferase system: PTS)을 통하여 이용된다. PTS에서는 각각의 6탄당이 흡수되는 동안 동시에 인산화되어 세포 내로 이동된다. 특정 당 기질의 흡수 및 활용은 탄소 이화대사 억제 (CCR)에 의해 조절된다. 바람직한 바실러스 섭티리스의 당 기질인 글루코오스가 존재하는 경우, 만노오스 오페론과 같이 다른 기질을 흡수하고 사용하기 위한 유전자의 전사는 억제된다.

바실러스 섭티리스에서 글루코오스에 의존하는 CCR의 메커니즘은 널리 연구되었고 당해 분야에 공지되어 있다 (Stulke J. et al., 'Regulation of carbon catabolism in Bacillus species', in Annu. Rev. Microbiol. 54, 2000, pages 849-880).

본 발명에 따른 전사단위는 일반적으로 전사단위의 번역 개시점 (개시코돈)의 업스트림에 위치한 번역 개시영역을 더 포함하는데, 상기 번역 개시영역은 상기 핵산서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 번역 개시영역은 대개 ATG, GTG 또는 TTG일 수 있는 전사 단위의 번역 개시점에 바로 인접한 업스트림에 위치한다.

번역 개시영역은 만노오스 오페론에서 manP 유전자나 manR 유전자의 전사단위의 번역 개시영역일 수 있다. 만노오스 오페론의 manP나 manR 유전자의 번역 개시영역은 부분 또는 전체적으로 다른 번역 개시영역으로 대체될 수 있다. 예를 들면, 모두 바실러스 섭티리스로부터의 tufA (연장인자 Tu) 및 gsiB (스트레스 단백질: Jurgen et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258, 538-545)의 번역 개시영역을 사용할 수 있다.

tufA 및 gsiB의 각 핵산서열은 굵은 글씨로 표시한 개시코돈, 밑줄로 표시한 제한 부위, 하이라이트로 표시한 사인-달가르노서열 포함하며, 아래와 같이 도시한다.

tufA:

gisB:

상기 전사 개시 영역을 적절히 선택함으로써 mRNA의 안정성이 향상될 수 있으며, 이는 유전자 발현에 있어서 중요한 특징 중 하나이다. mRNA 안정성의 특징은 그 특유의 반감기이다.

상기 전사 개시 영역에 추가하여, 상기 번역의 개시점 및 선택적으로는 상기 개시점 이후의 다수의 유전자 코돈, 예를 들면 대략 5-6개의 코돈이 대체될 수 있는데, 예를 들면 상기에서 설명한 바와 같이 각각 tufA 및 gsiB의 핵산서열 내에서 대체될 수 있다.

번역 개시 영역은 본 발명의 이종 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 신호 서열을 인코딩하는 서열을 더 포함할 수 있다. 신호 서열은 대개 번역의 개시점에 바로 인접한 다운스트림에 위치하는데, 이 개시점은 상기 전사 단위의 ATG, GTG 또는 TTG일 수 있다.

디시스트로닉 (dicistronic) 또는 폴리시스트로닉 전사 단위가 사용되는 경우, 시스트론 각각에 작동 가능하게 연결된 다른 또는 동일한 신호 서열이 적용될 수 있다. 바람직하게는 이러한 경우, 다른 신호 서열이 사용된다. 사용되는 신호 서열은 원핵 또는 진핵 신호 서열일 수 있다. 대개 원핵 신호 서열이 적용된다.

본 발명의 발현 벡터에 사용될 신호 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 시판되는 것을 구입하거나 또는 화학적으로 합성하여 얻을 수 있다. 예를 들면, 신호 서열은 Van Devanter et. Al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)에 설명된 바와 같이, 예를 들면 Beaucage & Caruthers, 1981 , Tetrahedron LeHs. 22, 1859-1862에 설명된 고상 포스포라미디트 트리메스테르(trimester) 법에 따라 합성될 수 있다. 올리고핵산염의 정제는 Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)에 설명된 바와 같이 네이티브 아크릴아미드 겔 전기영동이나 음이온 교환 HPLC에 의해 수행될 수 있다.

일반적으로 전사 단위는 전사 종결 영역을 더 포함한다.

바람직하게는 강력한 전사 종결 영역은 프로모터가 상기 전사단위에서 측면 플라스미드 서열로 독파하는 것 뿐만 아니라 다른 플라스미드 프로모터에서 상기 전사단위로 독파하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한 mRNA의 안정화는 이러한 전사 종결 영역이 존재 하는 경우에 관찰되었다.

강력한 전사 종결영역의 바람직한 예는 상업적으로 구입할 수 있는 바실러스 섭티리스 168 tufA의 3'영역으로부터의 핵산서열 5'-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3'을 포함한다.

본 발명에 따른 이종 핵산서열은 숙주에 이질적인 발현 생성물을 암호화한다. 상기 숙주가 바실러스 섭티리스나 대장균과 같은 원핵 생물종인 경우, 상기 관심 핵산서열은 보다 바람직하게 Burkholderia 종과 같은 감마 프로테오박테리아와 같은 다른 부류, 특히 고세균 (archaea bacteria)과 같은 다른 문(phylum)에서 유래한 종류, 보다 구체적으로 포유류와 같은 진핵생물, 특히 인간에서 유래한 것일 수 있다. 그러나, 이종 핵산서열은 상기 숙주의 '코돈 사용빈도'에 따라 변경될 수 있다. 본 발명의 이종 서열은 대개 관심 유전자이다. 바람직하게 관심 유전자는 구조, 조절 또는 치료 단백질과 같은 이종 폴리펩타이드나, 녹색 형광 단백질 또는 그 밖의 융합단백질과 같은 다른 단백질 (Tags)를 포함하는 구조, 조절 또는 치료 단백질의 N 또는 C 말단 융합체를 포함한다. 또한 이종 핵산서열은 예를 들면 역배열 RNA와 같은 RNA 형태로 사용될 수 있는 전사물을 암호화할 수 있다.

상기 단백질은 불용성 집합체나 세포질이나 숙주 세포의 원형질 외극(periplasmic space) 및/또는 세포외 매개체에 존재하는 가용성 단백질로 생성될 수 있다. 바람직하게 상기 단백질은 숙주 세포의 원형질 외극 및/또는 세포외 매개체에 존재하는 가용성 단백질로 생성된다.

관심 이종 단백질은 인간, 포유류나 원핵생물에서 유래한 것일 수 있다. 다른 단백질로는 바이러스성 및 항균성 미생물 병원균 및 종양에서 나온 당단백 및 탄수화물과 같은 항원이 포함된다. 그 밖의 단백질로는 카이모신, 프로테아제, 중합효소, 탈수소효소, 뉴클레아제, 글루카나아제, 산화효소, 알파 아밀라아제, 산화환원 효소, 리파아제, 아미다아제, 니트릴 수화효소, 에스테라아제 또는 니트릴라아제와 같은 효소가 있다.

본 발명에서는 상기 신호 서열 및 이종 핵산서열이 발현 벡터 내에서 배열되는 순서 및 거리는 변할 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 상기 신호서열은 예를 들어 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열에 대해 5'(업스트림)방향에 위치한다. 신호서열 및 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열은 약 1000개의 아미노산에 대해 0만큼 이격될 수 있다. 바람직한 실시예에 따르면, 신호서열 및 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열은 바로 인접하고 있다. 즉, 그 사이에 다른 핵산이 존재하지 않는다.

바람직하게 본 발명의 벡터는 서열번호 1에서 5 중 어느 하나에 따른 핵산서열, 이에 상보적인 서열 및 이들의 변종을 포함한다.

또한 본 발명은 원핵 숙주에서 핵산서열을 조절하여 이종 발현하기 위한 본 발명에 따른 벡터의 사용법을 포함한다.

발현은 적절한 유도인자를 첨가함으로써 개시된다. 만노오스 오페론의 유도인자는 만노오스 또는 만노오스 오페론의 manR 프로모터 영역이나 manP 프로모터 영역을 유도할 수 있는 그 유도체이다. 발현은 원핵 숙주가 사용할 수 있는 유도인자의 양에 의해 조절될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 분리 및 정제된 핵산서열이 제공된다. 바람직하게 분리 및 정제된 핵산서열은 만노오스 오페론의 manP 프로모터 및/또는 manR 프로모터를 포함한다. 보다 바람직하게 분리 및 정제된 핵산서열은 서열번호 1에서 5 중 어느 하나를 포함한다. 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함하는 분리 및 정제된 핵산서열은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열을 포함하는 전사단위에 작동 가능하게 연결될 수 있고, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산서열의 발현은 상기 만노오스 오페론의 프로모터 영역에 의해 제어된다.

본 발명에 따른 분리 및 정제된 핵산서열은 조절 유전자 manR의 모든 또는 일부 서열을 포함할 수 있다.

적어도 manR 프로모터의 분리 및 정제된 핵산 서열은 cre 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 분리 및 정제된 핵산서열은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 표준 PCR 프로토콜 및 방법에 따라 분리될 수 있다. 상기 정제 및 분리된 DNA 서열은 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 일반적으로 핵산서열에 의해 암호화된 생성물의 발현에 사용되는 증폭자와 같은 하나 이상의 조절 서열을 더 포함할 수 있다.

숙주세포를 성공적으로 선택하고 본 발명의 벡터나 분리 및 정제된 핵산서열을 이용하여 안정적으로 형질전환하기 위해서는 선택 표시물 (예를 들면 항생물질에 내성이 있는 물질)을 암호화하는 유전자를 관심 핵산서열과 함께 숙주세포에 도입할 수 있다. 선택 표시물을 암호화하는 유전자는 벡터나 분리 및 정제된 핵산서열상에 위치하거나 독립된 형태, 예를 들면 독립벡터 상에 선택적으로 공동 도입될 수 있다. 다양한 선택 표시물이 사용될 수 있으며, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 암피실린, 테트라시클린과 같은 항생물질에 대한 내성을 부여하는 물질이 포함된다. 항생물질의 양은 선택적인 조건을 만들기 위해 원하는 대로 조정할 수 있다. 보통 하나의 선택 표시물이 사용된다.

상기 벡터가 셔틀 벡터인 경우, 적절한 숙주에 일반적인 표시물이 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터가 바실러스 섭티리스 및 대장균에서 모두 복제 가능한 셔틀벡터인 경우, 엔터로로커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)의 스펙트로마이신-아데닐 전이효소 (spectinomycin-adenyltransferase) 를 암호화하는 내성 표시 유전자가 사용될 수 있으며, 이는 스펙트로마이신에 대한 내성을 부여한다.

또한 형광 단백질과 같은 리포터 유전자가 관심 핵산서열과 함께 숙주세포에 도입될 수 있는데, 이는 형질전환 효율을 판단하기 위함이다.

예를 들면, 적절한 리포터 유전자는 강화 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 코드화하는 유전자 및 베타 갈락토시다아제를 인코딩하는 lacZ를 들 수 있다. 두 가지 모두 시중에서 이용가능하고 폭 넓게 사용되는 리포터 유전자이다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 벡터를 이용하여 형질 전환된 원핵 숙주를 제공하기 위한 것으로, 상기 벡터는 만노오스 오페론의 프로모터 영역을 포함한다. 바람직하게 상기 벡터는 상기 서열번호 1~5 중 어느 하나, 이에 상보적인 서열 또는 이들의 변종을 포함한다.

다양한 종류의 원핵 숙주세포는 본 발명에 따른 만노오스 오페론의 만노오스 유도 프로모터 영역을 사용하여 유용하게 형질 전환된다 . 이러한 숙주는 바실러스 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)와 같은 그램 양성 세포 및 대장균 및 슈도모나스균 (Pseudomonas)과 같은 그램 음성 세포의 균주를 포함할 수 있다. 바람직하게 숙주세포는 그램 양성 세포로, 특히 피르미쿠테스 문 (phylum Firmicutes)의 균주로, 보다 바람직하게는 바실러스 균주이다.

사용될 수 있는 바실러스 균주의 예로는 바실러스 섭티리스(B. subtilis), 바실러스 아밀로리케파시넨스 (B.amyloliquefaciens), 바실러스 리체니포르미스 (B. licheniformis), 바실러스 나토 (B.natto), 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 등이 있다. 바람직하게 상기 숙주 세포는 바실러스 섭티리스 3NA와 바실러스 섭티리스 168과 같은 바실러스 섭티리스이다.

사용될 수 있는 대장균의 예로는 TG1, W3110, DH1, XL1-Blue 및 오리가미 (Origami)를 들 수 있으며, 이들은 시판되고 있다.

적절한 숙주세포는 시판되고 있는데, 예를 들면 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)와 같은 균주 모음으로부터 확보할 수 있다.

예를 들면, 바실러스는 Bacillus Genetic Stock Center에서 입수할 수 있다.

숙주세포는 만노오스를 대사시키거나 대사시킬 수 없다. 일반적으로 바실러스 섭티리스와 같이 만노오스를 흡수하고 대사시킬 수 있는 숙주세포는 변형되어 만노오스의 흡수 및/또는 대사에 관련된 기능 중 하나 이상이 부족해질 수도 있다. 예를 들면, 만노오스 6 인산 이성질체화효소를 코딩하는 manA 유전자와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하거나 차단함으로써 하나 이상의 만노오스의 흡수 및/또는 대사에 관련된 기능이 부족하도록 할 수 있다. 이러한 과정은 트랜스포슨 (transposon) 지지 돌연변이유발 기술이나 녹아웃 돌연변이 기술과 같은 공지기술에 의해 수행될 수 있다.

일반적으로 원핵숙주는 선택된 신호서열에 대응되는데, 예를 들어 바실러스 신호서열이 사용되는 경우, 숙주세포는 보통 동일한 간균과 (family of bacillaceae)에 속한 구성원이며, 보다 바람직하게는 상기 숙주세포는 바실러스 균주이다.

바람직하게 포스포에놀피루브산염 (phosphoenole pyruvate)인 탄수화물 포스포트란스페라아제 시스템 (PTS)을 갖고 있는 숙주가 이용된다. 특히, PTS를 갖고 있는 숙주는 바실랄레스 목(order Bacillales), 구체적으로 바실러스 속 (genus Bacillus), 보다 바람직하게는 바실러스 섭티리스 종의 미생물이거나, 장내세균 (Enterobacteriales) 목, 바람직하게는 대장균 (Escherichia) 속, 보다 바람직하게는 대장균 (E.coli) 종의 미생물이다.

탄소 이화대사 억제 (CCR)의 주요한 요소는 이화대사 억제 단백질 A (CcpA)이며, 이는 서열번호 3과 4 내의 추정 cre 서열과 같은 cre 서열에 결합될 수 있다. CcpA가 결합된 상태에서는 각각의 유전자, 여기서는 manR의 전사가 억제된다.

글루코오스가 존재하지 않고 D-만노오스와 같은 유도체가 존재하는 경우에는, CcpA가 결합됨으로써 억제가 일어나지 않고, 조절 단백질 (ManR)이 만노오스 오페론의 프로모터 영역의 결합부위에 각각 결합하여 만노오스 오페론의 유전자가 전사되기 시작된다.

대단한 것은 본 발명자들이 ManR이 manP 프로모터 영역을 위한 조절 단백질일 뿐만 아니라 manR 자체를 위한 자기조절체라는 것을 발견했다는 점이다.

또한 본 발명은 숙주세포에서 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 a) 벡터를 구성하는 단계, b) 상기 벡터로 원핵숙주를 형질 전환하는 단계, c) 적절한 조건하에 세포 배양 시스템에서 상기 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 단계 및 d) 상기 세포 배양 시스템에서 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함한다.

상기 사용되는 벡터, 벡터의 구성 및 상기 원핵숙주의 형질전환은 상기에서 정의된 바와 같으며, 상기 벡터에 의해 구성되는 이종 핵산서열은 폴리펩타이드를 암호화한다.

세포 배양 시스템으로는 회분배양(batch culture)이나 유가배양(fed batch culture)과 같은 연속 또는 비연속 배양이 배양관, 진동 플라스크나 박테리아 발효기에서 적용될 수 있다.

숙주세포를 배양하기 위해서는 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이 종래의 배지(medium)가 사용될 수 있는데, '양분 이스트 배지액'과 같은 복합 배지, Kortz et al. 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65에 설명된 바와 같은 글리세롤을 포함하는 배지, Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1에 설명된 바와 같은 무기염 배지, Wilms et al., 2001 , Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103 에 설명된 바와 같은 대장균 발효를 위한 배치(batch) 배지, 또는 Bertram et al, 1051 , J. Bacteriol. 62, 293-300에서 설명한 LB 배지가 있다.

배지는 적절한 탄소원을 포함하는데, 예를 들면 글루코오스와 같은 당으로서 사용되는 것과 숙주세포가 성장하기 위한 기질로서 사용되는 것이 있다. 기질로서 사용되는 탄소원은 유도인자와는 다른 것이다.

배지는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 일반적으로 알려진 바와 같이 완충제(buffers), 염류(salts), 비타민군, 아미노산, 항생물질 또는 그 밖의 미량영양소와 같은 성분을 더 첨가함으로써 적절히 변경될 수 있다.

또한 다른 배지나 그 조합이 세포를 배양하는 동안 사용될 수 있다.

바람직하게 기본 배지로 사용되는 상기 배지는 유도인자를 포함하지 않아야 하는데, 이는 만노오스 프로모터 영역을 철저하게 조절하기 위함이다.

상기 유도인자의 첨가는 배양물이 결정한도(determining parameter)에 도달한 후에 시작한다. 이러한 결정한도의 예는 배양물의 세포농도를 나타내는 흡광도 (optical density: OD)나 탄소원의 농도를 포함하며, 여기서 탄소원는 상기 유도인자와는 다른 것이다.

예를 들면, 본 과정에서 상기 유도인자는 배양물이 특유의 배양 시스템에 따라 좌우되는 적절한 흡광도(OD)에 도달한 후 첨가될 수 있다. 진동플라스크 회분 배양을 위해서는 결정한도로서 일반적인 OD₆₀₀값이 약 0.3이상이다.

보통 원핵숙주 배양물의 배지 내의 만노오스와 같은 유도인자의 양은 약 10 g/l, 바람직하게는 약 5 g/l, 보다 바람직하게는 약 2 g/l로 조절된다.

그러나 첨가되는 유도인자의 양은 특유의 발효과정의 필요요건에 따라 조정될 수 있다.

유도인자를 첨가하는 방식 (유도방법)은 특유의 배양시스템에 따라 선택될 수 있다.

첨가하는 방식에 의해 숙주세포의 생장률 및 발현률이 더 조절될 수 있다.

예를 들면, 만노오스는 적절한 기간 동안 비연속적 또는 연속적으로 첨가될 수 있다. 비연속 방식 (충격유도방식, impact induction)에서는 유도시점에만 한 번 첨가되거나 적절한 간격으로 두 번이나 여러 번까지 첨가될 수 있다. 바람직한 방식은 배양시스템에 따라 좌우되며 당해 기술분야의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

예를 들면, 연속 방식에서는 만노오스가 일정한 속도 또는 감소/증가하는 속도로 첨가될 수 있다.

또한, 연속 첨가는 배양 중 선택된 시간 간격 사이에 이루어질 수 있는데, 예를 들면 배양물이 기하급수적으로 성장하는 동안 선택된 시간 간격 사이에 첨가될 수 있다.

또한, 비연속 및 연속 유도 방법이 조합된 것도 가능하다.

본 발명의 유가 배양의 일 실시예에 따르면, 배치(batch)단계에서는 세포가 성장하여 세포농도가 20 에서 30 OD₆₀₀이 되고, 그 후 주요 탄소원 및 만노오스 혼합물을 첨가함에 따라 배양은 영양공급(fed)단계로 전환된다. 영양공급단계에서는 만노오스에 대한 주요 탄소원의 비율이 달라질 수 있는데, 바람직한 비율은 3:1에서 1:3이다. 주요 탄소원과 만노오스 사이의 비율을 변경함으로써 발현률을 제어할 수 있다.

적절한 pH 범위는 예를 들면 6-8, 바람직하게는 7-7.5이며, 적절한 배양온도는 섭씨 10에서 40도, 바람직하게는 섭씨 30에서 37도 사이이다.

상기 세포는 보통 발현생성물의 양 및/또는 바이오매스가 최대가 될 때까지 배양하는데, 바람직하게는 1시간에서 20일, 보다 바람직하게는 5시간에서 3일이 걸린다.

바이오매스의 수율인 발현생성물의 양은 사용되는 배양시스템에 따라 달라진다.

진동 플라스크 배양의 경우, 일반적으로 0.5 g/l 배양 배지에서 발현된 생성물은 본 발명의 벡터를 사용하여 형질 전환된 숙주를 사용하여 생산될 수 있다. 회분배양 및/또는 유가배양 방식에서 발효기 배양을 사용하면 발현 생성물은 보통 0.5 g/l, 바람직하게는 1 g/l, 보다 바람직하게는 1.3 g/l보다 많은 발효액으로 얻어질 수 있다.

또한 본 발명의 숙주세포를 사용한 본 발명의 발효과정에서 세포농도는 적어도 10에서 30 OD₆₀₀, 구체적으로 적어도 50 OD₆₀₀, 바람직하게는 약 250 OD₆₀₀ 이상, 보다 바람직하게는 적어도 500 OD₆₀₀, 가장 바람직하게는 적어도 1000 OD₆₀₀의 높은 농도로 확보될 수 있다. 특히 본 발명의 유가배양에 따르면 50 OD₆₀₀에서 1000 OD₆₀₀ 이 넘는 세포농도를 확보할 수 있다.

일 예에 따르면, 1 OD₆₀₀은 평균적으로 리터 당 약 0.322 g의 건조량에 해당된다. 결과적으로 OD₆₀₀값 100은 리터당 건조량 32.2g에 해당하며, OD₆₀₀값 500은 리터당 건조량 161 g에 해당한다.

또한 본 발명에 따른 숙주세포는 벡터를 손실하지 않고 높은 복제율을 얻을 수 있도록 한다.

숙주세포에서 발현 후, 관심 폴리펩타이드와 같은 발현 생성물은 숙주세포의 배양물로부터 회수될 수 있다. 발현 생성물의 수율을 최대화하기 위해, 상기 세포는 일반적으로 배양 마지막에 수확하여 리소자임 처리, 초음파 처리 또는 프렌치 프레스 (French Press)에 의해 분리된다. 따라서 상기 폴리펩타이드는 일반적으로 처음으로 수득한 숙주세포의 조분리물 (crude lysate)이다. 이후 폴리펩타이드는 시차침전, 분자체크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 등전점전기영동, 겔 전기영동법, 친화성크로마토그래피 및 면역친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있는 당해 기술분야에서 공지된 표준 단백질 정제과정에 의해 정제될 수 있다. 이러한 일반적으로 이용되는 공지의 방법은 예를 들면 Ausubel et al., supra., and Wu et al. (eds.), Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology에 기술되어 있다. 예를 들면 재조합되어 생산된 면역글로불린항체를 정제하기 위해 이러한 글로불린항체는 컬럼에 결합된 수지를 포함하는 컬럼을 통과하는 통로에 의해 면역친화성크로마토그래피를 사용하여 정제되고, 이러한 발현된 면역글로블린항체는 목표 분자들에 결합되어 있다.

또한 본 발명은 원핵숙주에서 예를 들면 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 세포 내 이종 발현을 위한 방법 및 수단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 발명의 벡터를 사용하여 원핵숙주에서 이종 폴리펩타이드의 세포 내 발현을 위한 벡터 및 이러한 벡터의 사용에 관한 것이다.

세포 내 발현의 경우, 상기 폴리펩타이드는 세포질 내에서 발현되며 세포질 내에서 비세포질 위치로 이동되지 않는다. 상기 폴리펩타이드는 세포질 내에서 봉입체나 용해된 형태로 발현될 것이다. 상기 세포, 특히 세포추출물에서 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 과정 또한 널리 공지되어 있다.

본 발명의 만노오스 프로모터는 철저하게 조절될 수 있고, 흔하고 무독성이어서 산업적으로 유용한 화합물에 의해 유도될 수 있다는 장점이 있다.

또한 본 발명의 만노오스 프로모터 및 만노오스 프로모터를 포함하는 벡터는 세포 내에서 안정적이며 세포가 여러 번 복제 된 후에도 없어지지 않는다. 따라서 본 발명에 따라 형질 전환된 숙주세포를 이용하면 높은 셀 농도로 발효 가능하다.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 상기에서 구체적으로 설명된 바 이외에도 다양한 변경 및 수정된 형태가 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 본 발명의 정신이나 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형 및 수정된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 언급되거나 설명된 단계, 특징, 구성 및 화합물을 개별적으로 혹은 포괄적으로 포함하며, 상기 단계나 특징 중 어느 하나 또는 모든 조합이나 어느 두 개 이상의 조합을 포함한다. 따라서 본 발명의 내용은 전반적으로 바람직한 예시로 제시된 것이며 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석할 수는 없다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다. 다양한 참고문헌이 본 명세서에서 인용되었으며, 각각은 본 발명에서 전부 참고문헌으로서 포함된다.

상기의 구체적인 설명은 이하에서 제시된 실시예를 참고하여 완전하게 이해될 수 있을 것이다. 다만, 이는 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 방법으로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

I) 만노오스 오페론의 manR 프로모터영역 및 manP 프로모터영역의 분리 및 확인

본 명세서에서 특별히 언급되지 않는 한, 본 발명에서는 하기에 기재된 물질 및 방법이 사용된다.

박테리아 균주 및 성장조건

대장균 JM109 (Yanisch-Perron C. et al., Gene 33, 1985, 103-1 19) 및 바실러스 섭티리스 3NA (Michel J. F. et al., J. Appl. Bacteriol. 33, 1970, 220-227)를 복제 및 발현을 위해 주요 숙주로 사용되었다. 대장균은 액상 LB배지 (Luria S. E. et al., Virology 12, 348-390) 및 섭씨 37도에서 100μg ml^-1암피실린이나스펙티노마이신이 보충된 LB 한천평판에서 성장시켰다. 바실러스 섭티리스는 액상 LB배지 및 섭씨 37도의 탄소나 황이 최소로 포함된 배지 (Martin-Verstraete I . et al., J. Mol. Biol. 214, 1990, 657-671)에서 성장시켰다. 액상 배지 및 한천평판은 각각 100 μg ml^-1스펙티노마이신, 10μg ml^-1카나마이신, 5μg ml^-1에리스로마이신으로 보충하였다. 만노오스 프로모터를 유도하기 위해, 살균 여과되거나 오토클레이브된 D-만노오스를 최종 농도 0.2 %(w/v)로 첨가하였다.

재료

모든 화학물질은 Sigma-Aldrich (Taufkrichen, 독일), Fluka (Buchs, 독일) 또는 Merck (Darmstadt, 독일)에서 확보하였다. 합성 DNA 올리고뉴클레오티드는 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, 독일)에서 구입하여 사용하였다. 제한효소 및 DNA 조절 효소는 Roche Applied Science (Mannheim, 독일)이나 New England Biolabs. (Frankfurt am Main, 독일)에서 구입하였다. 중합효소연쇄반응 (PCR)은 Fermentas (ST. Leon-Rot, 독일)사의 High Fidelity-DNA 중합효소를 사용하여 Biozym사의 MiniCycler 에서 수행되었다.

DNA 준비 및 형질전환

제조업자가 설명한 바와 같이 DNA 준비 키트 Qiagen (Hilden, 독일)나 Roche (Mannheim, 독일)을 사용하여 대장균 및 바실러스 섭티리스 또는 아가로스 겔로부터의 DNA 분리를 수행하였다. 모든 실시예에서 표준 분자 기술이 사용되었다.

대장균은 Chung CT. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, 2172-2175에 설명된 바와 같이 플라스미드 DNA를 사용하여 형질 전환하였다. 바실러스 섭티리스는 변경된 Paris method (Harwood CR. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd., England)에 따른 플라스미드 DNA를 사용하여 형질 전환하였다.

베타 갈락토시다아제 활성 측정

Z 버퍼 0.9 ml에 검사할 세포 0.1 ml를 넣고 섭씨 37도에서 30분간 톨루엔 10μl를 사용하여 처리하였다. Miller 방법 (Miller J. H., 1972, experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, NY)에 따라 섭씨 22도에서 o-니트로페닐-베타-갈락토피라노사이드 (o-nitrophenyl-β-galactopyranoside)를 사용하여 베타 갈락토시다아제 (β-galactosidase) 활성을 측정하였다.

사용된 올리고뉴클레오티드

올리고 뉴클레오티드	서열	목적
s4693	5'-AAA AAA ACG CGT GTT TAA ACT GAA TTT CTG CTG AAT ATA CA-3'	바실러스 섭티리스로부터의 manR을 PCR 증폭
s4694	5'-AAA AAA TCT AGA AAG TGT GAA TAA TAA GAT CTT G-3'	바실러스 섭티리스로부터의 manR을 PCR 증폭
s4802	5'-AAA AAA ACT AGT GTT TAA ACA GGG AAA AAT GCC TTT ATT AC-3'	P_manP _Δ3의 증폭을 위한 포워드 프라이머
s4833	5'-AAA AAA GTT TAA ACC CCT GGC GAA TGG CGA T-3'	플라스미드 pDG1730으로부터의 spc을 증폭
s4835	5'-AAA AAA GAA TTC ATT AGA ATG AAT ATT TCC CAA AT-3'	플라스미드 pDG1730으로부터의 spc을 증폭
s4956	5'-AAT TGC GTC GAG ACC CCT GTG GGT CTC GTT TTT TGG ATC CGG CGC CCA CGT GGC TAG CC-3'	tufA 종결부 삽입
s4957	5'-TTA AGG CTA GCC ACG TGG GCG CCG GAT CCA AAA AAC GAG ACC CAC AGG GGT CTC GAC GC-3'	tufA 종결부 삽입
s5006	5'-Cy5-TAG CCT TTT TTA TAG TTG TTC AGC CAC TGT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5007	5'-Cy5-ATC CAC GCC ATA ATG CAT GCC GCC ATT AAT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5097	5'-Cy5-CACTGTACCCTATCTGCGAAA-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5098	5'-Cy5-ATTGAGATAATCCTCGATCACTT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5203	5'-GATATCCTGCACCATCGTC-3'	프로모터 연구를 위한 P_manP의 증폭을 위한 백워드 프라이머
s5208	5'-GGTACCATTTCTTGCTGAATA-3'	pSUN279.2로부터의 P_manP- 영역을 증폭
s5209	5'-CTTAAGCCTGTCAGTATCTACTTGAG-3'	pSUN279.2로부터의 P_manP- 영역을 증폭
s5262	5'-AAAAAAGCTAGCGTTTAAACAAAAAGCGATT TTAATGAGCTG-3'	P_manP _Δ4의 증폭을 위한 포워드 프라이머

실험 1: 만노오스 오페론의 프로모터영역을 포함하고 있는 DNA 단편의 분리 및 manR 프로모터 및 manP 프로모터의 전사 개시 부위 결정

바실러스 섭티리스 168 염색체 DNA를 DNeasy Blood & Tissue 키트인 Qiagen (Hilden, Germany)를 사용하여 분리하였다.

추정 manR 프로모터 및 manR과 manP사이의 유전자간 영역을 포함하는 완전한 manR를 포함하는 약 2.3 kb DNA 단편을 프라이머 s4693/s4694을 사용하여 PCR에 의해 얻어진 DNA로부터 증폭했다.

획득한 약 2.3 kb DNA 단편을 사용하여 manR 프로모터 및 manP 프로모터의 전사 개시부위의 결정하기 위한 프라이머 연장실험을 실시하였다.

프라이머 연장을 위한 mRNA의 분리를 위해 셔틀인자를 대장균 벡터 plC20HE (Altenbuchner et al., 1992, Methods Enzymol. 216, 457-466) 및 바실러스 섭티러스 벡터 pUB1 10 (MacKenzie et al., 1986, Plasmid 15, 93-103)으로부터 구성한다. 이 벡터는 리포터 유전자로서 lys 유전자를 포함하는데, 이는 스테필로코커스 시뮬란으로부터의 리소스타핀 유전자의 성숙한 형태를 코드화한다 (Staphylococcus simulans, Recsai et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1127-1131).

이러한 높은 복제율을 갖는 pUB110 유도체 내로 2.3 kb DNA 단편이 리소스타핀 유전자의 업스트림위치로 복제되었다. 이렇게 생성된 플라스미드를 pSUN178.4라 명명하고 바실러스 섭티리스 3NA로 도입하였다.

플라스미드 pSUN178.4를 포함하는 바실러스 섭티리스 3NA를 카나마이신을 포함하는 LB배지에서 성장시켰다. 급격한 성장단계에서 배양물을 0.2% 만노오스를 사용하여 유도하였다. 섭씨 37도에서 1시간 성장시킨 후, 유도 및 유도되지 않은 세포를 수확하였다. Qiagen-RNeasy Mini Kit를 사용하여 모든 RNA를 분리하였다.

5' 말단에 Cy5를 포함한 표지 프라이머 s5006, s5007, s5097 및 s5098을 사용하였다.

프라이머 s5006 및 s5007는 리소스타핀 유전자의 시작 코돈에 대해 각각 +21에서 +50, +76에서 +105까지 하이브리드화되었다. 프라이머 s5097 및 s5098는 manR의 시작 코돈에 대해 각각 +81에서 +101, +131에서 +153까지 하이브리드화되었다.

플라스미드 DNA pSUN178.4의 서열분석을 위해 동일한 프라이머를 사용하였는데, 이는 크기측정을 위한 표준체 (size standard)의 역할을 하였다. 역전사 및 DNA 서열분석을 위해 각각 AMV-Reverse 전사효소 및 Roche사의 T7-DNA 중합효소가 사용되었다. 역전사 및 서열분석으로 인해 생성된 생성물은 변성 폴리아크릴아미드 서열결정 겔 (GE healthcare)에서 분석되었다. 그 밖에 사용된 모든 시약은 Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing 키트에서 제공하였다.

manP 프로모터의 전사 개시부위는 프라이머 s5006를 사용함으로써 결정된다. 동일한 프라이머를 가진 플라스미드 pSUN 178.4의 DNA 서열결정은 비교를 위해 동일한 변성 겔에서 준비되어 수행된다. 도 1은 하이라이트로 표시된 A (아디닌 뉴클레오티드)에서 전사 개시부위를 갖는 manP프로모터 주위의 DNA서열을 도시한다. 추정된 -10 및 -35 구역은 이탤릭체로 표시되고, manR 유전자의 말단 및 lys 유전자의 개시부는 화살표로 표시되며, Bgl-II, XbaI, AflII 및 NdeI을 위한 제한부위는 밑줄로 표시되어 있다.

manR 프로모터의 전사 개시부위는 manR 유전자에 결합된 프라이머 s5098이 사용된 것을 제외하고 상기 설명된 바와 같이 manP 프로모터에 대해 수행된 RNA 분리 및 DNA 서열분석을 수행함으로써 결정되었다.

도 2와 3에서는 manR 프로모터 영역의 DNA 서열이 도시되어있는데, G (구아닌 뉴클레오티드)에서의 전사 개시부위는 하이라이트로 표시되고, 추정된 -10 및 -35 구역은 이탤릭체로, lys 유전자 및 manR 유전자의 개시부는 각각 화살표로 표시된다. 제한부위와 추정 cre서열은 밑줄로 표시되어 있다.

manR 프로모터 및 특히 manP 프로모터로부터의 전사는 세포가 프라이머 연장 실험에서 보여지는 바와 같이 훨씬 더 강력한 신호에 의해 만노오스에 의해 유도될 때 급격히 증가했다.

사용된 프라이머는 상기 표 1에 도시되어 있다.

실험 2

실험 1의 프라이머 연장 실험에 의해 manP 프로모터의 전사 개시부위는 manR과 manP 시작부위에 있는 세포간 영역의 3' 말단 근처로 이동되었다. manP 포로모터 영역을 보다 정밀하게 판단하기 위해, 2.3 kb DNA 단편의 길이를 PCR 증폭에 의해 단계적으로 줄이고, 서로 다른 길이로 된 획득한 서열 단편을 동일한 기본 발현벡터에 다시 복제하여 발현을 조사하였다.

a) 기본 발현벡터 구성

리포터 유전자로서 프로모터가 없는 lacZ를 포함하는 발현벡터를 구성하였다. 발현벡터는 바실러스 섭티리스 및 대장균에서 모두 복제가능하고 pSUN272.1라 명명된 셔틀벡터로 설계된다.

리포터 유전자 lacZ를 pLA2로부터의 NdeI 및 XmaI를 사용하여 절단하고 (Haldimann A. et al, 2001, J. Bacteriol. 183, 6384-6393) XmaI 부위에 바실러스 섭티리스 tufA 전사 종결부위를 포함하는 람노오스 유도 발현벡터 pWA21의 유도체인 pJOE5531.1 에 연결한다 (Wegerer et al., 2008, BMC. Biotechnol. 8, 2). 이 플라스미드에 올리고뉴클레오티드s4956/4957 한 쌍을 lacZ의 업스트림 위치에 동일한 tufA 전사 종결부위를 첨가하기 위해 AflII/MunI 제한부위 사이에 삽입한다. 따라서 종결부위에 의해 플라스미드 프로모터에서 lacZ로 독파하는 것뿐만 아니라 lacZ로부터 측면 플라스미드 서열 내로 독파하는 것을 방지할 수 있다. 대장균 및 바실러스 섭티리스 모두를 위한 스펙티노마이신에 내성이 있는 유전자 spc는 올리고뉴클레오티드 s4833/4835를 사용하여 플라스미드 pDG1730로부터 증폭되어 (Geurout-Fleury et al., 1996, Gene 180, 57-61) 상기에서 획득한 플라스미드에 삽입되었다. 또한 대장균 벡터 부분은 BspHI/HindIII 단편을 삭제함으로써 길이를 줄였다. 그 결과, 바실러스 섭티리스 pMTLBS72의 복제 영역을 포함하는 EcoRI/SphI 단편 (Lagodich et al., 2005, Mol. Biol. (Mosk) 39, 345-348)이 상기 플라스미드로 연결되었다.

실험 1에서 얻은 2.3 kb DNA 단편을 AflII와 NheI를 이용하여 소화시키고 연결하여 lacZ 앞에 pSUN272.1에 삽입하여 도 4에 도시한 바와 같은 플라스미드 지도를 갖는 발현벡터 pSUN279.2를 얻었다.

사용된 프라이머는 상기 도1에 도시되어 있다.

b) 벡터 pSUN279 .2의 발현효과 결정

상기 a)에서 얻은 플라스미드 pSUN279.2와 pSUN272.1를 바실러스 섭티리스 3NA에 삽입하였다. 후자는 백그라운드 대조군으로 사용되었다. 각각의 플라스미드를 포함하고 있는 바실러스 섭티리스 3NA 균주를 스펙티노마이신를 포함한 LB 배지에서 성장시킨 후, 급격한 성장단계에서 0.2% 만노오스 또는 0.2% 만노오스 및 0.2% 글루코오스를 유도 배양물에 첨가하거나 유도 배양물에 설탕을 첨가하지 않는다 (비유도 대조군). 한 시간 동안 유도한 후 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 밀러 분석(Miller's assay)을 통해 판단한다. 결과는 도 5와 7에 도시되어 있다.

pSUN279.2를 포함하는 바실러스 섭티리스의 비유도 배양물은 이미 매우 높은 기저수준의 베타 갈락토시다아제 활성을 보였다. 만노오스가 존재하는 경우, 베타 갈락토시다아제 활성은 4배 더 증가하게 된 반면, 만노오스 및 글루코스가 함께 존재하는 경우, 활성은 감소하였지만 여전히 기저수준을 훨씬 넘었다. 이러한 결과는 pSUN279.2에서 보여지는 프로모터의 활성이 manR과 manP 사이의 영역, manR이나 둘 모두의 업스트림 영역으로부터 비롯된 것일 수 있다는 것을 분명히 나타낸다.

따라서, 도 4에 도시된 바와 같이 2.3 kb DNA 단편 pSUN279.2를 SfoI과 NruI사이에서 절단함으로써 manR의 업스트림 영역 뿐 아니라 manR의 대부분의 영역이 모두 pSUN279.2에서 삭제되어 플라스미드 pSUN284.1가 생성된다.

이렇게 생성된 pSUN284.1의 핵산서열은 도 6에 도시되어 있다.

바실러스 섭티리스 3NA는 이러한 플라스미드 pSUN284.1을 사용하여 형질 전환되고, 상기 발현효율은 상기에서 정리한 바와 같이 결정된다. 이 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 바실러스 섭티리스 3NA 내에서 manR이 제거된 벡터 pSUN284.1는 바실러스 섭티리스 3NA 내의 pSUN279.2와 비교하면 단지 기저 수준의 1/2정도의 베타 갈락토시다아제 활성을 나타내며, 만노오스 유도에 의해서는 매우 강한 증가를, 글루코스가 존재하는 경우에는 다시 강한 감소를 보인다. 이러한 결과는 manP 프로모터가 manR과 manP 사이에 위치한다는 것을 증명하며 manR의 염색체 복제가 로카피 플라스미드에서 모든 manP 프로모터 복제를 조절하기에 충분하다는 것을 보여준다.

c) manP 프로모터 영역의 로컬라이제이션

짧아진 DNA 단편 pSUN284.1에 더하여 manP 프로모터 영역을 로컬라이징하기 위해, 제한부위에서 manP 프로모터의 전사 개시부위 업스트림 방향으로 서로 다른 위치에서 절단하고 도 6에 도시된 제한효소에 의해 2.3 kb DNA 단편으로부터 더 짧은 서열 단편을 준비하였다.

manP의 전사 개시부위 업스트림 방향으로 bp -81과 bp -80까지 삭제하면 서열번호 1을 포함하는 제 2 결실서열이 생성된다.

또한 manP의 전사 개시부위 업스트림 방향으로 bp -41과 bp -40까지 삭제를 수행한다 (제 3 결실서열).

제 2결실서열 pSUN290과 제 3결실서열 pSUN297.5를 포함하는 플라스미드를 상기의 2 b)의 플라스미드 pSUN284.1와 유사한 방식으로 프라이머 s4802/s5203과 s5262/s5203으로 각각 증폭된 PCR 생성물을 제한효소 EcoRV 및 NheI을 통해 pSUN272.1로 삽입하여 구성했다.

상기 플라스미드를 바실러스 섭티리스 3NA에 삽입하여 상기 b)에서 설명한 바와 같이 배양한다. 1시간 동안 유도한 후, 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 b)에서 설명한 바와 같이 조사한다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.

도 7에 도시된 바와 같이, pSUN290 및 pSUN284.1를 포함한 숙주 모두 만노오스에 의한 lacZ 유도에 있어서 두드러진 차이를 보이지 않았다. 그러나 제 3결실서열을 갖는 pSUN297.5를 포함하는 바실러스 섭티리스 3NA에서는 만노오스에 의한 유도가 전적으로 폐기되고 기저 발현수준이 거의 0이었다. 이러한 결과로부터 manP 만노오스 프로모터 영역의 ManR 결합부위는 manP의 전사개시부위에 대해 bp-80과 -35사이에 위치한다.

실험 3: manR 프로모터의 결정

a) cre 서열확인

대부분의 CCR은 이화대사억제단백질 A (CcpA)를 통해 이루어지기 때문에, 전체 만노오스 오페론에서 각각의 결합부위 (cre 서열)를 검색하는 것이 클론 매니저 프로그램에서 (Clone Manager program) DNA 정렬 기능을 사용하여 수행되었다. 정렬을 위해 cre 공통배열 5'-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3'가 사용되었다.

도 2와 3에 도시된 바와 같이, manR의 프로모터 영역에서만 하나의 추정 cre 서열이 발견되었고, 이는 -10 구역의 다운스트림에 위치한다.

본 발명의 서열번호 3은 bp -122에서 시작되어 lacZ의 개시코돈에 이르는 영역을 포함하고, 서열번호 4는 bp -122에서 bp +7(를 포함하는)영역을 포함하며, 서열번호 5는 도 3에 도시된 서열의 bp -122에서 bp -1(를 포함하는) 영역을 포함한다.

b) manR 프로모터의 발현효율 평가

manR 프로모터의 발현효율을 평가하기 위해, pSUN284.1과 같은 발현벡터를 상기에서 설명한 바와 같이 구성하여 pSUN291로 명명했다. 이에 추정 manR 프로모터 및 manR의 업스트림의 약 600개의 염기쌍(bp)을 포함하는 DNA 단편을 프라이머 s5208/s5209로 증폭하고, 플라스미드 DNA pSUN279.2를 주형으로 선형화하고, KpnI와 AflIII를 사용하여 소화시키고 연결함으로써 플라스미드 pSUN272.1 내의 lacZ 앞에 삽입되었다.

DNA 서열은 도 3에 도시되어 있다.

플라스미드 pSUN291을 바실러스 섭티리스 3NA에 삽입하고, 베타 갈락토시다아제 활성을 상기에서 설명한 실험 2 b)와 같이 측정하였다.

결과는 도 5에 도시하였다. 여기서, 기저 발현은 이미 상대적으로 높았고 0.2% 만노오스를 첨가함으로써 약 3배 정도 더 증가하였다.

글루코오스를 첨가하면 베타 갈락토시다아제 활성이 거의 기저 발현수준으로 억제되었다.

이와 같은 결과는 manR 프로모터가 단지 약한 구성 프로모터이기 때문이 아니라 만노오스 및 CCR 조절에 영향을 받는다는 것을 의미한다.

c) manR 프로모터 영역의 로컬라이제이션

실험 2c)와 같이 manR DNA 서열의 프로모터 영역을 보다 로컬라이제이션하기 위해, 제한 부위에서 manR 프로모터의 전사개시부위 업스트림 방향으로 서로 다른 위치에서 절단하고 도 3에 도시된 제한효소에 의해 pSUN291에 포함된 것과 같이 DNA 서열로부터 서로 다른 길이의 DNA 단편을 준비하였다.

제 1결실서열은 전사개시부위 G의 업스트림 방향으로 도 3의 서열을 bp -100과 bp -99까지 절단하여 확보했고, 제 2결실서열은 전사개시부위 G의 업스트림 방향으로 도 3의 서열을 bp -83과 bp -82까지 절단하여 확보했다.

실험 2c)와 유사하게, 확보한 제 1, 2 결실 서열을 pSUN272.1에 도입하고, 이에 의해 생성되는 플라스미드를 각각 pSUN384.1과 pSUN385.2이라고 명명했다.

각각의 플라스미드를 바실러스 섭티리스 3NA에 삽입하여 실험 2b와 같이 배양했다. 1시간 동안 유도한 후, 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 실험 2b에서 설명한 바와 같이 판단한다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. pSUN291과 비교하면 pSUN384.1의 만노오스에 의한 lacZ 유도와 관련하여 두드러진 차이가 나타나지 않았다. 그러나 제 2결실서열을 포함하는 pSUN385.2를 포함하는 바실러스 섭티리스 3NA에서는 만노오스에 의한 유도가 전적으로 폐기되고 기저 발현수준이 거의 0이었다. 이러한 결과로부터 manR 프로모터 영역의 ManR 결합부위는 manR의 전사개시부위에 대해 bp-99과 bp-35사이에 위치한다.

II ) 높은 세포농도로 발효 시 만노오스 오페론 프로모터 영역의 사용

실험 4: 형질전환

본 발명의 프로모터 영역을 지니고 있는 모형 숙주의 생장 및 발현 능력에 대해 검사했다. 도 6에 도시되고 실험 2c에서 사용된 바와 같은 플라스미드 pSUN284.1에 도입된 바와 같은 manP 프로모터 영역에 따른 핵산서열을 사용하여 플라스미드 pMW168.1을 아래에서 설명된 바와 같이 구성하여 형질전환에 의해 숙주인 바실러스 섭티리스 3NA로 도입한다.

a) 플라스미드 pMW168 .1의 구성

lacZ 대신에 eGFP를 리포터 유전자로 사용한 것을 제외하고는 실험 2a)에서 설명한 바와 같이 대장균과 바실러스 섭티리스에서 모두 복제 가능한 셔틀벡터를 설계하였다. 또한 manP 전사개시영역을 gsiB 유전자의 전사개시영역으로 대체했다(Stress protein; Jurgen et al., supra).

또한 eGFP의 개시코돈 및 개시코돈 다음에 오는 6개의 코돈을 대체하였다.

획득된 프로모터의 개략적인 구조 및 전사개시영역을 도 17에 도시하였다.

유전자 (화살표) 및 관련 제한부위를 포함하는 영역 (구역)의 배열을 도시한다.

일반적으로 플라스미드 pMW168.1을 도 18에 따른 흐름도에 도시된 바와 같이 획득하였다.

흐름도에 도시된 바와 같이 사용된 벡터 DNA, 삽입 DNA 및 상보적인 뉴클레오티드 명칭은 구역에 표시된 바와 같고, PCR 생성물에 대해 프라이머와 주형 DNA는 괄호 안에 표시된 바와 같고, 사용된 제한효소는 각 부위에 표시되어 있다.

복제 단계는 대장균 JM109를 사용하여 수행되었다.

사용된 플라스미드는 암피실린 내성이 있는 (amp-resistance) PCR 생성물을 위한 양성 선택 및 복제벡터인 pUC18 (Yanosch-Perron et al., supra), 암피실린 내성이 있는 대장균을 위한 발현 및 복제벡터인 pWA21 (Wegerer et al., 2008, BMC Biotechnol. 8,2), manP 프로모터 영역을 포함하고 암피실린 및 카나마이신 내성이 있는 (amp and kan resistance) pUB 110 유도체로 대장균 및 바실러스 섭티리스를 위한 셔틀 벡터인 pSUN202.4, 터서열 (ter-sequence)사이의 통합부위를 포함하고 스펙티노마이신 및 암피실린 내성이 있는 (spc and amp resistance) pUC18유도체인 pSUN266.1이다.

사용된 프라이머 서열은 다음과 같다.

시작코돈 및 시작코돈 다음에 오는 코돈을 포함하여 전사개시영역을 상보적인 올리고뉴틀레오티드를 사용 및 단일 제한부위 BgIII, AflII 및 BamHI를 통해 대체하였다. 상기 벡터의 구성은 pWA21 벡터의 T7유전자 10의 전사개시영역을 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 s5019 및 s5020를 통해 바실러스 섭티리스로부터의 tufA의 번역개시영역으로 대체함으로써 개시되었다. 또한 추가적인 복제 단계에서는 이러한 전사개시영역이 gsiB의 전사개시영역으로 대체되었다. 최종 플라스미드 pMW168.1은 pUB110로부터의 ori⁺를 포함하는 rep 유전자를 포함한다. pMW168.1의 플라스미드 지도는 도 9에 도시되어 있다.

b) 구조 안정성 및 분리 결정

바실러스 섭티리스 3NA를 벡터 pMW168.1를 사용하여 형질 전환하고 벡터의 구조 안정성 및 세포분할 (분리)시 안정적 증식에 대해 판단하였다.

pMW168.1으로 형질 전환된 바실러스 섭티리스 3NA를 LB_Spc 배지에서 전배양하고 도태압(selection pressure)없이 LB₀ 배지로 옮겼다.

섭씨 37에서 배양하였다. 급격한 성장 단계 마지막에 LB₀ 배지에 각 배양물을 접종하였다. 이러한 과정을 반복하여 100세대를 얻은 후 Harwood et al., 1990, Molecular Biolegical Methods for Bacillus, John Wiley & Sons Ltd.에 기재된 변경된 방법에 따라 신선한 배지로 옮기는 동안 측정된 OD 값에 기반하여 안정성을 계산하였다.

결과를 도 10에 도시한다.

약 15세대 이후에 99.9%가 넘는 세포가 벡터를 포함하고 있었으며 20세대 이후에도 약 90%의 세포가 벡터를 포함하고 있었다. 25세대 이후가 되어서야 세포가 점점 벡터를 상실하였다.

플라스미드의 구조 안정성을 판단하기 위해 15세대 후 20개의 복제물로부터 플라스미드를 분리했다. 이렇게 분리한 각 플라스미드 약 0.5μg을 아가로스 겔 전기영동에 의해 대조군인 대장균에서 분리한 pMW168.1과 비교하였다. 플라스미드 및 대조군의 상태를 관찰한 결과 특별한 차이점이 나타나지 않았고, 이는 구조상의 변화가 발생하지 않았다는 것을 의미한다.

이러한 결과는 플라스미드 pMW168.1이 구조 안정성이 높을 뿐 아니라 발효과정에서 바람직한 안정적인 분리특성을 갖는다는 것을 보여준다.

실험 5: 발효

서로 다른 유도 체계를 갖는 리포터 유전자 eGFP를 포함하는 플라스미드 pMW168.1을 사용하여 형질 전환된 바실러스 섭티리스 3NA를 이용하여 여섯 개의 발효과정을 실시하였고, eGFP유전자의 형광신호를 관찰함으로써 온라인으로 모니터링했다.

발효배지로서 Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103에서 언급되고 하기와 같이 설명된 높은 세포 농도로 대장균을 발효하기 위한 공지의 배지를 사용했다.

재료 및 방법

본 명세서에서 특별히 언급되지 않는 한, 일반적으로 사용되며 발효실험에서도 사용되는 표준 분자 기술이 사용된다.

흡광도 ( Optical Density )

흡광도를 측정하기 위해, Amersham Bioscience 사의 분광계 Ultrospec 1100pro를 사용하였고, 제조업체의 규약에 따라 600nm에서 측정하였다.

건조 바이오매스 농도 결정

건조 바이오매스 농도 (c_x)를 측정하기 위해, 수분계인 Ohaus사의 MB835 Halogen을 사용하였다.

형광발광 분광측정

아래와 같은 측정변수를 포함하는 판독 소프트웨어 X Fluor 4 (버전 V4.11)를 사용한 TECAN사의 다기능 리더 GENios에 의해 eGFP유전자의 발현 및 형광발광을 각각 분석하였다.

발효기에서의 온라인 형광발광측정

발효가 진행되는 동안 eGFP의 발현을 형광탐침(Micropack HPX-2000, High Power Xenon Lightsource of Ocean Optics, Inc.; S2000 fiber optic spectrometer)을 사용하여 온라인상에서 관찰했다.

측정변수는 다음과 같은 485nm 여기필터, 535nm 방출필터, 0.6필터를 포함한다. 측정값을 기록하고 저장하기 위해 Ocean Optics SpectraSuite Software를 사용하였다.

형광발광은 상대형광단위 (RFU)로 표시된다. 4000개의 RFU를 획득하기 직전에 통합시간을 50ms에서 25ms로 변경하였고, 그 후 10ms로 변경하였다. 이러한 경우에 측정값은 인자 2와 5에 의해 각각 배가되었다.

전배양물 ( pre - cultures ) 배양

단일 콜로니를 LB 평판한천에 놓고 0.02%(w/v) 카사미노산 (Casamio acid: CA) 및 항생물질을 포함하는 5ml SMM (Spizizen's minimal medium)에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이 배양물 1ml를 0.02 %(w/v) CA 및 항생물질을 포함하는 20ml SMM에 넣고 250ml 삼각플라스크에서 섭씨 37도로 5-6시간 배양했다 (전배양 1).

전배양물 1의 10ml를 글루코오스 5g/l를 포함하는 200ml 배치 배지에 첨가하고 1L 삼각플라스크에서 섭씨 37도로 6시간까지 배양하였다 (전배양2).

발효기의 접종을 위해 1.2에서 2.2 상이의 OD600 값을 갖는 전배양물 2를 사용하였다.

발효

일반적으로 발효는 Wilms et al., 2001 , Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103에 명시된 원리에 따라 수행되었다.

탄소원인 글루코오스가 모두 소비되자마자 회분배양모드가 유가배양모드로 전환되었다.

유가배양단계에서 양분용액을 급격하게 첨가함으로써 μ=0.10 h^-1인 일정한 생장률이 얻어질 수 있으며 동시에 글루코오스에 의한 이화대사억제 방지되는데, 이는 세포가 글루코오스를 즉시 소비하기 때문이다.

단백질 분석

수확한 세포의 조단백질 추출물을 다음과 같은 조성으로 된 3% 적층겔과 12% 분리겔로 이루어진 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다.

Biometra사의 트윈 미니 겔 챔버 (Twin Mini gel chamber)를 사용하였다.

변성을 수행하기 위해 단백질 혼합물에서 12 μl 조단백질 추출물을 5배의 SDS 애플리케이션 버퍼 3 μl와 혼합하여 Eppendorf사의 Thermomixer 5438에서 섭씨 95도로 5분 동안 배양한다. 상온으로 냉각한 후 원심분리로 시편을 분리하여 모두 겔에 넣는다.

적층겔에서 분리되는 동안, 전류를 10 mA 흘려주고 브롬페놀의 경계가 적층겔에 닿은 후 전류를 20 mA로 올려주었다. 1배 SDS 러닝버퍼 및 Roth사의 크기기준 ROTI＠-Mark가 분리단계에서 사용되었다. 전기영동은 브롬페놀경계가 겔에서 완전히 빠져나오면 종결하였다. 뚜렷한 단백질 띠를 감지하기 위해, 상기 겔을 쿠마시 착색용액을 사용하여 실온에서 30분간 배양한 후 이어 탈색용액을 이용하여 실온에서 30분간 처리하였다. 상기 겔에서 남아 있는 푸르스름한 백그라운드를 제거하기 위해, 겔을 7.5% 아세트산에 여러 시간 동안 배양하였다.

완충용액, 착색 및 탈색용액의 조성은 다음과 같다.

TRIS:트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 (Tris(hydroxymethyl)aminomethane)

SDS: 도데실황산나트륨 (Sodium dodecylsulfate)

APS: 과황산암모늄 (Ammonium persulfate)

TEMED: N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)

EDTA: 에틸렌디아민 사초산 (Ethylenediaminetetraacetic acid)

유전자 발현 도입

유전자 발현을 유도하기 위해, 유도용액을 첨가하는 다양한 방법(유도방법)이 검토되었다.

1. 주어진 시점에서 단일 부분으로 첨가 (충격 유도법)

2. 시간 간격 동안 추가 유도법과 조합하여 사용되는 충격 유도법

- 추가적인 첨가는 일정한 속도로 단계적으로 양을 증가하면서 수행하거나

- 추가적인 첨가는 급격히 증가하는 속도로 수행.

3. 주어진 세포 농도에 도달할 때 유도용액을 첨가하기 시작

2몰 수산화나트륨 및 1몰 염산용액을 사용하여 pH를 각각 조절하였다. 평판한천의 경우, BD사의 Euroagar 15 g/l를 추가적으로 첨가하였다. 모든 배지를 섭씨 121도에서 약 30분간 오토클레이브하였다.

발효단계 1: 충격유도법

발효단계 1은 30L 반응기 (D598 and D596 of Bioengineering)에서 실시된다. 배치의 부피는 8L이다. OD₆₀₀값에 따라 200-400 ml의 전배양물 2를 초기 OD₆₀₀값을 0.1로 조절하기 위해 배양했다.

회분배양단계에서는 하룻밤 동안에는 온도를 섭씨 30로 하였고, 12시간 후 섭씨 37도까지 상승시켰다. 전체 발효단계 동안 24% (v/v) 수산화암모늄을 첨가하여 pH를 약 7.0으로 조절하였다. 포기율 (aeration rate)은 30 l/min까지로 조절 가능하였다. 회분배양단계 초기에는 포기율이 10 l/m였다.

양분배지 I 및 Ⅱ의 조성은 아래 표 3에 도시한다.

양분배지 I 및 Ⅱ의 조성

양분배지 Ⅰ		양분배지 Ⅱ
성분	농도	성분	농도
glucose * H₂O	654.76 g/l	(NH₄)₂HPO₄	396.00 g/l
MgSO₄ * 7 H₂O	25.50 g/l	pH 7.0로 조절
*TES	120.00 ml/l	총 부피 1.0 l
탈이온수	ad 4.2 l	탈이온수	ad 1.0 l

*TES: 미량원소 용액

배지 I과 II를 총 비율에 비례하여, 즉, 4.2:1.0 (총 영양분(F) 중 80.8% 배지 I 및 19.2% 배지 II에 상응하도록) 비율로 첨가했다.

유가배양 단계의 초기에 유도하기 위해 0.2% (w/v) D-만노오스용액 일부를 첨가하였다.

건조 바이오매스 농도 및 관찰된 형광신호는 도 11a와 11b에 각각 도시한다.

도면에서 건조 바이오매스 농도 (C_x)는 배양기간 동안 대수적으로 표현된다. 회분배양 및 유가배양 단계는 수직선에 의해 서로 구분된다.

535 nm 방출 파장에서 관찰된 형광신호는 배양기간 동안 나타난다. 화살표는 유도시점을 나타낸다.

도 11a에서 최대 건조 바이오매스(DM) 농도는 82.75 g DM/L로 반응부피 11.7L에 대해 약 970g DM에 대응된다.

유도인자의 총량 71.5g에서 D-만노오스는 처음 첨가시 16g이 사용된다.

전체 유가배양단계 동안 특수생장율 (μ)은 0.10h^- ¹였다.

도 11b에 도시된 바와 같이, 유가배양 단계에서 초기 5시간 내에 D-만노오스를 최대 약 2,200 RFU까지 1차 첨가한 후, 형광신호가 매우 증가하였다. 그 후, 신호는 계속해서 감소했다. 발현율에서 이러한 감소는 유도인자 및/또는 증가하는 세포 질량에 의한 가려막기 효과로 인한 것으로 추정된다. 37시간 후에 0.5% (w/v) 만노오스 용액을 더 첨가함으로써 형광신호는 2,100 RFU 값까지 새롭게 증가되었다.

발효단계 2: 일정한 속도의 조합유도

유도인자를 첨가하는 방법을 변경한 것을 제외하고는 단계 1과 동일한 과정이 반복되었다. 단계 1과 마찬가지로, 0.2% (w/v) D-만노오스 용액 한 부분 (single portion)을 유가배양 단계 개시시점에서 첨가하였다. 유도인자의 제 2 부분은 단계 1의 형광신호 곡선의 전환점에 RFU에 도달했을 때 첨가되기 시작하였고, 이때 RFU는 1,500였다.

제 2첨가단계에서, 평균 속도 0.39 g/min로 양을 단계적으로 증가시키면서 제 2부분이 모두 첨가될 때까지 일정한 비율로 20% (w/v) 만노오스 용액을 첨가하였다.

결과는 도 12a 및 12b에 도시하였는데, 도면에서는 건조 바이오매스 농도 및 형광신호 곡선을 도시하고 있으며, 디노테이션은 도 11a 및 11b에 도시되어 있는 것과 동일하다. 도 12b에서는 제 1부분의 첨가 시점과 제 2부분의 첨가 시작 및 종료 시점을 화살표로 표시하였다.

도 12a에 도시된 결과에 따르면, 건조 바이오매스의 최대 농도는 67.6 gDM/L로 반응부피 11.9L에 대해 약 804 g DM에 해당되는 것이다. 총 (제 1, 2 첨가에서) 70 g의 D-만노오스가 첨가되었다.

바이오매스의 수율은 단계 1과 비교해서 17%만큼 줄어들었다. 이는 유가배양 단계 중에 μ=0.09h^-1이라는 낮은 특수 생장율과 관계가 있는데, 이에 반해 회분배양 단계에서는 특수 생장율이 0.43h^- ¹였다.

도 12b에 도시된 결과에 따르면, 형광신호의 최대값은 25시간 후 약 4,900 RFU에 도달하였고, 계속해서 감소하여 약 2,500 RFU이 되었다.

단계 1과 비교하면 단계 2에서는 바이오매스의 농도가 약간 감소함에 따라 발현율이 120%만큼 향상될 수 있다.

발효단계 3 및 4: 급격한 속도의 조합유도

단계 3과 4에서는 3.7L 소형 실험용 발효기 (Kleinlaborfermenter of Bioengineering Company)를 사용하였다. 배치부피 (배치 배지 및 접종물의 부피)는 총 1.5L였다. 초기 OD₆₀₀값을 약 0.1로 조절하기 위해 OD₆₀₀ 값에 따라 전배양물 2를 100-200ml을 접종하였다. 회분배양 및 유가배양 단계 모두 온도는 섭씨 37도로 하였다. 발효하는 동안 pH는 24% (v/v) 암모니아수를 사용하여 7.0으로 조절하였다. 발효하는 동안 포기율은 2 l/min로 일정하게 하였다. 교반기의 회전속도에 의해 산소투입량을 조절하였다. 발효압력은 초기에 1.3bar로 하였고, 그 후 1.5bar로 증가시켜 요구에 따라 산소투입량을 증가시켰다. 탄소원인 글루코오스를 완전히 소비한 후, 배치 동작을 유가배양 동작으로 전환하였다.

단계 2와는 달리 단계 3과 4에서는 급격히 증가하는 속도로 유도용액을 공급하였다. 또한 글루코오스 포함 배지 I을 유도인자 포함 배지 II와 함께 제공하였다. 양분배지 I 및 II의 조성은 아래의 표 4에 도시했다.

양분배지 I 및 Ⅱ의 조성

양분배지 Ⅰ		양분배지 Ⅱ
성분	농도	성분	농도
D-glucose	200 g/l	D-mannose	200 g/l
TES	40 ml/l	TES	40 ml/l
MgSO₄	3.85 g/l	MgSO₄	3.85 g/l
(NH₄) HPO₄	63.36 g/l	(NH₄)HPO	63.36 g/l
탈이온수	ad 1.0 l	탈이온수	ad 0.25 l (run3) ad 1 l (run4)

양분배지 I 및 II의 모든 성분은 각각 오토클레이브하였다.

pH값은 성분의 용해도 때문에 두 배지에서 모두 85% (v/v) 인산 (H₃PO₄)를 사용하여 3.3으로 조절하였다.

시간 t에서의 총 공급량 (F)는 다음과 같은 식에 따라 계산하였다.

여기서, m = 유지계수 · (0.04 g g^-1 H^-1), Y_x _/s= 기질과 관련된 바이오매스의 비산출량 계수 (글루코오스의 경우 0.5), C_x0 = 유가배양 단계 초기의 바이오매스 농도, V₀ = 유가배양 단계 초기의 반응기 부피 (=배치 부피), C_s0 = 영양액 내의 글루코오스 농도이다.

계산을 위해, D-만노오스는 비교 산출량계수 Y_x _/s글루코오스를 가진 바실러스 섭티리스에 의해 소비된 것을 가정한다.

KLF에서는 배지 I 및 II가 따로 공급될 수 있으며, 그 비율은 달라질 수 있다.

a) 발효단계 3

바이오매스 농도 및 관찰된 형광신호가 도 13a와 13b에 도시되어 있으며, 도면의 디노테이션은 단계 1에서와 동일하다.

유가배양 단계 초기에 0.2% (w/v) 만노오스 용액 (만노오스의 양은 총 16g)의 일부를 첨가하여 배지 I 및 II를 50:50 비율로 급격한 속도로 공급하기 시작하였다 (구간 I). 기울기가 감소하면, 배지 II를 포함하는 만노오스 부분을 60%로 늘려서 글루코오스에 의한 생장률을 유지하기 위해 총 양분 (F, 배지 I과 II)의 양을 125%로 증가시켰다 (구간 II). 2시간 후, 기울기가 감소하는 것이 관찰되었고, 배지 II 부분을 66.6%로 증가시켜 총 양분 (F)의 양을 150%로 증가시켰다 (구간 III). 배지 II를 모두 소비한 후, 양분배지 I 로 총 100% 공급하면서 발효를 계속하였다 (도 10에 도시되지 않음).

단계 3의 진행상황 및 결과는 하기 표 5에 요약되어 있다.

구간 [h]	배지 Ⅰ :Ⅱ [%]	F[%]	μ[h ^-1 ]	RFU	건조 바이오매스 [ gDM /l]
0-12			0.52	-
Ⅰ 12-17	50:50	100	0.09	7000
Ⅱ 17-19	50:75	125	0.08	9000
Ⅲ 19-22	50:100	150	0.09	11000	22

총 50g의 만노오스가 첨가되었다.

12시간, 20시간, 24시간이 되었을 때, 총 10 OD₆₀₀ 세포의 가용성 단백분획에 대한 SDS 겔에서의 발현을 분석하기 위해 샘플을 채취했다.

SDS PAGE 결과는 도 19에 도시한다.

왼쪽으로부터 (M)표준 크기 ( ROTI○R-Mark), (1) 12시간 후 유도되지 않음, (2) 20시간 후 8시간 동안 유도되었음, (3) 24시간 후 12시간 동안 유도되었음을 나타낸다. 20시간 및 24시간 후에는 약 27 kDa에서 분명한 선이 나타나며, 이는 eGFP가 발현되었음을 나타낸다 (화살표).

b) 발효단계 4

배지 II (만노오스)의 공급부피를 총 1.0L로 늘린 것을 제외하고는 단계 3과 동일한 과정을 수행하였다.

건조 바이오매스 농도 및 형광 신호는 도 14a와 12b에 도시하였으며, 디노테이션은 단계 1과 동일하였다.

과정 및 결과는 하기 표 6에 요약되어 있다.

구간 [h]	배지 Ⅰ :Ⅱ [%]	F[%]	μ[h ^-1 ]	RFU	건조 바이오매스 [ gDM /l]
0-15			0.40
Ⅰ 15-22	50:50	100		3500
Ⅱ 22-38	50:75	120		10000- 7800
Ⅲ 38-39	50:100	150		8900	40.4

총 200g의 만노오스가 첨가되었다.

관찰된 부족분의 질소를 보상하기 위해 약 15시간 발효 후에 인산암모늄 ((NH₄)₂HPO₄)을 일정비율로 추가적으로 공급하였다.

구간 II에서 최대 RFU 10,000에 도달하였고, 구간 II 중에 7,800 RFU로 감소하였다.

a) 발효단계 5 및 6: 충격유도법 사용하지 않음

두 발효단계 모두 30L 발효기에서 실시되었다.

두 단계 모두에서, 글루코오스 공급속도를 급격하게 증가시키면서 세포농도가 높아질 때까지 세포를 성장시키고, 세포농도가 높아지면 이를 일정하게 공급되는 만노오스로 대체하였다.

사용된 양분배지 I, II, III를 하기 표 7에 도시한다.

양분배지 Ⅰ			양분배지 Ⅱ		양분배지 Ⅲ
성분	농도	성분		농도		성분	농도
D-glucose*H₂O	654.76 g/l	(NH₄)₂HPO₄		396.00g/l		D-mannose	400.00g/l
MgSO*7 H₂O	23.50 g/l					MgSO*7H₂O	23.50g/l
TES	120.00 ml/l					SEL	120.00ml/l
탈이온수	ad 4.2 l	탈이온수		ad 1.0 l 7.0		탈이온수	ad 1.0 l

발효단계 5

배지 I 및 II를 속도를 급격하게 증가시키면서 전체 부피비 4.2:1.0으로 첨가하였다. 세포농도가 높아지면, 배지 I과 II로 구성된 양분을 배지 I과 II의 최종 급격한 공급비의 부피에 상응하는 일정한 부피에서 배지 II와 III을 20:80 비율로 포함하는 양분으로 대체하였다.

형광신호는 도 15에 도시되었고, 디노테이션은 단계 1에서와 같다.

약 17시간의 발효기간 후 도 15의 형광신호가 최소 증가한 것은 배지 III가 단기적으로 누출되었기 때문으로 가정한다.

진행 상황 및 데이터는 아래 표 8에 요약되어 있다.

유가배양 단 게 [h]	배지[%] Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ	최대 RFU	특수생장률 [h ^-1 ]	건조 바이오매스 [g DM /l]	총 만노오스양 [g]
15-35	80.8:19.2 :-	-	0.1
35-39	-:20:80	2,800		80	150

b) 발효단계 6

세포 농도가 높아졌을 때 배지 II와 III로 이루어진 양분을 일정하게 첨가하기 전에 0.2 (w/v) 만노오스 용액 (총 만노오스 양 16g)의 충격 유도법을 사용하여 만노오스를 총 600g 첨가한 것을 제외하고는 단계 5와 동일한 과정으로 수행하였다.

형광신호는 도 16에 도시하였고, 디노테이션은 단계 1에서와 같다.

단계 6의 진행상황 및 데이터는 아래 표 9에 요약하였다.

유가배양 단게 [h]	배지[%] Ⅰ:Ⅱ:Ⅲ	최대 RFU	특수생장률 [h ^-1 ]	건조 바이오매스 [g DM /l]	총 만노오스양 [g]
20-40	80.8:19.2 :-	-			-
40	0.2 % (w/v) 만노오스 용액	-			16
42-53	- 80 : 20	14000		82	600

단계 1-6의 평가

최대 형광발광 시점에서 평가하기 위해, 건조 바이오매스 농도 (c_x), 반응기 부피 (V_R), 사용된 만노오스 양 및 유도개시로부터의 기간을 확인하여 아래 표 10에 요약했다.

발효단계	최대형광발광 x RFU	Cx gDMl ^-1	VR l	유도인자 gMan	발현기간 h

1	2200	16	8.2	16	5
2	4900	22	8.3	70	8
3	11000	22	1.6	50	10
4	10000	17	1.7	60	13
5	1700	80	12.0	150	5
6	14000	82	14.7	600	12

표 10에 도시된 과정 데이터를 기반으로 각 단계에서의 부피 및 시간 당 최대 형광발광 RFU에 대한 생산성을 계산하였다. 또한, 발현효율을 절대 생물체량 (gDM) 및 유도인자의 농도 (gman/L)에 대한 최대 형광발광값으로부터 계산한 상대 형광발광값으로 표현하였다.

이 결과를 표 11에 도시하였다.

발효단계	생산성 RFU l ^-1 h ^-1	상대 형광발광값 RFU ( gDM ) ^-1	상대 형광발광값 RFU ( man /l) ^-1

1	53.7	16.8	1127.5
2	73.8	26.8	581.0
3	687.5	312.5	352.0
4	452.5	346.0	283.3
5	28.3	1.8	36.0
6	79.4	11.6	343.0

이러한 결과에 따르면, 만노오스 프로모터를 지니는 플라스미드를 사용한 본 발명은 높은 세포 농도 발효과정에 적중하여 사용될 수 있고 유도인자 D-만노오스를 첨가함으로써 양성적으로 조절되는 발현에 사용될 수 있음이 분명해졌다.

또한, 유도방법을 선택함으로써 발효의 중심이 필요에 따라 각각 바이오매스, 발현생성물 및 유도인자 사용을 고려하여 생산량을 최대화함에 있어 변경될 수 있다.

용이한 다운스트림 프로세싱을 고려하면, 단계 3에 따른 조합된 충격 유도법 및 급격한 공급을 포함하는 유도인자 체계가 특히 유리하다.

여기서, 바이오매스에 대해 생산된 높은 발현생성물은 정제단계와 같은 처리를 더 효율적으로 가능하게 하여 이에 따라 시간과 비용을 절약할 수 있다.

<110> Lonza AG <120> Vector comprising mannose promoter and mannose promoter <130> PF2012-0001 <140> 10-2012-7006337 <141> 2012-03-09 <150> EP 09010283.1 <151> 2009-08-10 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 143 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac aagatcttat tattcacact ttctagaaat aattttctta 120 agaaggagat atacatatga cac 143 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 2 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac 80 <210> 3 <211> 195 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 ggtttcttat atagtatact tatactatca atttgctcaa gtagatactg acaggcttaa 180 gaaggagata tacat 195 <210> 4 <211> 128 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 4 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 ggtttctt 128 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 5 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt 60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac 120 g 121

Claims

폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열을 포함하는 전사단위에 작동 가능하게 연결되어 있는 바실러스 섭티리스 (Bacillus subtilis)의 만노오스 오페론의 만노오스 유도 프로모터를 포함하고,
상기 프로모터는 manP 프로모터 또는 manR 프로모터이고,
상기 manP는 운반체인 만노오스 특이 효소 성분을 암호화하는 유전자이며,
상기 manR은 만노오스 오페론의 활성체인 ManR을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 원핵 숙주세포에서 발현 가능한 벡터.
제 1항에 있어서,
상기 벡터는 조절 유전자 manR의 전체 서열 또는 부분 서열을 포함하고,
상기 유전자 manR의 전체 서열은 플라스미드 pSUN 279.2에 포함되는 것을 특징으로 하는 벡터.
삭제
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 manP 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 이에 상보적인 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 manR 프로모터는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 이에 상보적인 서열로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 벡터는 이화생성물 반응요소인 상기 이종 핵산서열의 업스트림을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 벡터는 상기 이종 핵산서열로부터 다운스트림에 위치한 전사 종결서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 8항에 있어서,
상기 전사 종결서열은 상기 바실러스 섭티리스의 tufA 유전자의 3' 영역으로부터 유래한 서열 5'-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3'을 따르는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 벡터는 대장균 (Escherichia coli)과 바실러스 섭티리스에서 복제 가능한 셔틀벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 벡터는 플라스미드 pUC18 또는 pBS72 레플리콘의 복제 개시점을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 이종 핵산서열은 항체나 이들의 단편을 암호화하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
manP 유전자나 manR 유전자의 전사개시영역은 다른 유전자의 전사개시영역에 의해 대체되는 것을 특징으로 하는 벡터.
삭제
바실러스 섭티리스의 만노오스 오페론의 만노오스 유도 프로모터 영역의 분리 및 정제된 핵산, 또는 이에 상보적인 핵산을 포함하고,
상기 프로모터 영역은 manP 프로모터 또는 manR 프로모터이고,
상기 manP는 운반체인 만노오스 특이 효소 성분을 암호화하는 유전자이며,
상기 manR은 만노오스 오페론의 활성체인 ManR을 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는 분리 및 정제된 핵산.
제 15항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 1에서 5 중 어느 하나, 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제된 핵산.
제 1항 또는 제 2항의 벡터 또는 제 15항 또는 제 16항의 핵산으로 형질 전환된 원핵 숙주세포.
제 17항에 있어서,
상기 원핵 숙주세포는 탄소 이화대사 억제에 의해 제어되며 포스포에놀피루브산염 (phosphoenole pyruvate)인 탄수화물 포스포트란스페라아제 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 원핵 숙주세포.
제 18항에 있어서,
상기 원핵 숙주세포는 그램 양성(Gram-positive)인 것을 특징으로 하는 원핵 숙주세포.
제 19항에 있어서,
상기 숙주세포는 피르미쿠테스 문 (phylum Firmicutes)에 속하는 것을 특징으로 하는 원핵 숙주세포.
원핵 숙주세포에서 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 있어서,
제 1항 또는 제 2항에 따른 벡터를 구성하는 단계,
상기 벡터로 원핵 숙주세포를 형질 전환하는 단계,
적절한 조건하에 세포 배양 배지에서 상기 형질 전환된 숙주세포를 성장시킴으로써 상기 폴리펩타이드를 발현하도록 하는 단계, 및
상기 세포나 세포 배양물로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서,
상기 숙주세포는 처음에는 유도인자와는 다른 탄소원의 존재 하에 성장하고 그 후 제 2단계에서는 유도인자의 존재 하에서 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
원핵 숙주세포에서 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산의 조절된 발현을 위하여 제 1항 또는 제 2항에 따른 벡터 또는 제 15항 또는 제 16항에 따른 분리 및 정제된 핵산을 사용하는 방법.