CN103108954A

CN103108954A - 诱导型启动子的调控

Info

Publication number: CN103108954A
Application number: CN2011800367655A
Authority: CN
Inventors: M·文泽尔; J·埃尔滕布克纳; C·基茨亚克
Original assignee: Lonza AG
Current assignee: Lonza AG
Priority date: 2010-07-29
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2031-07-27
Also published as: HK1184496A1; EP2722390B1; ZA201209268B; KR101904140B1; EA024834B1; SG187024A1; US9464294B2; WO2012013710A2; TWI515295B; TWI510623B; ES2636910T3; EP2722390A1; WO2012013710A3; MX352068B; JP6071878B2; TW201428102A; EA201300189A1; EA034074B1; TW201213544A; AU2011284844A1

Abstract

本发明涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的产生，其中使得所述细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。

Description

诱导型启动子的调控

本发明涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的生产。具体地，本发明涉及通过使用特定底物（诱导物）可诱导的启动子而调节编码多肽的异源核酸序列的表达。最具体地，本发明涉及异源多肽在细菌宿主细胞中的表达的调控，其中已使得细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。

发明背景

异源多肽在重组微生物中的产生的一个重要方面是选择用于控制编码靶多肽的异源核酸序列的表达的启动子。

适当的启动子应当比较强。即，以高速率产生相应mRNA，从而允许以较高的量产生多肽。此外，启动子应当容易受到调控并且仅在诱导时开始异源多肽的产生。

然而，存在通常诱导底物为微生物的营养物并且被微生物消耗的问题。然而，当用于培养微生物的培养基耗尽诱导底物时，微生物使启动子失活，从而靶多肽的表达停止。为了避免基因表达的不希望的停止，必须以较高的量添加和/或连续补充诱导物。较高量的诱导物的需要增加了发酵工艺的成本。此外，需要昂贵诱导物的高效启动子的使用也受到限制。

因此，为了生产重组多肽，需要其中控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导物的存在、但异源多肽的表达仍然可被严密调控的宿主细胞。

WO 2006/133210 A2涉及在利用甘露醇、阿糖醇、葡糖醇或甘油-诱导型启动子的细菌宿主细胞中生产重组多肽的方法，其中已使得细菌宿主细胞不能降解或代谢诱导物。根据所述方法，对基因组中编码代谢所述诱导物所需的酶的一个或多个基因进行了遗传改变或缺失，以便细胞不能从其基因组表达代谢或降解所述诱导物所必需的功能性酶。为了确保诱导物的摄入，不影响与诱导物转运至细胞内相关的基因。

然而，该方法需要另外添加用于催化控制靶多肽表达的相应启动子的激活的诱导物。

此外，诱导物在细胞中的积累可不利地影响细胞的发育。

许多细菌能够利用不同的碳源。如果提供以碳源的混合物，则选择允许最快速生长的碳源（主要碳源）。同时牵涉次级碳源的利用的功能被称为碳分解代谢物阻遏(CCR)的现象抑制。

除了CCR外，参与较不优选的次级碳源的利用的特定分解代谢基因仅在所述次级碳源存在的情况下表达。因此，参与次级碳源的分解代谢的基因的表达依赖于所述次级碳源的存在（诱导）以及主要碳源（分解代谢抑制）的不存在。

Tianqui Sun等人的出版物“Characterization of a mannoseutilization system in bacillus subtilis“,Journal of Bacteriology,American Society for Microbiology,第192卷,第8期,2010年4月1日，第2128页至2139页涉及甘露糖操纵子及其基因以及受甘露糖调节的启动子PmanP和PmanR的鉴定。据报导，甘露糖的代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统，并且甘露糖操纵子还受控于碳分解代谢物阻抑。为了表征和鉴定单个基因的功能，制备缺乏相应基因、从而不存在由所述基因编码的相应蛋白质的敲除突变体。已发现甘露糖转运蛋白基因manP的缺失导致从启动子PmanP和PmanR的组成型表达，这表明甘露糖转运蛋白ManP对甘露糖操纵子和编码甘露糖特异性转录调节剂ManR的manR基因的调控具有负作用。

Tobisch等人“Regulation of the lic operon of Bacillus subtilis andcharacterization of potential phosphorylation sites of the LiRregulator protein by site-directed mutangenesis”，Journal ofBacteriology,第181卷,第16期,1999年8月19日，第4995-5003页报导了：调节剂LicR的EIIA结构域中的磷酰基结合氨基酸替换为另一个氨基酸导致了诱导底物不存在的情况下突变调节蛋白LicR的活性。

等人“Carbon catabolite repression in bacteria：Many waysto make the most out of nutrients”，Nature Reviews.Microbiology,第6卷,第8期,2008年8月，第613-624页涉及缺乏甘露糖转运蛋白EIIAB的链球菌属突变菌株和对磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的影响。已显示甘露糖转运蛋白EIIAB并非仅限于甘露糖的磷酸化，而是同样地还磷酸化葡萄糖、果糖和2-脱氧葡萄糖。此外，已显示即使在甘露糖转运蛋白EIIAB不存在的情况下，甘露糖仍然可通过果糖特异性转运蛋白EII^FRU摄入。

Deutscher等人“The mechanisms of carbon catabolite repressionin bacteria”(Current Opinion in Microbiology,Current Biology LTD,GB,第11卷,第2期,2008年4月1日，第87-93页)提供了不同细菌例如大肠杆菌（E.coli）和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中的碳分解代谢抑制机制的一般概述。

发明概述

本发明通过提供细菌宿主细胞而利用这些碳分解代谢的调控机制，其中所述细菌宿主细胞中，调控参与次级碳源代谢的基因表达的启动子在其相应的碳源不存在的情况下不被灭活，并且其中所述启动子仅处于碳分解代谢产物阻抑的控制之下。

根据本发明，使用的启动子为调控细菌宿主细胞的次级碳源的利用的启动子。

在主要碳源存在的情况下，启动子被CCR抑制。当用于培养重组细菌宿主细胞的培养基耗尽主要碳源或主要碳源的浓度降至低于进行CCR所需的水平时，所述启动子的CCR无效并且启动子自动地起始由所述启动子控制的基因的表达。

本发明提供了重组细菌宿主细胞，其中所述重组细菌宿主细胞能够利用一种以上的碳源，其中所述细菌宿主细胞的此类碳源的碳分解代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)和CCR，其中对所述细菌宿主细胞进行了遗传改变，以防止在所述次级碳源不存在的情况下碳源诱导型启动子的转录调节蛋白的失活，但仍然在CCR的控制之下，其中所述碳源是细菌宿主细胞的次级碳源。

根据本发明的又一方面，利用包含有效地连接了可被次级碳源诱导的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体转化本发明的重组细菌宿主细胞，其中载体的启动子受转录调节蛋白控制，所述细菌宿主细胞已在遗传上经历改变从而不能在特定相应碳源不存在的情况下灭活所述调节蛋白。

此外，本发明提供了用于通过培养利用包含编码多肽的核酸序列的载体转化的本发明重组细菌宿主细胞来制备异源多肽的方法。

此外，本发明涉及根据本发明的重组细菌宿主细胞用于产生异源多肽的用途。

根据特定方面，本发明涉及需要减少量的诱导物、特别地根本不需要诱导物的基因表达诱导方案。根据进一步具体的方面，本发明涉及适合于高细胞密度发酵的细菌表达系统。

具体地，本发明提供了用于在重组细菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上被改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且其包含具有有效地连接于启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，所述启动子可被次级碳源诱导并且受转录调节蛋白调控，所述方法包括如下步骤：在不包含诱导性次级碳源但包含不同碳源的细胞培养基中，当该不同碳源的浓度降至低于碳分解代谢物阻抑所必需的水平时，培养细菌宿主细胞由所述不同碳源诱导所述多肽表达，以及从细胞或从细胞培养物回收多肽。

此外，本发明还提供了适合进行本发明的方法的重组细菌宿主细胞。

例如，本发明涉及重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且已通过在所述细菌宿主细胞的基因组中缺失编码特异于该转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因而在遗传上对其进行了改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活可被次级碳源诱导的启动子所特异的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白（对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞在遗传上已被改变从而不能灭活其）调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，并且其中将编码该特异性转录调节蛋白的基因整合入所述载体。

此外，本发明涉及重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其已通过在该细菌宿主细胞的基因组中遗传上改变编码该转录调节蛋白的基因（以便由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII转移的磷酰基）来在遗传上进行改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白（对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞遗传上已被改变从而不能灭活其）调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，并且所述载体中额外地整合了编码不能结合由相应的酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的加工基因。

根据其它方面，本发明涉及用于通过培养重组细菌宿主细胞生产异源多肽的方法，其中使用其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统控制之下的重组细菌宿主细胞，并且所述重组细菌宿主细胞已被遗传改造，从而其不能代谢碳源诱导型启动子的诱导性碳源，其中所述诱导性碳源为该细菌宿主细胞的次级碳源，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有可被所述次级碳源诱导的启动子和有效地连接于该启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，其中所述方法是补料分批法，其中在分批期（batchphase）后，通过添加第一部分诱导性次级碳源、并且同时开始第二部分的进料来起始诱导。

根据下列详细说明，参考附图和所附权利要求书，其它目的和有利方面对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。

根据上文提及的实施方案，靶多肽的表达的诱导不依赖于该启动子的诱导性碳源的存在。因此，该实施方案是特别有利的，因为不需要诱导性碳源。

然而，如果可减少诱导启动子必需的碳源的量的话，那么从经济的观点来看其也是有利的。

因此，根据可选择的技术方案，本发明涉及用于通过表达编码所述靶多肽的核酸来生产靶多肽的方法，其中表达处于碳源诱导型启动子的控制之下，其中细菌宿主细胞（该细菌宿主细胞应当用具有所述启动子和靶多肽的核苷酸序列的载体转化）对该诱导性碳源的分解代谢的过程被中断或至少被延迟。

根据本发明，该替代方案可通过消除或在遗传上改变细菌宿主细胞的基因组中的编码诱导性碳源特异性异构酶的核苷酸序列来实现，所述诱导性碳源一旦被转运至细胞内即被所述异构酶转化成果糖-6-磷酸。当碳源已被转运进入细胞时，对果糖-6-磷酸的异构化是碳源的分解代谢的第一步。中断或延迟碳源的异构化意味着碳源可供长时期诱导。因此，可减少诱导性碳源的量。

根据实例，该替代方案涉及甘露糖诱导型启动子以及具有这样的启动子的细菌宿主细胞，其中在该细菌宿主细胞的基因组中已消除或遗传上改变了编码甘露糖-6-磷酸异构酶（也称为ManA）的基因，从而不可能发生或至少延迟了转运入细胞就发生的甘露糖异构化。

附图概述

在如下图中显示了：

图1：甘露糖操纵子的示意性结构，各基因和启动子的排列和方向以及ManR对其的激活由箭头标示；

图2：甘露糖分解代谢的流程图，涉及至细胞内的转运、在转运过程中甘露糖至甘露糖-6-磷酸的磷酸化以及向果糖-6-磷酸的转化;

图3：具有不同结构域和潜在的磷酸化位点的ManR激活蛋白的示意性结构;

图4：包含manR启动子的枯草芽孢杆菌启动子区域的核酸序列；

图5：用于启动子-探针载体pSUN272.1（用于研究甘露糖和葡萄糖对manP启动子的诱导性和分解代谢物阻抑以及ManR结合位点的测定）的枯草芽孢杆菌的核酸序列；

图6：枯草芽孢杆菌中通过CcpA分解代谢物阻抑和激活的机制;

图7：表达载体pSUN279.2的质粒图谱;

图8：分别包含质粒pSUN279.2、pSUN284.1和pSUN291的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性;

图9：包含质粒pSUN284.1以及含有图5中所示核酸序列的不同长度片段的其它质粒的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性;

图10：包含具有图4中所示核酸序列的载体pSUN291、pSUN385.2和pSUN386.9的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性;

图11：表达载体pMW168.1的质粒图谱；

图12：插入载体pSUN356.7(ΔmanP)的质粒图谱；

图13：显示在枯草芽孢杆菌TQ356/pMW168.1(ΔmanP-突变体)的整个发酵工艺期间中标绘的对数干生物质浓度和在整个工艺期间标绘的荧光信号（RFU）的图解；和

图14：从利用枯草芽孢杆菌TQ356/pMW168.1的发酵获取的细胞样品的SDS-PAGE；

图15：质粒pMw168.1的制备流程图。

发明详述

如本文中所用，提供下列定义以帮助理解本发明。

“酶EII”、“EII”或“转运蛋白”是指磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)的碳源特异性通透酶，其催化碳源的转运和伴随性磷酸化。

PTS包含多种EII，每一种特异于一种碳源例如糖。

EII是通常由3个结构域A、B和C以及有时有第4结构域D组成的复合体，其中EIIA和EIIB参与相应碳源的磷酸化，并且膜结合性EIIC(EIID，如果存在的话)介导该特异性碳源通入细胞。

在特异性碳源不存在的情况下，相应的EIIA和在某些情况下EIIB通过将磷酰基转移至转录调节蛋白中存在的相应磷酸化位点（称为EIIA和EIIB结构域，取决于该磷酸化EII）来灭活相应碳源特异性转录调节蛋白。

“转录调节蛋白”或“调节剂”正面调控（即，激活）特异性碳源的分解代谢操纵子。转录调节蛋白通常包含两个可被磷酸化的保守性调节结构域(PTS调节结构域，PRD)。此外，一些转录调节蛋白另外地包含称为EIIA和EIIB的其它磷酸化位点。取决于转录调节蛋白，该转录调节蛋白通过酶II的磷酰基转移至EIIA和EIIB和/或PRDI结构域中的上述磷酰基结合位点中的一个或多个来灭活，以及通过将磷酰基从组氨酸蛋白(HPr)转移至PRDII结构域来激活。PTS的各种碳源特异性转录调节蛋白可以是激活物或抗终止因子（antiterminator）。

如本文中所用，“启动子”是指调控表达的核酸序列。“启动子区域”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且起始下游(3′方向)编码序列的转录的调控区域。在启动子区域内有负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域（共有序列）例如-35盒和-10盒(Pribnow盒)。此外，启动子区域可包含转录起始位点和其特异性转录调节蛋白的结合位点。

“变体”或“序列的变体”意指与参照序列相比的差异在于保守核酸置换的核酸序列，由此一个或多个核酸可被具有相同特征的另一个核酸替代。变体还包括简并序列、具有缺失和插入的序列，只要此类修饰序列显示与参照序列相同的功能（功能上等同）即可。

“可在宿主中表达的载体”或“表达载体”是重组或合成地产生的多聚核酸构建体，其具有一系列指定的允许特定核酸序列在宿主细胞中转录的多聚核酸元件。通常，这样的载体包括包含有效地连接于启动子的待转录的特定核酸序列的转录单位。可在宿主中表达的载体可以是例如自主或自身复制的质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。

术语“转化”、“转化的”或“向宿主细胞中引入核酸”意指其中细胞外核酸如载体（具有或不具有伴随材料）进入宿主细胞的任何过程。

可利用公知的方法例如显微注射、电穿孔、微粒轰击或利用化学方法例如磷酸钙介导的转化和利用天然转化系统（例如在Maniatise等人,Molecular Cloning A laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1982)中或Ausubel等人,Current protocols in molecularbiology,John Wiley和Sohns(1984)中描述的）实现例如表达载体对适当的宿主细胞的转化。

“异源核酸序列”或“对于宿主是异源的核酸序列”意指编码例如对于宿主是外来的“异源表达”或“异源产物”的表达产物例如多肽的核酸序列，即源于与宿主不同的供体的核酸序列或化学合成的核酸序列，其编码例如对于宿主是外来的表达产物例如多肽。如果宿主是特定的原核生物物种，则异源核酸序列优选源自生物的科的不同属，更优选源自不同目或纲，特别地源自不同门，最特别地来自不同域(界)。

可在将其引入宿主细胞之前，通过对单个核酸或部分异源核酸序列的突变、插入、缺失或置换来修饰源于与宿主不同的供体的异源核酸序列，只要此类修饰序列显示与参照序列相同的功能（功能上等同的）即可。本文中提及的异源核酸序列还包括源自生物的不同域（界）例如源自真核生物（真核生物来源的）的核酸序列，例如人抗体，所述抗体已被用于噬菌体展示文库并且其中的单个核酸或核酸序列的部分已根据原核宿主的“密码子使用”进行了修饰。

本发明的意义内的“异源多肽”或“靶多肽”可以是人、哺乳动物或原核生物来源的异源蛋白质。其它蛋白质为来自微生物病原体（病毒和抗细菌的）以及来自肿瘤的抗原例如糖蛋白和碳水化合物。其它异源多肽为酶如凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶、脂酶、酰胺酶、腈水合酶、酯酶或腈水解酶。

“碳源”是指可被细菌细胞摄入和代谢并且处于PTS和碳分解代谢物阻抑(CCR)之下的碳源，通常是碳水化合物，碳水化合物的典型实例为糖和糖衍生物。

许多细菌可利用1种以上的碳水化合物作为碳源和能源。通过使用特定细胞外酶，细菌例如芽孢杆菌能够降解以大量存在于植物生物质中的几种多糖。所得的低聚糖、二糖或单糖被运输进入细胞并且进一步被加工。通常，当特定底物存在于培养基中并且优选碳源和能源不存在时，仅合成参与糖的代谢或降解的分解代谢酶。用于将碳水化合物转运通过细菌细胞的膜的优选碳水化合物转运途径是PTS。

在PTS中，碳水化合物通过细胞膜的转运和随后的磷酸化由特异于所述碳水化合物的称为酶II(EII)的酶介导。由于EII介导其相应碳源至细胞内的转运，因此EII也被称为“转运蛋白”。

在碳水化合物的混合物存在的情况下，细胞选择性摄入给它们提供最多能量和生长有利方面（主要碳源）的碳源。同时，它们抑制参与次优选碳源(次级碳源)的分解代谢和摄入的各种功能。

通常地，用于大多数细菌的主要碳源为葡萄糖，并且取决于细菌，许多其它糖和糖衍生物被用作次级碳源。然而，主要碳源也可以是另一种化合物。例如在假单胞菌的情况下，主要碳源可以是芳香化合物。

次级碳源包括例如甘露糖、乳糖和蜜二糖，但不限于此类糖

在PTS中，参与特异性碳源的代谢的各种分解代谢基因受转录调节蛋白控制。此类转录调节蛋白可用作抗终止因子或转录激活物并且仅在特异性碳源(诱导物)存在时才具有活性。已发现EII通过将磷酰基转移至转录调节蛋白中存在的特异性结合位点而对其相应的转录调节蛋白具有负（灭活）调控作用。

在主要碳源不存在并且启动子特异性诱导性碳源存在的情况下，启动子被其相应的转录调节蛋白激活，从而表达处于该启动子的控制之下的基因。在诱导性碳源不存在的情况下，调节该启动子的转录调节蛋白通过将磷酰基从其EII转移至该转录调节蛋白上的相应结合位点来灭活，从而灭活所述启动子并终止处于所述启动子控制之下的基因的表达。

另外，在优选主要碳源存在的情况下-无论次优选的次级碳源是否存在-所述次级碳源的分解代谢基因的表达被CCR抑制。

一般而言，本发明基于抑制所述特异性碳源不存在的情况下对碳源持异性转录调节蛋白的调控。具体地，本发明基于阻止通过相应的EII将磷酰基转移至转录调节蛋白产生的抑制或灭活。

如果碳源持异性转录调节蛋白的抑制被阻止，所述转录调节蛋白作为其激活物的启动子具有活性，无论作为所述启动子的诱导物的碳源是否存在。

因此，诱导性碳源对于处于此类启动子的控制之下的基因的表达不是必需的，此外，此基因连续表达。

鉴于上述内容，本发明利用可被次级碳源诱导的启动子，其中所述启动子一方面受PTS控制，另一方面受CCR控制。

因此，本发明寻求通过阻止特异于碳源诱导型启动子的转录调节蛋白的灭活来阻止在靶多肽的表达中用作启动子的所述碳源诱导型启动子的灭活。

根据第一方法，该目标可这样实现：通过使转录调节蛋白对于由EII转移的磷酰基的至少一个结合位点不能结合磷酰基来中断其特异性EII对转录调节蛋白的磷酸化。

为此，在细菌宿主细胞的基因组中，可遗传操作编码转录调节蛋白的基因，以便所述基因表达不能结合从EII转移的磷酰基的转录调节蛋白。

根据第二方法，通过在细菌宿主细胞的基因组中缺失编码EII（即调节转录调节蛋白的活性的酶）的基因来中断磷酸化。

根据本发明，将异源多肽的表达置于特异于上文中提及的转录调节蛋白的启动子的控制之下，可通过在遗传上改变细菌宿主细胞来阻止通过EII的磷酰基转移引起的灭活。

本发明提供了用于通过利用载体（其包含有效地连接于碳源诱导型启动子的编码所述多肽的异源核酸）转化的本发明重组细菌宿主细胞的发酵来生产异源多肽的有利系统，其中即使在发酵培养基中不存在诱导性碳源时所述启动子仍然具有活性。由于控制编码靶多肽的核酸序列的表达的启动子仍然处于碳分解代谢物阻抑的控制之下，因此在主要碳源例如葡萄糖存在的情况下表达不发生，但当系统耗尽该主要碳源时自动地获得诱导(自动诱导)。由于控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导性碳源的存在，因此在发酵培养基中，无需诱导性碳源即可实现靶多肽表达的诱导。

本发明的一个有利之处在于，重组细菌宿主细胞可在其主要碳源存在的情况下生长至高细胞密度，并且一达到期望的细胞密度，就可在消除控制表达的启动子的碳分解代谢物阻抑下自动地开始靶多肽的产生。

本发明的另一有利方面在于，在补料分批发酵中，在分批期中没有或几乎没有靶多肽产生，即存在强分解代谢物阻抑。

适用于本发明的细菌宿主细胞是可利用1种以上的碳源的那些细菌宿主细胞，其中不同碳源的利用受控于碳分解代谢物阻抑并且其中碳源通过细胞膜的转运以及其磷酸化受控于磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统。

适用于本发明的细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞。优选实例为属于厚壁菌门（phylum Firmicutes）的细菌，特别地，属于芽孢杆菌纲（class Bacilli）的细菌。具体的实例为芽孢杆菌属的细菌例如枯草芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens),地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、纳豆芽孢杆菌（B.natto）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）等，其它优选实例包括例如链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属或肠杆菌（Enterobacteria）的其它成员，但不限于此。

通常，硬壁菌门是革兰氏阳性并且具有低GC含量。“低GC含量”意指在细菌基因组中低于52%的碱基对为GC对。例如，革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属和梭菌属（Clostridium）的细菌在基因组中包含40%或更低的GC对。

其它适当的细菌宿主细胞为肠细菌，例如属于肠杆菌目的细菌。此类肠细菌的实例是革兰氏阴性细菌（例如埃希氏菌属细菌）。具体的实例为大肠杆菌的菌株，例如TG1、W3110、DH1、XL1-Blue和Origami。

大肠杆菌和肠细菌在基因组中包含约50%的GC含量，因此是低GC含量生物。

根据公知的革兰氏染色方法确定革兰氏阳性和革兰氏阴性生物。革兰氏阳性生物为在标准革兰氏染色下呈现紫罗兰色的生物。革兰氏阴性生物结合负染剂而非主要的革兰氏染色剂。

在硬壁菌门和肠细菌中存在不同的CCR机制，所述机制已在作为模型生物的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中得到详细研究（参考例如J.Stülke等人,“Regulation of carbon catabolism in Bacillus species”,Annu.Rev.Microbiol.(2000)54：849-880；

B.et Stülke J.,“Carbon catabolite repression in bacteria：many ways to make themost out of nutrients”,Nat.Rev.Microbiol.(2008)6：613-624；Gosset G.等人,Transcriptome analysis of Crp-dependent catabolitecontrol of gene expression in Escherichia coli”,J.Bacteriol.,(2004)186：3516-3524,Martinez-Antonio A.等人,Identifying globalregulators in transcriptional regulatory networks in bacteria”Curr.Opin.Microbiol.(2003)6：482-489)。虽然CCR的总体机制不同，但结果相同，即在主要碳源存在的情况下，参与次级碳源的摄入和磷酸化的各种分解代谢操纵子被阻遏。

本发明的重组细菌宿主细胞被遗传改造来阻止控制异源核酸序列的表达的碳源诱导型启动子的阻遏，这通过抑制在所述诱导性碳源不存在的情况下启动子特异性转录调节蛋白的灭活来实现。

因此，在本发明的重组细菌宿主细胞中，控制异源核酸序列的表达的碳源诱导型启动子仅受控于碳分解代谢物阻抑。在主要碳源存在的情况下异源多肽的表达受CCR抑制。

根据本发明，除非碳分解代谢物阻抑受到更优选的主要碳源刺激，否则无论诱导性碳源存在与否，碳源诱导型启动子都以其活性状态存在。

因此，本发明提供了异源多肽的生产而无需诱导物来诱导控制编码多肽的基因的启动子。

一般而言，适合于本发明的启动子是在细菌细胞中受控于PTS和CCR的启动子。具体地，相应的转录调节蛋白是处于所述启动子的控制之下的分解代谢操纵子的激活物或抗终止因子。此类启动子在本领域是已知的。适用于本发明的启动子的实例以参照各操纵子的方式示于下表中：

a：转录调节蛋白

b：A：激活物

AT：抗终止因子

在下面，参考枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子更详细地解释本发明。

枯草芽孢杆菌可使用许多不同的单糖或二糖作为碳源，例如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇和果糖。这些糖被PTS系统摄入。向细胞内的转运和磷酸化由特异于各自糖的酶EII介导。

如在许多细菌中一样，枯草芽孢杆菌的优选碳源为葡萄糖。在葡萄糖存在的情况下，PTS对任何其它糖的摄入都被CCR抑制。

甘露糖的操纵子结构示于图1中，甘露糖向细胞内的转运及其分解代谢示于图2中。枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子包含3个分解代谢基因(Kunst F.N.等人,“The complete genome sequence ofgram-positive bacterium B.subtilis”,Nature(1997)390：249-256)。

第一个基因，manP，编码称为ManP的甘露糖特异性EII酶。ManP实现甘露糖通过细胞膜的转运，并且同时实现甘露糖至甘露糖-6-磷酸的磷酸化。第二个基因，manA，编码将甘露糖-6-磷酸转化成相应的果糖-6-磷酸的甘露糖-6-磷酸异构酶。第三个基因，yjdF，其功能仍然不清楚。调控基因manR位于这3个基因的上游并且以相同的方向排列，其编码称为ManR的转录调节蛋白。

甘露糖-操纵子为正调节的分解代谢操纵子并且受两个不同启动子控制。一个启动子，manR启动子(PmanR)，负责转录调节蛋白ManR。第二启动子，manP启动子(PmanP)，负责基因manP-manA-yjdF(连带称为“manPA-yjdF”)的转录。在甘露糖存在并且葡萄糖不存在的情况下，ManR结合PmanP并且激活manPA-yjdF的表达。令人惊讶地，已发现：ManR不仅是manPA-yjdF-启动子的转录调节蛋白，而且还是manR自身的自调节剂（auto-regulator）。

图3示意性显示转录调节蛋白ManR的结构和可能的磷酸化位点。如所显示的，ManR包含两个PRD(PTS调节结构域)结构域，一个EIIA和一个EIIB结构域以及HTH(螺旋-转角-螺旋)结构域。PRD是存在于转录调节蛋白中的保守调节结构域，其可在碳分解代谢的过程中被磷酸化。EIIA和EIIB结构域为由ManP（甘露糖操纵子的EII转运蛋白）转移的磷酰基的结合位点。HTH为能够结合DNA的蛋白质中的结构单元（structural motive）。

在诱导物甘露糖不存在的情况下，ManR的EIIA和EIIB以及最终PRDI结构域被ManP（甘露糖操纵子的甘露糖特异性EII）磷酸化，从而导致失活。

因此，根据本发明的第一方法，如果加工ManR的EIIA和/或EIIB中的磷酸化位点或缺失所述结构域以使其不能接受磷酰基，则防止了在诱导物甘露糖不存在的情况下ManR的灭活。

为此，在细菌宿主细胞的基因组中，通过缺失或操作相应的编码ManR中的相应磷酸化位点的核酸序列而在遗传上改变基因manR。

此外，根据本发明的第二方法，通过中断甘露糖转运来阻止甘露糖操纵子的启动子的失活，这可通过缺失或灭活细菌宿主细胞的基因组中编码ManP的基因来实现。

这些改变可通过在细菌宿主细胞中改变或缺失编码参与转录调节蛋白磷酸化的蛋白质的基因（此处，在甘露糖操纵子中为manR和/或manP）的编码序列来进行。

此类遗传上改变的敲除宿主细胞可按照本领域已知的用于这种目的的多种方法中的任意方法来制备。例如，可将包含被靶向的核酸缺失序列5′和3′的同源靶基因序列的同源重组载体转化进入宿主细胞。在同源重组后，可产生期望的敲除细胞。

基因敲除法在本领域是公知的。例如，通过多核苷酸的插入进行的基因灭活已描述于例如

D.L.等人,“Marker-exchangemutagenesis of a pektate lyase isozyme gene in Erwinia chrysanthemy”J.Bacteriol.(1985)164(1：51-56)中。基因中的特定突变或缺失可使用盒式诱变来构建，例如，如Wells J.A.等人,“Cassettemutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutationsat defined sites”,Gene(1985)34(2-3)：315-323中所描述的；由此可在基因的选定部分产生定点或随机突变，随后利用同源重组将其掺入基因的染色体拷贝。

本发明人已发现：调控甘露糖操纵子的启动子即PmanR和PmanPA-yjdF是强启动子，因此其为用于生产异源多肽的有希望的候选者。然而，甘露糖（诱导此类启动子的碳源）是价格昂贵的糖，其仍然限制了甘露糖诱导型启动子的使用。

因此根据本发明，对于在细菌宿主细胞中表达异源多肽，诱导性碳源不是起始表达所必需的，启动子例如甘露糖启动子的使用不仅在强度上而且在成本上均具有竞争性。

因此，本发明还涉及甘露糖操纵子的启动子PmanR和PmanPA-yjdF作为用于在本发明的重组细菌宿主细胞中控制编码靶多肽的异源核酸序列的启动子的用途。

用于各种表达载体如pSUN284.1中的包含manP启动子的启动子区域的枯草芽孢杆菌核酸序列示于图5中，其中腺嘌呤核苷酸处的转录起始位点被突出显示，-35和-10框以粗斜体显示，manR的末端用箭头标示，限制性位点BglII、XbaI、AflII、NdeI和NruI以下划线标示。显示了报道基因lacZ的起始密码子。

包含manR启动子的启动子区域的获自枯草芽孢杆菌的核酸序列示于图4中，其中转录起始位点被突出显示，-10和-35框以粗斜体显示，manR基因的起始位点用箭头标示，HindIII限制位点以粗体和下划线标示，推定的cre序列以下划线标示。

“甘露糖操纵子的启动子区域”意指调控manPA-yjdF以及具有或不具有cre序列的manR的表达的启动子区域。

如本文中所提及，“manPA-yjdF启动子”基本上由-35区域、-10区域(Pribnow框)、转录起始位点和ManR结合位点组成。

如本文中所提及，“manR启动子”基本上由-35区域、-10区域、转录起始位点和ManR结合位点以及任选地cre序列组成。

cre序列（分解代谢物阻抑元件)为保守的14个核苷酸长的DNA序列，其结合CcpA(分解代谢物控制蛋白A)，即硬壁菌门中CCR的全局调节蛋白。枯草芽孢杆菌中分解代谢物阻抑和激活的机制示于图6中。通过CcpA复合以Serin-46磷酸化HPr（组氨酸蛋白）对cre序列的结合，启动子被阻抑。这代表了甘露糖操纵子的分解代谢物阻抑的第二机制。这样，调控基因manR的表达在葡萄糖存在的情况下被抑制。因此，这抑制了manP启动子的激活。在葡萄糖存在的情况下，细胞通过PtsG（与EII甘露糖转运蛋白类似的PTS-依赖性转运系统）摄入葡萄糖。在细胞中，中间产物果糖-6-磷酸(Fru-6-P)和果糖-1,6-二磷酸(Fru-1,6-DP)积累并且刺激HPr-激酶。HPr-激酶(HPrk)在丝氨酸-46上磷酸化HPr。Ser-46-HPr与DNA结合蛋白CcpA形成复合物，其结合许多枯草芽孢杆菌的分解代谢物阻抑的和分解代谢物激活的启动子中存在的所谓的cre-位点。cre位点位于-10启动子序列的下游或与该-10序列重叠，Ser-46-HPr/CcpA复合物的结合抑制了从该启动子的表达。该状况见于manR启动子(图4)。

包含manPA-yjdF的启动子区域的核酸序列优选包含图5中从lacZ的bp-80至起始密码子的核酸序列(SEQ ID NO.1)，更优选图5中从bp-80至bp-1（包括bp-1）（即bp+1处转录起始位点的上游）的核酸序列(SEQ ID NO.2)。

包含manR的启动子区域的核酸序列优选包含图4中从manR的bp-122至起始密码子的核酸序列(SEQ ID NO.3)，更优选图4中从bp-122至bp+7（即包括推定的cre-序列）的核酸序列(SEQ ID NO.4)，以及特别地，图4中从bp-122至bp-1（即在bp+1处转录起始位点G的上游）的核酸序列(SEQ ID NO.5)。manP和manR的启动子区域都包含转录调节蛋白ManR的结合位点(在图4中标记为IRI-R，在图5中标记为IRI-P)，其为甘露糖操纵子的启动子的转录激活物。

根据其它方面，本发明涉及这样的遗传上改变的细菌宿主细胞，其包含具有有效地连接于碳源诱导型启动子的编码目标多肽的核酸序列的载体，其中载体的启动子受转录调节蛋白调控，所述细菌宿主细胞在遗传上已被改变，从而不能在特异于所述转录调节蛋白的碳源不存在的情况下灭活所述转录调节蛋白。

参考上述甘露糖操纵子，载体的启动子可以是PmanR或PmanPA-yjdF，例如序列SEQ ID NO.1至5的任意序列以及上表的任意序列。

根据本发明的一个实施方案，在本发明中使用的载体中，可整合编码不能结合由相应EII转移的磷酰基的相应转录调节蛋白的遗传上改变的基因。因此，在重组细菌宿主细胞中，转录调节蛋白不仅由染色体基因表达，而且还由整合入载体的相应基因表达，这导致更高浓度的转录调节蛋白和增强的诱导。例如，当载体的启动子为甘露糖操纵子的启动子时，基因manR可被整合入载体，其中编码EIIA结构域的核苷酸序列已被缺失(manRΔEIIA)。

适用于本发明的载体优选为自主复制或自我复制的质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。许多种宿主/载体组合可用于本发明。

有用的表达载体例如可由染色体、非染色体和/或合成的核酸序列区段组成。

适当的载体包括具有特定宿主范围的载体，例如分别特异于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的载体，以及具有广宿主范围的载体，例如可用于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的载体。可使用“低拷贝”、“中拷贝”以及“高拷贝”质粒。

例如，在枯草芽孢杆菌中，一种低拷贝质粒为pAMβ1、中拷贝质粒为pBS72衍生物，高拷贝质粒为pUB110。对于例如在大肠杆菌中的表达，有用的载体为pBR322、pUC18、pACYC177、pACYC184、pRSF1010和pBW22或其衍生物，例如质粒pBLL15或质粒pAKL15E。

本发明的遗传上改变的细菌宿主细胞不能在所述启动子的诱导性碳源不存在的情况下灭活控制该启动子的转录调节蛋白。由于载体的启动子受到与相应染色体启动子相同的转录调节蛋白控制，因此即使在诱导性碳源不存在的情况下，编码靶多肽的异源核酸序列的表达继续进行。

此外，本发明提供了用于在本发明的遗传上改变的细菌宿主细胞中生产异源多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在允许多肽表达的条件下培养用包含有效地连接于启动子的编码多肽的核酸序列的载体转化的本发明的遗传上改变的细菌宿主细胞，其中所述载体的启动子受转录调节蛋白调控，所述转录调节蛋白在特异于该转录调节蛋白的碳源不存在的情况下不能被灭活，和

b)从细胞或从细胞培养物回收所述多肽。

根据本发明，靶多肽的表达在培养基耗尽主要碳源或主要碳源的浓度下降至低于CCR所需的水平时的时间点自动地开始。

为了允许细胞在诱导后生长，可继续以不允许碳分解代谢物阻抑的水平向培养基中添加主要碳源。例如，以立即被细胞耗尽的量添加主要碳源，以便在发酵液中基本上不存在可刺激CCR的主要碳源。

通常地，可以认为，如果存在于培养基中的主要碳源的量超过1.0g/l，则可观察到碳分解代谢物阻抑，然而，如果该量为0.01g/l或更少，则不存在碳分解代谢物阻抑。

由于碳分解代谢物阻抑与启动子的诱导的界限与细胞的生长速率相关，而细胞的生长速率又与添加至培养基中的或存在于培养基中的主要碳源的量相关，因此可通过监控生长速率来调整不引起碳分解代谢物阻抑的主要碳源的量。如果在给定的生长速率下，碳分解代谢物阻抑发生，则必须减少添加至培养基的主要碳源的量，从而降低生长速率直至观察不到碳分解代谢物阻抑时的值。

对于大多数发酵过程而言，在诱导期中将主要碳源添加调整至导致比生长速率μ≤0.2h^-1的量是适当的。

无论如何，对于任何具体的发酵过程，比生长速率μ的合适值可通过常规工作来容易的测定。

使用的载体以及宿主的构建和转化是如上文中所定义的。

作为细胞培养系统，连续或不连续培养例如分批培养或补料分批培养可用于培养管、摇瓶或细菌发酵罐等。

优选地，在诱导期中，当靶多肽表达时，将主要碳源按指数添加至培养基中。

为了培养所述遗传上改变的细菌宿主细胞，可使用本领域中已知的常规培养基，例如复合培养基，如“营养酵母液体培养基（nutrientyeast broth medium）”，如Kortz等人,J.Biotechnol.(1995)39：59-65描述的含甘油的培养基，由Kulla等人Arch.Microbiol.(1983)135：1描述的无机盐培养基，由Bertani等人,J.Bacteriol.1951)62：293-300描述的LB-培养基或由Wilms等人,Biotechnol.Biong.(2001)73：95-103描述的用于大肠杆菌发酵的分批培养基。

培养基包含用于将宿主细胞生长至期望细胞密度的适当的碳源，例如糖，如葡萄糖。作为碳源，使用针对相应宿主细胞的主要碳源，其与诱导物（其为所述宿主细胞的次级碳源）不同。

适当时可以例如通过添加其它成分例如缓冲剂、盐、维生素、氨基酸、抗生素或其它微量营养物来改进培养基，这对于本领域普通技术人员来说通常是已知的。同样地，还可在细胞培养过程中使用不同的培养基或培养基的组合。

在本发明的一个实施方案中，可向培养基中添加酪蛋白氨基酸。已发现，酪蛋白氨基酸在培养基中的存在可帮助抑制基础表达水平。

通常，可以以0.05%至0.1%(w/v)的量添加酪蛋白氨基酸。

根据本发明的用于生产异源多肽的一个实施方案，可使用在其基因组中包含编码甘露糖操纵子的基因的细菌宿主细胞，即对于该细菌宿主细胞而言甘露糖是次级碳源，并且例如葡萄糖是主要碳源。为了适合作为用于本方法的宿主，使所述细菌细胞不能灭活ManR（控制甘露糖操纵子的启动子的转录调节蛋白）。

例如，可缺失编码ManP的核苷酸序列manP，从而抑制通过ManP进行的磷酸化对ManR的灭活。

向缺失manP的细菌宿主细胞中引入包含有效地连接于编码靶多肽的核酸序列的启动子PmanR或启动子PmanP的载体。

将重组细菌宿主细胞在适合于所述细菌宿主细胞的培养基中生长，其中所述培养基可包含葡萄糖和/或可将葡萄糖以足以允许细菌宿主细胞增殖并且通过载体中包含的甘露糖启动子的葡萄糖介导的碳分解代谢物阻抑来抑制靶多肽的表达的量添加至培养基。

培养基的葡萄糖水平一降至低于碳分解代谢物阻抑所需的值，载体的甘露糖启动子的碳分解代谢物阻抑就被解除，并且甘露糖启动子开始表达多肽而无需通过甘露糖诱导。此外，由于在细菌基因组中，编码ManP的核酸序列被缺失，因此甘露糖启动子不能被通过ManP进行的磷酸化灭活。因此，本方法允许靶多肽在诱导性碳源不存在的情况下在特异性碳源诱导型启动子的控制之下表达。

通常地，在使用经包含甘露糖操纵子的启动子的载体转化的细菌宿主细胞进行的发酵过程的诱导期中，可将葡萄糖，即甘露糖操纵子的启动子的主要碳源以导致比生长速率μ≤0.2h^-1的量添加至发酵培养基中。此外，指数进料是优先的。

原则上，上文中提出的关于根本不需要诱导性碳源来诱导启动子的本发明第一替代方案的解释也适用于本发明的第二替代方案，其中可减少诱导所必需的碳源的量。

本发明的一个有利之处在于，控制编码靶多肽的异源核酸序列表达的启动子允许严密调控。

诱导性碳源的添加或存在不是必需的。

根据本发明的第一替代方案，启动子即使在诱导性碳源不存在的情况下（即在诱导物不存在的情况下）仍然处于活性状态。

已证明枯草芽孢杆菌的甘露糖操纵子的甘露糖启动子PmanP是强启动子。在Sun T.等人“Characterization of a mannose utilizationsystem in Bacillus subtilis“J.Bacteriol192,2010,2128-2139（将其通过引用并入本文）中给出了甘露糖操纵子的详细论述。

PmanP对基因表达的强控制特征使该启动子适合用于有价值多肽的异源生产。然而，本发明已发现牵涉甘露糖操纵子的枯草芽孢杆菌表达系统需要较高量的甘露糖以获得持久的高表达速率。假定诱导物甘露糖的快速消耗的原因是甘露糖为枯草芽孢杆菌的最喜爱的碳源之一。然而，甘露糖是相当昂贵的糖，使得这样的表达系统在经济上不适用于大规模工业应用。

为了优化这样的表达系统以用于工业应用，诱导物必须不能被代谢掉。

根据本发明，这可通过操作或优选破坏宿主细胞染色体基因组中的甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA以使宿主细胞不能将进来的甘露糖-6-磷酸转化成随后进入糖酵解的果糖-6-磷酸来实现。

这样的表达系统需要少得多的诱导物，然而可获得高表达速率。

如上文中所示的，特别有利的表达系统是可自诱导的表达系统，即不再需要任何诱导物的表达系统。根据本发明的一个优选实施方案，这样的自诱导表达系统可通过在细菌宿主细胞基因组的甘露糖操纵子中使基因manP不能灭活（通过阻止ManP对ManR的EIIB和EIIB样结构域的磷酸化）调节蛋白ManR来获得。

优选地，缺失染色体基因manP（敲除突变体）。

在这样的表达系统中，PmanP启动子仅受由葡萄糖引起的CCR调节控制。直到葡萄糖变得有限，调节蛋白ManR才可结合其操纵基因系统并且开始表达。由于实际上未发生早熟基因表达，因此这样的自诱导表达系统是非常适合用于工业应用的。

例如，在补料分批发酵中，实际上在分批期中未观察到不希望的表达，并且无需添加任何诱导物而在整个补料分批期中获得高表达水平。这样的表达系统特别适合高细胞发酵并且允许获得高表达速率。

由本发明提供的新型表达系统，特别地新型自诱导系统，确实对提高产率和减少与其技术应用相关的成本作出了相当大的贡献。

如在下列实施例中所显示的，本发明通过培养本发明的遗传上改变的细菌宿主细胞来生产异源多肽，其中在遗传上改变的细菌宿主细胞的生长过程中和在诱导之前，仅有极低或没有多肽的早熟表达，即，基本上不存在控制编码多肽的基因表达的启动子的泄漏。此外，在自诱导后立即以高生产速率和高终产量开始多肽的产生。

还显示了本发明的其它替代方案的实例，其中在具有拥有甘露糖诱导型启动子和异源核酸序列的载体的细菌宿主细胞的基因组中，编码甘露糖-6-磷酸异构酶的基因发生缺失。

上述说明将通过参考下列实施例来更全面地理解。然而此类实施例只是实施本发明的方法的示例，并且无意限定本发明的范围。

I)甘露糖操纵子的manR启动子和manP启动子的启动子区域的分离和鉴定

如果未另外说明，则使用下列材料和方法：

细菌菌株和生长条件

将大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron C.等人,Gene33,1985,103-119)和枯草芽孢杆菌3NA，一种在spo0A基因中具有突变的不产孢子枯草芽孢杆菌菌株(Michel J.F.等人,J.Appl.Bacteriol.33,1970,220-227)用作克隆和表达的主要宿主。用于发酵实验的其它菌株是枯草芽孢杆菌3NA突变菌株TQ281(spo0AΔmanA:：ermc)(Sun T.等人,J.Bacteriol.192,2010,2128-2139)和TQ356(spo0AΔmanP:：ermc)(参见下面II,实施例4,b)。

将菌株在37℃于LB培养基中生长(Bertoni G.,J.Bacteriol.62,1951,293-300)。

选择条件如下：100μg ml^-1氨苄青霉素、100μg ml^-1壮观霉素、5μg ml^-1红霉素。

为了诱导甘露糖启动子，将无菌过滤的或高压灭菌的D-甘露糖添加至0.2%w/v的终浓度。

材料

所有化学药品获自Sigma-Aldrich(Taufkichen,Germany)、Fluka(Buchs,Germany)或Merck(Darmstadt,Germany)。合成DNA寡核苷酸购自Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)。限制性内切酶和DNA修饰酶购自Roche Applied Science(Mannheim,Germany)或New England Biolabs(Frankfurt am Main,Germany)。在来自MJResearch Inc.(Walthan,Massachusetts,USA)的MiniCycler TM上利用来自Fermentas(ST.Leon-Rot,Germany)的高保真-DNA聚合酶进行PCR。

DNA的制备和转化

如由制造商所描述的，利用Qiagen(Hilden,Gemrany)或Roche(Mannheim,Germany)的DNA制备试剂盒从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或从琼脂糖凝胶分离DNA。在整个实验中使用标准分子技术。

如由Chung C.T.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,1989,2172-2175所述，利用质粒DNA转化大肠杆菌。按照改良的“Paris法”(Harwood C.R.Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley&Sons Ltd.,England)利用质粒DNA转化枯草芽孢杆菌。

β-半乳糖苷酶活性测量

利用900μl Z-缓冲液和10μl甲苯在37℃下处理待检查的0.1ml细胞30分钟。根据Miller法(Miller J.H.,1972,experiments inmolecular genetics,Cold Spring Harbor,NY)利用o-硝基苯基-β-半乳吡喃糖苷在22℃下测定β-半乳糖苷酶活性。

使用的寡核苷酸（引物）

表1.

实验1：

分离具有甘露糖操纵子的启动子区域的DNA片段以及确定manR启动子和manP启动子的转录起始位点。

通过使用Qiagen的DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Hilden,Germany)分离枯草芽孢杆菌168的染色体DNA。

使用引物s4693/s4694通过PCR从获得的DNA扩增具有整个manR基因和manR启动子以及manR与manP之间并且具有manP启动子的基因间区域的约2.3kb DNA片段。

将获得的约2.3kb DNA片段用于引物延伸实验以测定manR启动子和manP启动子的转录起始位点。

为了分离mRNA用于引物延伸，从大肠杆菌载体pIC20HE(Altenbuchner等人,1992,Methods Enzymol.216,457-466)和枯草芽孢杆菌载体pUB110(MacKenzie等人,1986,Plasmid15,93-103)构建穿梭因子。载体包含lys基因作为报道基因，其编码来自模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans）的溶葡萄球菌酶的成熟形式(Recsai等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84,1127-1131)。

将2.3kb DNA片段克隆到高拷贝pUB110衍生物中溶葡萄球菌酶基因的上游。所得的质粒命名为pSUN178.4，将其引入枯草芽孢杆菌3NA。

将具有质粒pSUN178.4的枯草芽孢杆菌3NA生长在含有卡那霉素的LB培养基中。在指数生长期，利用0.2%w/v甘露糖诱导培养物。在于37℃生长1小时后，收获诱导的和未诱导的细胞。利用Qiagen-RNeasy Min试剂盒分离总RNA。

使用在5’-末端用Cy5标记的引物s5006、s5007、s5097和s5098。

引物s5006和s5007分别杂交到针对于溶葡萄球菌酶基因的起始密码子而言+21至+50和+76至+105处。引物s5097和s5098分别杂交到针对于manR而言起始密码子而言+81至+101和+131至+153处。

将相同的引物用于pSUN178.4的质粒DNA的测序反应，所述质粒DNA用作大小标准。将AMV-逆转录酶和T7-DNA聚合酶（来自Roche）分别用于逆转录和DNA测序。在变性聚丙烯酰胺测序凝胶(GEhealthcare)上分析逆转录和测序的产物。使用的所有其它试剂由Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing试剂盒提供。

manP-启动子的转录起始位点通过使用引物s5006来测定。制备利用相同引物的质粒pSUN178.4的DNA序列反应物，将其在同一变性凝胶上电泳以进行比较。

图5显示围绕manP启动子的DNA序列，A（腺嘌呤核苷酸）处的转录起始位点被突变显示。推断的-10和-35框以斜体字标示，manR基因的末端以箭头标示，BglII、NruI、XbaI、NdeI、AflII的限制酶切位点以下划线标示。IRI-P表示不完美的反向重复序列，推定的ManR结合位点。

manR启动子的转录起始位点通过RNA分离和DNA测序来进行测定，除使用结合manR基因的引物s5098外，如对于manP启动子所描述的进行所述RNA分离和DNA测序。

在图4中，显示了manR启动子区域的DNA序列，G（鸟嘌呤核苷酸）处的转录起始位点被突出显示，推定的-10和-35框以斜体字标示，核糖体结合位点(RBS)以下划线标示，manR基因的起点以箭头标示。限制酶切位点和推定的cre序列以下划线标示。IRI-R显示不完美的反向重复序列，推定的ManR结合位点。

当细胞被甘露糖诱导时，来自manR启动子、特别地来自manP启动子的转录强烈增加，如通过引物延伸实验中强得多的信号所看到的。

使用的引物示于上面的表1中。

实验2

根据实验1的引物延伸实验将manP启动子的转录起始位点定位到manR与manP的起始之间的基因间区域的3’末端附近。为了更精确地测定manP启动子区域，通过PCR扩增逐步地缩短2.3kb DNA片段，将所获得的具有不同长度的序列片段克隆回相同的基础表达载体，并且研究表达。

a)基础表达载体的构建

构建以无启动子lacZ作为报道基因的表达载体。将表达载体设计为能够在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌二者中复制的穿梭载体，命名为pSUN272.1。

利用NdeI和XmaI从pLA2切割报道基因lacZ(Haldimann A.等人,2001,J.Bacteriol.183,6384-6393)，将其连接入pJOE5531.1（鼠李糖诱导性表达载体pWA21的衍生物）(Wegerer等人,2008,BMC.Biotechnol.8,2)，所述pJOE5531.1在XmaI位点包含枯草芽孢杆菌tufA转录终止子。将一对寡核苷酸s4956/4957插入该质粒中AflII/MunI限制酶切位点之间，以将相同的tufA转录终止子添加到lacZ的上游。这样就通过终止子避免了从质粒启动子“通读”至lacZ内以及再从lacZ内“通读”至侧翼质粒序列内。利用寡核苷酸s4833/4835从质粒pDG1730(Geurout-Fleury等人,1996,Gene180,57-61)扩增用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的壮观霉素抗性基因spc，将其插入上文中获得的质粒。此外，大肠杆菌载体部分通过缺失BspHI/HindIII片段来缩短。随后，将具有枯草芽孢杆菌pMTLBS72的复制区的EcoRI/SphI片段(Lagodich等人,2005,Mol.Biol.(Mosk)39,345-348)连接进入质粒。

通过利用AflII和NheI消化和连接，将实验1中获得的2.3kb DNA片段插入pSUN272.1中lacZ之前，从而获得表达载体pSUN279.2，质粒图谱示于图7。

使用的引物示于上文表1中。

b)载体pSUN279.2的表达效率的测定

将在上文a)中获得的质粒pSUN279.2和pSUN272.1引入枯草芽孢杆菌3NA中。后者用作背景对照。将具有其中一个或另一个质粒的枯草芽孢杆菌3NA株生长在具有壮观霉素的LB培养基中，在指数生长期，将0.2%甘露糖、0.2%甘露糖+0.2%葡萄糖添加至或不将糖(未诱导的对照)添加至培养物以进行诱导。在1小时的诱导后，通过Miller’s测定法测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果示于图8中。

包含pSUN279.2的枯草芽孢杆菌的未诱导培养物已显示相当高基础水平的β-半乳糖苷酶活性。甘露糖的存在导致β-半乳糖苷酶活性进一步增加4倍，然而具有甘露糖和葡萄糖的活性下降，但仍然明显高于基础水平。结果明确地表明在pSUN279.2中看见的启动子活性可能源自manR与manP之间的区域，源自manR上游的区域或源自两者。

因此，通过切除pSUN279.2的2.3kb DNA片段（如图7中显示的SfoI与NruI之间的片段），从pSUN279.2缺失manR的上游区域以及manR的大部分，以产生质粒pSUN284.1。

利用该质粒pSUN284.1转化枯草芽孢杆菌3NA，如上所述测定表达效率。结果示于图8中。如可从图8中看到的，枯草芽孢杆菌3NA中这种manR缺失的载体pSUN284.1与枯草芽孢杆菌3NA中pSUN279.2相比较而言仅显示β-半乳糖苷酶活性基础水平的大约一半，在甘露糖诱导时显示甚至更强的增加，并且在葡萄糖存在的情况下同样显示更强的下降。这些结果证明manP启动子位于manR与manP之间，并且显示manR的染色体拷贝足以调节低拷贝质粒上的所有manP启动子拷贝。

c)manP启动子区域的定位

为定位manP的启动子区域，除了pSUN284.1上述的缩短的DNA片段外，还通过利用PCR扩增在manP启动子的转录起始位点上游的不同位置处缩短的DNA片段来从该2.3kb DNA片段制备其它缩短的序列片段，然后将所述片段插入pSUN272.1中，如图5中显示。

缺失至manP转录起始位点上游bp-81和bp-80导致了包含SEQID NO.1的第二缺失序列。

进行进一步的缺失，达到manP转录起始位点上游的bp-41和bp-40(第三缺失序列)。

以与上文2b)中质粒pSUN284.1相似的方式，通过将利用引物s4802/s5203和s5262/s5203扩增的PCR产物经限制性内切酶EcoRV和NheI分别插入pSUN272.1来构建包含第二缺失序列的质粒pSUN290和包含第三缺失序列的质粒pSUN297.5。

将质粒插入枯草芽孢杆菌3NA，如上文b)中所示进行培养。在1小时诱导后，如上文b)中所示测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果示于图9中。

如图9中所示，具有pSUN290和pSUN284.1的菌株在甘露糖对于lacZ的诱导方面都未显示显著的差异。然而，在包含pSUN297.5的枯草芽孢杆菌3NA中，甘露糖的诱导被完全消除，基础表达水平几乎为0。从这些结果可以看出，manP甘露糖启动子区域的ManR结合位点位于相对于manP转录起始位点而言的-80与-35之间。

实验3：manR启动子的确定

a)cre序列的鉴定

由于破壁菌门中的大部分CCR通过分解代谢物控制蛋白A(CcpA)介导，因此使用Clone Manager程序中的DNA比对功能在完整甘露糖操纵子中进行相应结合位点（cre序列）的搜寻。为了比对，使用cre共有序列5’-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’。

仅在manR的启动子区域中发现一个推定的cre序列，如图4中所显示的，其被定位在下游-10框。

b)manR启动子的表达效率的评估

为了评估manR启动子的表达效率，如上文中所示构建表达载体如pSUN284.1，命名为pSUN291。为达到该目的，利用引物s5208/s5209并且以线性化质粒DNA pSUN279.2作为模板扩增包括推定的manR-启动子和manR上游约600bp的DNA片段，随后通过利用KpnI和AflIII消化和连接而将其插入在质粒pSUN272中的lacZ之前。

图4中显示了所述DNA-序列。

将质粒pSUN291引入枯草芽孢杆菌3NA，如上文实验2b)中所示测量β-半乳糖苷酶活性。

结果示于图10中。此处，基础表达已相对较高，并且通过添加0.2%甘露糖进一步增加3倍。葡萄糖的添加导致将β-半乳糖苷酶活性抑制至几乎基础表达水平。

结果显示manR启动子不仅是弱组成型启动子，而且还受到甘露糖和CCR调控。

c)manR启动子区域的定位

如实验2c)中一样，为了进一步定位manR的启动子区域，利用在manR启动子的转录起始点上游不同位点处结合的引物(引物s5932和s5933)和结合lacZ基因的下游的引物(s5934)(图4)，通过PCR扩增DNA而从如pSUN291内包含的DNA-序列制备不同长度的DNA片段。

通过将图4中显示的序列缩短至转录起始位点G上游的bp-82和bp-81获得第一缺失序列，通过将其缩短至转录起始位点G上游的bp-62和bp-61获得第二缺失。

与实验2c)类似，利用限制性内切酶SacI和NheI消化所述PCR片段，将其连接于利用相同限制性内切酶消化的pSUN279.2DNA，将所得的质粒分别命名为pSUN385.2和pSUN386.9。

将每一个质粒插入枯草芽孢杆菌3NA，如实验2b中所示进行培养。在1小时的诱导后，如实验2b中所示测定细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果示于图10中。在甘露糖对lacZ的诱导方面，包含pSUN385.2的枯草芽孢杆菌3NA与包含pSUN291的枯草芽孢杆菌3NA相比较没有显著差异。然而，在具有第二缺失序列的枯草芽孢杆菌pSUN386.9中，甘露糖导致的诱导被完全消除，基础表达水平几乎为0。从该结果可以看出，manR启动子区域的ManR结合位点位于相对于manR的转录起始位点而言bp-81与bp-35之间。ManR结合位点甚至可能与-35序列重叠，正如对于经典激活物所发现的一样，因为在所推测的结合位点中发现的反向重复序列延伸入所推测的-35序列。

II)构建具有遗传改变的甘露糖操纵子基因区域的重组宿主细胞

实验4：转化

a)作为表达载体的质粒pMW168.1的构建

使用如图5中所示引入质粒pSUN284.1和实验2c中使用的manP启动子区域核酸序列，如下所示构建质粒pMW168.1，将其引入作为宿主的枯草芽孢杆菌3NA。

除将eGFP而非lacZ用作报道基因外，如实验2a)中所示设计可在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均可复制的穿梭载体。此外，还用基因gsiB的转录起始区(Stress protein；Jürgen等人,同上)替代manP的转录起始区。由此也替换了eGFP的起始密码子和起始密码子后的6个密码子。

获得的启动子和转录起始区的示意性结构如下：

显示了基因(箭头)和区域(框)与相关限制性酶切位点的排列。

所使用的gsiB的转录起始区的序列为：

5′-cttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGGCAGACAATAACAAAggatcc-3′

Aflll SD 起始密码子 BamHI

一般地，如图15的流程图所示获得质粒pMW168.1：

在流程图中，使用的载体-DNA、插入物-DNA和互补寡核苷酸的名称示于框中；关于PCR的产物，引物和模板-DNA如示于括号内，使用的限制性酶切位点示于相应的位点。

利用大肠杆菌JM109进行克隆步骤。

使用的质粒为pUC18，具有amp-抗性的用于PCR产物的克隆载体(Yanosch-Perron等人,supra)；pWA21，具有amp-抗性的用于大肠杆菌的表达和克隆载体(Wegerer等人,2008,BMC Biotechnol.8,2)；pSUN202.4，具有manP启动子区域以及amp和kan抗性的pUB110衍生物，其为用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的穿梭载体；以及pSUN266.1，在ter-序列与spc之间具有整合位点以及具有amp抗性的pUC18衍生物。

质粒pSUN266.1为鼠李糖诱导性表达载体pWA21的衍生物，其中鼠李糖启动子和eGFP基因被这样的序列替代，所述序列以正向包含被BamHI、SmaI和AflII的限制性酶切位点分隔的枯草芽孢杆菌tufA基因的两个转录终止子(参见下列序列)和壮观霉素抗性基因。后者利用引物s4833和s4835(表1)从质粒pDG1730(Cuerout-Fleury等人1996)扩增。在最终构建体pMW168中，将甘露糖启动子和eGFP基因插入在两个tufA转录终止子序列之间。

BamHISmalAfl11

AATTGCGTCGAGACCCCTGTCGGTCTCGTTTTTTGGATCCCCGGGACGTCGAGACCCCTGTG

TTAACGCAGCTCTGGGGACACCCAGAGCAAAAAACCTAGGGGCCCTGCAGCTCTGGGGACAC

Pmel Hindlll

GGTCTCGTTTTTTGTTTAAACAAGCTT

CCAGAGCAAAAAACAAATTTGTTCGAA

两个tufA终止子序列(粗斜字)以及序列之间和其末端的限制酶内切位点(以下划线标示)的核苷酸序列。

使用互补寡核苷酸和通过单个限制酶内切位点BglII、AflII和BamHI进行包括起始密码子和起始密码子之后的密码子的转录起始区的替代。载体的构建始于枯草芽孢杆菌的tufA转录起始区分别通过互补寡核苷酸s5019和s5020对载体pWA21(Wegerer等人,同上)的T7基因10的转录起始区的替换。在进一步克隆步骤中，该转录起始区被gsiB的转录起始区(寡核苷酸s5236/s5237)替换。最终质粒pMW168.1包含rep基因，包括来自pUB110的ori+在内。

pMW168.1的质粒图谱示于图11中。

b)缺乏manP(ΔmanP)和manA(ΔmanA)的缺失突变株

b1)用于manP的缺失的插入载体

插入载体pSUN356.7用于缺失编码来自芽孢形成缺陷型枯草芽孢杆菌NA染色体上的甘露糖-操纵子的甘露糖特异性EII的基因manP，所获得的菌株命名为枯草芽孢杆菌TQ356(spo0AmanP::ermC)。使用红霉素抗性盒作为选择标记。

载体pSUN356.7为pUC18衍生物(氨苄青霉素抗性)，并且包含侧翼连接manR和manA的序列的红霉素抗性基因和位于替换盒外之外的壮观霉素抗性基因。从pDG1730(参见上文针对pSUN266.1所述)扩增壮观霉素抗性基因。利用引物s5069和s5070从质粒pDG1730扩增红霉素抗性基因。利用引物s5407和s5408从枯草芽孢杆菌DNA扩增manR基因的C末端，将其插入在红霉素基因的一侧。利用引物s5362和s5363从枯草杆菌染色体扩增manA的N末端，将其插入在红霉素抗性基因的另一侧。

质粒pSUN356.7的图谱示于图12中。

b2)manA的缺失

此外，利用来自芽孢形成缺陷型枯草芽孢杆菌3NA染色体上的甘露糖操纵子的缺失型manA产生枯草芽孢杆菌敲除突变体，使用插入载体pSUN281得到枯草芽孢杆菌TQ281(spo0A3,manA::ermC)(参见Sun T.等人,同上)。

基因manA编码将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸的甘露糖-6-磷酸异构酶。

为了监控成功的缺失，使用红霉素抗性盒。

b3)转化

上述b1)和b2)的枯草芽孢杆菌TQ356和枯草芽孢杆菌TQ281各自利用a1)中获得的质粒进行转化。

使用的培养基：

a)最小葡萄糖(MG)：

2.0g (NH₄)SO₄

6.0g KH₂PO₄

14.0g K₂HPO₄

1.0g Na₃Citrat

0.2g MgSO₄*7H₂O

5.0g 葡萄糖(单独地为20-50%原液)

b)培养基I：

9.50ml MG

0.20ml 酪蛋白氨基酸(1%的原液)

0.05ml MgSO₄(1M的原液)

c)培养基II：

8.00ml MG

0.10ml 酪蛋白氨基酸(1%的原液)

0.05ml MgSO₄(1M的原液)

按照Anagnostopulos等人,“Requirements for transformation inBacillus subtilis”J.Bacteriol.(1961)81：741-746的方案进行转化。

将每一个细菌株的单个菌落接种到5ml培养基I中，在37℃下在摇床中温育过夜。将1ml过夜培养物(1与2之间的OD₆₀₀)转移入100ml带挡板透明三角瓶（baffled Erlenmeyer flask）中的8ml培养基II中，在37℃温育85分钟。随后将1ml感受态细胞转移入SchüttCompany的试管中，将其与相应的插入载体混合。在与感受态细胞混合之前，插入载体已利用单一切割者在非必需位点进行了切割。通过异丙醇沉淀获得的混合物，让其在室温下连接至少2小时。

随后，将所获得的转化细胞在摇床中在37℃温育30分钟，在室温下以4,500rpm离心5分钟。将沉淀重悬浮于残留液体中，然后涂板。

实验5：发酵

5.1材料和方法

一般地，如果没有另外说明，同样地也将标准分子技术用于发酵实验。

用于发酵的培养基的组成

在补充有0.02%(w/v)酪蛋白氨基酸(BD Difco^TM,Sparks,Maryland,USA)以及用于质粒选择的100μg mL^-1壮观霉素和用于菌株选择的5μg mL^-1红霉素(在TQ281和TQ356存在的情况下)的Spizizen’s最小盐培养基(SMM)中进行过夜培养和预培养#1(SpizizenJ.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1958,1072-1078)。使用由1.0g L^-1(NH₄)₂-H-柠檬酸盐、2.0g L^-1Na₂SO₄、2.68g L^-1NH₄SO₄、0.5gL^-1NH₄Cl、14.6g L^-1K₂HPO₄、4.0g L^-1Na₂HPO₄×2H₂O、1.0g L^-1MgSO₄×7H₂O、3mL L^-1微量元素溶液(TES)、5g L^-1葡萄糖（用于预培养#2）和25g L^-1葡萄糖（用于分批培养基）组成的从Wilms等人(Wilms B.等人,Biotechnol.Bioeng.73,2001,95-103)改良的矿质培养基进行预培养#2和发酵培养(分批)。TES包含0.5g L^-1CaCl₂、0.18g L^-1ZnSO₄×7H₂O、0.1g L^-1MnSO₄×H₂O、10.05g L^-1Na₂-EDTA、8.35g L^-1FeCl₃、0.16g L^-1CuSO₄×5H₂O和0.18g L^-1CoCl₂×6H₂O。当使用KLF反应器时，用于高细胞密度发酵的补料培养基（feed medium）包含200g L^-1葡萄糖,7.89g L^-1MgSO₄×7H₂O,40mL L^-1TES和63.36g L^-1(NH₄)₂HPO₄。将pH调整至3.3以确保所有组分的可溶性。当使用30L反应器时，使用两种分开的补料培养基。第一培养基包含654.76g L^-1葡萄糖×H₂O、23.5g L^-1MgSO₄×7H₂O、120mL L^-1的TES，第二培养基包含396g L^-1(NH₄)₂HPO₄。为了诱导manP启动子，使用20%(w/v)D-甘露糖溶液或包含200g L^-1甘露糖、7.89g L^-1MgSO₄×7H₂O、40mL L^-1的TES和63.36g L^-1(NH₄)₂HPO₄的分开补料溶液。

预培养和补料分批培养条件

将来自LB琼脂板的单个菌落接种在5mL的SMM中，在37℃下温育过夜，进行至少14小时。将25mL的SMM转移至250-mL摇瓶，用过夜培养物接种所述SMM，至600nm下的光密度(OD₆₀₀)达到0.05(预培养#1).。在于37℃温育5小时后，将20mL的预培养物#1用于在1000-mL摇瓶(预培养#2)中接种200mL的预培养#2培养基。在于37℃下再温育7小时后，用预培养物#2接种分批培养基。

使用先前开发的并且针对大肠杆菌最优化的以葡萄糖作为主要碳源的补料分批发酵方案(Korz D.J.等人,J.Bacteriol.39,1995,59-65；Wilms同上)。当使用3.7升的小型实验室发酵罐KLF(BioengineeringAG,Wald,Switzerland)时，批容积（batch volume）为1.5L，并且补料容积（feeding volume）为1.0L。在30升的实验室发酵罐D598(LF；Bioengineering AG,Wald,Switzerland)的情况下，批容积为8.0L，葡萄糖补料培养基为4.2L以及氨补料培养基为1.0L。将葡萄糖和氨培养基以81%:19%的比率补入反应器。按照下式将补料培养基补入生物反应器：

F(t)=[(μ_set/Y_X/S)+m]×[(c_x0×V₀)/c_s0]×exp(μ_set×t) Eq.1

其中F(L h^-1)为补料速率（feeding rate），μ_set(h^-1)为期望的比生长速率，m(g g^-1h^-1)为比维持系数（specific maintenance coefficient）(=0.04g g^-1h^-1)，Y_x/s为比生物质/底物产率系数(对于葡萄糖为约0.5)，c_x0(g L^-1)为进料开始时的生物质浓度，V₀(L)为进料开始时的反应器容积，c_s0(g L^-1)为补料溶液中的葡萄糖浓度，以及t(h)为补料开始后时间。选择0.1h^-1的比生长速率以避免产生非特异性和不想要的副产品并且避免氧限制。

在37℃下进行分批发酵直至将温度转换至30℃，开始补料分批期期以避免表达的异源蛋白质的不期望的包涵体形成。分别利用24%(v/v)NH₄OH和20%(v/v)H₃PO₄将pH调整至7.0。通过自动调节搅拌速率将pO₂值维持在超过50%的饱和度。当使用KLF时通气速率恒定地保持2L min^-1，当使用LF时为15-25L min^-1。超压（overpressure）保持在0.5bar。通过利用Ultrospec^TM1100pro UV/可见光分光光度计(GE Healthcare,formerly Amersham Biosciences,United Kingdom)定期测量OD₆₀₀来测定细胞密度。通过将OD₆₀₀值乘以0.322g_cdw L^-1的系数，来计算细胞干重（cdw），所述系数是在发酵过程中利用MB835Halogen(Ohaus Corporation,Pine Brook,NewJersey,USA)在几次含水量测定后获得的平均值。将Biolog1.7软件包(Institute of Biochemical Engineering,University of Stuttgart,Germany[http://www.ibvt.uni-stuttgart.de])用于控制发酵参数。在约40小时的工艺时间后终止补料分批发酵。

在线和离线荧光测量

为了实时跟踪所生产的重组eGFP的表达速率，在生物反应器内使用荧光探针(Mikropack HPX-2000,High Power XenonLightsource；Ocean Optics,Inc.；S2000fibre optic spectrometer；Dunedin,Florida,USA)。激发波长为485nm，而在535nm检测发射，通过Spectra Suite软件包(Ocean Optics,Dunedin,Florida,USA)进行在线记录。使荧光通过具有强度为0.6的光学滤波器的波道。探针的积分时间为50msec。由于软件只能计数达到4,000个计数的计数值，因此在达到更高水平时，将积分时间逐步减少。因此，随后将荧光计数乘以相应的减少系数（reduction factor）以获得相应于50msec的值。测量的值特异于某一反应器容积。

此外，通过使用SpectraFluor Microplate读数器(Tecan GroupLtd.,

,Switzerland)进行荧光活性离线测量。因此，使用3×250μl分批培养基作为空白试验值，在96孔微量滴定板(Greiner-BioOne GmbH,Frickenhausen,Germany)中测量3×250μl的未稀释细胞培养物(激发滤波器：485nm；发射滤波器：535nm；增益(手工)：60；积分时间：20μsec；闪烁总数：3；读取模式：顶部)。从样品的平均值减去空白试验值的平均值以获得终值。一达到20,000的计数就将细胞培养物稀释在分批培养基中。

根据针对内部纯化的eGFP标准(约95%的纯度，1.3g L^-1)的校准，可以推知约120,000的离线测量计数相应于1g_eGFP L^-1。可以看出，在离线与在线测量的值之间存在线性相关性（linear coherence），相关度为每7470个在线测量计数对应1.5geGFP L^-1。

质粒稳定性的测定

通过按照Harwood和Cutting(Harwood C.R.等人,MolecularBiological Methods for Bacillus,1990,John Wiley&Sons Ltd.,Chichester,England)测量包含质粒的细胞的级分来测定载体pMW168.1的稳定性。

利用SDS-PAGE的蛋白质分析

如下获得粗制细胞提取物：收获10¹⁰个细胞，随后离心。用1mL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)重悬浮沉淀的细胞，使用超声(HeatSystems-Ultrasonics,Inc.,model W-385sonicator,Farmingdale,NewYork,USA；3×30秒，50%工作周期)溶解所述细胞。离心后从上清液获得可溶性蛋白质级分，通过用1mL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)重悬浮沉淀来获得不溶性级分。利用SDS-PAGE(Laemmli U.K.,Nature227,1970,680-685；LeBlanc D.J.等人,Antimicrob.AgentsChemother35,1991,1804-1810)分析蛋白质级分。

5.2使用枯草芽孢杆菌3NA/pMW168.1的高细胞密度发酵

在补料分批发酵中测试利用枯草芽孢杆菌3NA/pMW168.1的甘露糖表达系统。如先前所述(Korz等人,Wilms等人,同上)使用方案。

在于LF搅拌反应器中进行的第一发酵中，将一剂0.2%(w/v)D-甘露糖添加至液体培养基中，随即开始补料分批期。到当前为止未显示显著荧光的探针的荧光信号，在一诱导后就极迅速增加。在于补料分批期中4小时后达到约2,200次计数的峰值后，信号开始再次稳定地衰减。该衰减伴随着诱导物的消耗（通过HPLC测量的，数据未显示）。在该过程结束时，产生0.2geGFP L^-1或3mg_eGFP/g_cdw。

在第二发酵中，使用另外的指数式D-甘露糖补料。这与葡萄糖补料同时开始，从而使两种进料的总体糖浓度保持与第一发酵中一样高。荧光信号在诱导物一加入后就开始，并且延续直至该过程结束。将总量50g D-甘露糖添加至反应器液体培养基以维持该增加。利用本诱导方案，产生2.1g_eGFP L^-1或53mg_eGFP/g_cdw。利用枯草芽孢杆菌3NA/pMW168.1进行的两个发酵的详细结果概述于5.5结果中显示的表中。

eGFP产量在整个进料期一直在增加，但比生物质产生慢。质粒稳定性检查显示约95%的细胞在两个发酵过程结束时仍然具有所述载体。

5.3使用ΔmanA菌株TQ281进行的高细胞密度发酵

选择不能在以甘露糖作为唯一碳源生长的manA缺失菌株TQ281(Sun T.等人,同上)用于进一步发酵实验。用pMW168.1转化的枯草芽孢杆菌TQ281在摇瓶实验中显示针对D-甘露糖的敏感性。

利用TQ281/pMW168.1建立2个补料分批发酵。在第一补料分批发酵中，通过在补料分批期开始时一次性添加甘露糖来进行诱导。在第二补料分批发酵中，同时开始另外的指数式甘露糖进料。利用D-甘露糖的诱导显示在补料分批期中对比生长速率没有显著影响。利用一次性添加策略，可获得相应于36mg_eGFP/g_cdw的0.71g_eGFP L^-1，利用指数式进料策略，获得相应于32mg_eGFP/g_cdw的1.9g_eGFP L^-1。两个发酵的详细结果列于5.5结果的表中。

5.4使用ΔmanP菌株TQ356在高细胞密度发酵中开发和应用自诱导表达系统.

枯草芽孢杆菌ΔmanP菌株TQ356显示在非诱导型条件下的来自P_manP的组成型表达，以及当葡萄糖存在时的CCR效应(Sun T.等人,同上)。用pMW168.1转化该菌株，这导致相当小的荧光菌落。在将0.5%(w/v)葡萄糖添加至选择培养基后，菌落生长被标准化。在摇瓶实验中，当葡萄糖被耗尽时获得高表达水平（数据未显示）。

随后将具有pMW168.1的枯草芽孢杆菌TQ356用于补料分批发酵(图13)。在补料分批期中，未检测到显著荧光，与枯草芽孢杆菌菌株3NA/pMW186和TQ281/pMW168的分批发酵相似。随着补料分批期的开始，反应器探针的荧光信号开始连续增加。在36小时的总体发酵时间后，细胞中的表达水平达到最大值，通过14.6%的Y_P/X恒定值可看到这一点（一直至发酵过程结束），该值相应于恒定的比生产率。在无诱导物的任何添加的情况下，产生几乎10g_eGFP L^-1（相应于146mg的eGFP/g_cdw）。发酵结果概述于下面5.5结果中所列的表中，将其与进行的其它发酵相比较。进行SDS-PAGE获得了关于与总蛋白质相比较而言表达eGFP的百分比的印象（impression）(图14)。由此可见，至少20%的总蛋白质为eGFP分子。只有少部分是不溶性并且以包涵体的形式存在(图14，泳道7)。未稀释的培养液上清液也通过SDS-PAGE进行分析(图14，泳道8)并且通过分光光度计进行测量。在上清液中发现约1%的总体测量的eGFP，这可能归因于在整个发酵过程中进行的细胞裂解。

可在整个发酵过程中检查质粒完整性和细胞形态学。

5.5结果

5.2至5.4的发酵运行的结果概述于下表中。

在不同诱导方案和使用的具有表达载体pMW168.1.b的枯草芽孢杆菌株方面进行的发酵的比较

b缩写和参数说明：SA：诱导物（甘露糖）的一次性添加；EF：诱导物（甘露糖）的指数式进料；AI：自诱导；final：在发酵过程结束时；LF：30升的实验室发酵罐；KLF：3.7升的小的实验发酵罐；tfb：补料分批时间/持续时间，final：在发酵结束时；cx,final：细胞干重浓度；Xfinal：绝对细胞干重；cP,final：产物浓度；PeGFP,final：绝对产物（absolute product）(eGFP)；YP/X：产物/g细胞干重；rP：比生产率，qP：容积生产率（volumetric productivity）。

如由这些结果显示的，在分批期过程中，实际上未发生报道分子eGFP的表达。在5.4的自诱导发酵中，发酵的分批期与补料分批期之间的葡萄糖限制转换期的开始时自诱导的起始及其在整个不足葡萄糖-限制性补料分批期中的维持导致产品收率有3倍增加，达到146mgGPF/gcdw。

此外如由利用TQ281(发酵5.3)获得的结果显示的，通过一次性添加诱导物获得的产率0.7g(eGFP)/L可通过在指数生长期中诱导物的额外补料而显著增加，达到1.9g/L。

5.6讨论

在发酵5.2至5.4中，使用在载体MW168.1中包含甘露糖启动子PmanP的枯草芽孢杆菌表达系统，以促进eGFP的表达。启动子PmanP已被证明是强启动子，在添加D甘露糖后被激活。

在发酵5.2中，利用该载体转化的枯草芽孢杆菌芽孢形成缺陷株3NA导致高产物水平，即2.1g_eGFP L^-1。与最近描述的关于巨大芽孢杆菌（B.megaterium）的系统（用于重组蛋白质生产的有前景的宿主系统）(Stammen等人,Appl.Environ.Microbiol.76,2010,4037-4046)相比较，枯草芽孢杆菌系统导致更优的结果。可由木糖诱导的细胞内巨大芽孢杆菌蛋白质生产系统产生1.25g_GPF L^-1，相应于补料分批发酵中的36.8mg/g_cdw。此外，Stammen等人(同上)使用抗生素直至发酵过程结束，结果在发酵过程中没有质粒丢失。

发酵5.2显示甘露糖系统在生产率方面相当有效，然而诱导物的一次性添加不能导致持久的高表达速率。这是由于诱导物甘露糖的快速消耗所致，因为其是枯草芽孢杆菌喜爱的碳源之一。

因此，本申请涉及用于在芽孢形成缺陷型枯草芽孢杆菌宿主细胞中生产异源多肽的方法，包括以下步骤：用包含有效连接于编码多肽的核苷酸序列的manP启动子的载体转染芽孢形成缺陷型枯草芽孢杆菌细胞，将转化的宿主细胞在允许所述多肽表达的适当条件下于培养基中生长，和从细胞或从细胞培养物回收多肽，其中多肽的表达通过添加诱导物甘露糖来诱导。在本申请的一个优选实施方案中，在补料分批期开始时添加诱导物甘露糖。在另一个优选实施方案中，首先在补料分批期开始时添加诱导物甘露糖，在同时利用葡萄糖补料的指数生长过程中进行甘露糖的第二次添加。

通过破坏甘露糖6-磷酸异构酶基因manA，经发酵5.3获得诱导物需求降低的表达系统。这导致其中需要更少诱导物来获得高表达速率（如可在摇瓶实验中观察到的）的系统。

然而，该系统伴随着细胞的自我毒化，因为当使用超过0.5%(w/v)的量的甘露糖时生长被抑制。这种效应可能是由于甘露糖-6-磷酸的细胞内积累所致。ΔmanA株TQ281对甘露糖的敏感性的另一个可能的原因可能是可供利用的磷酸基团的强烈减少，因为当磷酸根通过PTS进入细胞后，其不可逆地结合于甘露糖。

因此，本申请涉及用于在manA基因缺陷型枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达异源多肽的方法，包括以下步骤：利用包含有效地连接于编码多肽的核苷酸序列的manP启动子的载体转染manA基因缺陷型枯草芽孢杆菌细胞，将转化的宿主细胞在允许所述多肽表达的适当条件下于培养基中生长，从细胞或从细胞培养物回收多肽，其中多肽的表达通过以不超过0.5%(w/v)的量添加诱导物甘露糖来诱导。在本申请的一个优选实施方案中，在补料分批期开始时添加诱导物甘露糖。在另一个优选实施方案中，首先在补料分批期开始时添加诱导物甘露糖，在同时用葡萄糖补料的指数生长过程中进行甘露糖的第二次添加。

不再需要任何诱导物的诱导方法示于实施例5.4中。利用ΔmanP株TQ356和表达载体pMW168.1实施该自诱导系统。

在转运蛋白阴性菌株如TQ356中，甘露糖启动子仅受由葡萄糖引起的CCR的调控，其例如发生在发酵过程的分批期中。消除了由同源转运蛋白ManP产生的负调控作用。然而，只要葡萄糖存在，调节剂就停留在无活性状态。此外，由于manR操纵子位点被阻遏，因此没有充足量的ManR。直至葡萄糖变得限制性，ManR才可结合其操纵子序列并且开始表达。该自诱导系统使得不必需要相当昂贵的诱导物。这种有效的诱导策略对于工业应用是极具前景的，因为没有显著的不想要的基础表达在分批期中发生，并且不必添加任何诱导物来在整个补料分批期中获得高表达水平。

除此以外，还可获得与发酵5.2和5.3相比较而言与高产率组合的相对高的表达速率。可产生几乎10g L^-1的重组蛋白(eGFP)，相应于146mg_eGFP/g_cdw。产物因其溶解性而均匀地分布在细胞中，其可通过荧光显微镜检查和SDS-PAGE分析观察到。高表达速率，即高生产率可在恒定高水平上维持直至发酵过程结束。

因此，本申请还涉及用于在转运蛋白阴性枯草芽孢杆菌宿主细胞例如manP基因缺陷型细胞中产生异源多肽的方法，包括以下步骤：用包含有效地连接于编码多肽的核苷酸序列的manP启动子的载体转染转运蛋白阴性枯草芽孢杆菌细胞，将转化的宿主细胞在允许所述多肽表达的适当条件下在培养基中生长，和从细胞或从细胞培养物回收多肽，其中多肽的表达不由甘露糖诱导但处于葡萄糖的控制之下。

Claims

1.一种用于在重组细菌宿主细胞中生产异源多肽的方法，

其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上已被改变，从而不能在诱导性的次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白；并且其包含具有有效地连接于启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，所述启动子可被次级碳源诱导并且受转录调节蛋白调控，

所述方法包括包括如下步骤：在不包含所述诱导性次级碳源但包含不同碳源的细胞培养基中培养细菌宿主细胞，当该不同碳源的浓度降至低于碳分解代谢物阻抑所必需的水平时，由所述不同碳源诱导所述多肽表达，

以及从细胞或从细胞培养物回收所述多肽。

2.权利要求1或2的方法,

其中使用细菌宿主细胞，其中通过遗传改变，阻止了通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII的磷酸化而对转录调节蛋白的灭活。

3.权利要求3的方法,

其中i)在所述细菌宿主细胞的基因组中，缺失编码特异于所述转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因，或

其中ii)在所述细菌宿主细胞的基因组中，对编码转录调节蛋白的基因进行遗传改变，从而由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合从酶EII转移的磷酰基。

4.权利要求4的方法,

其中在情形i)中，将编码控制所述载体的启动子的转录调节蛋白的基因整合进入所述载体；或

其中在情形ii)中，将编码不能结合从相应酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的细菌宿主细胞遗传上操作的基因整合进入所述载体。

5.权利要求1至5中任一项的方法，

其中所述细菌宿主细胞选自芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌（Chlostridia）和埃希氏菌属。

6.权利要求1和5中任一项的方法，

其中所述培养基包含酪蛋白氨基酸。

7.权利要求1至7中任一项的方法，

其中在无所述诱导物诱导的情况下开始所述多肽的表达。

8.权利要求1至8中任一项的方法，

其中在无碳分解代谢物阻抑的诱导的情况下，将所述至少一种碳源以足以维持细菌宿主细胞的预定生长速率的量添加至培养物。

9.权利要求1和8中任一项的方法，

其中所述碳源诱导性启动子为甘露糖操纵子的启动子并且其中所述诱导性碳源为甘露糖。

10.权利要求10的方法,

其中所述启动子为甘露糖操纵子的P_manP或P_manR启动子。

11.权利要求11的方法,

其中i)在细菌宿主细胞的基因组中缺失所述编码manP的基因，或

其中ii)在所述细菌宿主细胞的基因组中，遗传上改变编码所述转录调节蛋白ManR的基因，从而由所述基因表达的ManR不能结合从特定酶Ell转移的磷酰基。

12.一种用于通过培养重组细菌宿主细胞生产异源多肽的方法，其中使用其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统控制之下的重组细菌宿主细胞，并且所述重组细菌宿主细胞已被遗传改造，从而其不能代谢碳源诱导型启动子的诱导性碳源，其中所述诱导性碳源为细菌宿主细胞的次级碳源，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有可被所述次级碳源诱导的启动子和有效地连接于该启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，

其中所述方法是补料分批法，其中在分批期后，通过添加第一部分的诱导性次级碳源起始诱导，同时开始第二部分的补料。

13.权利要求13的方法,

其中在所述细菌宿主细胞的基因组中，缺失编码诱导物特异性6-磷酸异构酶的基因。

14.权利要求14的方法,

其中该基因为甘露糖操纵子的基因manA。

15.权利要求1至15的方法，

其中所述细菌宿主细胞选自芽孢杆菌属。

16.一种重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且已通过缺失所述细菌宿主细胞的基因组中编码特异于转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因而在遗传上进行了改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，对于所述转录调节蛋白而言，所述细菌宿主细胞已被遗传上改变从而不能灭活，并且在所述载体中整合了编码该特异性转录调节蛋白的基因。

17.一种重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，

并且其已通过遗传上改变细菌宿主细胞的基因组中编码转录调节蛋白的基因，从而由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII转移的磷酰基，而在遗传上进行改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，

并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞在遗传上已被改变从而不能灭活，并且

其中在载体中额外地整合了编码不能结合由相应酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的已操作基因。