JP2013501510A - マンノースプロモーターを含むベクター及びマンノースプロモーター - Google Patents
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Abstract
Description
本発明によれば、前記課題と以下の詳細な説明から明らかな課題の他の課題は、前記宿主に対して異種である核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されたマンノースオペロンのプロモーター領域を含み、前記核酸配列の発現が、前記のマンノースオペロンのプロモーター領域によって制御される新規ベクターを提供することによって解決された。
以下の図面に以下のことが示されている。
本願で使用される場合に、以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される。
a)ベクターを構築する工程、
b)原核性の宿主を前記のベクターで形質転換する工程、
c)前記ポリペプチドを細胞培養系中で好適な条件下で発現させる工程、
d)前記のポリペプチドを細胞培養系から回収する工程
を含む前記方法が提供される。
特に規定されない限りは、以下の材料及び方法を使用している:
細菌菌株及び増殖条件
E.コリJM109(Yanisch−Perron C.et.al.,Gene 33,1985,103−119)及びバシラス・サチリス3NA(Michel J.F.et al.,J.Appl.Bacteriol.33,1970,220−227)を、クローニング及び発現のための主要な宿主として使用した。E.コリは、LB液体培地(Luria S.E.et al.,Virology 12,1960,348−390)及びLB寒天プレートであって、100μg ml-1のアンピシリン又はスペクチノマイシンを補ったものにおいて37℃で増殖させた。B.サチリスは、LB液体培地及びC最少培地もしくはS最少培地において37℃で増殖させた(Martin−Verstraete I.et al.,J.Mol.Biol.214,1990,657−671)。液体培地及び寒天プレートには、100μg ml-1のスペクチノマイシン、10μg ml-1のカナマイシン又は5μg ml-1のエリスロマイシンのそれぞれを補った。マンノースプロモーターの誘導のために、滅菌濾過した又はオートクレーブにかけたD−マンノースを添加して、0.2%(w/v)の最終濃度にした。
全ての化学物質は、Sigma−Aldrich(Taufkrichen、ドイツ)、Fluka(Buchs、ドイツ)又はMerck(Darmstadt、ドイツ)から入手した。合成DNAオリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon(Ebersberg、ドイツ)から入手した。制限酵素及びDNA改変酵素は、Roche Applied Science(Mannheim、ドイツ)又はNew England Biolabs.(Frankfurt am Main、ドイツ)から入手した。PCRは、Biozym社製のMiniCycler上で、Fermentas社製(ST.Leon−Rot、ドイツ)の高忠実度DNAポリメラーゼを用いて実施した。
E.コリ及びB.サチリスからの又はアガロースゲルからのDNA単離は、Qiagen(Hilden、ドイツ)又はRoche(Mannheim、ドイツ)のDNA調製キットを用いて製造元の指示に従って実施した。実施例を通じて標準的な分子的技術を使用した。
試験されるべき細胞0.1mlをZバッファー0.9ml中で10μlのトルエンで37℃において30分間にわたり処理した。β−ガラクトシダーゼ活性は、o−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドを用いて22℃でMiller法(Miller J.H.,1972,experiments in molecular genetics,Cold Spring Harbor,NY)に従って測定した。
マンノースオペロンのプロモーター領域を有するDNA断片の単離及びmanRプロモーター及びmanPプロモーターの転写開始部位の決定
バシラス・サチリス168の染色体DNAを、Qiagen(Hilden、ドイツ)のDNeasy Blood&Tissueキットを使用することにより単離した。
実験1によるプライマー伸長実験により、manPプロモーターの転写開始部位は、manRとmanPの開始との間の遺伝子間領域の3′末端付近に位置づけられた。manPプロモーター領域をより厳密に決定するためには、前記の2.3kbのDNA断片を、PCR増幅によって段階的に短くし、得られた異なる長さの配列断片を、同じ基礎発現ベクターにクローニングし戻して発現を研究した。
レポーター遺伝子としてのプロモーターレスのlacZを有する発現ベクターを構築した。該発現ベクターは、B.サチリスとE.コリの両方で複製できるシャトルベクターとして設計され、それはpSUN272.1と名付けた。
前記のa)で得られたプラスミドであるpSUN279.2及びpSUN272.1をB.サチリス3NA中に導入した。後者のプラスミドは、バックグラウンドコントロールとして用いた。一方のプラスミド又は他方のプラスミドを有するB.サチリス3NA菌株をスペクチノマイシンを有するLB培地中で増殖させ、そして指数増殖期において、0.2%のマンノースを誘導のために培養に添加するか、0.2%のマンノースと0.2%のグルコースを誘導のために培養に添加するか、あるいは糖を培養に添加しない(誘導されていないコントロール)か、のいずれかとした。誘導1時間後に、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Millerのアッセイにより測定した。結果は、図5及び図7に示されている。
pSUN284.1の短くされたDNA断片に加えてmanPのプロモーター領域を局在化するために、更に短くされた配列断片を、前記の2.3kbのDNA断片から、manPプロモーターの転写開始部位の上流にある種々の位置の制限部位でかつ図6に示される制限酵素によって切断することによって調製した。
a) cre配列の同定
殆どのCCRはカタボライト制御タンパク質A(CcpA)を通じて媒介されるので、各々の結合部位(cre配列)の調査は、マンノースオペロン全体で、Clone ManagerプログラムにおけるDNAアラインメント機能を使用して実施した。該アラインメントのために、creコンセンサス配列5′−WWTGNAARCGNWWWCAWW−3′を使用した。
manRプロモーターの発現効率を評価するために、pSUN284.1のような発現ベクターを、前記のように構築し、それをpSUN291と名付けた。このために、推定manRプロモーターとmanRの上流の約600bpを含むDNA断片を、プライマーs5208/s5209と、直鎖化したプラスミドDNAのpSUN279.2を鋳型として用いて増幅させ、それをlacZの前方でプラスミドのpSUN272.1中に、KpnI及びAflIIIでの消化とライゲーションとによって挿入した。該DNA配列は、図3に示されている。
実験2c)と同様に、manRのDNA配列のプロモーター領域の更なる位置決めのために、種々の長さのDNA断片を、pSUN291に含まれるDNA配列から、manRプロモーターの転写開始位置の上流の種々の位置で制限部位で、かつ図3に示される制限酵素によって切断することによって調製した。第一の欠失配列は、図3に示される配列を、転写開始部位Gの上流のbp−100及びbp−99にまで下って切断することによって得られ、第二の欠失配列は、転写開始部位Gの上流のbp−83及びbp−82にまで下って切断することによって得られた。
実験4: 形質転換
本発明のプロモーター領域を有するモデル宿主を、その増殖と発現能力について試験した。図6に示される実験2cで使用されるプラスミドpSUN284.1に導入されるmanPプロモーター領域による核酸配列を使用して、プラスミドpMW168.1を、以下に示されるように構築し、宿主としてのB.サチリス3NA中に形質転換によって導入した。
E.コリとB.サチリスの両方で複製可能なシャトルベクターは、実験2a)に示されるようにして設計したが、但し、lacZの代わりにレポーター遺伝子としてeGFPを使用した。また、manPの転写開始領域を、遺伝子gsiB(ストレスタンパク質;Juergen et al.、上記)の転写開始領域で置き換えた。
B.サチリス3NAを、ベクターpMW168.1で形質転換させ、そして該ベクターの細胞分裂における構造安定性並びに安定な伝播(分配)を測定した。
6つの発酵行程を、レポーター遺伝子eGFPを含むプラスミドpMW168.1で形質転換されたB.サチリス3NAで、異なる誘導レジームを用いて実施し、eGFPの蛍光シグナルの観察によってオンラインでモニタリングした。発酵培地としては、Wilms et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.73,95−103に開示されるE.コリの高細胞密度発酵用の以下に示されるような公知の培地を使用した。
一般に、発酵実験のためにも、特に記載がない限りは、標準的な分子的技術を使用した。
光学密度(OD)の測定のために、Amersham Bioscience CompanyのスペクトロフォトメーターUltrospec 1100proを、製造元のプロトコールに従って600nmで使用した。
乾燥バイオマス濃度cxの測定のために、Ohaus CompanyのモイスチャーメーターMB835Halogenを使用した。
eGFPの発現と蛍光のそれぞれを、TECAN Companyの多機能リーダーGENiosによってリーダーソフトウェアX Fluor 4(バージョンV4.11)を使用して以下の測定パラメータで解析した:
発酵の間に、eGFPの発現を、蛍光プローブ(Micropack HPX−2000,High Power Xenon Lightsource of Ocean Optics,Inc.;S2000 fiber optic spectrometer)を使用してオンラインでモニタリングした。
1つのシングルコロニーをLB寒天プレート上に置き、0.02%(w/v)のカザミノ酸(CA)と抗生物質を含む5mlのSpizizensの最少培地(SMM)中で一晩培養した。1mlのオーバーナイト培養を、0.02%(w/v)のCAと抗生物質を有する20mlのSMMに添加し、そして250mlのエルレンマイヤーフラスコ中で37℃で5〜6時間インキュベートした(前培養1)。
一般に、発酵は、Wilms et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.73,95−103の原理に従って実施した。
収穫した細胞の粗製タンパク質抽出物を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、以下の組成を有する3%のスタッキングゲル及び12%の分離ゲルからなるポリアクリルアミドゲルを用いて分析した:
SDS: ドデシル硫酸ナトリウム
APS: 過硫酸アンモニウム
TEMED: N,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン
EDTA: エチレンジアミン四酢酸
遺伝子発現の誘導のために、インデューサー溶液の様々な様式の添加(誘導レジーム)を評価した:
1. 所定の時点での単一部での添加(インパクト誘導)
2. インパクト誘導と、ある時間インターバルにわたる更なる誘導との組み合わせ、その際、
− 更なる添加は、一定速度で段階的に増加する量で、又は
− 更なる添加は、指数関数的に増加する速度で
3. 所定の細胞密度に達した後にインデューサー溶液の添加の開始
発酵行程1を、30lのリアクター(BioengineeringのD598及びD596)中で実施した。回分容量は8lであった。OD600に応じて、200〜400mlの前培養2を接種して、0.1の開始OD600に調整した。
発酵行程1と同様の手順を繰り返すが、インデューサーの添加の様式を変更した。発酵行程1と同様に、0.2%(w/v)のD−マンノース溶液を単一部で流加段階の開始時点に添加した。インデューサーの第二部の添加は、発酵行程1の蛍光シグナルの曲線の転換点の1,500のRFUに達したらすぐに開始した。
3.7lの小さい研究室用の発酵器(Bioengineering Companyの小さい研究室用発酵器)を、発酵行程3及び4で使用した。回分容量(バッチ培地と接種物とを足したもの)は、全体で1.5lであった。OD600に応じて、100〜200mlの前培養2を接種して、約0.1に開始OD600を調整した。回分段階と流加段階の両方の温度は、37℃であった。発酵の間に、pHを、24%(v/v)のNH4OHによって7.0に調整した。エアレーション速度は、発酵の間に一定で2l/分であった。酸素導入は、撹拌機の回転速度によって調整した。発酵圧力は開始時に1.3バールであり、次いで必要に応じて酸素導入を高めるために1.5バールに高めた。炭素源であるグルコースの完全な消費の後に、回分運転を流加運転に切り換えた。
第4表: 供給培地I及びIIの組成
mは、維持係数・(0.04g g-1 H-1)であり、
Yx/sは、基質に関連したバイオマスの比収率係数(グルコースについては0.5)であり、
Cx0は、流加段階の開始時のバイオマス濃度であり、
V0は、流加段階の開始時のリアクター容量(=回分容量)であり、
Cs0は、供給溶液におけるグルコース濃度である]によって計算した。
バイオマス濃度及びモニタリングされた蛍光シグナルは、図13a及び13bに示されており、その際、図面の表示は、発酵行程1と同じである。
発酵行程3と同じ手順を繰り返すが、培地II(マンノース)の供給容量を全体で1.0lにまで高めた。
両方の発酵は、30lの発酵器中で実施した。
培地I及びIIを、それらの全体容量に対する割合4.2:1.0で指数関数的に増大する速度で添加した。高細胞密度に達したら、培地I及びIIから構成される供給物を、培地II及びIIIから構成される供給物によって20:80の割合比率で、培地I及びIIの最後の指数関数的な供給速度の容量に相当する一定容量で置き換えた。
発酵行程5と同じ手順を繰り返したが、全体で600gのマンノースを0.2(w/v)マンノース溶液(全体で16gのマンノース)のインパクト誘導で添加し、それから高細胞密度に達したら培地II及びIIIから構成される供給物の一定の添加を行った。
最大蛍光の時点での評価のために、乾燥バイオマス濃度cx、反応器容量VR、消費されたマンノース及び誘導開始からの期間を測定し、以下の第10表にまとめた。
第11表:
Claims (23)
- バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)のマンノースオペロンのマンノースで誘導可能なプロモーターを含み、該プロモーターがポリペプチドをコードする異種の核酸配列を含む転写ユニットに作動的に連結されている、原核性の宿主細胞において発現可能なベクター。
- 調節遺伝子manRの完全な配列又は部分的な配列を含む、請求項1に記載のベクター。
- 前記プロモーターがmanPプロモーターである、請求項1又は2に記載のベクター。
- manPプロモーターが、配列番号1及び配列番号2から選択される配列、それらに相補的な配列又はそれらの変異体を含む、請求項1から3までのいずれか1項に記載のベクター。
- 前記プロモーターがmanRプロモーターである、請求項1に記載のベクター。
- manRプロモーターが、配列番号3、配列番号4及び配列番号5から選択される配列、それらに相補的な配列又はそれらの変異体を含む、請求項5に記載のベクター。
- 異種の核酸配列の上流にカタボライト応答エレメントを含む、請求項1から6までのいずれか1項に記載のベクター。
- 転写終結配列を含み、それが異種の核酸配列から下流に位置している、請求項1から7までのいずれか1項に記載のベクター。
- 転写終結配列が、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)のtufA遺伝子の3′領域から得られる、請求項8に記載のベクター。
- エシェリキア・コリ(Escherichia coli)及びバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)中で複製可能なシャトルベクターである、請求項1から9までのいずれか1項に記載のベクター。
- プラスミドpUC18及び/又はpBS72レプリコン又はrep遺伝子の複製起点と一緒に、プラスミドpUB110の複製起点を含む、請求項1から10までのいずれか1項に記載のベクター。
- 異種の核酸配列が、抗体又はそのフラグメントをコードする、請求項1から11までのいずれか1項に記載のベクター。
- manP遺伝子又はmanR遺伝子の転写開始領域が、別の遺伝子の転写開始領域によって置き換えられている、請求項1から12までのいずれか1項に記載のベクター。
- manP遺伝子又はmanR遺伝子の転写開始領域が、tufA遺伝子又はgsiB遺伝子の転写開始領域によって置き換えられている、請求項13に記載のベクター。
- バシラス・サチリス(Bacillus subtilis)のマンノースオペロンのマンノースで誘導可能なプロモーター領域の単離され精製された核酸、それらに相補的な配列又はそれらの変異体。
- 配列番号1から5のいずれかの配列、それらに相補的な配列又はそれらの変異体を含む、請求項15に記載の単離され精製された核酸配列。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載のベクター又は請求項15又は16に記載の核酸配列で形質転換された原核性の宿主細胞。
- 原核性の宿主細胞が、炭素カタボライト抑制の支配下にあり、かつホスホエノールピルビン酸:炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系を含む、請求項17に記載の原核性の宿主細胞。
- 原核性の宿主細胞が、グラム陽性である、請求項17又は18に記載の原核性の宿主細胞。
- 宿主細胞が、ファーミキューテス門に属する、請求項18又は19に記載の原核性の宿主細胞。
- 原核性の宿主細胞においてポリペプチドを生産する方法であって、請求項1から14までのいずれか1項に記載のベクターを構築する工程と、前記ベクターで原核性の宿主細胞を形質転換する工程と、好適な条件下で細胞培養培地中で前記形質転換された宿主細胞を増殖させることによって前記ポリペプチドを発現させる工程と、前記細胞又は細胞培養からポリペプチドを回収する工程とを含む前記方法。
- 宿主細胞を、まずインデューサーとは異なる炭素源の存在下で増殖させ、次いで第二工程で、インデューサーの存在下で増殖させる、請求項21に記載の方法。
- 請求項1から14までのいずれか1項に記載のベクター又は請求項15及び16のいずれかに記載の単離され精製された核酸配列を、原核性の宿主細胞におけるポリペプチドをコードする異種の核酸配列の調節された発現のために用いる使用。
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