JP6071878B2 - 誘導性プロモーターの制御 - Google Patents

Description

本発明は、組換え細菌性宿主細胞内で異種ポリペプチドを生産する方法に関する。特に、本発明は特定の基質（インデューサー）により誘導可能なプロモーターの使用によりポリペプチドをコードする異種核酸配列の発現の制御に関する。とりわけ本発明は細菌性宿主細胞内での異種ポリペプチドの発現の制御に関し、その際、細菌性宿主細胞はインデューサーの不在で異種ポリペプチドの発現を制御するプロモーターを不活性化できないようにさせられる。

本発明の背景
組換え微生物内における異種ポリペプチド生産における重要な側面は、ターゲットのポリペプチドをコード化する異種核酸配列の発現の制御に使用されるプロモーターの選択である。

適切なプロモーターは強力であるべきである。すなわち、各々のｍＲＮＡを高い割合で生産し、大量のポリペプチドの生産を可能にするのがよい。更に、プロモーターは容易に制御され、かつ誘導される場合にのみ異種ポリペプチドの生産が開始されるべきである。

しかし、通常は誘導基質が微生物の栄養であり、よって微生物により消費されてしまうという問題点がある。しかし、微生物の培養に使用される培地が誘導基質を使い切ってしまう場合に、微生物はプロモーターを不活性化し、かつこのようにターゲットのポリペプチドの発現が停止する。遺伝子発現の不所望な停止を回避するために、インデューサーは大量に添加されるべきであり、及び／又は連続的に補充されるべきである。大量のインデューサーの必要性は発酵プロセスのコストを上げることになる。しかし、効率的なプロモーターの使用は高価なインデューサーの必要性を抑えることになる。

従って、組換えポリペプチド生産には、異種ポリペプチドの発現を制御するプロモーターの活性が、インデューサーの存在とは無関係であり、しかしそれにもかかわらず異種ポリペプチドの発現を厳重に制御できる宿主細胞が望ましい。

ＷＯ２００６／１３３２１０Ａ２は、マンニトール、アラビトール、グルシトール又はグリセロール−誘導性プロモーターを使用する細菌性宿主細胞内で組換えポリペプチドを生産する方法に関し、その際、前記細菌性宿主細胞はインデューサーを分解又は代謝できないようにされている。前記方法によれば、インデューサーの代謝に必要な酵素をコード化する１つの遺伝子又は複数の遺伝子は、細胞がそのゲノムからインデューサーの代謝又は分解に必要な機能的酵素を発現できないように遺伝子改変しているか又はゲノムが欠損している。インデューサーの吸収を確実にするために、細胞へのインデューサーの輸送に関する遺伝子は無関係である。

しかし、この方法はターゲットのポリペプチドの発現を制御する各々のプロモーターの活性を触媒するためのインデューサーの添加が必要である。更に、細胞内でのインデューサーの蓄積は細胞の増殖にマイナスに影響し得る。

多くの細菌は種々の炭素源の利用を可能にする。炭素源の混合物が用意される場合には、最も迅速な増殖を可能にする炭素源（第一炭素源）が選択される。同時に第二炭素源の利用に関する機能はカーボン・カタボライト・リプレッション（ＣＣＲ）と称される現象により表される。

ＣＣＲの他に、あまり有利ではない第二炭素源の利用に関わる特定の異化遺伝子は前記の第二炭素源の存在でのみ発現する。従って、第二炭素源のカタボリズムに関わる遺伝子の発現は、前記第二炭素源の存在（誘導）及び第一炭素源の不在（カタボライト・リプレッション）による。

Ｔｉａｎｑｕｉ Ｓｕｎ等の出版物"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｎｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ"，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｔｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１９２版、Ｎｏ．８、２０１０年４月１日、２１２８〜２１３９頁は、マンノースオペロン及びその遺伝子ならびにマンノースにより制御されるプロモーターＰｍａｍＰ及びＰｍａｎＲの同定に関する。マンノースの代謝はホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系に課され、かつマンノースオペロンは更にカーボン・カタボライト・リプレッションに課されることが報告されている。各々の遺伝子の機能のキャラクタリゼーション及び同定のために、各々の遺伝子が欠損した、よって前記遺伝子によりコード化される各々のタンパク質が欠損したノックアウトミュータントを生産した。マンノーストンランスポーター遺伝子ｍａｎＰの欠失は、プロモーターＰｍａｎＰとＰｍａｎＲの両方からの保存的発現を結果として生じ、マンノーストランスポーターＭａｎＰ及びマンノースはマンノースオペロン及びマンノースに特異的な転写制御因子ＭａｎＲをコード化するｍａｎＲ遺伝子の制御にマイナスの影響を与えることが見出された。

Ｔｏｂｉｓｃｈ等"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｃ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＬｉＲ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｇｅｎｅｓｉｓ"はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８１巻、Ｎｏ．１９（１９９９）の、４９９５〜５００３頁には、レギュレーターＬｉｃＲのＥＩＩＡドメイン中のホスホリル基結合アミノ酸を他のアミノ酸と交換することにより、誘導性基質の不在でミュータントのレギュレーターＬｉｃＲの活性を生じることが報告されている。

Ｇｏｅｒｋｅ等"Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｍａｎｙ ｗａｙｓ ｔｏ ｍａｋｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｕｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ"ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６巻、Ｎｏ．８、２００８年８月、６１３〜６２４は、マンノーストランスポーターＥＩＩＡＢが欠失したストレプトコッカスミュータント株及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物ホスホトランスフェラーゼ系における影響に関する。マンノーストランスポーターＥＩＩＡＢはマンノースのリン酸化に限定されるだけではなく、同様にグルコース、フルクトース及び２−デオキシグルコースをリン酸化することが示された。更に、マンノーストランスポーターＥＩＩＡＢの不在でさえも、マンノースはフルクトースに特異的なトランスポーターＥＩＩ^FRUにより吸収できることが示された。

Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ等"Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ"（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬＴＤ，ＧＢ、第１１巻、Ｎｏ．２、２００８年４月１日、８７〜９３頁）は、種々の細菌、例えば、大腸菌及び枯草菌におけるカーボン・カタボライト・リプレッションのメカニズムの一般的概要を示している。
本発明の要約
本発明は、細菌性宿主細胞を提供することにより、これらのカーボンカタボリズムの制御メカニズムを使用し、その際、第二炭素源の代謝に関係する遺伝子の発現を制御するプロモーターは、相応の炭素源の不在では不活性化せず、かつその際、前記プロモーターは単にカーボン・カタボライト・リプレッションの制御下にある。

本発明によれば、使用されるプロモーターは細菌性宿主細胞の第二炭素源の利用を制御するプロモーターである。

第一炭素源の存在では、プロモーターはＣＣＲにより制御される。組換え細菌性宿主細胞の培養に使用される培地が第一炭素源を使い果たすか又は第一炭素源の濃度がＣＣＲに必要なレベルを下回る場合には、プロモーターのＣＣＲは非作動的になり、かつプロモーターは前記プロモーターにより制御される遺伝子の発現を自動的に開始する。

本発明は、組換え細菌性宿主細胞を提供し、その際、この組換え宿主細胞は１つよりも多い炭素源を利用でき、組換え宿主細胞のこれらの炭素源のカーボンカタボリズムはホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）及びＣＣＲに課される。その際細菌性宿主細胞は遺伝子改変され、第二炭素源の不在で、しかしＣＣＲの制御下に炭素源誘導性プロモーターの転写調節タンパク質の不活性化を妨げ、その際、前記炭素源は細菌性宿主細胞にとって第二炭素源である。

本発明のもう１つの態様によれば、本発明の組換え細菌性宿主細胞は、第二炭素源により誘導されるプロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含んでいるベクターで形質転換され、その際、ベクターのプロモーターは転写調節タンパク質により制御され、そのために該細菌性宿主細胞が遺伝子改変され、相応の特異的炭素源の不在で不活性化できないようになっている。

更に、本発明はポリペプチドをコードする核酸配列を有するベクターで形質転換した本発明の組換え細菌性宿主細胞を培養することによる異種ポリペプチドを生産する方法を提供する。更に、本発明は、異種ポリペプチドの生産における本発明による組換え細菌性宿主細胞の使用に関する。

本発明の特殊な態様によれば、本発明は少量のインデューサーを必要とする、特にインデューサーを全く必要としない遺伝子発現の誘導レジームに関する。本発明のもう１つの態様によれば、本発明は高細胞密度発酵に適切な細菌発現系に関する。

特に本発明は組換え細菌性宿主細胞において異種ポリペプチドを生産する方法を提供し、その際、組換え細菌性宿主細胞が使用され、炭素源のそのカタボライトはカーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にあり、かつ前記細胞は誘導性第二炭素源の不在で第二炭素源により誘導されるプロモーターに特異的な転写調節タンパク質を不活性化できないように遺伝子改変されていて、かつ前記細胞はプロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を有するベクターを含み、かつ前記細胞は第二炭素源により誘導され、かつ転写調節タンパク質により制御される。前記方法は、誘導性第二炭素源では無く、異なる炭素源を有する細胞培養培地内で細菌性宿主細胞を増殖させ、異なる炭素源の濃度がカーボン・カタボライト・リプレッションに必要なレベルを下回る場合に、前記ポリペプチドの発現を異なる炭素源により誘導し、かつポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する工程を含む。

更に、本発明は本発明を実施するために適切な組換え細菌性宿主細胞を提供する。

例えば、本発明は炭素源のそのカタボリズムがカーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にある組換え細菌性宿主細胞に関し、かつこれは、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて転写調節タンパク質に特異的なホスホリル基転移酵素ＥＩＩをコード化する遺伝子を欠失することにより、誘導性第二炭素源の不在で第二炭素源により誘導可能なプロモーターに特異的な転写調節タンパク質を不活性化できないように遺伝子改変されていて、かつ前記細胞は、転写調節タンパク質により制御されているプロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を有するベクターを含み、そのために該細菌性宿主細胞は不活性化できないように遺伝子改変されていて、かつその際、該ベクターには特定の転写調節タンパク質をコード化する遺伝子が組み込まれている。

更に本発明は、炭素源のそのカタボリズムがカーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にある組換え細菌性宿主細胞に関し、かつこれは、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、転写調節タンパク質をコード化する遺伝子を遺伝子改変し、前記遺伝子により発現される転写調節タンパク質が、前記転写調節タンパク質に特異的である酵素ＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できないようにすることにより、誘導性第二炭素源の不在で第二炭素源により誘導可能なプロモーターに特異的な転写調節タンパク質を不活性化できないように遺伝子改変されていて、かつ該細胞は、転写調節タンパク質により制御されているプロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を有するベクターを含み、そのために該細菌性宿主細胞は不活性化できないように遺伝子改変されていて、かつその際に、ベクターには相応の酵素ＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できない転写調節タンパク質をコード化する操作された遺伝子が更に組み込まれている。

本発明によるもう１つの態様によれば、本発明は組換え細菌性宿主細胞を培養することによる異種ポリペプチドを生産する方法に関し、その際、炭素源のそのカーボンカタボリズムがカーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にある組換え細菌性宿主細胞が使用され、かつ前記細胞は炭素源誘導性プロモーターの誘導性炭素源を代謝できないように遺伝子改変されていて、その際、誘導性炭素源は細菌性宿主細胞の第二炭素源であり、かつこれは前記の第二炭素源により誘導されるプロモーター及び該プロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を含み、前記方法はフェドバッチ法であり、その際、バッチフェーズの後に誘導性第二炭素源の初めの一部分の添加により誘導が開始すると同時に２番目の部分の供給が開始する。

その他の対象及び利点は以下の図式及び添付された請求項を参照して、詳細な説明の再考から当業者には明らかになるであろう。

上記に関する実施態様によれば、ターゲットのポリペプチドの発現の誘導は、プロモーターの誘導性炭素源の存在とは無関係である。従って、この実施態様は誘導性炭素源を必要としない点において特に有利である。しかし、経済的な観点からはプロモーターの誘導に必要な炭素源の量を減らすことができれば有望であろう。

このように、二者択一的な解決法によれば、本発明はターゲットのポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を発現させることにより、ターゲットのポリペプチドを生産する方法に関し、その際、この発現は炭素源誘導性のプロモーターの制御下にあり、ここで、細菌性宿主細胞により炭素源を誘導するカタボリズムのプロセス（プロモーター及びターゲットのポリペプチドのヌクレオチド配列を運ぶベクターで形質転換される）は、中断されるか又は少なくとも遅くなる。

本発明によれば、この選択肢は細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、誘導性炭素源に特異的なイソメラーゼをコード化するヌクレオチド配列の除去又は遺伝子的変更により達成され、これは一度細胞に輸送された誘導性炭素源をフルクトース−６−ホスフェートに変換する。
フルクトース−６−ホスフェートへの異性化は、一度炭素源が細胞に輸送された場合に、炭素源のカタボリズムにおける第一工程である。炭素源の異性化の中断又は遅れとは、この炭素源を長期間誘導できることを意味する。従って、誘導性炭素源の量を減らすことができる。

一例によれば、この選択肢はマンノース誘導性プロモーター及び、このようなプロモーターの細菌性宿主細胞に関し、その際、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコード化する遺伝子（ＭａｎＡとも称される）が除去されているか、又はマンノースの異性化が一度細胞に輸送されると不可能であるように又は少なくとも遅れるように遺伝子改変されている。

図１には、各々の遺伝子及びプロモーターの配置及び方向を用いてマンノースオペロンの構造及び矢印により示されたＭａｎＲによるその活性が図式的に示されている。 図２には、細胞への輸送の際のマンノースカタボリズムのフローチャート、輸送の間のマンノースからマンノース−６−ホスフェートへのリン酸化及びフルクトース−６−ホスフェートへの変換が示されている。 図３には、様々なドメイン及び可能性としてあるリン酸化部位を用いてＭａｎＲアクチベータータンパク質の構造が図式的に示されている。 図４には、ｍａｎＲプロモーターを有する枯草菌のプロモーター領域の核酸配列が示されている。 図５には、ｍａｎＰプロモーターの周囲のＤＮＡ配列が示されている。 図６には、発現ベクターｐＳＵＮ２７９．２のプラスミドマップが示されている。 図７には、それぞれプラスミドｐＳＵＮ２７９．２、ｐＳＵＮ２８４．１及びｐＳＵＮ２９１を含む枯草菌３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図８には、マンノースとグルコースによるｍａｎＰプロモーターの誘導性及びカタボライト・リプレッションを検証するためのプロモータープローブベクターｐＳＵＮ２７２．１で使用された枯草菌からの核酸配列が示されている。 図９には、プラスミドｐＳＵＮ２８４．１ならびに種々の長さの核酸配列の断片を有するプラスミドを含む枯草菌３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図１０には、図４に示されているような核酸配列を有するベクターｐＳＵＮ２９１、ｐＳＵＮ３８５．２及びｐＳＵＮ３８６．９を含んでいる枯草菌３ＮＡのβ−ガラクトシダーゼ活性が示されている。 図１１には、発現ベクターｐＭＷ１６８．１のプラスミドマップが示されている。 図１２には、挿入ベクターｐＳＵＮ３５６．７のプラスミドマップ（ΔｍａｎＰ）が示されている。 図１３には、枯草菌ＴＱ３５６／ｐＭＷ１６８．１（ΔｍａｎＰ−ミュータント）の発酵の処理期間にわたりプロットした乾燥バイオマス濃度を対数表示するダイアグラム及び処理期間にわたりプロットした蛍光シグナル（ＲＦＵ）が示されている。 図１４には、枯草菌ＴＱ３５６／ｐＭＷ１６８．１を用いる発酵から取り出した細胞試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥが示されている。 図１５には、プラスミドｐＭｗ１６８．１の調製に関するフローチャートが示されている。

本発明の詳細な説明
本明細書で使用されているように、以下の定義は本発明の解釈を用意にするために提供される。

"酵素ＥＩＩ"、"ＥＩＩ"又は"トランスポーター"とは、ホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の炭素源に特異的なパーミアーゼを意味し、これは炭素源の輸送及び付随するリン酸化を触媒する。ＰＴＳは炭素源、例えば糖に特異的な様々なＥＩＩを有する。

ＥＩＩは、通常は３つのドメインＡ、Ｂ及びＣから成り、かつ時折４番目のドメインＤから成る複合体である。その際、ＥＩＩＡとＥＩＩＢは相応の炭素源のリン酸化に関与し、かつ膜結合したＥＩＩＣ（存在する場合にはＥＩＩＤ）は細胞への特異的な炭素源の貫通を媒介する。

特定の炭素源が不在の場合には、ホスホリル基を転写調節タンパク質中に存在する相応のリン酸化部位に移すことにより、相応のＥＩＩＡ、及びある場合にはＥＩＩＢは転写調節タンパク質に特異的な各々の炭素源を不活性化する（ＥＩＩのリン酸化に応じて、それぞれＥＩＩＡ及びＥＩＩＢドメインと称される）。

"転写調節タンパク質"又は"レギュレーター"は、特異的炭素源のカタボリックオペロンをポジティブに制御する（すなわち、活性化する）。通常、転写調節タンパク質はリン酸化できる２個の保存制御ドメイン（ＰＴＳ制御ドメイン、ＰＲＤｓ）を有する。更に、幾つかの転写調節タンパク質はＥＩＩＡとＥＩＩＢと称される更なるリン酸化部位を含んでいる。転写調節タンパク質に応じて、転写調節タンパク質は酵素ＩＩからＥＩＩＡとＥＩＩＢ及び／又はＰＥＤＩドメイン内の上記ホスホリル結合部位の１つ又は複数に移されたホスホリル基により不活性化され、かつヒスチジンタンパク質（ＨＰｒ）からＰＲＤＩＩドメインに移るホスホリル基により活性化される。ＰＴＳの転写調節タンパク質に特異的な様々な炭素源は、アクチベーター又はアンチターミネーターであることができる。

本明細書で使用されるような"プロモーター"とは、発現を制御する核酸配列を意味する。"プロモーター領域"は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合でき、かつ下流（３’方向）コード領域の転写を開始する調節領域である。プロモーター領域内では、−３５ボックスと−１０ボックス（プリブナウボックス）のようなＲＮＡポリメラーゼを結合する役目のあるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。更に、プロモーター領域は転写開始部位及びそれらの転写調節タンパク質に特異的な結合部位を有していてもよい。

"変異体"又は"配列の変異体"とは、保存的核酸の置換により基本配列から変化した核酸配列を意味し、それにより、１つ又は複数の核酸は同じ特性を有する他のものと置き換えられる。変異体には、このような変性配列が基本配列と同じ機能（機能的等価）を示す限りは、縮重配列、欠失及び挿入を有する配列も含まれる。

"宿主内で発言可能なベクター"又は"発現ベクター"は、宿主細胞内の特定の核酸配列の転写を可能にする規定の高分子核酸エレメントの系列を用いて組換えにより又は合成により生じた高分子核酸構造物である。通常は、このベクターには、プロモーターに作動的に連結して転写されるべき特定の核酸配列を有する転写ユニットが含まれる。宿主内で発現可能なベクターは、例えば、自動的又は自己複製型プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス又はレトロウイルスである。

"形質転換"、"形質転換した"又は"宿主細胞内への核酸の導入"という用語は、ベクターのような細胞外核酸が、付随する材料を伴って又は伴わずに宿主細胞内に入るプロセスを意味する。

例えば発現ベクターでの適切な宿主細胞の形質転換は、マイクロインジェクション、電気泳動、粒子衝突のような周知の方法、又はリン酸カルシウム媒介形質転換のような化学的方法ならびに自然な形質転換系（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓｅ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８２）、又はＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｈｎｓ（１９８４）に記載されている）により行うことができる。

"異種核酸配列"又は"宿主にとって異種の核酸配列"とは、例えば、宿主に対して異種であるポリペプチドのような発現産物"異種発現"又は"異種産物"をコード化する核酸配列、すなわち、宿主とは異なるドナーに由来する核酸配列、又は例えば、宿主にとって異種であるポリペプチドのような発現産物をコードする化学的に合成された核酸配列を意味する。宿主が特に原核生物である場合には、異種核酸配列は、有利には異なる属又は科から由来し、より有利には異なる目又は網から、特に異なる門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から、最も有利には異なる生物のドメイン（ｅｍｐｉｒｅ）から生じる。

宿主とは異なるドナーに由来する異種核酸配列は、これが宿主細胞に導入される前に、１つの核酸又は異種核酸配列の一部分の突然変異、挿入、欠失又は置換により変性できるが、但しこのような変性配列が基本配列と同じ機能（機能的等価）を示す限りにおいてである。本明細書で参照される異種核酸配列には、同様に異なる生物のドメイン（ｅｍｐｉｒｅ）から、例えば、多核生物（多核生物起源）から、例えば、ファージディスプレイライブラリーで使用されたヒトの抗体から生じる核酸配列も含まれ、かつこの単一の核酸又は核酸配列の一部は原核生物の宿主の"コドン出現頻度"により変性されている。

本発明の意味する範囲内での"異種ポリペプチド"又は"ターゲットのポリペプチド"とは、ヒト、哺乳類又は原核生物起源の異種タンパク質であることができる。その他のタンパク質は、抗体、例えば、病原性微生物（ウイルス性及び抗菌性の両方）からの糖タンパク質及び炭水化物及び腫瘍からのものである。その他の異種ポリペプチドは、酵素、例えば、キモシン、プロテアーゼ、ポリメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、グルカナーゼ、オキサダーゼ、α−アミラーゼ、オキシドリダクターゼ、リパーゼ、アミダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、エステラーゼ又はニトリラーゼである。

"炭素源"とは、通常は炭水化物である炭素源を意味し、これは細菌細胞により吸収され、かつ代謝でき、かつＰＴＳ及びカーボン・カタボライト・リプレッション（ＣＣＲ）に課される。炭水化物の通常の例は糖及び糖の誘導体である。

多くの細菌は１つ以上の炭水化物を炭素源及びエネルギーとして利用できる。特定の細胞外酵素を使用することにより、枯草菌のような細菌は植物バイオマス中に大量に存在する多くの多糖類を分解することができる。結果として生じるオリゴ糖、二糖類又は単糖類は細胞に輸送され、かつ更に加工される。通常、糖類の代謝又は分解に関わるカタボリック酵素は、特定の基質が培地中に存在し、かつ有利な炭素源及びエネルギー源が不在の場合にだけ合成される。細菌の細胞膜を介して炭水化物を輸送するために有利な炭水化物の輸送経路は、ＰＴＳである。

ＰＴＳでは、膜を介した炭水化物の輸送及び引き続くリン酸化は、酵素ＩＩ（ＥＩＩ）と称される前記炭水化物に特異的な酵素により媒介される。ＥＩＩは、細胞へのその相応する炭素源の輸送を媒介するので、ＥＩＩは"トランスポーター"とも称される。

炭水化物の混合物の存在では、最もエネルギー的及び増殖的な優位性を提供する炭素源（第一炭素源）を選択的に吸収する。同時に、これらはあまり有利ではない炭素源（第二炭素源）のカタボリズムと吸収に関わる様々な機能を抑制する。

通常は、大抵の細菌の第一炭素源はグルコースであり、かつ細菌により、その他の様々な糖及び糖の誘導体は第二炭素源として使用される。しかし、第一炭素源は他の化合物であってもよい。例えば、シュードモナスの場合には第一炭素は芳香族化合物であることができる。

第二炭素源には、例えば、マンノース、ラクトース及びメリビオースが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

ＰＴＳにおいて、特定の炭素源の代謝に関わる様々な異化遺伝子は転写調節タンパク質により制御される。これらの転写調節タンパク質は、アンチターミネーター又は転写アクチベーターとして作用でき、かつ特定の炭素源（インデューサー）の存在でのみ活性である。ホスホリル基を転写調節タンパク質内に存在する特定の結合部位に移すことにより、ＥＩＩが、その相応の転写調節タンパク質に対してマイナスの（不活性）調節作用を有することが見出された。

第一炭素源の不在で、かつ誘導性炭素源に特異的なプロモーターの存在では、プロモーターはその相応する転写調節タンパク質により活性化され、かつこのプロモーターの制御下に遺伝子は発現する。誘導性炭素源の不在では、プロモーターを制御する転写調節タンパク質は、そのＥＩＩから該転写調節タンパク質上の各々の結合部位に移されたホスホリル基により不活性化され、これによりプロモーターが不活性化され、かつ前記プロモーターの制御下に遺伝子の発現が停止する。

そうでない場合には、有利な第一炭素源の存在で（あまり有利ではない第二炭素源が存在するかどうかとは無関係に）、前記第二炭素源の異化遺伝子の発現はＣＣＲにより抑制される。

一般に、本発明は炭素源に特異的な転写調節タンパク質の制御の阻害に基づくが、但し前記の特異的炭素源は不在である。特に本発明は相応のＥＩＩを介して転写調節タンパク質に移動するホスホリル基による抑制又は不活性化の阻害に基づく。

炭素源に特異的な転写調節タンパク質の抑制が妨げられると、前記転写調節タンパク質にとってはアクチベーターであるプロモーターは、該プロモーターにとってはインデューサーである炭素源の存在とは無関係に活性である。

従って、このようなプロモーターの制御下に誘導性炭素源は遺伝子の発現には必要ではなく、かつ更に遺伝子は連続的に発現する。

上記の観点から、本発明は第二炭素源により誘導されるプロモーターを使用し、その際、このプロモーターは一方ではＰＴＳにより、かつ他方ではＣＣＲにより制御される。

従って、本発明は、プロモーターに特異的な転写調節タンパク質の不活性化を妨げることにより、ターゲットのポリペプチドの発現においてプロモーターとして使用される炭素源誘導性プロモーターの不活性化を妨げることを探索する。

第一のアプローチによれば、この目的はその特異的ＥＩＩによる転写調節タンパク質のリン酸化を中断することにより達成され、これはＥＩＩにより移されたホスホリル基に対して転写調節タンパク質の少なくとも１つの結合部位をホスホリル基に結合できなくさせることにより行われる。

このために、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、ＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できない転写調節タンパク質を遺伝子が発現するように、転写調節タンパク質をコード化する遺伝子を遺伝子操作することができる。

第二のアプローチによれば、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、リン酸化はＥＩＩをコード化する遺伝子、すなわち、転写調節タンパク質の活動を制御している酵素を削除することにより中断される。

本発明によれば、異種ポリペプチドの発現は、上記の転写調節タンパク質に特異的であるプロモーターの制御下に置かれ、そのためにＥＩＩにより移されたホスホリル基による不活性化は、細菌性宿主細胞の遺伝子改変より妨げられる。

本発明は、異種ポリペプチドを生産するための有利な系を提供し、これは炭素源誘導性プロモーターに作動的に連結している前記ポリペプチドをコード化する異種核酸を含んでいるベクターで形質転換した本発明の組換え細菌性宿主細胞の発酵により行われ、その際、前記プロモーターは発酵培地中に誘導性炭素源が無い場合でも活性である。ターゲットのポリペプチドをコード化する核酸配列の発現を制御するプロモーターは、なおカーボン・カタボライト・リプレッションの制御下にあるので、グルコースのような第一炭素源の存在では発現は行われないが、しかし系が第一炭素源を使い果たした場合に誘導が自動的に達成される（自動的誘導）。異種ポリペプチドの発現を制御するプロモーターの活性は、誘導性炭素源の存在とは無関係であるので、発酵培地において、ターゲットのポリペプチドの発現の誘導は誘導性炭素源の必要なしに達成される。

本発明は、第一炭素源の存在で組換え細菌性宿主細胞を高い細胞濃度まで増殖でき、かつ所望の細胞密度が達成され次第、ターゲットのポリペプチドの生産が、発現を制御するプロモーターのカーボン・カタボライト・リプレッションが解放されると自動的に開始する点において有利である。

本発明のもう１つの利点は、バッチフェーズの間にフェドバッチ発酵において、ターゲットのポリペプチドの生産は全く又は殆ど行われない点である。すなわち、強力なカタボライト・リプレッションがある。

本発明にとって適切な細菌性宿主細胞は、１つよりも多い炭素源を利用できるものであり、その際、種々の炭素源の利用はカーボン・カタボライト・リプレッションに課され、かつその際、膜を介した炭素源の輸送及びそのリン酸化はホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系に課される。

本発明にとって適切な細菌性宿主細胞は、グラム陽性又はグラム陰性細菌であることができる。有利な例は、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門に属するもの、及び特に枯草菌網に属するものである。特別な例は、バチリス属のもの、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍなどであり、その他の有利な例には、特にストレプトコッカス、スタフィロコッカス、ラクトバチルス、エッシェリキア又はエンテロバクテリアの他のメンバーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

通常、フィルミクテスは、グラム陽性であり、かつ低いＧＣ含有量を有する。"低いＧＣ含有量"とは、細菌ゲノム中の塩基対の５２％未満がＧＣ対であることを意味する。例えば、グラム陽性細菌、例えば、枯草菌及びクロストリジウムのものは、ゲノム中に４０％以下のＧＣ対を有する。

更に適切な細菌性宿主細胞は、腸内細菌、例えば、エンテロバクター目に属するものである。このような腸内細菌の例は、大腸菌属のようなグラム陰性に属するものである。特別な例は、大腸菌株、例えば、ＴＧ１、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＸＫ１−ブルー及びＯｒｉｇａｍｉである。

大腸菌及び腸内細菌は、ゲノム中に約５０％のＧＣ含有量を有し、よって低いＧＣ含有量の生物である。

グラム陽性及びグラム陰性生物は、周知のグラム染色法により決定される。グラム陽性生物は、標準のグラム染色下に紫色を呈するものである。グラム陰性生物は、一次グラム染色よりもむしろ対比染色を取り込む。

フィルミクテス及び腸内細菌には種々のメカニズムのＣＣＲがあり、これらはモデル生物としての枯草菌と大腸菌において集中的に研究されてきた（例えば、Ｊ．Ｓｔｕｅｌｋｅ等、"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅs",Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０００）５４：８４９〜８８０；ＧｏｅｒｋｅＢ及びＳｔｕｅｌｋｅＪ．"Ｃａｒｂｏｎ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｍａｎｙ ｗａｙｓ ｔｏ ｍａｋｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ",Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００８）６：６１３〜６２４；ＧｏｓｓｅｔＧ等、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ",Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（２００４）１８６：３５１６〜３５２４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａｎｔｏｎｉｏ Ａ等、"Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ"Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００３）６：４８２〜４８９参照）。ＣＣＲの全体的なメカニズムは異なるにもかかわらず、結果は同じである。すなわち、第一炭素源の存在では、第二炭素源の吸収及びリン酸化に関わる種々のカタボリックオペロンは抑制される。

本発明の組換え細菌性宿主細胞は、遺伝子改変されて異種核酸配列の発現を制御する炭素源誘導性プロモーターの抑制を妨げるようにされ、これは前記誘導性炭素源の不在で転写調節タンパク質に特異的なプロモーターの不活性化を阻害することにより行われる。

従って、本発明の組換え細菌性宿主細胞内では、異種核酸配列の発現を制御する炭素源誘導性プロモーターは、カーボン・カタボライト・リプレッションだけに課される。第一炭素源の存在では、異種ポリペプチドの発現はＣＣＲにより抑制される。

本発明によれば、炭素源誘導性プロモーターは、カーボン・カタボライト・リプレッションがより有利な第一炭素源により刺激されない限り、誘導性炭素源の存在とは無関係にその活性な状態である。

従って、本発明は、ポリペプチドをコード化する遺伝子を制御するプロモーターを誘導するためのインデューサーを必要としない異種ポリペプチドの生産を提供する。

一般に、本発明に適切なプロモーターは細菌細胞内でＰＴＳ及びＣＣＲに課されるものである。特に、各々の転写調節タンパク質は、前記プロモーターの制御下にカタボリックオペロンのアクチベーター又はアンチターミネーターである。このようなプロモーターは当業者に公知である。本発明に適切なプロモーターの例を各々のオペロンを参考にして以下の表に挙げることにする。

以下に、枯草菌のマンノースオペロンを参考にして本発明をより詳細に説明することにする。

枯草菌は、多くの様々な単糖類又は二糖類、例えばグルコース、マルトース、スクロース、マンノース、マンニトール及びフルクトースを炭素源として使用できる。これらの糖類は、ＰＴＳ系により吸収される。細胞への輸送及びリン酸化は各々の糖類に特異的な酵素ＥＩＩにより媒介される。

多くの細菌と同様に、枯草菌の有利な炭素源はグルコースである。グルコースの存在では、ＰＴＳに課される他の糖類のどの吸収もＣＣＲにより抑制される。

マンノースのオペロン構造は図１に示されていて、かつ細胞へのマンノースの輸送及びそのカタボリズムは図２に示されている。枯燥菌のマンノースオペロンは、３個の異化遺伝子を有する（Ｋｕｎｓｔ Ｆ．Ｎ等、"Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ"、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：２４９〜２５６頁）。

１番目の遺伝子、ｍａｎＰは、ＭａｎＰと称されるマンノースに特異的なＥＩＩ酵素をコード化する。ＭａｎＰは、膜を介してマンノースの輸送を行い、かつ同時にマンノースをリン酸化してマンノース−６−ホスフェートにする。２番目の遺伝子、ｍａｎＡはマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコード化し、これはマンノース−６−ホスフェートを相応するフルクトース−６−ホスフェートに変換する。３番目の遺伝子ｙｊｄＦの機能は、まだ不明である。これらの３個の遺伝子の上流及び同じ方向には、ＭａｎＲと称される転写調節タンパク質をコード化する調節遺伝子ｍａｎＲが位置する。

マンノースオペロンは、ポジティブに調節されるカタボリックオペロンであり、かつ２つの異なるプロモーターにより制御される。１番目のプロモーター、ｍａｎＲプロモーター（ＰｍａｎＲ）は、転写調節タンパク質ＭａｎＲを担う。２番目のプロモーターｍａｎＰプロモーター（ＰｍａｎＰ）は、遺伝子ｍａｎＰ−ｍａｎＡ−ｙｊｄＦ（合わせて"ｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦ"）の転写を担う。マンノースの存在で、及びグルコースの不在では、ＭａｎＲはＰｍａｎＰに結合し、かつｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦの発現を活性化する。意外にも、ＭａｎＲはｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦ−プロモーターにとって転写調節タンパク質であるだけではなく、ｍａｎＲ自体にとって自動的レギュレーターであることが見出された。

図３には、転写調節タンパク質ＭａｎＲの構造及び潜在的なリン酸化部位が図示されている。表示されているように、ＭａｎＲは、２個のＰＲＤ（ＰＴＳ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）ドメイン、１個のＥＩＩＡとＥＩＩＢドメインならびにＨＴＨ（へリックス−ターン−ヘリックス）ドメインを有する。ＰＲＤは、転写調節タンパク質中に存在する保存された調節ドメインであり、これはカーボン・カタボリズムの間にリン酸化できる。ＥＩＩＡとＥＩＩＢドメインは、ＭａｎＰにより輸送されたホスホリル基の結合部位である（マンノースオペロンのＥＩＩトランスポーター）。ＨＴＨはＤＮＡを結合できるタンパク質内の構造モチーフである。

インデューサーであるマンノースの不在で、ＥＩＩＡとＥＩＩＢ及び実質的にＭａｎＲのＰＲＤＩドメインは、ＭａｎＰ（マンノースオペロンのマンノースに特異的ＥＩＩ）によりリン酸化され、それにより不活性にされる。

従って、本発明の第一のアプローチによれば、インデューサー（マンノース）の不在では、ＭａｎＲの不活性化は妨げられるが、これはホスホリル基が受容できないようにＭａｎＲのＥＩＩＡ及び／又はＥＩＩＢにおいてリン酸化部位が操作されるか、又はドメインが欠失される場合である。

このために、細菌性宿主細胞のゲノム内で、ＭａｎＲ内にて各々のリン酸化部位をコード化する相応の核酸配列の欠失又は操作により遺伝子ｍａｎＲは遺伝子改変される。

更に、本発明の２番目のアプローチによれば、マンノースオペロンのプロモーターの不活性化は、マンノース輸送の中断により妨げられ、これは細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、ここではマンノースオペロン、ｍａｎＲ及び／又はｍａｎＰにおいてＭａｎＰをコード化する遺伝子の欠失又は不活性化により行うことができる。

これらの変更は、細菌性宿主細胞において、転写調節タンパク質のリン酸化に関わるタンパク質をコード化する遺伝子のコーディング配列を変更又は欠失により行うことができる。

このような遺伝子改変したノックアウト宿主細胞は、このような目的に公知である様々な方法により調製できる。例えば、ターゲットの核酸配列が欠失した配列の相同のターゲット遺伝子配列５’と３’を含んでいる相同組換えベクターは、宿主細胞に形質転換することができる。相同組換えの際に、所望のノックアウト細胞を生産できる。

遺伝子ノックアウト法は当業者に周知である。例えば、ポリヌクレオチドの挿入による遺伝子不活性化は、例えば、Ｒｏｅｄｅｒ Ｄ．Ｌ．等、"Ｍａｒｋｅｒ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｐｅｋｔａｔｅ ｌｙａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓ ａｎｔｈｅｍｙ"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８５）１６４（１：５１〜５６）に記載されている。遺伝子における特定の突然変異又は欠失は、カセット突然変異を用いて構築でき、これは例えば、Ｗｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．等、"Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ", Ｇｅｎｅ（１９８５）３４（２〜３）：３１５〜３２３に記載されている。これにより遺伝子の選択箇所でダイレクト又はランダムな突然変異が行われ、かつ次に相同組換えにより遺伝子の染色体コピーが挿入される。

本発明の発明者により、マンノースオペロンを制御するプロモーター、すなわちＰｍａｎＲとＰｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦが強いプロモーターであることが見出されたので、これは異種ポリペプチドの生産にとって有能な候補者である。しかし、これらのプロモーターを誘導する炭素源であるマンノースは高価な糖であり、なおマンノース誘導性プロモーターの使用を制限してしまう。

本発明によれば、細菌性宿主細胞内での異種ポリペプチドの発現には、誘導性炭素源は発現の開始に不必要であるので、マンノースプロモーターのようなプロモーターの使用も強さの観点からだけではなく、値段の点でも競争力がある。

従って、本発明は本発明の組換え宿主細胞内においてターゲットのポリペプチドをコード化する異種核酸配列を制御するためのプロモーターとしての、マンノースオペロンのプロモーター（ＰｍａｎＲ及びＰｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦ）の使用にも関する。

ｐＳＵＮ２８４．１のような様々な発現ベクターにおいて使用されるｍａｎＰプロモーターのプロモーター領域を含んでいる枯草菌からの核酸配列は、図５に示されていて、アデニンヌクレオチドでの転写開始部位が強調されていて、−３５ボックスと−１０ボックスはイタリック体及び太字で、ｍａｎＲの末端を矢印によりマークし、かつ制限部位Ｂｇ／ＩＩ、ＸｂａＩ、Ａｆ／ＩＩ、ＮｄｅＩおよびＮｒｕＩには下線が引いてある。レポーター遺伝子ｌａｃＺの開始コドンが示されている。

ｍａｎＲプロモーターのプロモーター領域を含んでいる枯草菌から得られる核酸配列は、図４に示されていて、転写開始部位が強調されていて、−３５ボックスと−１０ボックスはイタリック体及び太字で、ｍａｎＲ遺伝子の開始は矢印により示されて、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は太字で示されていて、かつ下線が引いてあり、推定のｃｒｅ配列には下線が引いてある。

"マンノースオペロンのプロモーター領域"とは、ｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦならびにｍａｎＲ（ｃｒｅ配列有り又は無し）の発現を制御するプロモーター領域を意味する。

本明細書内で参照される"ｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦプロモーター"は主に−３５領域、−１０領域（プリブナウボックス）、転写開始部位及びＭａｎＲ結合部位から成る。

本明細書内で参照される"ｍａｎＲプロモーター"は、主に−３５領域、−１０領域、転写開始部位及びＭａｎＲ結合部位及び場合によりｃｒｅ配列から成る。

ｃｒｅ配列（カタボライト・リプレッシブ・エレメント）は、保存された１４個のヌクレオチドの長さのＤＮＡ配列であり、これにフィルミクテスにおけるＣＣＲの包括的な調節タンパク質であるＣｃｐＡ（カタボライト制御タンパク質Ａ）が結合する。枯草菌におけるカタボライト・リプレッション及び活性化のメカニズムは、図６に示されている。ｃｒｅ配列へのＣｃｐＡの結合により、セリン−４６リン酸化ＨＰｒ（ヒスチジンタンパク質）により複合体を形成し、プロモーターは抑制される。これはマンノースオペロンのカタボライト・リプレッションの第二のメカニズムを示している。これにより、レギュレーター遺伝子ｍａｎＲの発現はグルコースの存在で抑制される。その結果、これはｍａｎＰプロモーターの活性化を阻害する。グルコースの存在で、細胞はＰｔｓＧによりグルコースを吸収し、ＰＴＳ依存性輸送系はＥＩＩマンノーストランスポーターと類似している。細胞内では、中間体フルクトース−６−ホスフェート（Ｆｒｕ−６−Ｐ）及びフルクトース−１，６−ビスホスフェート（Ｆｒｕ−１，６−ＤＰ）が蓄積し、かつＨＰｒ−キナーゼを刺激する。ＨＰｒ−キナーゼ（ＨＰｒｋ）はセリン−４６でＨＰｒをリン酸化する。Ｓｅｒ−４６−ＨＰｒは、ＤＮＡ結合タンパク質ＣｃｐＡと複合体を形成し、これはいわゆる枯草菌の多くのカタボライト抑制された及びカタボライト活性化されたプロ―ター中に存在するｃｒｅ部位に結合する。

ｃｒｅ部位でのプロモーター配列の下流−１０又は重複する−１０配列で、Ｓｅｒ−４６−ＨＰｒ／ＣｃｐＡ複合体の結合は、このプロモーターからの発現を抑制する。この状況はｍａｎＲプロモーターで見出すことができる（図４）。

ｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦのプロモーター領域を含んでいる核酸配列は、有利には図５の−８０塩基対からｌａｃＺの開始コドンまでの核酸配列を有し（配列番号１）、より有利には図５の−８０塩基対から−１塩基対を含む、すなわち＋１塩基対の転写開始部位Ａの上流までの核酸配列を有する（配列番号２）。

ｍａｎＲのプロモーター領域を含んでいる核酸配列は、有利には図４の−１２２塩基対からｍａｎＲの開始コドンまでの核酸配列を有し（配列番号３）、より有利には図４の−１２２塩基対から＋７塩基対までの核酸配列、すなわち推定のｃｒｅ配列までを含む（配列番号４）、及び特に図４の−１２２塩基対から−１塩基対までの核酸配列、すなわち＋１塩基対の転写開始位置Ｇの上流までを含む（配列番号５）。ｍａｎＰとｍａｎＲのプロモーター領域は両方とも転写調節タンパク質ＭａｎＲのための結合部位を含み（図４中、ＩＲＩ−Ｒ及び図５中、ＩＲＩ−Ｐと記してある）、これはマンノースオペロンのプロモーターにとって転写アクチベーターである。

もう１つの態様によれば、本発明は炭素源誘導性プロモーターに作動的に連結した関心のあるポリペプチドをコード化する核酸配列を有するベクターを含んでいる遺伝子改変した細菌性宿主細胞に関し、その際、前記ベクターのプロモーターは転写調節タンパク質により制御され、そのために細菌性宿主細胞は前記転写調節タンパク質に特異的な炭素源の不在で不活性化できないように遺伝子改変されている。

上記のマンノースオペロンに関して、ベクターのプロモーターはＰｍａｎＲ又はＰｍａｎＰＡ−ｙｊｄＦであることができ、例えば、配列番号１から５までのいずれか、ならびに上記表のいずれかである。

本発明の１実施態様によれば、本発明で使用されるベクター中では、各々のＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できないように各々の転写調節タンパク質をコード化する遺伝子改変された遺伝子を挿入できる。従って、組換え細菌性宿主細胞内では、転写調節タンパク質は染色体遺伝子によってだけではなく、ベクター中に組み込まれた相応の遺伝子によっても発現され、その結果、より高い濃度の転写調節タンパク質及び改善された誘導を生じる。例えば、ベクターのプロモーターがマンノースオペロンのプロモーターである場合には、遺伝子ｍａｎＲをベクター中に組み込むことができ、その際、ＥＩＩドメインをコードするヌクレオチド配列は欠失されている（ｍａｎＲΔＥＩＩＡ）。

本発明に適切なベクターは、有利には自律的に又は自己複製型プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス又はレトロウイルスである。本発明には幅広い多くの宿主／ベクターの組み合わせを使用してもよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体の及び／又は合成核酸配列の断片から成っていてもよい。

適切なベクターには、特定の宿主幅を有するベクター、例えば、それぞれ枯草菌及び大腸菌に特異的なベクター、ならびに広い宿主幅を有するベクター、例えば、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に有用なベクターが含まれる。"低いコピー数"、"中程度のコピー数"ならびに"高いコピー数"のプラスミドを使用できる。

例えば、枯草菌では、低いコピー数のプラスミドはｐＡＭｂｅｔａ１であり、中程度のコピー数のプラスミドはｐＢＳ７２誘導体であり、かつ高いコピー数のプラスミドはｐＵＢ１１０である。例えば、大腸菌で発現するために有用なベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹ１８４、ｐＲＳＦ１０１０及びｐＢＷ２２又はその誘導体、例えば、プラスミドｐＢＬＬ１５又はプラスミドｐＡＫＬ１５Ｅである。

本発明の遺伝子改変した細菌性宿主細胞は、プロモーターを誘導する炭素源の不在ではプロモーターを制御する転写調節タンパク質を不活性化することができない。ベクターのプロモーターは、各々の染色体プロモーターと同じ転写調節タンパク質によって制御されるので、ターゲットのポリペプチドをコード化する異種核酸配列の発現は、誘導性炭素源の不在でさえも継続される。

更に、本発明は本発明の遺伝子改変した細菌性宿主細胞において異種ポリペプチドを生産する方法を提供し、その際、該方法は以下の工程を含む：
ａ）ポリペプチドの発現を可能にする条件下に培養し、本発明の遺伝子改変した細菌性宿主細胞を、プロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する核酸配列を含んでいるベクターで形質転換し、その際、前記ベクターのプロモーターは、転写調節タンパク質に特異的な炭素源の不在で不活性化できない転写調節タンパク質により制御され、かつ
ｂ）ポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する。

本発明によれば、ターゲットのポリペプチドの発現は、培地が第一炭素源を使い果たした時点、又は第一炭素源の濃度がＣＣＲに必要なレベルを下回って減少した時点で自動的に開始する。

誘導後に細胞が増殖できるようにするために、カーボン・カタボライト・リプレッションができないレベルで第一炭素源を更に培養に供給することができる。例えば、第一炭素源は、直ちに細胞により消費される量で供給され、発酵液中には、ＣＣＲを刺激し得る第一炭素源が実質的に存在しないようにする。

一般に、培地中に存在する第一炭素源の量が１．０ｇ／ｌを超える場合に、カーボン・カタボライト・リプレッションが観察されるのに対して、この量が０．０１ｇ／ｌ又は未満である場合には、カーボン・カタボライト・リプレッションは無いことが言える。

カーボン・カタボライト・リプレッション及びプロモーターの誘導のボーダーラインは、細胞の増殖率と相関するため、これが今度は培地中に供給された第一炭素源の量、又は培地中に存在する第一炭素源の量と相関し、カーボン・カタボライト・リプレッションを引き起こさない第一炭素源の量は、増殖率を監視することにより調節できる。所定の増殖率でカーボン・カタボライト・リプレッションが生じる場合には、培養に添加される第一炭素源の量を減らさなくてはならない。それにより、増殖率はカーボン・カタボライト・リプレッションが観察されなくなる値まで減少する。

大抵の発酵プロセスでは、誘導フェーズでμ≦０．２ｈ^-1の特定の増殖率を生じる量まで第一炭素源を添加するのが適切である。

いずれにせよ、特定の発酵プロセスにとって、特定の増殖率μに適切な値は、ルーチンワークによって容易に決定できる。

使用されるベクター、ならびに宿主の構築及び形質転換は先に定義した通りである。

細胞培養系として、バッチ培養又はフェドバッチ培養のような連続又は不連続な培養を、培養管、振盪フラスコ又は細菌発酵装置などにおいて適用できる。有利には、誘導フェーズでは、ターゲットのポリペプチドが発現する場合には、第一炭素源は培養培地に指数関数的に供給される。

遺伝子改変した細菌性宿主細胞を培養するために、当業者に公知のような通常の培地、例えば、"栄養酵母ブロス培地"のような複合培地、Ｋｏｒｔｚ等により、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）３９：５９〜６５に記載されているようなグリセロール含有培地、Ｋｕｌｌａ等によりＡｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８３）１３５：１に記載されている最小塩培地、Ｂｅｒｔａｎｉ等により、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９５１、６２：２９３〜３００に記載されているようなＬＢ培地、又はＷｉｌｍｓ等によりＢｉｏｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｎｇ．（２００１）７３：９３〜１０３に記載されているような大腸菌発酵用のバッチ培地を使用できる。

培地は、宿主細胞を所望の細胞密度まで増殖させるために適切な炭素源、例えば、グルコースのような糖を含む。炭素源として、各々の宿主細胞にインデューサーとは異なる第一炭素源が使用され、これは前記宿主細胞にとって第二炭素源である。

培地は、更なる成分、例えば、当業者に一般的に公知のような緩衝剤、塩、ビタミン、アミノ酸、抗生剤又は他の微量栄養素の添加により適切に変更されてもよい。同様に、種々の培地又は培地の組み合わせを細胞の培養の間に使用できる。

本発明の１実施態様では、カザミノ酸が培養培地に添加される。培地中のカザミノ酸の存在では、基底レベルの発現の抑制を補助できることが見出された。通常は、カザミノ酸を０．０５％〜０．１％（ｗ／ｖ）の量で添加できる。

異種ポリペプチドを生産するための本発明の方法の１実施態様によれば、そのゲノム内でマンノースオペロンをコード化する遺伝子を含んでいる細菌性宿主細胞を使用できる。すなわち、この細菌性宿主細胞にとってマンノースは第二炭素源であり、かつ、例えば、グルコースは第一炭素源である。本発明の方法の宿主として適切であるために、細菌細胞はＭａｎＲ（マンノースオペロンのプロモーターを制御する転写調節タンパク質）を不活性化できないようにされる。

例えば、ＭａｎＰをコードするヌクレオチド配列ｍａｎＰを欠失することができ、それによりＭａｎＰによるリン酸化によりＭａｎＲの不活性化を阻害する。

ｍａｎＰが欠失した細菌性宿主細胞中に、ターゲットのポリペプチドをコード化する核酸配列に作動的に連結したプロモーターＰｍａｎＲ、又はプロモーターＰｍａｎＰを含んでいるベクターが導入される。

組換え宿主細胞は前記細菌性宿主細胞に適切な培養培地中で増殖し、その際に、培養培地はグルコースを含有することができ及び／又はグルコースは、細菌性宿主細胞が複製できるように、かつベクター中に含有されるマンノースプロモーターのグルコース媒介カーボン・カタボライト・リプレッションによりターゲットのポリペプチドの発現を抑制するために十分な量で培養培地に供給できる。

培地のグルコースレベルがカーボン・カタボライト・リプレッションに必要な値を下回るとすぐに、ベクターのマンノースプロモーターのカーボン・カタボライト・リプレッションは解放され、かつマンノースによる誘導の必要性無しにマンノースプロモーターはポリペプチドの発現を開始する。更に、細菌ゲノム中でＭａｎＰをコード化する核酸配列が欠失されるので、マンノースプロモーターはＭａｎＰによるリン酸化により不活性化できない。従って、本発明の方法は、誘導性炭素源が存在しなくても特定の炭素源誘導性プロモーターの制御下にターゲットのポリペプチドの発現を可能にする。

通常は、誘導フェーズの間に、マンノースオペロングルコースのプロモーターを含んでいるベクターで形質転換した細菌性宿主細胞を使用する発酵プロセスにおいて、マンノースオペロンのプロモーターの第一炭素源は、μ≦０．２ｈ^-1の特定の増殖率を生じる量で発酵培地に供給できる。更に、指数関数的供給が有利である。

原則として、プロモーターの誘導に誘導性炭素源を全く必要としない本発明の１番目の選択肢に関する上記の説明は、本発明の２番目の選択肢においても適用可能であり、それにより誘導に必要な炭素源の量は減少する。

本発明は、ターゲットのポリペプチドをコード化する異種核酸配列の発現をコントロールするプロモーターが厳密な制御を可能にする点において有利である。誘導性炭素源の添加又は存在は必要ではない。

本発明の１番目の選択肢によれば、プロモーターは誘導性炭素源が無くても、すなわちインデューサーの不在でも活性な状態である。

枯草菌のマンノースオペロンのマンノースプロモーターＰｍａｎＰは、強いプロモーターであることが判明した。マンノースオペロンの詳細な論議については、ＳｕｎＴ等、"Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｎｎｏｓｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ" "Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ；１９２，２０１０，２１２８〜２１３９"に挙げられていて、これを参照して本明細書に取り入れることとする。

ＰｍａｎＰによる遺伝子発現の強力な制御特性は、価値のあるポリペプチドを異種生産するためにこのプロモーターを適格なものにする。しかし、本発明により、マンノースオペロンに関わる枯草菌発現系は、永久に高い発現率を得るために大量のマンノースを必要とすることが見出された。インデューサーであるマンノースの迅速な消費の理由は、マンノースが枯草菌にとって好物の炭素源のうちの１つであるということが想定される。しかし、むしろマンノースは高価な糖であり、このような発現系は大規模な工業用途にとって経済的に好ましくない。

このような発現系を工業用途に最適化するために、インデューサーは代謝されるべきではない。本発明によれば、これは宿主細胞の染色体ゲノム内でマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子ｍａｎＡを操作又は有利には分解し、宿主細胞が入ってきたマンノース−６−ホスフェートを、引き続き解糖系に入るフルクトース−６−ホスフェートに変換できないようにすることにより達成される。

このような発現系は、はるかに少ないインデューサーしか必要としないが、それにもかかわらず高い発現率を達成できる。

上記のように、特に有利な発現系は自動的誘導性のものである。すなわち、もはやインデューサーを必要としない発現系である。本発明の有利な実施態様によれば、このような自動的誘導性の発現系は、細菌性宿主細胞のゲノムのマンノースオペロンにおいて、ＭａｎＰによるＭａｎＲのＥＩＩＢとＥＩＩＡ様ドメインのリン酸化を妨げることにより、遺伝子ｍａｎＰが調節タンパク質ＭａｎＲを不活性化できないようにさせることにより得られる。有利には、染色体遺伝子ｍａｎＰは欠失される（ノックアウトミュータント）。

このような発現系では、ＰｍａｎＰプロモーターはグルコースによって遂行されるＣＣＲによってのみ制御的にコントロールされる。グルコースが制限されなくなるまで、レギュレーターＭａｎＲはそのオペレーター系に結合でき、かつ発現を開始する。このような自動的誘導性の発現系は、工業的用途に極めて価値がある。それというのも、実質的に早まった遺伝子発現が行われないからである。

例えば、フェドバッチ発酵では、実質的に不所望の発現がバッチフェーズでは観察されず、かつフェドバッチフェーズの全体を通して高い発現レベルを得るためにインデューサーを添加する必要がない。このような発現系は特に高細胞密度発酵に適切であり、かつ得るべき高い発現率を可能にする。

本発明により提供される新規発現系、特に新規自動誘導系は、産生物収率の改善に著しく寄与し、かつその工業用途と関連するコストを下げる。

以下の実施例に示されているように、本発明は本発明の遺伝子改変した細菌性宿主細胞の培養による異種ポリペプチドの生産を提供し、その際、遺伝子改変した細菌性宿主細胞の増殖の間及び誘導の前に、極めて低いポリペプチドの発現しか生じないか、又は早まったポリペプチドの発現を全く生じない。すなわち、ポリペプチドをコード化する遺伝子の発現をコントロールするプロモーターの漏えい性が実質的に無い。更に、ポリペプチドの生産は、自動誘導の際に高い生産性で直ちに開始され、高い最終的な生産性を伴う。

また、本発明の更なる選択肢の一例も示されていて、その際、マンノース誘導性プロモーター及び異種核酸配列を有するベクターが宿る宿主細胞のゲノムにおいて、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコード化する遺伝子は欠失している。

以下の説明により、下記の実施例を参考にして更に完全に解釈されるであろう。しかし、このような実施例は本発明を実施する方法の例示であり、かつ本発明の範囲を制限するものではない。

Ｉ）マンノースオペロンのｍａｎＲプロモーター及びｍａｎＰプロモーターの単離と同定
特記されない限り、以下の材料と方法を使用した：
細菌株及び増殖条件
大腸菌ＪＭ１０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ Ｃ等、Ｇｅｎｅ３３、１９８５、１０３〜１１９）及び枯草菌３ＮＡ、ｎｏｎ−ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ，ｗｉｔｈ ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｏＯＡ ｇｅｎｅ，（Ｍｉｃｈｅｌ Ｊ．Ｆ．等、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３，１９７０，２２０〜２２７）をクローニング及び発現するために主な宿主として使用した。発酵実験に使用した更なる株は、枯草菌３ＮＡミュータント株ＴＱ２８１（ｓｐｏＯＡ ΔｍａｎＡ：：ｅｒｍｃ）（Ｓｕｎ Ｔ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９２，２０１０，２１２８〜２１３９）及びＴＱ３５６（ｓｐｏＯＡΔｍａｎＰ：：ｅｒｍｃ）（以下ＩＩ参照、実施例４，ｂ）であった。株をＬＢ培地中３７℃で増殖させた（Ｂｅｒｔｏｎｉ Ｇ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６２，１９５１，２９３〜３００）。

選択条件は以下のようであった：１００μｇｍｌ^-1アンピシリン、１００μｇｍｌ^-1スペクチノマイシン、５μｇｍｌ^-1エリスロマイシン。

マンノースプロモーターの誘導のために、無菌濾過するか、又はオートクレーブしたＤ−マンノースを添加して０．２％ｗ／ｖの最終濃度にした。

材料
全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（タウフキルヘン、ドイツ）、Ｆｌｕｋａ社（ブーフス、ドイツ）又はＭａｒｃｋ社（ダルムシュタット、ドイツ）から得られた。合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（エベルスブルク、ドイツ）から購入した。制限酵素及びＤＮＡ変性酵素は、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（マンハイム、ドイツ）又はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．（フランクフルト、ドイツ）から購入した。ＰＣＲは、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．社（ウォルサム、マサチューセッツ、米国）のＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ ＴＭにおいてＦｅｒｍｅｎｔｓ社（ザンクト・レオン＝ロート、ドイツ）の高い正確性のＤＮＡポリメラーゼを用いて進めた。

ＤＮＡの調製及び形質転換
大腸菌及び枯草菌からの又はアガロースゲルからのＤＮＡ単離は、キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）又はロシュ社（マンハイム、ドイツ）のＤＮＡ調製キットを用いて生産者により記載されているように実施した。標準の分子技術は実施例の全体を通して使用された。

大腸菌は、Ｃｈｕｎｇ Ｃ．Ｔ．等により、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１９８９，２１７２〜２１７５に記載されているようにプラスミドＤＮＡで形質転換した。枯草菌は、改変された"Ｐａｒｉｓ ｍｅｔｈｏｄ"（Ｈａｒｗｏｏｄ Ｃ．Ｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，１９９０，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ.；英国）によるプラスミドＤＮＡで形質転換した。

β−ガラクトシラーゼ活性の測定
試験すべき細胞０．１ｍｌをＺ−バッファー９００μｌ及びトルエン１０μｌで３７℃で３０分間処理した。β−ガラクトシダーゼ活性は、２２℃でｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシドを用いてＭｉｌｌｅｒ法により決定した（Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ． Ｈ．，１９７２， ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。

使用したオリゴヌクレオチド（プライマー）

実験１：
マンノースオペロンのプロモーター領域を有するＤＮＡ断片の単離及びｍａｎＲプロモーターとｍａｎＰプロモーターの転写開始部位の決定。

枯草菌１６８の染色体ＤＮＡは、キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用することにより単離した。

完全なｍａｎＲ遺伝子及びｍａｎＲプロモーターならびにｍａｎＲとｍａｎＰの間の遺伝子間領域、ｍａｎＰプロモーターを有する約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を、プライマーｓ４６９３／ｓ４６９４を用いてＰＣＲにより得られたＤＮＡから増幅させた。

得られた約２．３ｋｂのＤＮＡ断片は、ｍａｎＲプロモーターとｍａｎＰプロモーターの転写開始部位を決定するためにプライマー伸長実験に使用した。

プライマー伸長にｍＲＮＡを単離するために、大腸菌ベクターｐｌＣ２０ＨＥ（Ａｌｔｅｎｂｕｃｈｅｒ等、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６，４５７〜４６６）と枯草菌ベクターｐＵＢ１１０（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ等、１９８６、プラスミド１５、９３〜１０３）からシャトルベクターを構築した。該ベクターは、レポーター遺伝子としてｌｙｓ遺伝子を含有し、これはスタフィロコッカス・シミュランスからのリゾスタフィンの成熟型をコードする（Ｒｅｃｓａｉ等、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，１１２７〜１１３１）。

この高いコピー数のｐＵＢ１１０誘導体には、２．３ｋｂＤＮＡ断片がリゾスタフィン遺伝子の上流にクローン化された。得られるプラスミドをｐＳＵＮ１７８．４と名付け、かつ枯草菌３ＮＡに導入した。

プラスミドｐＳＵＮ１７８．４と一緒に枯草菌３ＮＡをカナマイシン含有ＬＢ培地中で増殖させた。指数増殖フェーズでは、培地を０．２％ｗ／ｖマンノースで誘導した。３７℃で１時間増殖させた後に、誘導及び非誘導細胞を回収した。全体のＲＮＡをキアゲン−ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔで単離した。

Ｃｙ５を用いて５’末端で標識したプライマーｓ５００６、５００７、ｓ５０９７及びｓ５０９８を使用した。プライマーｓ５００６及びｓ５００７は、リゾスタフィン遺伝子の開始コドンに関して、それぞれ＋２１〜＋５０まで、及び＋７６〜＋１０５までをハイブリダイズした。プライマーｓ５０９７とｓ５０９８は、ｍａｎＲの開始コドンに関してそれぞれ＋８１〜＋１０１まで、及び＋１３１〜＋１５３までをハイブリダイズした。

同じプライマーは、ｐＳＵＮ１７８．４のプラスミドＤＮＡのシーケンシング反応に使用し、これはサイズ基準として役立った。ＡＭＶ−リバーストランスクリプターゼ及びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ社製）をそれぞれ、逆転写及びＤＮＡシーケンシングに使用した。逆転写及びシーケンシングの産生物は変性ポリアクリルアミドシーケンシングゲルにおいて分析した（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。使用したその他の全ての薬剤は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡｕｔｏＲｅａｄシーケンシングキットにより提供された。

ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位は、プライマーｓ５００６の使用により決定した。同じプライマーを用いたプラスミドｐＳＵＮ１７８．４のＤＮＡ配列反応を用意し、かつ比較のために同じ変性ゲルにおいて行った。

図５は、ｍａｎＰプロモーターの周囲のＤＮＡ配列を示していて、Ａ（アデニンヌクレオチド）での転写部位が強調されている。推定の−１０と−３５ボックスはイタリックで記載されている。ｍａｎＲ遺伝子の末端は矢印でマークしてあり、Ｂｇ／ＩＩ、ＮｒｕＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、Ａｆ／ＩＩには下線が引いてある。ＩＲＩ−Ｐは、不完全な反転繰り返し配列、推定のＭａｎＲ結合部位を示している。

ｍａｎＲプロモーターの転写開始部位をＲＮＡ単離で決定し、かつＤＮＡシーケンシングは上記のようにｍａｎＰプロモーターに関して実施したが、ｍａｎＲ遺伝子中に結合するプライマーｓ５０９８を使用した点が異なる。

図４には、ｍａｎＲプロモーター領域のＤＮＡ配列が示されていて、Ｇ（グアニジンヌクレオチド）での転写開始部位が強調されている。推定の−１０及び−３５ボックスはイタリックで記載し、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）には下線が引いてあり、かつｍａｎＲ遺伝子の開始はそれぞれ矢印で示されている。制限部位及び推定のｃｒｅ配列には下線が引いてある。ＩＲＩ−ＩＲは、不完全な反転した繰返し配列、推定のＭａｎＲ結合部位を示している。

ｍａｎＲプロモーターからの、特にｍａｎＰプロモーターからの転写は、細胞がマンノースにより誘導される場合に著しく増大し、これはプライマー伸長実験において更に強いシグナルにより見られた。

上記の第１表には使用したプライマーが使用されている。

実験２
例１によるプライマー伸長実験では、ｍａｎＰプロモーターの転写開始部位は、ｍａｎＲとｍａｎＰの開始の間のイタリック体領域の３’−末端の近くに位置した。ｍａｎＰプロモーター領域、２．３ｋｂのＤＮＡ断片をより詳細に決定するために、ＰＣＲ増幅により徐々に短くし、得られた種々の長さの配列断片は、同じ基本的発現ベクターに戻ってクローン化し、かつ発現を調べた。
ａ）基本的発現ベクターの構築
レポーター遺伝子としてプロモーターの無いｌａｃＺを有する発現ベクターを構築した。枯草菌と大腸菌の両方で複製できるシャトルベクターとして発現ベクターを設計し、かつｐＳＵＮ２７２．１と名付けた。

レポーター遺伝子ｌａｃＺを、ｐＬＡ２社（ＨａｌｄｉｍａｎｎＡ等、２００１、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３，６３８４〜６４９３）のＮｄｅＩとＸｍａＩで切断し、かつｐＪＯＥ５５３．１．１、すなわちラムノース誘導性発現ベクターｐＷＡ２１の誘導体であり、ＸｍａＩ側で枯草菌ｔｕｆＡ転写ターミネーターを含んでいるものにライゲーションした（Ｗｅｇｅｒｅｒ等、２００８、ＢＭＣ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８．２）。このプラスミドにＡｆＩＩＩ／ＭｕｎＩ制限部位の間にオリゴヌクレオチド対ｓ４９５６／４９５７を挿入し、ｌａｃＺの上流に同じｔｕｆＡ転写ターミネーターを加えた。従って、プラスミドプロモーターからｌａｃＺへの"読み過ごし"ならびにｌａｃＺの外からフランキングプラスミド配列への"読み過ごし"は、ターミネーターにより避けられた。大腸菌及び枯草菌両方のスペクチノマイシン耐性遺伝子ｓｐｃは、オリゴヌクレオチドｓ４８３３／４８３５と一緒にプラスミドｐＤＧ１７３０（Ｇｅｕｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ等、１９９６、Ｇｅｎｅ１８０，５７〜６１）から増幅し、かつ得られた上記のプラスミドに挿入した。更に、ＢｓｐＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を欠失することにより大腸菌ベクター部分を短くした。引き続き、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ断片と枯草菌ｐＭＴＬＢＳ７２（Ｌａｇｏｄｉｃｈ等、２００５、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ）３９，３４５〜３４８）の複製領域をプラスミドにライゲーションした。

Ａｆ／ＩＩとＮｈｅＩでの消化及びライゲーションにより、実験１で得られた２．３ｋｂのＤＮＡ断片をｌａｃＺの前でｓＰＵＮ２７２．１に挿入し、それにより図７に示されているようなプラスミドマップを有する発現ベクターｐＳＵＮ２７９．２が得られた。上記第１表に示されているようなプラスミドを使用した。

ｂ）ベクターｐＳＵＮ２７９．２の発現効率の決定
上記ａ）で得られたプラスミドｐＳＵＮ２７９．２とｐＳＵＮ２７２．１を枯草菌３ＮＡに挿入した。後者のプラスミドはバックグランドコントロールとして役立った。一方のプラスミド又はもう一方のプラスミドを有する枯草菌３ＮＡ株をスペクチノマイシン含有ＬＢ培地中で増殖させ、かつ指数増殖フェーズでは、０．２％マンノース又は０．２％マンノース＋０．２％グルコース、又は無糖（非誘導型コントロール）のいずれかを誘導のための培地に添加した。１時間後に、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性の誘導をミラーアッセイにより決定した。結果は図８に記載されている。

ｐＳＵＮ２７９．２を含有する枯草菌の非誘導型培地は、既に極めて高い基底レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。マンノースの存在では更に４倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の増大を生じたのに対して、マンノースとグルコースでの活性は減少したが、しかしなお基底レベルよりも極めて高かった。この結果は、ｐＳＵＮ２７９．２で見られたプロモーター活性が、ｍａｎＲとｍａｎＰの間の領域から、ｍａｎＲの上流の領域から、又は両方から生じえたことを明らかに示している。

従って、ｍａｎＲの上流領域ならびにｍａｎＲの殆どの部分は、図７に示されているようなｐＳＵＮ２７９．２の２．３ｋｂＤＮＡ断片をＳｆｏＩとＮｒｕＩの間で切断することにより両方ともｐＳＵＮ２７９．２から欠失させ、プラスミドｐＳＵＮ２８４．１を生じた。

枯草菌３ＮＡを、このプラスミドｐＳＵＮ２８４．１で形質転換し、かつ上記のような発現効率を決定した。結果は図８に示されている。図８から分かるように、枯草菌におけるこのｍａｎＲが欠失したベクターｐＳＵＮ２８４．１は、枯草菌３ＡにおけるｐＳＵＮ２７９．２と比べて約半分のβ−ガラクトシダーゼ活性の基底レベルしか示さず、マンノース誘導によってむしろ強い増大を示すが、グルコースの存在で再びより強く減少する。これらの結果は、ｍａｎＰプロモーターはｍａｎＲとｍａｎＰの間に位置し、かつｍａｎＲの染色体コピー数が低いコピー数のプラスミドにおいて全てのｍａｎＰプロモーターのコピー数を調節するために十分であることを示している。
ｃ）ｍａｎＰプロモーター領域の位置決め
ｐＳＵＮ２８４．１の短くしたＤＮＡ断片に加えて、ｍａｎＰのプロモーター領域を位置決めするために、ＰＣＲによりｍａｎＰプロモーターの転写開始部位の上流にある種々の箇所で短くしたＤＮＡ断片を増幅し、かつこの断片を図５に示されているようなｐＳＵＮ２７２．１に挿入することにより、更に短くした配列断片を２．３ｋｂのＤＮＡ断片から調製した。

ｍａｎＰの転写開始部位の−８１塩基対下流までと−８０上流までの欠失は、配列番号１を含む第二の欠失配列を生じる。

更なる欠失は、ｍａｎＰの転写開始部位の−４１塩基対下流までと−４０塩基対上流までで実施した（第三の欠失配列）。

第二の欠失配列を有するプラスミド、ｐＳＵＮ２９０、及び第三の欠失配列、ｐＳＵＮ２９７．５は、上記２ｂ）のプラスミドｐＳＵＮ２８４．１と同様の方法で構築した。これは、プライマーｓ４８０２／ｓ５２０３及びｓ５２６２／ｓ５２０３と一緒に増幅させたＰＣＲ産物を、それぞれｐＳＵＮ２７２．１中に制限酵素ＥｃｏＲＶとＮｈｅＩにより挿入することにより行った。

プラスミドを枯草菌３ＮＡに挿入し、かつ上記ｂ）で記載したように培養した。１時間誘導した後に、上記ｂ）で記載したように細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。結果は図９に示されている。

図９に示されているようにｐＳＵＮ２９０とｐＳＵＮ２８４．１を有する株はいずれも、マンノースによるｌａｃＺの誘導に関して著しい違いがないことを示している。しかし、ｐＳＵＮ２９７．５を含んでいる枯草菌３ＮＡでは、マンノースによる誘導が完全に消滅していて、かつ基底発現レベルは殆ど０であった。これらの結果から、ｍａｎＰマンノースプロモーター領域のＭａｎＲ結合部位がｍａｎＰの転写開始部位に対して−８０塩基対と−３５塩基対の間に位置していることが分かる。

実験３：ｍａｎＲプロモーターの決定
ａ）ｃｒｅ配列の同定
フィルミクテスにおける殆どのＣＣＲは、カタボライト制御タンパク質Ａ（ＣｃｐＡ）により媒介されるので、各々の結合部位（ｃｒｅ配列）の調査は、全体のマンノースオペロンでクローンマネージャープログラムにおいてＤＮＡアライメント機能を用いて実施された。アライメントにはｃｒｅコンセンサス配列５’−ＷＷＴＧＮＡＡＲＣＧＮＷＷＷＣＡＷＷ−３’を使用した。ｍａｎＲのプロモーター領域では、図４に示されているように、１つだけの推定のｃｒｅ配列が見出され、これは−１０ボックスの下流に位置している。
ｂ）ｍａｎＲプロモーターの発現効率の評価
ｍａｎＲプロモーターの発現効率を評価するために、上記のようにｐＳＵＮ２８４．１のような発現ベクターを構築し、かつそれをｐＳＵＮ２９１と名付けた。このために、推定のｍａｎＲ−プロモーターとｍａｎＲの約６００塩基対上流を含むＤＮＡ断片を、プライマーｓ５２０８／ｓ５２０９と、直線化したプラスミドＤＮＡｐＳＵＮ２７９．２を鋳型として用いて増幅させ、かつＫｐｎＩとＡｆ／ＩＩＩで消化し、かつライゲーションすることによりプラスミドｐＳＵＮ２７２．１中のｌａｃＺの前に挿入した。ＤＮＡ配列は図４に示されている。

プラスミドｐＳＵＮ２９１を枯草菌３ＮＡに導入し、かつ実験２ｂ）で記載したようにβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。

結果は図１０に示されている。ここでは底発現は既に比較的高く、かつ０．２％マンノースの添加により３倍だけ更に増大した。グルコースの添加は、基底発現レベルに近いβ−ガラクトシダーゼ活性の抑制を導いた。

この結果は、ｍａｎＲプロモーターが弱い構成的プロモーターであるだけではなく、マンノースとＣＣＲ制御に課されていることを示した。
ｃ）ｍａｎＲプロモーター領域の位置決め
実験２ｃ）のように、ｍａｎＲのプロモーター領域の更なる位置決めのために、ｐＳＵＮ２９１に含まれているようなＤＮＡ配列から種々の長さのＤＮＡ断片を、ｍａｎＲプロモーターの転写開始部位の上流の種々の位置で結合するプライマー（プライマーｓ５９３２及びｓ５９３３）及びｌａｃＺ遺伝子の下流で結合するプライマー（ｓ５９３４）を用いてＤＮＡをＰＣＲ増幅することにより調製した（図４）。

第一の欠失配列は、図４に示されている配列を転写開始部位Ｇの−８２塩基対下流まで、及び−８１塩基対上流まで短くすることにより得られ、かつ第二の欠失は、転写開始部位Ｇの−６２塩基対下流まで及び−６１塩基対上流まで短くすることにより得られた。

実験２ｃ）と同様に、ＰＣＲ断片をｅｎｄｏＲ ＳａｃＩとＮｈｅＩで消化し、かつ同じ制限酵素で消化したｐＳＵＮ２７９．２ＤＮＡにライゲーションし、かつ得られたプラスミドをそれぞれｐＳＵＮ３８５．２及びｐＳＵＮ３８６．９と名付けた。

各プラスミドを枯草菌３ＮＡに挿入し、かつ実験２ｂに記載されているように培養した。１時間の誘導の後、細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を実験２ｂに記載されているように決定した。結果は図１０に示されている。ｐＳＵＮ２９１と比べて、ｐＳＵＮ３８５．２を有する枯草菌３ＮＡのマンノースによるｌａｃＺの誘導に関して著しい違いは無い。しかし、第二の欠失配列を有する枯草菌ｐＳＵＮ３８６．９において、マンノースによる誘導を完全に廃止すると基底発現レベルは殆ど０であった。この結果から、ｍａｎＲプロモーター領域のＭａｎＲ結合部位が、ｍａｎＲの転写開始部位に関して、−８１塩基対と−３５塩基対の間に位置していることが分かった。ＭａｎＲの結合部位は、従来のアクチベーターでみられるように−３５配列が重複するかもしれない。それというのも、提唱した結合部位で見られた反転した繰返し配列が提唱した−３５配列に伸びるからである。

ＩＩ）マンノースオペロンの遺伝子改変された遺伝子領域を有する組換え宿主細胞の構築
実験４：形質転換
ａ）発現ベクターとしてのプラスミドＰＭＷ１６８．１の構築
図５に示されているような及び実験２ｃで使用されたプラスミドｐＳＵＮ２８４．１中に導入されたｍａｎＰプロモーター領域の核酸配列を使用し、プラスミドｐＭＷ１６８．１を以下に記載するように構築し、かつ宿主としての枯草菌３ＮＡに導入した。

大腸菌と枯草菌の両方で複製可能なシャトルベクターを実験２ａで記載されているように設計したが、ｌａｃＺの代わりにｅＧＦＰをレポーター遺伝子として使用したことが異なる。またｍａｎＰの転写開始領域を遺伝子ｇｓｉＢのものと置き換えた（Ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｊｕｅｒｇｅｎ等、ｓｕｐｒａ）。これにより、ｅＧＦＰの開始コドンならびに開始コドンに続く６個のコドンが置き換えられる。

得られたプロモーター及び転写開始領域の図式構造は以下の通りである：

遺伝子の配列（矢印）及び関連する制限部位を有する領域（ボックス）が示されている。

使用したｇｓｉＢの転写開始領域の配列は以下のものであった：

一般に、図１５のフローチャートに示されているようなプラスミドｐＭＷ１６８．１が得られた。

フローチャートでは、使用したベクターＤＮＡ、インサート−ＤＮＡ及び相補的オリゴヌクレオチドは、ボックス内に示されているようなものであり、ＰＣＲ産物に関して、プライマー及び鋳型ＤＮＡは枠の中にあり、使用した制限酵素は各々の部位で示されている。

クローニング工程は大腸菌ＪＭ１０９を用いて実施した。使用したプラスミドはｐＵＣ１８（これはａｍｐ−耐性を有するＰＣＲ産物用のクローニングベクターである）（Ｙａｎｏｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、ｓｕｐｒａ）；ｐＷＡ２１（これはａｍｐ−耐性を有する大腸菌の発現ベクターとクローニングベクターである）（Ｗｅｇｅｒｅｒ等、２００８、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８．２）；ｐＳＵＮ２０２．４ａ（これはｍａｎＰプロモーター領域及びａｍｐ耐性及びｋａｎ耐性を有するｐＵＢ１１０誘導体であり、大腸菌及び枯草菌のシャトルベクターである）；及びｐＳＵＮ２６６．１（ｔｅｒ−配列の間に挿入部位を有し、かつｓｐｃとａｍｐ耐性を有するｐＵＣ１８誘導体）であった。

プラスミドｐＳＵＮ２６６．１は、ラムノース誘導性発現ベクターｐＷＡ２１の誘導体であり、その際ラムノースプロモーターとｅＧＦＰ遺伝子は、直線方向で枯草菌のｔｕｆＡ遺伝子の２個の転写ターミネーターを含んでいる配列により置き換えられていて、かつＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ及びＡｆ／ＩＩの制限部位（以下の配列参照）ならびにスペクチノマイシン耐性遺伝子により分離されている。この耐性遺伝子は、プラスミドｐＤＧ１７３０（Ｃｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ等１９９６）とプライマーｓ４８３３とｓ４８３５（第１表）から増幅した。最終的な構築物ｐＭＷ１６８では、マンノースプロモーターとｅＧＦＰ遺伝子を２個のｔｕｆＡ転写ターミネーター配列の間に挿入した。

２個のｔｕｆＡターミネーター配列のヌクレオチド配列（太字のイタリック体）ならびに配列の間及び配列の末端の制限部位（下線）が示されている。

開始コドン及び開始コドンに続くコドンを含む転写開始領域の置き換えは、相補的オリゴヌクレオチドを用いて、及び１つの制限部位Ｂｇ／ＩＩ、Ａｆ／ＩＩ及びＢａｍＨＩにより実施した。ベクターの構築は、それぞれ相補的オリゴヌクレオチドｓ５０１９とｓ５０２０による枯草菌からのｔｕｆＡの転写開始領域によるベクターｐＷＡ２１のＴ７遺伝子１０の転写開始領域の置き換えで開始した（Ｗｅｇｅｒｅｒ等、ｓｕｐｒａ）。更なるクローニング工程では、この転写開始領域をｇｓｉＢにより置き換えた（オリゴヌクレオチドｓ５２３６／ｓ５２３７）。最終的なプラスミドｐＭＷ１６８．１は、ｐＵＢ１１０からのｏｒｉ＋を含むｒｅｐ遺伝子を有していた。

ｐＭＷ１６８．１のプラスミドマップは図１１に示されている。

ｂ）ｍａｎＰ（ΔｍａｎＰ）とｍａｎＡ（ΔｍａｎＡ）が欠損している欠失ミュータント株
ｂ１）ｍａｎＰを欠失するための挿入ベクター
挿入ベクターｐＳＵＮ３５６．７を使用して、胞子形成欠損枯草菌ＮＡの染色体においてマンノースオペロンからのマンノースに特異的なＥＩＩをコード化する遺伝子ｍａｎＰを欠失し、かつ得られた株を枯草菌ＴＱ３５６と名付けた（ｓｐｏ０Ａ ｍａｎＰ：：ｅｒｍＣ）。選択マーカーとしてエリスロマイシン耐性カセットを使用した。

ベクターｐＳＵＮ３５６．７は、ｐＵＳ１８誘導体（アンピシリン耐性）であり、かつｍａｎＲとｍａｎＡの配列によりフランクされているエリスロマイシン耐性遺伝子ならびに置換カセットの外側には、スペクチノマイシン耐性遺伝子を含んでいる。スペクチノマイシン耐性遺伝子をｐＤＧ１７３０から増幅した（上記のｐＳＵＮ２６６．１参照）。エリスロマイシン耐性遺伝子をプライマーｓ５０６９とｓ５０７０によりプラスミドｐＤＧ１７３０から増幅した。ｍａｎＲ遺伝子のＣ末端は、プライマーｓ５４０７とｓ５４０８により枯草菌ＤＮＡから増幅し、かつエリスロマイシン遺伝子の一方の末端に挿入した。ｍａｎＡのＮ−末端は、プライマーｓ５３６２とｓ５３６３により枯草菌染色体から増幅し、かつエリスロマイシン耐性遺伝子のもう一方の末端に挿入した。プラスミドｐＳＵＮ３５６．７のマップは図１２に示されている。

ｂ２）ｍａｎＡの欠失
更に、胞子形成欠損枯草菌３ＮＡの染色体において、枯草菌ＴＱ２８１（ｓｐｏ０Ａ３、ｍａｎＡ：：ｅｒｍＣ）で生じる挿入ベクターｐＳＵＮ２８１と一緒に、マンノースオペロンからｍａｎＡが欠損した枯草菌ノックアウトミュータントを生産した（ＳｕｎＴ等、ｓｕｐｒａ参照）。

遺伝子ｍａｎＡは、マンノース−６−ホスフェートをフルクトース−６−ホスフェートに変換するマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼをコード化する。

成功した欠失を監視するために、エリスロマイシン耐性カセットを使用した。

ｂ３）形質転換
上記ｂ１）とｂ２）による枯草菌ＴＱ３５６と枯草菌ＴＱ２８１は、それぞれ上記ａ１）で得られたプラスミドｐＭＷ１６８．１で形質転換した。

使用した培地：
ａ）最小グルコース（ＭＧ）：
（ＮＨ₄）ＳＯ₄ ２．０ｇ
ＫＨ₂ＰＯ₄ ６．０ｇ
Ｋ₂ＨＰＯ₄ １４．０ｇ
クエン酸ナトリウム １．０ｇ
ＭｇＳＯ₄＊７Ｈ₂Ｏ ０．２ｇ
グルコース（２０〜５０％ストック溶液として別個に） ５．０ｇ
ｂ）培地Ｉ：
ＭＧ ９．５０ｍｌ
カザミノ酸（１％ストック溶液） ０．２０ｍｌ
ＭｇＳＯ₄（１Ｍストック溶液） ０．０５ｍｌ
ｃ）培地ＩＩ：
ＭＧ ８．００ｍｌ
カザミノ酸（１％ストック溶液） ０．１０ｍｌ
ＭｇＳＯ₄（１Ｍストック溶液） ０．０５ｍｌ
形質転換はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｕｌｏｓ等のプロトコール"Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｍｎｔｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ"Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６１）８１：７４１〜７４６に倣って実施した。各細菌株の単独のコロニーを５ｍｌの培地Ｉに入れて、かつローラー中、３７℃で一晩インキュベートした。オーバーナイト培養した物１ｍｌ（１と２の間のＯＤ₆₀₀）をバッフル付き三角フラスコ１００ｍｌ中の培地ＩＩ８ｍｌに移し、かつ３７℃で８５分間インキュベートした。次に、コンピテント細胞１ｍｌをシュッテ社（Ｓｃｈｕｅｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）の試験管に移し、かつ各々の挿入ベクターと混合した。コンピテント細胞と混合する前に、挿入ベクターを重要では無い部位でシングルカッターで切断しておいた。得られた混合物をイソプロパノールにより沈殿させ、かつ室温で少なくとも２時間ライゲーションした。

次に、得られた形質転換細胞を３７℃にてローラー中で３０分間インキュベートし、４５００ｒｐｍで室温にて５分間遠心分離した。ペレットを残った液体中で再懸濁させ、かつプレート塗布した。

実験５：発酵
５．１ 材料と方法
特記されない限り一般に発酵実験にも標準の分子技術が使用された。
発酵に使用した培地の組成物
オーバーナイト培養と予備培養＃１は、０．０２％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ^TM、Ｓｐａｒｋｓ、米国、メリーランド）ならびにプラスミド選択のための１００μｇｍＬ^-1スペクチノマイシン及び株選択のための５μｇｍＬ^-1エリスロマイシン（ＴＱ２８１とＴＱ３５６の場合）を補充したＳｐｉｚｉｚｅｎの最小塩培地（ＳＭＭ）（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．４４，１９５８，１０７２〜１０７８）中で実施した。予備培養＃２と発酵培地（バッチ）を、次のものから成るＷｉｌｍｓ等（ＷｉｌｍｓＢ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ７３，２００１，９５〜１０３）により変性した無機培地を用いて実施した：１．０ｇＬ^-1（ＮＨ₄）₂−Ｈ−クエン酸塩、２．０ｇＬ^-1ｇＮａ₂ＳＯ₄、２．６８ｇＬ^-1Ｎａ₄ＳＯ₄、０．５ｇＬ^-1ＮＨ₄Ｃｌ、１４．６ｇＬ^-1Ｋ₂ＨＰＯ₄、４．０ｇＬ^-1Ｎａ₂ＨＰＯ₄×２Ｈ₂Ｏ、１．０ｇＬ^-1ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ、３ｍｌＬ^-1微量元素溶液（ＴＥＳ）、予備培養＃２のための５ｇＬ^-1グルコース及びバッチ培地用の２５ｇＬ^-1グルコース。ＴＥＳは０．５ｇＬ^-1ＣａＣｌ₂、０．１８ｇＬ^-1ＺｎＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ、０．１ｇＬ^-1ＭｇＳＯ₄×Ｈ₂Ｏ、１０．０５ｇＬ^-1Ｎａ₂−ＥＤＴＡ、８．３５ｇＬ^-1ＦｅＣｌ₃、０．１６ｇＬ^-1ＣｕＳＯ₄×５Ｈ₂Ｏ、及び０．１８ｇＬ^-1ＣｏＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏを含有している。高細胞密度発酵のための供給培地は、ＫＬＦ反応器を使用した場合には２００ｇＬ^-1グルコース、７．８９ｇＬ^-1ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ、ＴＥＳ４０ｍＬ^-1及び６３．３６ｇＬ^-1（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄を含有していた。ｐＨを３．３に調節し、全ての成分の溶解性を確実にした。３０リットルの反応器を使用した場合には２つの別々の供給培地を使用した。１番目の培地は、６５４．７６ｇＬ^-1グルコース×Ｈ₂Ｏ、２３．５ｇＬ^-1ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ、ＴＥＳ１２０ｍＬ^-1を含有し、２番目の培地は３９６ｇＬ^-1（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄を含有していた。ｍａｎＰプロモーターを誘導するために、２０％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンノース溶液、又は次のもの：２００ｍＬ^-1マンノース、７．８９ｇＬ^-1ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ、ＴＥＳ４０ｍＬ^-1及び６３．３６ｇＬ^-1（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄を含有している別々の供給溶液を使用した。

予備培養及びフェドバッチ培養の条件
ＬＢアガールプレートからの単独のコロニーをＳＭＭ５ｍｌ中で接種し、かつ３７℃で少なくとも１４時間一晩インキュベートした。ＳＭＭ２５ｍｌを２５０ｍｌ振盪フラスコに移し、オーバーナイト培養を接種し、６００ｎｍ（ＯＤ₆₀₀）で０．０５の光学密度を達成した（予備培養＃１）。３７℃で５時間インキュベートした後に、２０ｍｌの予備培養＃１を使用して、予備培養＃２の２００ｍｌを１０００ｍｌ振盪フラスコ中の培地に接種した（予備培養＃２）。更に３７℃で７時間インキュベートした後に、バッチ培養培地を予備培養＃２で接種した。

主要炭素源としてのグルコースで予め発育させ、かつ大腸菌に最適化したフェドバッチ発酵のセットアップを使用した（Ｋｏｒｚ Ｄ．Ｊ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９，１９９５，５９〜６５；Ｗｉｌｍｓ ｓｕｐｒａ）。３．７リットルの小さな実験用発酵装置ＫＬＦ（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＡＧ、バルド、スイス）を使用した場合には、バッチ容量は１．５リットルであり、供給容量は１．０リットルであった。３０リットルの実験室用発酵器Ｄ５９８（ＬＦ；Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＡＧ、バルド、スイス）の場合には、バッチ容量は８．０リットルであり、グルコース供給培地は４．２リットル、及びアンモニア供給培地は１．０リットルであった。グルコースとアンモニア培地は反応器に８１％：１９％の比で供給した。供給培地を次の等式１：
Ｆ（ｔ）＝［（μ_set／Ｙ_ｘ/s）＋ｍ］×［（Ｃ_x0／Ｖ₀）／Ｃ_s0］×ｅｘｐ（μ_set×ｔ）
［式中、
Ｆ（Ｌｈ^-1）は、供給速度であり、
μ_set（ｈ^-1）は所望の特定の増殖速度であり、
ｍ（ｇｇ^-1ｈ^-1）は、特定の維持係数（＝０．０４ｇｇ^-1ｈ^-1）であり、
Ｙ_ｘ/sは特定のバイオマス／基質収率係数（グルコースには約０．５）であり、
Ｃ_x0（ｇＬ^-1）は、供給開始時のバイオマス濃度であり、
Ｖ₀（Ｌ）は、供給開始時の反応器の体積であり、
Ｃ_s0（ｇＬ^-1）は、供給溶液中へのグルコースの濃度であり、かつ
ｔ（ｈ）は供給開始後の時間である］
によりバイオリアクターに供給した。０．１ｈ^-1の特定の供給速度μは、非特異的でかつ不所望の副生成物の生産を回避するように、かつ酸素制限を回避するように選択された。

フェドバッチフェーズの開始と共に温度が３０℃にシフトするまでバッチを３７℃で実施し、発現した異種タンパク質の封入体形成の包含を回避した。ｐＨは２４％（ｖ／ｖ）ＮＨ₄ＯＨと２０％（ｖ／ｖ）Ｈ₃ＰＯ₄でそれぞれ７．０に調節した。自動的に撹拌速度を調節することによりｐＯ₂の値は５０％飽和を超えるように維持した。ＫＬＦを使用する場合には通気速度は２Ｌ／分で一定に保持し、ＬＦを使用する場合には１５〜２５Ｌ／分の間に保持した。過圧は、０．５バールで保持した。定期的にＵｌｔｒａｓｐｅｃ^TM１１００ ｐｒｏＵＶ／可視分光光度計（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いてＯＤ₆₀₀の測定により細胞密度を決定した。細胞の乾燥質量（ｃｄｗ）はＯＤ₆₀₀の値と０．３２２ｇ_cdwＬ^-1の係数を掛けることにより計算し、これは発酵の間にＭＢ８３５ハロゲンを用いる数回の湿分測定後に平均値として得られた（Ｏｈａｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ，米国、ニュージャージー）。発酵パラメーターの制御にＢｉｏｌｏｇ１．７ソフトウェアパッケージ（ドイツ、シュトゥットガルト大学、生物化学工学科［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｖｔ．ｕｎｉ−ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．ｄｅ］）を使用した。フェドバッチ発酵はプロセス時間の約４０時間後に終了した。

オンライン及びオフライン蛍光測定
生産した組換えｅＧＦＰの発現率をリアルタイムで追跡するために、蛍光プローブ（Ｍｉｋｒｏｐａｃｋ ＨＰＸ−２０００，Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｘｅｎｏｎ Ｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ； Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；Ｓ２０００ ｆｉｂｒｅ ｏｐｔｉｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ；米国、ダニーディン、フロリダ）をバイオリアクター内で使用した。励起波長は４８５ｎｍであったのに対して、発光は５３５ｎｍで検出され、かつＳｐｅｃｔｒａ Ｓｕｉｔｅソフトウェアパッケージ（Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ、米国、ダニーディン、フロリダ）によりオンラインで記録された。蛍光灯は光学フィルターを通して０．６の強さで繋いだ。プローブの積分時間は５０ミリ秒であった。ソフトウェアは４０００カウントまでの値しか数えることができなかったので、より高い値に達する直前に積分時間を徐々に減らした。従って、後から蛍光カントを相応の減少係数と掛けて、５０ｍ秒に相応する値を得た。測定値は、特定の反応器の体積に特異的であった。

更に、蛍光活性のオフライン測定は、ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（テカン社、スイス、マンネドルフ）の使用により行った。そのために、３×２５０μｌのバッチ培地を空試験値として使用して（励起フィルター：４８５ｎｍ；エミッションフィルター：５３５ｎｍ；獲得（マニュアル）：６０；積分時間：２０μ秒；フラッシュの回数：３回；点検モード：トップ）、未希釈の細胞培養培地３×２５０μｌを９６ウェル−マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−Ｂｉｏ Ｏｎｅ ＧｍｂＨ、ドイツ、フリッケンハウゼン）中で測定した。空試験値の平均をサンプルの平均から差し引いて、最終値を得た。細胞培養培地は２００００カウントに到達し次第バッチ培地中で希釈された。

内部精製したｅＧＦＰ標準（約９５％の純度、１．３ｇＬ^-1）に対するキャリブレーションから、約１２００００のオフライン測定カウントが１ｇ_eGFPＬ^-1に相当することが伝達された。オフラインとオンラインの測定値の間に線状の整合性が存在し、７４７０オンライン測定カウント当たり、１．５ｇ_eGFPＬ^-1の相関を生じることを示すことができた。

プラスミド安定性の決定
ベクターｐＭＷ１６８．１の安定性は、ハーウッドとカッティング（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ）による、プラスミド含有細胞のフラクションを測定することにより決定した（ＨａｒｗｏｏｄＣ．Ｒ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，１９９０，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，英国、チチェスター）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分析
粗細胞抽出物は、以下のように得られた：１０¹⁰細胞を回収し、かつ遠心分離した。ペレット化した細胞を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌで再懸濁し、かつ超音波を用いて可溶化した（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ｍｏｄｅｌ Ｗ−３８５ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、米国、ニューヨーク；３×３０秒、５０％デューティサイクル）。

可溶性タンパク質のフラクションは、遠心分離後に上澄み液から得られ、不溶性フラクションは５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌでペレットを再懸濁することにより得られた。タンパク質フラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（Ｌａｅｍｍｉ、Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ ２２７，１９７０，６８０〜６８５；ＬｅＢｌａｎｃ Ｄ．Ｊ．等、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ３５，１９９１，１８０４〜１８１０）。

５．２ 枯草菌３ＮＡ／ｐＭＷ１６８．１を用いる高細胞密度発酵
枯草菌３ＮＡ／ｐＭＷ１６８．１を用いるマンノース発現系をフェドバッチ発酵で試験した。１つのセットアップを予め記載したように使用した（Ｋｏｒｚ等、Ｗｉｌｍｓ等、ｓｕｐｒａ）。

ＬＦ撹拌反応器中で実施された初めの発酵では、フェドバッチフェーズが開始すると同時に０．２％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンノースの割増し分を培養液に添加した。それまでに著しい蛍光を示さなかったプローブの蛍光シグナルは、誘導直後に極めて早く増大した。フェドバッチフェーズで４時間後に約２２００カウントでピーク値に達した後に、シグナルは再び安定して下がり始めた。この減少は、インデューサーの消費を伴った（ＨＰＬＣにより測定、データは表示されていない）。プロセスの終わりには、１ｇ_cdw当たり、０．２ｇ_eGFPＬ^-1又は３ｍｇ_eGFPが生産された。

２番目の発酵では、更に指数関数的Ｄ−マンノースの供給が使用された。これはグルコース供給と同時に開始し、両方の供給物の全体の糖濃度を１番目の発酵と同じくらい高く維持していた。蛍光シグナルは、インデューサーを添加した直後に開始し、かつプロセスの終わりまで伸びた。５０ｇＤ−マンノースの全大量を反応器の発酵液に添加し、この増大を保持した。この誘導レジームで１ｇ_cdw当たり、２．１ｇ_eGFPＬ^-1又は５３ｍｇ_eGFPが生産された。枯草菌３ＮＡ／ｐＭＷ１６８．１で実施された２つの発酵の詳細な結果は、５．５の結果に示されている表にまとめられている。

ｅＧＦＰの生産は、全体の供給フェーズにわたり増大したが、バイオマス生産よりもゆっくりであった。プラスミドの安定性のチェックにより、両方の発酵プロセスの終わりに細胞の約９５％がなおベクターを有することが明らかになった。

５．３ ΔｍａｎＡ株ＴＱ２８１を用いる高細胞密度発酵
単独の炭素源としてのマンノースおいて増殖できないｍａｎＡ欠失株ＴＱ２８１（ＳｕｎＴ等、ｓｕｐｒａ）を更なる発酵実験に選択した。ｐＭＷ１６８．１で形質転換した枯草菌ＴＱ２８１は、振盪フラスコ実験において、Ｄ−マンノースに対して感度を示した。

２つのフェドバッチ発酵をＴＱ２８１／ｐＭＷ１６８．１でセットアップした。１番目のフェドバッチ発酵では、誘導は、フェドバッチフェーズの開始時にマンノースを単独で添加して行われた。２番目のフェドバッチ発酵では、更に指数関数的マンノースの供給を同時に開始した。Ｄ−マンノースでの誘導は、フェドバッチフェーズでの特定の増殖率に著しいインパクトを示さなかった。単独の添加の攻略では、１ｇ_cdw当たり、３６ｍｇ_eGFPに相当する０．７１ｇ_eGFPＬ^-1を達成でき、指数関数的供給の攻略では、１ｇ_cdw当たり、３２ｍｇ_eGFPに相当する１．９ｇ_eGFPＬ^-1であった。２つの発酵の詳細な結果は、５．５の結果の表に挙げられている。

５．４ ΔｍａｎＰ株ＴＱ３５６を用いる高細胞密度発酵における自動誘導性発現系の発育と適用
枯草菌ΔｍａｎＰ株ＴＱ３５６は、Ｐ_manPからの非誘導的条件下に構成的な発現を示し、ならびにグルコースが存在した場合にはＣＣＲ効果を示した（Ｓｕｎ Ｒ等、ｓｕｐｒａ）。この株は、ｐＭＷ１６８．１で形質転換されていて、むしろ小さな蛍光コロニーを生じた。選択培地に０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを添加した後に、コロニーの増殖が標準化された。振盪フラスコ実験では、グルコースが消費された場合に高い発現レベルが達成された（データ表示なし）。

次に、ｐＭＷ１６８．１が宿っている枯草菌ＴＱ３５６をフェドバッチ発酵に使用した（図１３）。バッチフェーズでは、枯草菌株３ＮＡ／ｐＭＷ１８６とＴＱ２８１／ｐＭＷ１６８に類似した著しい蛍光は検出されなかった。フェドバッチフェーズの開始と共に、反応器プローブの蛍光シグナルが連続的に増大し始めた。発酵プロセスの終わりまで１４．６％の一定のＹ_p/x値により分かるように、全発酵時間の３６時間後に細胞中の発現レベルが最大に達した。これは一定の特異的な生産率に相応する。１ｇ_cdw当たり１４６ｍｇのｅＧＦＰに相当する約１０ｇ_eGFPＬ^-1がインデューサーを添加せずに生産された。以下に記載した５．５の結果の表に、発酵の結果がまとめられていて、かつ他に実施した発酵と比較されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、全体のタンパク質と比べて、発現したｅＧＦＰのパーセンテージについての情報を得た（図１４）。これからわかるように、全体のタンパク質の少なくとも２０％は、ｅＧＦＰタンパク質である。少量のフラクションだけは不溶性であり、かつ封入体の形で存在していた（図１４、レーン７）。未希釈の培養液の上澄み液もＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し（図１４、レーン８）、かつ分光光度により測定した。測定した全体のｅＧＦＰの約１％は、発酵プロセスの全体にわたり進行中の細胞分解によるものと思われる上澄み液で見られた。プラスミドの安定性と細胞形態を発酵プロセスの全体にわたりチェックした。

５．５ 結果
５．２〜５．４で実施した発酵の結果は以下の表にまとめてある。

種々の誘導レジームに関して実施した発酵と、発現ベクターｐＭＷ１６８．１ｂを用いた使用枯草菌の比較
表中の略語とパラメーターの説明：
ＳＡ：インデューサー（マンノース）の単独の添加；
ＥＦ：インデューサー（マンノース）の指数関数的供給；
Ａｌ：自動的誘導；
ｆｉｎａｌ：発酵プロセスの最後で；
ＬＦ：３０リットルの実験室用発酵装置；
ＫＬＦ：３．７リットルの小さな実験室用発酵装置；
Δｔｆｂ：フェドバッチ時間／期間、
ｆｉｎａｌ：発酵の最後で；
Ｃ_x、final：細胞乾燥質量（濃度）；
Ｘ_final：完全な細胞乾燥質量；
ｃＰ、_final：産生物の濃度；
Ｐ_eGFP、final：完全な産生物（ｅＧＦＰ）；
ＹＰ／Ｘ：細胞乾燥質量１ｇ当たりの産生物：
ｒＰ：特定の生産率；
ｑＰ：体積の生産率。

これらの結果から分かるように、バッチフェーズの間には、リポーターｅＧＦＰの発現は実施的に行われなかった。５．４の自動誘導性発酵では、バッチフェーズとフェドバッチフェーズの間のグルコース−制限転写フェーズの開始時での自動誘導の開始、及び内部グルコース制限フェドバッチフェーズを通してのその持続は、１ｇ_cdW当たり１４６ｍｇＧＰＦまでの産生物収率に３倍の増大を生じた。

更に、ＴＱ２８１（発酵５．３）で得られた結果から分かるように、０．７ｇ（ｅＧＦＰ）／Ｌのインデューサーを単独で添加することにより得られる収率は、指数関数的フェーズの間にインデューサーを更に添加することで１．９ｇ／Ｌまで著しく増大した。

５．６ 考察
発酵５．２〜５．４では、マンノースプロモーターＰｍａｎＰを含んでいるベクターｐＭＷ１６８．１中で枯草菌の発現系を使用してｅＧＦＰの発現を促進した。プロモーターＰｍａｎＰは、Ｄ−マンノースの添加において活性化される強いプロモーターであることが判明した。

発酵５．２では、このベクターで形質転換しておいた胞子形成欠損枯草菌株３ＮＡは、高い産生物レベル（すなわち２．１ｇ_eGFPＬ^-1）を生じた。バチルス・メガテリウムで最近記載された系（Ｓｔａｍｍｅｎ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７６，２０１０，４０３７〜４０４６）と比較して、組換え体タンパク質を生産するための見込のある宿主系、すなわち枯草菌系は優れた結果を生じた。キシロースにより誘導可能である細胞内でのバチルス・メガテリウムタンパク質生産系は、１．２５ｇ_eGFPＬ^-1を生じ、これはフェドバッチ発酵では１ｇ_cdw当たり３６．８ｍｇに相当する。更に、Ｓｔａｍｍｅｎ等（ｓｕｐｒａ）は、発酵プロセスの終わりまで抗生物質を使用したので、その結果、発酵プロセスの間にプラスミドは失われなかった。

発酵５．２は、マンノース系がむしろ生産性に関して効率的であることを示しているが、しかし、インデューサーを一度に加えることは、永久的に高い発現率をもたらさない。これは、枯草菌の好物の炭素源のうちの１つであるので、インデューサーであるマンノースの急速な消費による。

従って、本発明は、胞子形成欠損枯草菌宿主細胞において異種ポリペプチドを生産する方法に関し、該方法は、胞子形成欠損枯草菌細胞を、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作動的に連結したｍａｎＰプロモーターを含んでいるベクターでトランスフェクトし、形質転換した宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にするために適切な条件下に培地中で増殖させ、かつポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する工程を含み、それにより、ポリペプチドの発現はインデューサーであるマンノースの添加により誘導される。本発明の有利な実施態様では、インデューサーであるマンノースは、フェドバッチフェーズの開始時に添加される。他の有利な実施態様では、インデューサーであるマンノースは、フェドバッチフェーズの開始時にまず添加され、かつマンノースの２番目の添加は、グルコース供給と同時に指数増殖の間に実施される。

少ないインデューサーを要求する発現系は、マンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子ｍａｎＡの中断により発酵５．３で達成された。これは振盪フラスコ実験で観察できたように、高い発現率を得るためにより少ないインデューサーしか必要としない系を生じた。

しかし、この系は細胞の自己被毒を伴った。それというのも、０．５％（ｗ／ｖ）を上回るマンノースの量を使用した場合に、増殖が阻害されたからである。この作用は、おそらくマンノース−６−ホスフェートが細胞内に蓄積したものによる。マンノースに対するΔｍａｎＡ株ＴＱ２８１の感受性の可能性としてあり得る他の理由は、利用可能なホスフェート基の強い還元力であろう。それというのも、ホスフェートがＰＴＳにより開始細胞に入った場合に、不可逆的にマンノースに結合するからである。

従って、本発明はｍａｎＡ遺伝子に欠損のある枯草菌宿主細胞において異種ポリペプチドを生産する方法に関し、該方法は、ｍａｎＡ遺伝子に欠損のある枯草菌細胞を、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作動的に連結したｍａｎＰプロモーターを含んでいるベクターでトランスフェクトし、形質転換した宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能にするために適切な条件下に培地中で増殖させ、かつポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する工程を含み、それにより、ポリペプチドの発現は０．５％（ｗ／ｖ）を超えない量でインデューサーであるマンノースの添加により誘導される。本発明の有利な実施態様では、インデューサーであるマンノースは、フェドバッチフェーズの開始時に添加される。他の有利な実施態様では、インデューサーであるマンノースは、フェドバッチフェーズの開始時にまず添加され、かつマンノースの２番目の添加は、グルコース供給と同時に指数増殖の間に実施される。

どのインデューサーも必要としない誘導レジームは、実験５．４に示されている。自動誘導系は、ΔｍａｎＰ株ＴＱ３５６と発現ベクターｐＭＷ１６８．１を用いて実行された。

ＴＱ３５６のようなトランスポーターがマイナスの株では、マンノースプロモーターはグルコースに関わるＣＣＲによる制御コントロール下にだけある。これは、例えば発酵プロセスのバッチフェーズの場合である。同族のトランスポーターＭａｎＰによるマイナスの制御効果は、無効になる。それにもかかわらずグルコースが存在する限り、レギュレーターは不活性な状態のままである。更に、ｍａｎＲオペレーター部位が遮断されているので十分な量のＭａｎＲが存在しない。グルコースが制限されないまで、ＭａｎＲはそのオペレーター配列に結合することができ、かつ発現を開始する。この自動誘導系は、むしろ高価なインデューサーの必要性を不要にする。この洗練された誘導攻略は工業用途に極めて有望である。それというのも、極めて不要な基底発現がバッチフェーズで行われず、かつインデューサーを添加する必要が無くフェドバッチフェーズの全体を通して高い発現レベルを得られるからである。

それにもまして、発酵５．２と５．３と比べて、高い生産性と組み合わさって比較的に高い発現率も得られるであろう。１ｇ_cdw当たり１４６ｍｇ_eGFPに相当する約１０ｇＬ^-1の組換え体タンパク質（ｅＧＦＰ）が生産された。蛍光顕微鏡及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による観察から分かるように、産生物はその溶解性により細胞内に均一に分布していた。高い発現率、すなわち高い生産性は、発酵プロセスの終わりまで一定に高いレベルで保持されていた。

従って、本発明はトランスポーターがマイナスの枯草菌宿主細胞、例えばｍａｎＰ遺伝子が欠損しているような細胞内で、異種ポリペプチドを生産する方法にも関し、これはトランスポーターがマイナスの枯草菌細胞を、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作動的に連結したｍａｎＰプロモーターを含んでいるベクターでトランスフェクションし、形質転換した宿主細胞を、前記ペプチドの発現を可能にするために適切な条件下に培地中で増殖させ、かつポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する工程を含む。それにより、ポリペプチドの発現はマンノースにより誘導されるのではなく、グルコースの制御下にある。

Claims (10)

1. 組換え細菌性宿主細胞において異種ポリペプリドを生産する方法であって、
   前記組換え細菌性宿主細胞は、
   カーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系に課され、かつ
   ｉ）細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、転写調節タンパク質に特異的であるホスホリル基転移酵素ＥＩＩをコード化する遺伝子を欠失することによって、又は
   ｉｉ）細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、転写調節タンパク質をコード化する遺伝子を、前記遺伝子により発現される転写調節タンパク質が酵素ＥＩＩから移されたホスホリル基に結合できないように遺伝子改変することによって、
   誘導性第二炭素源の不在で第二炭素源により誘導可能なプロモーターに特異的な転写調節タンパク質を不活性化できないように改変されており、かつ
   前記組換え細菌性宿主細胞が、前記プロモーターに作動的に連結したポリペプチドをコード化する異種核酸配列を有するベクターを含む当該方法において、
   誘導性第二炭素源を含まず、組換え細菌性宿主細胞のための第一炭素源を含む細胞培養培地内で、細菌性宿主細胞を増殖させる工程と、
   第一炭素源の濃度をカーボン・カタボライト・リプレッションに必要なレベルより下に低下することにより、誘導性第二炭素源の不在で前記ポリペプチドの発現を誘導する工程と、
   ポリペプチドを細胞から又は細胞培養から回収する工程と、
   を含む、当該方法。
2. ｉ）の場合には、ベクターには、前記プロモーターを制御する転写調節タンパク質をコード化する遺伝子が組み込まれている；又は
   ｉｉ）の場合には、ベクターには、前記酵素ＥＩＩから移されたホスホリル基に結合できない転写調節タンパク質をコード化する細菌性宿主細胞の遺伝子操作された遺伝子が組み込まれている、請求項１に記載の方法。
3. 細菌性宿主細胞は、桿菌、クロストリジウム菌及び大腸菌から選択される、請求項１または２記載の方法。
4. 培養培地はカザミノ酸を含んでいる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記第一炭素源は、カーボン・カタボライト・リプレッションの誘導なしに、細菌性宿主細胞の予め決められた増殖率を維持するのに十分な量で培養に添加される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 炭素源誘導性プロモーターはマンノースオペロンのプロモーターであり、かつ誘導性炭素源はマンノースである、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. プロモーターは、マンノースオペロンのＰ_manP又はＰ_manRプロモーターである、請求項６に記載の方法。
8. ｉ）細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、ＭａｎＰをコード化する遺伝子を欠失する、又は
   ｉｉ）細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、転写調節タンパク質ＭａｎＲをコード化する遺伝子を、前記遺伝子により発現されるＭａｎＲが前記酵素ＥＩＩから移されたホスホリル基に結合できないように遺伝子改変する、請求項７に記載の方法。
9. 炭素源のそのカタボリズムが、カーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にある組換え細菌性宿主細胞であって、
   該細胞は、細菌性宿主細胞のゲノムにおいて、転写調節タンパク質に特異的なホスホリル基転移酵素ＥＩＩをコード化する遺伝子を欠失することにより、第一炭素源とは異なる誘導性第二炭素源の不在で、第二炭素源により誘導可能なプロモーターに特異的な前記転写調節タンパク質を不活性化できないように改変されており、かつ、
   該細胞は、ベクターを含み、当該ベクターは、細菌性宿主細胞が不活性化できないように遺伝子改変されている前記転写調節タンパク質によって制御されているプロモーターと、このプロモーターに作動的に連結されたポリペプチドをコード化する異種核酸配列と、前記転写調節タンパク質をコード化する遺伝子とを含む、組換え細菌性宿主細胞。
10. 炭素源のそのカタボリズムがカーボン・カタボライト・リプレッション及びホスホエノールピルビン酸−炭水化物・ホスホトランスフェラーゼ系の制御下にある組換え細菌性宿主細胞であって、
    該細胞は、転写調節タンパク質をコード化する遺伝子を細菌性宿主細胞のゲノムにおいて遺伝子改変することによって、遺伝子改変された当該遺伝子により発現される転写調節タンパク質が、前記転写調節タンパク質に特異的である酵素ＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できないようにされて、第一炭素源とは異なる誘導性第二炭素源の不在で、第二炭素源により誘導可能なプロモーターに特異的な転写調節タンパク質を不活性化できないように遺伝子改変されており、ここで前記遺伝子改変された遺伝子は前記組換え細菌性宿主細胞のゲノムに存在しており、かつ、
    該組換え細菌性宿主細胞は、ベクターを含み、当該ベクターは、細菌性宿主細胞が不活性化できないように遺伝子改変されている転写調節タンパク質によって制御されているプロモーターと、このプロモーターに作動的に連結されたポリペプチドをコード化する異種核酸配列と、前記酵素ＥＩＩにより移されたホスホリル基に結合できないように遺伝子改変された転写調節タンパク質をコード化する遺伝子とを含む、組換え細菌性宿主細胞。