TW201428102A - 可誘發啓動子之調節 - Google Patents

Abstract

本發明關係到於一重組之細菌性宿主細胞中製造異源性之多胜肽，其中該細菌性宿主細胞被改變成不能夠在無誘發劑之下使控制異源性多胜肽表現之啟動子去活化。

Description

可誘發啟動子之調節

本發明關係到於一重組之細菌性宿主細胞中製造異源性之多胜肽。尤其，本發明關係到藉由使用一可被一具有專一性受質(誘發劑)所誘發之啟動子調節一編有該多胜肽密碼之異源性核酸序列之表現。最特別的是，本發明關係到於一細菌性宿主細胞中異源性多胜肽表現之調節，其中該細菌性宿主細胞被改變成不能夠在無誘發劑之下使控制異源性多胜肽表現之啟動子去活化。

於重組微生物中製造異源性多胜肽之一重要面向係選擇啟動子，其用於控制編有該標的多胜肽密碼之異源性核酸序列之表現。

適用之啟動子應該是強而有力的。亦即是，以超高之速率製造出該相應之mRNA，以製造大量之多胜肽。此外，該啟動子應該要容易被調節，而且僅有當受到誘發時纔會開始製造該異源性之多胜肽。

但是通常該具有誘發性之受質係微生物之營養物且會被微生物所消耗，這個問題卻始終存在著。然而，當使用於培養該微生物之培養基耗盡該具誘發性之受質時，該微生物便將該啟動子去活化，因此停止該標的多胜肽之表現，為避免基因表現不被期望之停止，此誘發劑必須要被大量地添加及/或不斷地補充。大量誘發劑之需求增加了該發酵方法之成本。此外，使用有效率之啟動子會因為昂貴的誘發劑而受限。

因此，在重組多胜肽之製造上，宿主細胞是被期望的，其中控制該異源性多胜肽表現之啟動子之活性與誘發劑存在之與否無關，但是其中該異源性多胜肽之表現仍然可被緊密地調節。

世界專利WO 2006/133210 A2關及於一方法，其利用一可由甘露醇、阿拉伯糖醇、葡糖醇或甘油誘發之啟動子於細菌性宿主細胞內製造重組多胜肽，其中該細菌性之宿主細胞已經被改變成不能夠降解或代謝該誘發劑。根據所述之方法，於基因體上將一基因或數個基因，其等編有代謝該誘發劑所需要酵素之密碼基因做改變抑或將其刪除，使得該細胞無法從其基因體表現出一於代謝或降解該誘發劑所需之功能性酵素。為確保誘發劑之吸收，與運送該誘發劑進入細胞相關之基因皆不受影響。

然而該方法卻仍需要添加誘發劑於催化各別啟動子之活化，以控制標的多胜肽之表現。

此外，誘發劑累積於細胞內還會對細胞之發育產生負面影響。

許多細菌能夠利用各種不同之碳源。如果細菌被提供一碳源之混合物時，則其會挑選能使生長最快速之碳源(初級碳源)。同時，與利用次級碳源有關之功能則被一稱為碳降解代謝產物抑制(carbon catabolite repression；CCR)現象所抑制。

除CCR以外，與利用一偏好度較低之次級碳源有關之特殊降解代謝基因僅於所述之次級碳源存在時纔會被表現。因此，表現與降解代謝一次級碳源有關之基因乃取決於有所述次級碳源之存在(誘發)，和無一初級碳源之存在(降解產物抑制)。

Tianqui Sun等人之發表於2010年4月1日Bacteriology,American Society for Microbiology期刊第192卷第8期2128頁至2139頁「枯草 芽孢桿菌桿菌之甘露糖使用系統之特性描述」之論文關及於鑑別甘露糖操縱子及被甘露糖調節之啟動子PmanP及PmanR之基因。依據論文，甘露糖之代謝係由磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)：碳水化合物磷酸轉移酶系統所調控，且甘露糖操縱子又受到碳降解代謝產物抑制之控制。為表述個別基因功能之特性並將其加以鑑別，剔除基因之突變種於是被製備，其等缺少各自相應之基因，因此也就缺少由所述基因所編碼之相應蛋白質。由研究發現：刪除甘露糖傳輸蛋白之基因manP結果造成兩個啟動子PmanP和PmanR之持續表現，此表示：甘露糖傳輸蛋白ManP對甘露糖操縱子和對編有具甘露糖專一性轉錄調節蛋白ManR密碼之manR基因之調節具有負向之作用。

Tobisch等人之發表於1999年4月19日Bacteriology期刊第181卷第16期4995頁至5003頁「調控枯草芽孢桿菌桿菌內lic操縱子及藉由定點突變於lic調控蛋白上潛在磷酸化位置後之特性」，論文指出，將調節蛋白LicR之EIIA區域內之磷酸結合胺基酸換成另外一種胺基酸，結果造成該突變之調節蛋白LicR在無誘發性之受質存在下仍然具有活性。

Görke等人之發表於2008年8月於Nature Reviews.Microbiology期刊第6卷第8期613頁至624頁「細菌中碳酸降解代謝產物抑制：使用大部分營養之外的許多方法」，關及到缺少甘露糖傳輸蛋白EIIAB之鏈球菌之突變種及對於磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之影響。該研究顯示，甘露糖傳輸蛋白EIIAB並不局限於只有甘露糖之磷酸化，但亦會使葡糖糖、果糖及2-去氧葡萄糖產生磷酸化。此外，該研究還顯示，甚至在沒有甘露糖傳輸蛋白EIIAB之存在下，甘露糖還可經由具有果糖專一性之傳輸蛋白EIIFRU被吸收。

Deutscher等人之發表於2008年4月1日Current Opinion in Microbiology,Current Biology LTD,GB期刊第11卷第2期87頁至93頁「細菌中碳降解代謝產物抑制之機轉」，對於各種不同細菌，例如E.coli和B.subtilis，中碳降解代謝產物抑制之機制給予一般性之概述。

本發明摘要

本發明係由提供一細菌性之宿主細胞來利用該等碳降解代謝之調節機制，其中該啟動子調節與代謝一次級碳源有關之基因表現，在沒有其相應之碳源存在下並沒有被去活化，且其中該啟動子僅受到碳降解代謝產物抑制之控制。

根據本發明，所使用之啟動子係為一啟動子，其調節該細菌性宿主細胞一次級碳源之利用。

於一初級之碳源存在時，該啟動子即受到CCR之抑制。當被使用於培養該重組細菌性宿主細胞之培養基耗盡初級碳源時，抑或當初級碳源之濃度降至CCR所需之水準以下時，該啟動子之CCR遂被改變成不活化之狀態，然後該啟動子即自動開始表現由所述啟動子所控制之基因。

本發明提供一重組細菌性宿主細胞，其中該重組細菌性宿主細胞能夠利用一種以上之碳源，其中該細菌性宿主細胞中此等碳源之碳降解代謝係受到磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統(phosphotransterase system；PTS)和CCR之控制，其中該細菌性宿主細胞在基因上被修改以防止一可被碳源所誘發之啟動子之轉錄調節蛋白在沒有所述之次級碳源存在下被去活化，但卻為CCR所控制，其中該碳源係為該細菌性宿主細胞之一次級碳源。

根據本發明之另一面向，本發明之重組細菌性宿主細胞被一載體所轉化，該載體包含有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一可被一次級碳源所誘發之啟動子相連接，其中該載體之啟動子係受到轉錄調節蛋白之控制，且該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白在基因上被做修改以致於在沒有該特定相應之碳源下無法被去活化。

此外，本發明還提供一方法，其利用培養本發明之重組細菌性宿主細胞，其被一包含編有該多胜肽密碼之核酸序列之載體所轉化，製造異源性多胜肽。

此外，本發明還關係到使用一根據本發明之重組細菌性宿主細胞於製造異源性多胜肽用途。

根據一特別之面向，本發明關係到一組基因表現之誘發方案，其需要經過減量誘發劑，尤其是一點也不需要誘發劑。根據另一特別之面向，本發明關係到一適用於高細胞密度發酵之細菌性表現系統。

尤其，本發明提供一於重組細菌性宿主細胞中製造一異源性多胜肽之方法，其中使用到一重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致其不能夠在沒有誘發性次級碳源之存在下使對一啟動子具有專一性之轉錄調節蛋白去活化，該啟動子可被一次級碳源所誘發，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子可被該次級碳源所誘發，並且被該轉錄調節蛋白所調節，所述之方法包含下列之步驟：令該細菌性之宿主細胞生長於一細胞培養基中，該培養基不含該具誘發性之次級碳源，但卻包含一不同之碳源，由該不同之碳源誘發 所述之多胜肽之表現，當該不同之碳源濃度下降至碳降解代謝產物抑制所需之水準之下時，自該細胞或從該細胞培養基中收取多胜肽。

此外，本發明還提供適合於執行本發明方法之重組細菌性宿主細胞。

例如，本發明關係到一重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致無法令對可被一次級碳源所誘發之啟動子具專一性之轉錄調節蛋白在沒有誘發性次級碳源之存在下被去活化，其修改之方法係將該細菌性宿主細胞基因體上編有一磷酸基轉移酶密碼EII之基因刪除，該轉移酶對轉錄調節蛋白具有專一性，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子係被該轉錄調節蛋白所調節，且該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白在基因上被做修改以致於無法被去活化，且其中編有該具有專一性之轉錄調節蛋白密碼之基因被嵌入該載體中。

此外，本發明還關係到一重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致無法令對可被一次級碳源所誘發之啟動子具專一性之轉錄調節蛋白在沒有誘發性次級碳源之存在下被去活化，其修改之方法係將該細菌性宿主細胞基因體上編有該轉錄調節蛋白密碼之基因做基因上之修改，以使得由所述之基因表現出來之轉錄調節蛋白無法與由酵素EII，其對所述之轉錄調節蛋白具專一性，所轉移之磷酸基結合，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子係被該 轉錄調節蛋白所調節，且該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白在基因上被做修改以致於無法被去活化，且其中編有該不能夠與由相應之酵素EII所轉移之磷酸基結合之轉錄調節蛋白密碼之調控基因被嵌入該載體中。

根據又另一面向，本發明還關係到一利用培養一重組細菌性宿主細胞製造異源性多胜肽之方法，其中使用到一重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致其無法代謝可被一碳源誘發之啟動子之具誘發性之碳源，其中該具誘發性之碳源係為該細菌性宿主細胞一次級之碳源，且其包含一載體，其攜帶有該可為所述之次級碳源所誘發之啟動子和一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，其中該方法係為一饋料批次培養法，其中於批次培養階段之後，添加入第一個份量之該具誘發性之次級碳源開始進行誘發，且同時開始進行第二個份量之供應。

從研讀下列依據所附之圖式和申請專利範圍之詳細說明，其他之目的和優點對於習知技術人士將變得明顯。

根據上述誘發一標的多胜肽表現之實施例，其與該啟動子之一具誘發性碳源存在與否無關。因此，該實施例是特別有利的，因為不需要具誘發性之碳源。

然而，自節約之觀點而言，其亦將會是有助益的，如果可以減少誘發啟動子所需要之碳源數量。

所以，根據另一替代之解決方法，本發明關係到一製造一標的多胜肽之方法，其方法是表現一編有所述標的多胜肽密碼之核酸序列，其中該表現係受到一可被碳源誘發之啟動子所控制，其中該具誘發性之碳源藉由細菌性宿主細胞，其將會被一攜帶有啟動子和一標的多胜肽核 酸序列之載體所轉化，藉此中斷或至少延緩降解代謝過程。

根據本發明，此替代方法係將該細菌性宿主細胞基因體上編有對該具誘發性之碳源具專一性之異構酶密碼之基因移除抑或做基因上之修改，該酵素將該具誘發性之碳源被送進細胞之時轉變成果糖-6-磷酸鹽。異構化成果糖-6-磷酸鹽係碳源降解代謝之第一步，一旦當碳源被送入細胞之時，該碳源異構化之中斷或延緩意味著該碳源可被利用於較長時間之誘發。因此，可減少具誘發性碳源之數量。

根據一實施例，此替代方法關係到一可由甘露糖誘發之啟動子，和一適合於該啟動子之細菌性宿主細胞，其中於該細菌性宿主細胞基因體上移除編有甘露糖-6-磷酸鹽異構酶，亦稱之為ManA，密碼之基因，抑或做基因上之修改，以致於一旦當甘露糖被送入細胞時，不能夠進行或至少延緩甘露糖之異構化。

本發明詳細說明

如本文中所使用，茲提供下列定義以利於本發明之瞭解。

「酵素EII」、「EII」或「傳輸蛋白」係指磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統(PTS)之一對碳源具專一性之通透酶而言，其催化該碳源之傳輸，並同時將其磷酸化。

該PTS系統包含有多種EII，每種EII對於一碳源，例如糖，具有其專一性。

EII係為複合體，其通常係由三個區域A、B和C所組成，但有時候會出現第四個區域D，其中EIIA和EIIB參與相應碳源之磷酸化反應，而與膜結合之EIIC(EIID，如果存在時)則居間協助特殊之碳源通過細胞膜進入到細胞之內。

如果該特殊之碳源不存在時相應之EIIA，於有些情況中， EIIB會將對該相應碳源具專一性之轉錄調節蛋白去活化，其方法係將磷酸基轉移至存在於該轉錄調節蛋白上相應之磷酸化位置，其分別係指-取決於該具有磷酸化之EII-EIIA和EIIB區域。

「轉錄調節蛋白」或「調節蛋白」以正向方式調節(亦即是活化)特殊碳源之降解代謝操縱子。轉錄調節蛋白通常含有兩個保守之調節區域，該等區域可被磷酸化(PTS調節區域，PRDs)。此外，有些轉錄調節蛋白還含有另外磷酸化之位置，EIIA和EIIB。依據轉錄調節蛋白而定，轉錄調節蛋白之去活化係經由磷酸基從酵素EII移轉至EIIA和EIIB及/或PRDI區域中之一或數個上述之磷酸基結合位置上，且其活化係經由磷酸基從組織胺酸蛋白(HPr)移轉至PRDII區域。PTS之各種碳源專一性之轉錄調節蛋白因此可為活化蛋白或為反終止因子。

本文中所使用之「啟動子」係指一調節表現之核酸序列。一「啟動子區域」係為一具有調控功能之區域，其能夠於細胞中與RNA聚合酶結合，並啟動一位於下游(3’方向)編碼序列之轉錄。於該啟動子之區域內可發現到數個負責與RNA聚合酶結合之蛋白質結合區(一致性序列)，諸如-35框盒和-10框盒(Pribnow框盒)。此外，該啟動子區域還可包含有該等專一性轉錄調節蛋白之轉錄起始位置及結合位置。

「變異型」或「一序列之變異型」之意思係指一核酸序列，其與參考序列不同之處在於保留核酸被取代，其中一或數個核酸被另外具有相同特徵之核酸所取代。變異型亦包含退化之序列，具有經刪除或插入片段之序列，只要該等經過改變之序列呈現出與參考序列相同之功能(功能相等)。

「可於宿主中表現之載體」或「表現載體」係為一多核酸之結構體，其係以重組之方式或由合成之方式產生，且具有一系列特定能 使一特殊核酸序列於宿主細胞中進行轉錄之核酸元件。通常，此載體包括有一轉錄單元，其包含一特定待轉錄之核酸序列，其可以剪接之操作方式與一啟動子相連接。可於宿主中表現之載體例如可為一獨立存在或自行複製之質體、黏接質體、噬菌體、病毒及反轉錄病毒等。

「轉化」、「經轉化」或「將一核酸輸入一宿主細胞中」等術辭係表示任何之方法，其中一細胞外之核酸，如一載體，在有或無伴隨物質之下進入一宿主細胞。

將適當之宿主細胞以例如一表現載體之轉化可利用熟知之方法加以完成，諸如顯微注射法、電穿孔轉化法、粒子撞擊法等，或利用化學方法，諸如由磷酸鈣促成之轉化反應，和利用自然轉化系統，其例如被敘述於Maniatise et al.,Molecular Cloning A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1982)中或是於Ausubel et al.,Current protocols in molecular biology,John Wiley and Sohns(1984)中。

「異源性核酸序列」或「與宿主細胞不同源之核酸序列」係指一核酸序列，其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產物，如多胜肽(「異源表現」或「異源產物」)之密碼，亦即是一核酸序列，其源自於不同於宿主細胞之供應細胞或一以化學方法合成之核酸序列，其例如編有一對於宿主細胞而言為外來之表現產物，如多胜肽之密碼。如果當該宿主細胞為一特殊之原核細胞種類時，則該異源性之核酸序列較佳者為源自於一生物不同之屬或科，更佳者為源自於一生物不同之目或綱，尤其源自於一生物不同之門，最特別源自於一生物不同之界。

在將源自於不同於宿主細胞之供應細胞之異源性核酸序列輸入宿主細胞之前，可利用突變、插入、刪除或取代該異源性核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸之方式將其修改，只要該等經過修改之序列呈現 出與參考序列相同之功能(功能相等)。本文中所指之異源性核酸序列亦包含源自於不同界之生物，諸如源自於真核細胞(真核細胞起源)，例如人類之抗體，其已被使用於噬菌體之展示庫中，且該等抗體之核酸序列之單一核苷酸或數個核苷酸已依據原核宿主細胞「密碼子之用法」被加以修改。

「異源性多胜肽」或「標的多胜肽」於本發明之含意中可為一源自於人類、哺乳動物或原核細胞之異源性蛋白質。其他之蛋白質有抗原，諸如源自於微生物致病原，病毒和細菌，和源自於腫瘤之醣蛋白及碳水化合物。其他之異源性多胜肽為酵素，諸如凝乳酶、蛋白水解酶、聚合酶、脫氫酶、核酸水解酶、葡聚醣水解酶、氧化酶、α-澱粉水解酶、氧化還原酶、脂肪水解酶、醯胺酶、腈水合酶、酯水解酶或腈水解酶。

「碳源」意指一碳源，通常指一碳水化合物，其可被一細菌細胞吸收和代謝，並受PTS系統和碳降解代謝產物抑制(CCR)之控制，典型碳水化合物之範例有糖和糖之衍生物。

許多微生物能夠利用一種以上之碳水化合物作為碳和能量之來源。當使用特殊細胞外之酵素時，細菌如Bacilli能夠降解數種多醣類，其等大量存在於植物之生物原料中。其所產生之寡醣、雙醣或單糖被送入細胞做更進一步之加工。通常，與醣類代謝或降解有關之降解代謝酵素只有在特殊之受質存在於培養基中以及較偏好之碳源和能量來源不存在時纔會被合成。PTS系統係傳輸碳水化合物穿過細菌細胞膜之一較偏好之碳水化合物傳輸途徑。

於PTS系統中，碳水化合物先被傳輸通過細胞膜，然後再被磷酸化，此過程係由一對所述之碳水化合物具專一性，且被稱之為酵素II(EII)之酵素所促成。因為EII促成其相應之碳源被傳輸進入細胞之中，所以EII亦被稱之為「傳輸蛋白」。

如果存在一碳水化合物之混合物時，細胞會依選擇吸收能夠提供它們最大能量和生長利益之碳源(初級碳源)。同時，細胞會抑制與降解代謝和吸收偏好度較低之碳源(次級碳源)有關之各種功能。

通常，大多數細菌之初級碳源是葡萄糖，且取決於細菌之種類，各種其他之糖和糖之衍生物則被作為次級碳源使用。然而，初級碳源亦可為另外一種化合物，例如如果為假單胞菌時，則初級碳源可為一芳香烴之化合物。

次級碳源例如包括有甘露糖、乳糖和蜜二糖，但沒有侷限於該等糖類。

於PTS系統中，各種與特殊碳源代謝有關之降解代謝基因係由轉錄調節蛋白所控制。該等轉錄調節蛋白可作用為反終止因子或轉錄活化蛋白，且僅有在一特殊之碳源(誘發劑)之存在時纔會具有活性。有研究已經發現：EII對其相應之轉錄調節蛋白具有負向(去活性)之調節作用，其係藉由將磷酸基移轉至存在於該轉錄調節蛋白內之一特殊之結合位置上。

如果不存在初級碳源而存在對啟動子具有專一性之誘發性碳源時，則啟動子被其相應之轉錄調節蛋白所活化，然後由該啟動子所控制之基因被表現。如果不存在該具誘發性之碳源時，則調節該啟動子之轉錄調節蛋白經由將磷酸基從其EII轉移至該轉錄調節蛋白上相應之結合位置而被去活化，從而使得該啟動子被去活性，並停止在所述啟動子控制下之基因之表現。

否則，如果當存在一較偏好之初級碳源，無關偏好度較低之次級碳源存在與否時，則所述次級碳源之降解代謝基因之表現受到CCR所抑制。

大體上，本發明係以抑制對碳源具專一性之轉錄調節蛋白 於所述特殊之碳源不存在時之調節為依據。尤其，本發明係以防止藉由將磷酸基從相應之EII轉移至轉錄調節蛋白而抑制或去活化之發生為依據。

如果一對碳源具專一性之轉錄調節蛋白之抑制被阻止時，則啟動子，其上所述轉錄調節蛋白係一活化蛋白，不管其作為所述啟動子誘發劑之碳源存在與否，該啟動子是具有活性的。

因此，表現一在該種啟動子控制下之基因不需要任何誘發性之碳源，且該基因會不斷地被表現。

有鑑於上述之情況，本發明利用一啟動子，其可被一次級碳源所誘發，其中該啟動子一方面受到PTS系統之控制，且另一方面受到CCR之控制。

因此，本發明嘗試去防止一可被碳源所誘發之啟動子被去活化，其被作為表現一標的多胜肽之啟動子使用，其方法係藉由防止對所言之啟動子具專一性之轉錄調節蛋白被去活化。

根據第一種方法，該目的係藉由使轉錄調節蛋白中止被其專一性之EII磷酸化而達成，其方法係使轉錄調節蛋白至少一用於結合由EII轉移之磷酸基之結合位置無法與磷酸基結合。

為達到此目的，於該細菌性宿主細胞之基因體上編有該轉錄調節蛋白密碼之基因可被做基因上之修改，其使得該基因表現出一轉錄調節蛋白，其不能夠和由EII所轉移之磷酸基相結合。

根據第二種方法，磷酸化之中止係藉由刪除於該細菌性宿主細胞基因體上編有EII密碼之基因，亦即調節轉錄調節蛋白活性之酵素。

根據本發明，一異源性多胜肽之表現係被置於一對上述轉錄調節蛋白具專一性之啟動子之控制下，藉由對細菌性宿主細胞進行基因上之修改防止了轉錄調節蛋白被EII所轉移之磷酸基去活化。

本發明提供一用於製造異源性多胜肽之有利系統，其係藉由發酵本發明之重組細菌性宿主細胞，該細胞被一載體所轉化，其包含編有所述多胜肽密碼之異源性核酸，且該序列可經由剪接操作方式與一可被碳源誘發之啟動子相接，其中該啟動子甚至於發酵培養基中不存有誘發性之碳源時仍是具有活性的。因為控制編有該標的多胜肽密碼之核酸表現之啟動子仍然受到碳降解代謝產物抑制之控制，所以如果有初級碳源，如葡萄糖之存在時，就沒有表現會發生，但是當該系統耗盡初級碳源時，則誘發便自動會達成(自體誘發)。因為控制該異源性多胜肽表現之啟動子活性與是否一誘發性碳源存在於發酵培養基中無關，所以誘發該標的多胜肽之表現在不需要一誘發性碳源之下仍會被達成。

本發明是有利的，因為重組細菌性宿主細胞在其等初級碳源之存在下可被生長至高細胞之密度，且當一達到所要之細胞密度時，解除對控制表現之啟動子之碳降解代謝產物抑制時，標的多胜肽之製造會自動開始進行。

本發明另一優點是：於批次培養階段時之饋料批次發酵中沒有或幾乎沒有發生標的多胜肽之製造，亦即是，存在有很強之降解代謝產物抑制。

本發明適用之細菌性宿主細胞為該等能夠利用一種以上碳源之細胞，其中不同碳源之利用係受到碳降解代謝產物抑制之控制，且其中該碳源穿透細胞膜之傳輸及其磷酸化係受到磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制。

適用於本發明之細菌性宿主細胞可為革蘭氏陽性或革蘭氏陰性之細菌。較佳之範例有屬於厚壁菌門之細菌，和尤其是屬於桿菌綱之細菌。特殊之範例有芽孢桿菌屬之細菌，諸如B.subtilis、 B.amyloliquifaciens、B.licheniformis、B.natto、B.megaterium等，其他較佳之範例包括有i.a.鏈球菌、葡萄球菌、乳酸桿菌、埃希氏桿菌或腸內細菌之其他成員，但不被侷限於此等細菌。

通常，厚壁菌門之細菌係革蘭氏陰性，且擁有低GC-含量。「低GC-含量」意思是指於細菌基因體中有低於52%之鹼基對是GC鹼基對。例如，革蘭氏陽性細菌，諸如芽孢桿菌屬和芽孢梭菌屬之細菌，基因體中含有40%或較低之GC鹼基對。

其他適用之細菌性宿主細胞還有腸道細菌，諸如屬於腸桿菌目之細菌。此類腸道細菌之範例有革蘭氏陰性之細菌，諸如埃希氏菌屬之細菌。特殊之範例有大腸桿菌種，諸如TG1,W3110,DH1,XL1-Blue和Origami。

大腸桿菌和腸道細菌於基因體上含有大約50%之GC含量，因此為低GC含量之生物。

革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌係依據已知之革蘭氏染色法所測定。革蘭氏陽性細菌係於標準革蘭氏染色時呈現出紫羅蘭色之細菌。革蘭氏陰性細菌則是又加入對比染色，而非原來之革蘭氏染色。

厚壁菌門之細菌和腸道細菌有著不同之CCR機制，其等已在作為模型生物之枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(E.coli)中被深入地研究(請例如參考J.Stülke et al.於2000年發表於Annu.Rev.Microbiol期刊第54期849頁至880頁之「枯草芽孢桿菌於碳降解作用之調控」；Görke B.et Stülke J.於2008年Nat.Rev.Microbiol.期刊第6期613頁至624頁之「細菌中碳降解代謝產物抑制：使用大部分營養之外的許多方法」；Gosset G. et al.於2004年發表於J.Bacteriol.期刊第186期3516頁至3524頁之「透過轉錄學分析於大腸桿菌中Crp-依賴性降解作用對基因表達之控制」；Martinez-Antonio A.et al.於2003年發表於Curr.Opin.Microbiol期刊第6期482頁至489頁之「鑑定於細菌中轉錄調控網絡的整體調控者」)。雖然整個CCR之機制不同，但是結果卻是相同的，亦即是：如果初級碳源存在時，則各種與吸收次級碳源並將其磷酸化有關之降解代謝操縱子皆被抑制。

本發明之重組細菌性宿主細胞於基因上被做修改以防止一可被碳源誘發之啟動子，其控制一異源性核酸序列之表現，藉由抑制對該啟動子具專一性之轉錄調節蛋白於沒有所述具誘發性之碳源存在下被去活化。

因此，於本發明之重組細菌性宿主細胞中，該可被碳源所誘發之啟動子，其控制一異源性核酸序列之表現，僅受到碳降解代謝產物抑制之控制。如果有初級碳源存在時，則該異源性多胜肽之表現即受到CCR之抑制。

根據本發明，該可被碳源所誘發之啟動子，不管是否有無誘發性碳源之存在，皆處於活化之狀態中，除非有偏好度較高之初級碳源將碳降解代謝產物抑制加以刺激。

本發明因此提供異源性多胜肽之製造，其不需要誘發劑作為誘發啟動子，其控制編有該多胜肽密碼之基因。

大體上，適用於本發明之啟動子係為於細菌細胞中受到PTS系統和CCR控制之啟動子。尤其，各自相應之轉錄調節蛋白係作為被所述啟動子控制之降解代謝操縱子之活化蛋白或反終止因子。此類啟動子於技術上是已知的。適用於本發明之啟動子範例乃依據各自之操縱子被示於下表中：

a：轉錄調節蛋白

b：A：活化蛋白

AT：反終止因子

以下將依據枯草芽孢桿菌之甘露糖操縱子對本發明做更詳細之說明。

枯草芽孢桿菌可利用許多不同之單醣或雙醣作為碳源，諸如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇和果糖。這些糖經由PTS系統被吸收。傳輸進入細胞並加以磷酸化係由對各自對應之糖具專一性之酵素EII所促成。

正如許多細菌一樣，枯草芽孢桿菌較佳之碳源是葡萄糖。當葡萄糖存在時，任何其他糖之吸收會受到CCR之控制。

圖1顯示甘露糖操縱子之結構，且圖2顯示傳輸甘露糖進入細胞和甘露糖之降解代謝。枯草芽孢桿菌之甘露糖操縱子包含有三個降解 代謝基因(Kunst F.N.et al.於1997年發表於Nature期刊第390期249頁至256頁之「革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌之全基因組序列」之論文)。

第一個基因，manP，編有對甘露糖具專一性之EII，稱之為ManP，之密碼。ManP促使甘露糖傳輸通過細胞膜，並同時將甘露糖磷酸化成甘露糖-6-磷酸鹽。第二個基因，manA，編有一甘露糖-6-磷酸鹽異構酶之密碼，其將甘露糖-6-磷酸鹽轉變成對應之果糖-6-磷酸鹽。第三個基因，yjdF，之功能迄今尚不清楚。於此三個基因之上游和相同之方向上位有一調節基因，manR，其編有稱之為ManR之轉錄調節蛋白之密碼。

甘露糖操縱子係為一正向調節之降解代謝操縱子，且由兩個不同之啟動子所控制。第一個啟動子，manR啟動子(PmanR)，負責轉錄調節蛋白ManR。第二個啟動子，manP啟動子(PmanP)，負責轉錄基因manP-manA-yjdF(合稱為“manPA-yjdF”)。當甘露糖存在，而葡萄糖不存在時，ManR便與PmanP結合，並活化manPA-yjdF之表現。令人驚訝的是，研究已經發現到：ManR不僅是manPA-yjdF啟動子之轉錄調節蛋白，而且是manR本身之一自體調節因子。

圖3以示意圖顯示轉錄調節蛋白ManR和可能磷酸化位置之結構。如圖所示，ManR包含兩個PRD(PTS regulatory domain，PTS調節區域)區域，一個EIIA和EIIB區域和一個HTH(Helix-turn-Helix，螺旋-轉-螺旋)區域。PRD區域係為存在於轉錄調節蛋白中之保守調節區域，其可被磷酸化於碳降解代謝之過程中。EIIA和EIIB兩區域係為由ManP，其係甘露糖操縱子之EII傳輸蛋白，所轉移磷酸基之結合位置。HTH係為蛋白質中能夠與DNA結合之結構單元。

如果沒有誘發劑甘露糖之存在時，ManR之EIIA和EIIB，甚至到PRDI區域皆被ManP所磷酸化，其係甘露糖操縱子中對甘露糖具專一性 之EII，因此被改變成不具有活性。

因此，根據本發明之第一個方法，如果修改ManR之EIIA及/或EIIB之磷酸化位置或將區域刪除而使其不能夠接受磷酸基時，則沒有誘發劑甘露糖之存在下ManR去活性會被抑制。

為達到此目的，將該細菌性宿主細胞基因體上之manR基因進行基因上之修改，其方法係將編有ManR中各相應磷酸化位置密碼之相應核酸序列加以刪除或修改。

此外，根據本發明之第二個方法，甘露糖操縱子之啟動子去活化係以中止甘露糖傳輸之方式被抑制，其可由刪除該細菌性宿主細胞基因體上編有ManP密碼之基因或使其不具活性之方式而被達到。

此等基因之修改可以被實行，其方法係將細菌性宿主細胞中該基因之編碼序列，其編有該等與甘露糖操縱子中轉錄調節蛋白manR及/或manP之磷酸化有關之蛋白質密碼加以修改或刪除。

該種於基因上經過修改剔除之宿主細胞可依據各種於針對此目的之技術上已知之方法中之任何一種方法加以製備。例如，同源性重組載體，其含有被鎖定核酸刪除序列之同源性被鎖定之5'端基因序列和3'端基因序列，可以被轉化進入宿主細胞之中。依據同源性重組，可以製造出所要之基因剔除細胞。

基因剔除係目前技術中已熟知之方法。例如，藉由插入一聚核苷酸以使基因失去活性之方法已被敘述於例如Röder D.L.et al.於1985年發表於J.Bacteriol.期刊第164期第1卷51頁至56頁「菊歐文氏菌於果膠酸製解酶異構酶基因體之標記置換突變」之論文中。基因中特殊之突變或刪除可利用盒式突變法加以建構，其例如被敘述於Wells J.A.et al.於1985年發表於Gene期刊第34期2至3回315頁至323頁「盒式突變法：有效用之方法 於一標定位進行多個突變作用」之論文中；其中於一基因選定之部位上做直接或隨機之突變，然後以同源重組之方式嵌入該基因之染色體之複製體中。

本發明之發明者已發現：調節甘露糖操縱子之啟動子，即PmanR和PmanPA-yjdF，皆為強而有力之啟動子，因此是在製造異源性多胜肽方面有希望之候選者。然而，甘露糖為誘發該等啟動子之碳源，係一價格高昂之單糖，其迄今仍限制著可經甘露糖誘發之啟動子之使用。

因為根據本發明在關於異源性多胜肽於細菌性宿主細胞中之表現方面，表現之啟動不需要具誘發性之碳源，同時使用啟動子，諸如甘露糖啟動子，不論是從強度上和從成本上考量皆是具有競爭性的。

因此，本發明亦關係到使用甘露糖操縱子之啟動子，PmanR和PmanPA-yjdF，於本發明之重組細菌性宿主細胞中作為一啟動子，其控制編有一標的多胜肽密碼之異源性核酸序列。

圖5顯示由枯草芽孢桿菌取得到之核酸序列，該序列包含manP啟動子之啟動子區域，如同各種表現載體如pSUN284.1中所使用，其中突顯位在腺嘌呤核苷酸上之轉錄起始位置，-35和-10框盒係以斜體字和粗體字表示，manR基因之尾端係由箭頭所標示，限制酶BglII、XbaI、AflII、NdeI和NruI之剪切位置被標示於序列之下方。報導基因lacZ之起譯密碼子亦被標示。

圖4顯示由枯草芽孢桿菌取得到之核酸序列，該序列包含manR啟動子之啟動子區域，其中突顯轉錄起始位置，-10和-35框盒係以斜體字和粗體字表示，manR基因之起始端係由箭頭所標示，限制酶HindIII之剪切位置被以粗體字標示於序列之下方，及被推定之cre序列被標示於序列之下方。

「甘露糖操縱子之啟動子區域」意思是指啟動子區域，其利用或沒有利用cre序列來調節manPA-yjdF和manR之表現。

「manPA-yjdF啟動子」，如本文中所述，基本上係由-35區域、-10區域(Pribnow框盒)、轉錄起始位置和ManR結合位置等所組成。

「manR啟動子」，如本文中所述，基本上係由-35區域、-10區域、轉錄起始位置和ManR結合位置，及，可依據選擇，一cre序列等所組成。

Cre序列(降解代謝抑制元件)係為一14個核苷酸長之保守DNA序列，與其結合者為CcpA(降解代謝控制蛋白A)，其為厚壁菌門CCR之總調節蛋白。圖6顯示枯草芽孢桿菌降解代謝產物控制和活化之機制。當CcpA被絲胺酸-46經過磷酸化之組織胺酸蛋白(HPr)所絡合，與cre序列結合時，啟動子即被抑制。此即甘露糖操縱子降解代謝抑制之第二個機制。依此方式，調節蛋白基因manR之表現在葡萄糖存在時即受到抑制。因此，此抑制了manP啟動子之活化。當葡萄糖存在時，細胞係經由PtsG吸收葡萄糖，而PtsG係一依賴PTS之傳輸系統，其類似於EII甘露糖傳輸蛋白。於細胞中，果糖-6-磷酸鹽(Fru-6-P)和果糖-1,6-二磷酸鹽(Fru-1,6-DP)等中間產物持續不斷累積並刺激組織胺酸蛋白激酶。組織胺酸蛋白激酶(HPrk)將組織胺酸蛋白位在第46個位置上之絲胺酸磷酸化。該於絲胺酸-46經過磷酸化之組織胺酸蛋白與DNA結合蛋白CcpA形成一複合物，CcpA與所謂之cre-位置結合，其存在於枯草芽孢桿菌許多經由降解代謝產物抑制和經由降解代謝產物活化之啟動子之中。如果該cre-位置位係在-10啟動子序列之下游處抑或與-10序列重疊時，則絲胺酸-46-組織胺酸蛋白/CcpA複合物之結合會抑制由該啟動子之表現。此情況被發現在manR啟動子上(圖4)。

包含manPA-yjdF啟動子區域之核酸序列較佳者包含圖5從 鹼基對-80至lacZ始密碼子之核酸序列(SEQ ID NO.1)，更佳者為圖5從鹼基對-80和包括鹼基對-1在內，亦即位在於鹼基對+1上轉錄起始位置A之上游處之核酸序列(SEQ ID No.2)。

包含manR啟動子區域之核酸序列較佳者為圖4自鹼基對-122至manR始密碼子之核酸序列(SEQ ID NO.3)，更佳者為圖4自鹼基對-122至鹼基對+7，亦即包含推定之cre序列在內之核酸序列(SEQ ID NO.4)，又特別為圖4從鹼基對-122至鹼基對-1，亦即位在於鹼基對+1上之轉錄起始位置G上游處之核酸序列(SEQ ID NO.5)。manP和manR二者之啟動子區域，皆包含有一轉錄調節蛋白ManR之結合位置(於圖4中被標示為IRI-R及於圖5中被標示為IRI-P)，其作為甘露糖操縱子之啟動子之轉錄活化蛋白。

根據另一面向，本發明關係到此類於基因上經過修改之細菌性宿主細胞，該細胞包含有一載體，其攜帶編有感興趣多胜肽密碼之核酸序列，並可經由剪接操作方式與可被一碳源所誘發之啟動子相接，其中該載體之啟動子係受到轉錄調節蛋白所調節，其中該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白已於基因上被做修改以致不能夠去活化於當對所述轉錄調節蛋白具專一性之碳源不存在時。

有關於上文中之甘露糖操縱子，該載體之啟動子可以為PmanR或PmanPA-yjdF，例如，序列SEQ ID NOs.1至5中之任意一者及上表中之任意一者。

根據本發明一有關於本發明所使用載體之實施例，可嵌入該於基因上經過修改之基因，其編有該相應轉錄調節蛋白之密碼，該蛋白不能夠與由相應之EII轉移之磷酸基相結合。因此，於該重組細菌性之宿主細胞中，該轉錄調節蛋白不僅係由染色體之基因所表現，而且亦由被嵌入該載體中相應之基因所表現，其導致更高濃度之轉錄調節蛋白，並因此使 誘發獲得到改善。例如，當載體之啟動子為一甘露糖操縱子之啟動子時，則基因manR可以被嵌入該載體中，其中編有EIIA區域密碼之核苷酸序列已被刪除掉(manRΔEIIA)。

適用於本發明之載體較佳者為一獨立自主或自行複製之質體、黏接質體、噬菌體、病毒或反轉錄病毒。有許多宿主/載體之組合體可被使用於本發明中。

有用之表現載體，例如，可由染色體、非染色體及/或合成之核酸序列片段所組成。

適用之載體包括有載體，其具有專一性之宿主範圍，諸如分別對於例如枯草芽胞桿菌和大腸桿菌具有專一性之載體，和載體，其具有廣泛性之宿主範圍，諸如可用於革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌之載體。可被使用者還有「低度複製」、「中度複製」及「高度複製」之質體等。

例如，於枯草芽胞桿菌中，pAMbeta1係為一低度複製之質體，中度複製之質體係為pBS72衍生之質體，以及pUB110係為一高度複製之質體。對例如大腸桿菌內表現上有用之載體有pBR322、pUC18、pACYC177、pACYC184、pRSF1010和pBW22或其等之衍生物，諸如質體pBLL 15或質體pAKL15E。

本發明於基因上經過修改之細菌性宿主細胞不能使控制啟動子之轉錄調節蛋白於沒有所言啟動子之誘發性碳源之存在下去活化。因為該載體之啟動子如同各染色體之啟動子受到相同之轉錄調節蛋白所控制，所以編有該標的多胜肽密碼之異源性核酸序列之表現仍繼續進行，甚至在沒有誘發性之碳源存在時。

此外，本發明提供一方法，其係於本發明基因經過修改之 細菌性宿主細胞中製造一異源性之多胜肽，該方法包含下列之步驟：a)於可讓多胜肽表現之條件下培養本發明基因經過修改之細菌性宿主細胞，其被一載體所轉化，該載體包含編有該多胜肽密碼之核酸序列，其可經由剪接操作方式與一啟動子相接，其中該載體之啟動子係受轉錄調節蛋白所調節，當對該轉錄調節蛋白具專一性之碳源不存在時，其不能被去活化，及b)從細胞或從該細胞之培養基回收該多胜肽。

根據本發明，當培養基耗盡初級碳源或當初級碳源之濃度下降至CCR所需要之濃度水準以下時，標的多胜肽之表現即自動開始進行。

為了讓細胞於誘發之後能生長，可將初級碳源添加至培養基，並使其保持在不會引起碳降解代謝產物抑制之濃度水準上。例如，添加可立即被細胞所消耗之一特定含量之初級碳源，其使得於發酵培養液中基本上不存在可刺激CCR之初級碳源。

一般可以這樣說：如果存在於培養基中之初級碳源含量超過1.0公克/公升時，就可觀察到碳降解代謝產物抑制。相反地，如果初級碳源之含量為0.01公克/公升或較低之含量時，則不會發生碳降解代謝產物抑制。

因為啟動子被碳降解代謝產物抑制和被誘發之界線與細胞之生長速率相關，而細胞之生長又與添加至培養基或存在於培養基中初級碳源之含量相關，所以可藉由監控生長速率來調整初級碳源不會引起碳降解代謝產物抑制之含量。如果於某一特定之生長速率下發生碳降解代謝產物抑制，則必須要減少添加至該培養基初級碳源之含量，藉此將生長速率降低至一不會再觀察到有碳降解代謝產物抑制之數值為止。

對於大多數於誘發階段中之發酵過程而言，適當之作法係 將初級碳源之添加調整至一定之含量，其造成比生長速率μ0.2小時^-1。

無論如何，對於一特殊之發酵方法，比生長速率μ之適當數值可容易地由日常例行之工作被加以測定。

所使用之載體，及宿主之建構和轉化皆如上文中所定義。

作為細胞培養系統之連續或不連續培養，如批次培養或饋料批次培養，可被應用在培養試管、搖瓶或細菌發酵槽上。

較佳者為，於誘發階段中當標的多胜肽被表現時，初級碳源以指數方式被供應至培養基中。

於培養基因上經過修改之細菌性宿主細胞可使用技術上已知之傳統培養基，諸如複合培養基，如「營養酵母菌液體培養基」，一含有甘油之培養基，如Kortz et al.,J.Biotechnol.(1995)39：59-65所述，一礦物鹽培養基，如Kulla et.al.Arch.Microbiol.(1983)135：1所述，一LB-培養基，如Bertani et al.,J.Bacteriol.1951)62：293-300所述，或一用於大腸桿菌發酵之批次培養基，如Wilms et al.,Biotechnol.Biong.(2001)73：95-103所述。

該培養基包含一適當之碳源，例如一種糖，諸如葡萄糖，以使宿主細胞生長達到一所要之細胞密度。各相應宿主細胞之初級碳源被做為碳源使用，其與誘發劑不同，誘發劑係所述宿主細胞之次級碳源。

於適當情況下可例如以另外添加諸如緩衝劑、鹽類、維生素、胺基酸、抗生素或其他為習知技藝人士一般所熟悉之微量營養素等成份之方式修改培養基。於細胞培養時，同樣亦可使用不同之培養基或各種組合之培養基。

於本發明之一實施例中，將酪蛋白胺基酸添加至培養基中。結果發現：培養基中含有酪蛋白胺基酸可有助於基礎水準表現之抑制。

通常，酪蛋白胺基酸可添加之數量為0.05%至0.1%(重量/ 體積)。

根據本發明一製造異源性多胜肽之實施例，可使用一細菌性宿主細胞，其在基因體上包含編有甘露糖操縱子密碼之基因，亦即是甘露糖對於該宿主細胞係為一次級碳源，且例如葡萄糖對於該宿主細胞係為一初級碳源。為了適合作為本方法之宿主，該細菌性宿主細胞被改變成不能夠使ManR去活化。ManR係為轉錄調節蛋白，其控制甘露糖操縱子之啟動子。

例如，可將編有ManP密碼之核苷酸序列manP刪除，因此抑制ManR因被ManP磷酸化而被去活性。

將一載體導入刪除manP基因之細菌性宿主細胞，其中該載體包含啟動子PmanR或啟動子PmanP，其可經由剪接操作方式與編有該標的多胜肽密碼之核酸序列相接。

使重組細菌性宿主細胞生長於適合於所述細菌性宿主細胞之培養基中，其中該培養基可含有一定含量之葡萄糖及/或可將一定含量之葡萄糖添加至該培養基中，其中該含量足以能讓該細菌性宿主細胞透過由葡萄糖所間接促成對該載體中所含之甘露糖啟動子進行碳降解代謝產物抑制之方式增加和抑制該標的多胜肽之表現。

當培養基葡萄糖之濃度下降至碳降解代謝產物抑制所需要之濃度值以下時，該載體甘露糖啟動子之碳降解代謝產物抑制即被解除，甘露糖啟動子隨即開始多胜肽之表現，且不需要甘露糖之誘發。此外，因為將細菌基因體中編有ManP密碼之核酸序列刪除，所以該甘露糖啟動子不能夠被經由ManP所進行之磷酸化而去活性。因此，本方法可讓標的多胜肽表現於可被專一性碳源誘發之啟動子之控制下，不需要有誘發性碳源之存在。

通常，於發酵過程之誘發階段，其中該發酵使用經包含有甘露糖操縱子啟動子之載體所轉化之細菌性宿主細胞，可將一定數量之葡萄糖，其係甘露糖操縱子啟動子之初級碳源，添加至發酵培養基中，其中該數量造成比生長速率μ0.2小時^-1。此外，較佳者係以指數方式添加。

原則上，上文中有關於本發明第一個替代方法之說明，於其中完全不需要具誘發性之碳源進行啟動子之誘發，亦可適用於本發明第二個替代方法上，根據第二個方法，誘發所需之碳源數量是減少的。

本發明是有利的，因為控制編有該標的多胜肽密碼之異源性核酸序列表現之啟動子可被緊密地調節。

誘發劑之添加或誘發劑之存在是不需要的。

根據本發明第一個替代方法，啟動子甚至在沒有誘發性碳源之存在下，亦即在沒有誘發劑之下，仍處於活化之狀態中。

枯草芽孢桿菌甘露糖操縱子之甘露糖啟動子PmanP已被證明是一強力之啟動子。一篇有關於甘露糖操縱子之詳細討論被載於Sun T.et al.於2010年發表於Bacteriol期刊第192期2128頁至2139頁「枯草芽孢桿菌甘露糖使用系統之特性」之論文中，其被納入本文之參考文獻中。

PmanP強力地控制基因表現之特性使得此啟動子具有資格以異源性之方式製造具有價值之多胜肽。然而，本發明已發現到：與甘露糖操縱子有關之枯草芽孢桿菌表現系統需要大量之甘露糖纔能夠獲得到恆常之高表現率。依據推測：甘露糖誘發劑快速被消耗之理由是甘露糖為枯草芽孢桿菌特別喜愛之碳源之其中一者。然而，甘露糖由於是一非常昂貴之糖，所以使得此表現系統於經濟之考量上無法被用在大規模之工業應用上。

為了使該工業用之表現系統達到最佳化，該誘發劑不可被 代謝。

根據本發明，此目的之達成係經由修改或較佳者瓦解宿主細胞染色體基因體上之甘露糖-6-磷酸鹽異構酶基因manA以使該宿主細胞不能夠將進入細胞之甘露糖-6-磷酸鹽轉變成緊接著要進入醣酵解之果糖-6-磷酸鹽。

此種表現系統需要明顯更少之誘發劑，但是仍可達到高度之表現率。

如上文中所述，一特別有利之表現系統係為一可自體誘發之表現系統，其為一不再需要任何誘發劑之表現系統。根據本發明一較佳之實施例，此種可自體誘發之表現系統之取得係經由使細菌性宿主細胞基因體之甘露糖操縱子中之基因manP不能夠透過由ManP抑制ManR兩個與EIIB和EIIA相似之區域被磷酸化之方式使調節蛋白ManR去活化。

較佳者為，刪除染色體之基因manP(基因剔除突變種)。

於此種表現系統中，PmanP啟動子僅受到由葡萄糖所促成之CCR調節性之控制。不用等到葡萄糖達到限制量時，調節蛋白ManR便能夠和其操作子系統結合，並開始進行表現。此種自體可誘發之表現系統對於工業上之應用非常具有價值，因為實際上沒有發生比預期早之基因表現。

例如，於饋料批次發酵中，沒有在該批次階段中觀察到不希望出現之表現，且於整個饋料批次發酵中不需要添加任何誘發劑來得到高度之表現水準。如此之表現系統尤其適用於高細胞密度之發酵，並結合所要得到之高表現率。

由本發明所提供之新式表現系統，尤其是新式之自體誘發系統，的確真的對於改善產物之產量和降低與其技術使用上有關之成本做 出相當程度之貢獻。

所顯示者有圖1 以示意圖顯示甘露糖操縱子之結構，其中有各基因及啟動子之排列和走向及其等由箭頭所示由ManR之活化；圖2 一流程圖顯示甘露糖被送入細胞後之降解代謝，甘露糖於運送時被磷酸化成甘露糖-6-磷酸鹽和被轉變成果糖-6-磷酸鹽；圖3 以示意圖顯示ManR活化蛋白之結構，其具有不同之區域和可能被磷酸化之位置；圖4 包含有manR啟動子之B.subtilis啟動子區域之核酸序列；圖5 源自於B.subtilis之核酸序列，被使用於啟動子探針之載體pSUN272.1上，作為研究甘露糖和葡糖糖對manP啟動子之可誘發性和降解代謝產物抑制，及測定ManR之結合位置；圖6 B.subtilis內經由CcpA之降解代謝產物抑制和活化之機制；圖7 表現載體pSUN279.2之質體圖譜；圖8 分別內含質體pSUN279.2、pSUN284.1和pSUN291之B.subtilis 3NA之β-半乳糖苷酶之活性；圖9 內含質體pSUN284.1和其他含有圖5中所示核酸序列之不同長度片段之質體之B.subtilis 3NA之β-半乳糖苷酶之活性；圖10 內含載體pSUN291、pSUN385.2和pSUN386.9，其等攜帶有如圖4所示之核酸序列之B.subtilis 3NA之β-半乳糖苷酶之活性；圖11 表現載體pMW168.1之質體圖譜；圖12 插入型載體pSUN356.7(ΔmanP)之質體圖譜；圖13 一曲線圖，其係以對數方式顯示由乾燥之生物原料濃度對應 B.subtilis TQ356/pMW168.1(ΔmanP-突變種)發酵過程時間之對應點所繪製而成以及由螢光訊號(RFU)對應發酵過程時間之對應點所繪製而成。枯草芽孢桿菌TQ356/pMW168.1之饋料批次發酵。由細胞乾燥重量(X，黑色圓圈)，eGFP總產量(P_eGFP，黑色方格)和產物產率(P/X，黑色三角形)分別與發酵時間之對應點所繪製而成之曲線圖。 饋料批次階段之起始係由一垂直線表示；和圖14 由B.subtilis TQ356/pMW168.1發酵中所採集到細胞樣本之SDS-PAGE電泳圖。由枯草芽孢桿菌TQ356/pMW168.1之發酵中所採集到細胞樣本之SDS-PAGE電泳圖。第1行至第8行，M：Roti^®-Mark STANDARD蛋白質分子量標記；1：於12.5小時之後(批次)；2：於20.5小時之後(批次)；3：於36小時之後(13.5小時饋料批次)；4：於41小時之後(18.5小時饋料批次)；5：於44小時之後(21.5小時饋料批次)；6：於46小時之後(23.5小時饋料批次，發酵過程結束)；7：於46小時之後，不溶解之部份；8：於46小時之後，細胞培養之上清液。

下如於下列之實施例中所示，本發明提供異源性多胜肽之製造，其方法是培養本發明於基因上經過修改之細菌性宿主細胞，其中於該基因上經過修改之細菌性宿主細胞生長之時和進行誘發之前，多胜肽僅有非常低量或沒有比預期早之表現發生，亦即是，控制編有該多胜肽密碼之基因表現之啟動子基本上沒有發生遺漏之情形。此外，當自體誘發出現時，便以具高度終端生產率之高度生產速率立即開始進行多胜肽之製造。

同樣亦顯示本發明另一實施方法之範例，其中於細菌性宿主細胞，其含有攜帶一可被甘露糖誘發之啟動子和一異源性核酸序列之載 體，於基因體上刪除編有甘露糖-6-磷酸鹽異構酶密碼之基因。

依據下列之範例將更加完全之明瞭前述之說明。然而，該等範例僅用於說明實施本發明之方法，而並無意限縮本發明之範圍。

I)分離及鑑別甘露糖操縱子manR啟動子及manP啟動子之啟動子之區域

如果沒有另外說明時，使用到下列之材料及方法：

細菌菌株及生長條件

大腸桿菌JM109(Yanisch-Perron C.et al.,Gene 33,1985,103-119)及枯草芽胞桿菌3NA，一種不產孢子之枯草芽孢桿菌菌種，其spo0A基因上帶有突變(Michel J.F.et al.,J.Appl.Bacteriol.33,1970,220-227)，被使用作為選殖及表現之主要宿主細胞。其他被使用於發酵實驗上之菌種還有枯草芽孢桿菌3NA突變菌種TQ281(spo0A Δ manA：：ermc)(Sun T.et.al.,J.Bacteriol.192,2010,2128-2139)和TQ356(spo0A Δ manP：：ermc)(請參閱下文II，實驗4，b)。

讓菌種生長於37℃下於LB培養基中(Bertoni G.,J.Bacteriol.62,1951,293-300)。

篩選之條件如下：每毫升100微克之ampicillin，每毫升100微克之spectinomycin，每毫升5微克之erythromycin。

進行誘發甘露糖啟動子時，添加經過無菌過濾或經過高溫高壓滅菌之D-甘露糖至末濃度為0.2%(重量/體積)為止。

材料

所有化學藥品皆向Sigma-Aldrich(德國Taufkrichen)、Fluka(德國Buchs)或Merck(德國Darmstadt)購買取得。人工合成之DNA寡聚核苷酸係向Eurofins MWG Operon(德國Ebersberg)購買取得。限制酶及DNA修飾 酶係向Roche Applied Science(德國Mannheim)或New England Biolabs(德國Frankfurt am Main)購買取得。PCR係由高保真度之DNA聚合酶，其係向Fermentas(德國ST.Leon-Rot)購買取得，於一向MJ Research Inc.(美國麻州Walthan)購買取得之MiniCycler TM機器上進行。

DNA之製備及轉化

從大腸桿菌及枯草芽胞桿菌或從瓊脂凝膠中分離DNA係利用Qiagen(德國Hilden)或Roche(德國Mannheim)之DNA製備套組試劑及依據製造商所提供之說明下所完成。於所有本發明之範例中皆使用標準之分子技術。

大腸桿菌係依據Chung C.T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1989,2172-2175中所述之方法由質體DNA所轉化。枯草芽胞桿菌則係依據修改後之「巴黎方法」(Harwood C.R.Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley & Sons Ltd.,England)由質體DNA所轉化。

β-半乳糖水解酶活性之測量

於37℃下，將0.1毫升之待測細胞以900微升之Z-緩衝溶液和10微升之甲苯處理30分鐘。然後依據Miller之方法(Miller J.H.,1972,experiments in molecular genetics,Cold Spring Harbor,NY)，於22℃下以鄰-硝基苯-β-吡喃半乳糖苷測定β-半乳糖水解酶之活性。

所使用之寡聚核苷酸(引子)

實驗1：

分離攜帶甘露糖操縱子啟動子區域之DNA片段，並測定manR啟動子及manP啟動子之轉錄起始位置。

利用Qiagen(德國Hilden)之DNeasy血液及組織套組試劑分離枯草芽胞桿菌168之染色體DNA。

由PCR，其使用引子s4693/s4694，從所取得之DNA上擴增一長度大約為2300個鹼基對之DNA片段。此片段具有完整之manR基因和manR啟動子，以及介於manR和manP間之基因間隔區域，其中該區域含有manP啟動子。

所取得長度大約為2300個鹼基對之DNA片段被使用在引子延長試驗中測定manR啟動子及manP啟動子之轉錄起始位置。

為分離用於引子延長之mRNA，由大腸桿菌載體pIC20HE(Alten-buchner et al.,1992,Methods Enzymol.216,457-466)及由枯草芽胞桿菌載體pUB110(MacKenzie et al.,1986,plasmid 15,93-103)建構一穿梭因子。該載體含有lys基因為報導基因，其編有模仿葡萄球菌(Staphylo- coccus simulans)之成熟型溶葡萄球菌酶之密碼(Recsai et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,1127-1131)。

將該長度為2300個鹼基對之DNA片段複製到該高度複製之 pUB110衍生質體位於該溶葡萄球菌酶基因之上游處。所生成之質體被命名為pSUN178.4，並被送入枯草芽胞桿菌3NA中。

讓含有質體pSUN178.4之枯草芽胞桿菌3NA生長於含有kanamycin之LB培養基中。當達到指數生長期時，以0.2%(重量/體積)之甘露糖誘發該培養之細菌。經過37℃下生長1小時之後，將經過誘發及未經誘發之細胞加以收集。接著利用Qiagen-RNeasy Mini套組試劑分離全部之RNA。

使用於5’-端以Cy5標記之引子s5006、s5007、s5097及s5098。

引子s5006及s5007分別與由溶葡萄球菌酶基因起譯密碼子起算從鹼基對+21至鹼基對+50之片段以及從鹼基對+76至鹼基對+105之片段進行雜交。引子s5097及s5098則分別與由manR基因起譯密碼子起算從鹼基對+81至鹼基對+101之片段以及從鹼基對+131至鹼基對+153之片段進行雜交。

同樣之引子對被使用於pSUN178.4質體DNA之定序反應，其被做為長度標準品。此外，分別將羅氏(Roche)之AMV-反轉錄酶和T7-DNA聚合酶使用於反轉錄和DNA之定序上。反轉錄及定序之產物然後被分析於一變性之聚丙烯醯胺定序凝膠(GE healthcare)上。所有其他試劑皆由Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing kit所提供。

manP-啟動子之轉錄起始位置係利用引子s5006所測得。預備pSUN178.4質體與相同引子之DNA序列反應，並將其於同樣之變性凝膠上展開以進行比較。

圖5顯示manP啟動子周圍之DNA序列，其中突顯位在A(腺嘌呤核苷酸)上之轉錄起始位置。被推定之-10及-35框盒係以斜體字表示，manR基因之尾端係由箭頭所標示，限制酶BglII、NruI、XbaI、NdeI、 AflII及之剪切位置被標示於序列之下方。IRI-P係指不完整反向重複序列，其為推測之ManR結合位置。

manR啟動子之轉錄起始位置係利用RNA分離及DNA定序等方法所測得，其係依據上文中有關於manP-啟動子所述之方法進行，但除使用引子s5098以外，其與manR基因結合。

於圖4中顯示manR啟動子區域之DNA序列，其中突顯位在G(鳥糞嘌呤核苷酸)上之轉錄起始位置，被推定之-10及-35框盒係以斜體字表示，核醣體結合位置(RBS)被標示於該序列之下方，和manR基因之起始端分別由一箭頭所標示。限制酶剪切位置及一經推測之cre序列被標示於該序列之下方。IRI-R係指不完整反向重複序列，其為推測之ManR結合位置。

當細胞受到甘露糖之誘發時，由manR啟動子，尤其是由manP啟動子之轉錄會強烈地增加，此係由引子延長試驗中非常強烈之訊號所觀察。

所使用之引子被顯示於上文表1中。

實驗2

根據實驗1之方法所進行之引子延長試驗定位出manP啟動子之轉錄起始位置係靠近介於manR基因及manP基因起點之間間隔區域之3’-端。為了更精確地測定出manP啟動子之區域，以PCR擴增法逐步縮短長度為2300個鹼基對之DNA片段，然後將所得到不同長度之序列片段以選殖方式接回到相同之基本表現載體上，接著進行表現之研究。

a)建構基本表現載體

建構一表現載體，其具有不含啟動子之lacZ為報導基因。該表現載體被設計成一穿梭載體，其能夠於枯草芽胞桿菌及大腸桿菌中複 製，並且被命名為pSUN272.1。

報導基因lacZ係以限制酶NdeI及XmaI由質體pLA2上切割出來(Haldimann A.et al.,2001,J.Bacteriol.183,6384-6393)，然後被接進質體pJOE5531.1中，該質體係為一可經由鼠李糖(rhamnose)誘發之表現載體pWA21之衍生載體(Wcgerer et al.,2008,BMC.Biotechnol.8,2)，其在XmaI之位置上含有枯草芽胞桿菌之tufA轉錄終結子。於此質體中，於AflII/MunI等限制酶之剪切位置之間插入一對寡聚核苷酸s4956/4957以便在lacZ基因之上游處加入相同之tufA轉錄終結子。所以，該等終結子避免由質體啟動子「讀穿」進入到lacZ基因中以及由lacZ基因「讀穿」進入到兩側之質體序列中。針對於大腸桿菌及枯草芽胞桿菌兩者之抗spectinomycin基因spc係以寡聚核苷酸s4833/4835從質體pDG1730上被擴增(Geurout-Fleury et al.,1996,Gene 180,57-61)，然後被插入前面所得到之質體中。此外，藉由刪除一BspHI/HindIII之片段以縮短大腸桿菌之載體部份。接著將一含有枯草芽胞桿菌pMTLBS72複製原點之EcoRI/SphI片段(Lagodich et al.,2005,Mol.Biol.(Mosk)39,345-348)接進該質體中。

藉由AflII及NheI之切割及黏接，將實驗1中所取得長度為2300個鹼基對之DNA片段插進pSUN272.1中lacZ基因前方之位置，結果得到表現載體pSUN279.2，該質體之圖譜如圖7中所示。

所使用之引子對被顯示於上文之表1中。

b)測定載體pSUN279.2之表現效率

將上文a)中所取得之質體pSUN279.2及pSUN272.1送入枯草芽胞桿菌3NA中。後者係作為背景對照。讓攜帶一或另一質體之枯草芽胞桿菌3NA菌株生長於添加spectinomycin之LB培養基中，然後於達到指數生長期時將0.2%之甘露糖、0.2%之甘露糖加上0.2%之葡萄糖或無糖(無誘發 對照組)添加至該等培養之細菌中以進行誘發。經過一小時之誘發之後，依據Miller之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。結果顯示於圖8中。

未經誘發，含有pSUN279.2之枯草芽胞桿菌之培養菌顯現出一相當高基礎水準之β-半乳糖水解酶活性。甘露糖之存在造成β-半乳糖水解酶之活性又增加4倍，而以甘露糖加上葡萄糖誘發之活性則反而呈現下降，但仍超過基礎水準相當之幅度。此等結果明確指出於pSUN279.2上所觀察到之啟動子活性可源自於介於manR及manP間之區域，或源自於manR上游之區域或源自於二者。

因此，藉由切除如圖7中所示pSUN279.2介於SfoI及NruI間之2300個鹼基對之DNA片段，manR之上游區域和大部分之manR皆從pSUN279.2中被刪除，結果得到質體pSUN284.1。

將枯草芽胞桿菌3NA以質體pSUN284.1進行轉化，接著依據上述之方法測定表現效率。該結果顯示於圖8中。由圖8中可見，枯草芽胞桿菌3NA中去除manR之載體pSUN284.1，相較於枯草芽胞桿菌3NA中之pSUN279.2，僅顯現出β-半乳糖水解酶活性大約一半之基礎水準，但於甘露糖之誘發下卻又顯現出活性上甚至更強烈之增加，然後於葡萄糖之存在下卻又再度顯現出較強烈之下降。此等結果證明manP啟動子位在於manR及manP之間，並顯示出manR之染色體複製體即足以調控所有於該等低度複製質體上之manP啟動子複製體。

c)manP 啟動子區域之定位

為了進行manP啟動子區域之定位，除pSUN284.1經過縮短之DNA片段以外，由長度2300個鹼基對之DNA片段製備進一步縮短之序列片段，其方法係將一系列之DNA片段進行放大，其等被縮短於manP啟動子之轉錄起始位置上游處不同之位置，以PCR擴大，然後將該系列之片段插入 pSUN272.1中，如圖5所示。

由manP之轉錄起始位置上游處往下刪除至鹼基對-81和鹼基對-80產生第二個經過刪除之序列，其包含有SEQ ID NO.1。

另外一刪除係由manP之轉錄起始位置上游處往下進行至鹼基對-41和鹼基對-40(第三個經過刪除之序列)。

以類似於上述2b)中質體pSUN284.1建構之方式建構含有第二個經過刪除序列之質體pSUN290和含有第三個經過刪除序列之質體pSUN297.5，其方法係將由引子對s4802/s5203和引子對s5262/s5203所放大出之PCR產物分別插入經由限制酶EcoRV及NheI切割之pSUN272.1中。

將質體送入枯草芽胞桿菌3NA中，並依據上文b)中所述之方法進行培養。經過一小時之誘發後，依據上文b)中所述之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果顯示於圖9中。

如圖9中所示，於含有pSUN290和pSUN284.1之菌株當中沒有任何一者在關於甘露糖誘發lacZ基因方面顯示出顯著之差異性。然而，於包含有pSUN297.5之枯草芽胞桿菌3NA中，甘露糖之誘發作用卻完全被消除，且基礎表現水準近乎等於0。由此等結果可得到結論，即manP甘露糖啟動子區域之ManR結合位置位在於由manP轉錄起始位置算起之鹼基對-80及鹼基對-35之間。

實驗3：manR 啟動子之測定 a)cre 序列之鑑別

因為大多數後壁菌門之CCR係通過代謝產物控制蛋白A(CcpA)居間導引，故利用Clone Manager程式中DNA序列對比功能於整個甘露糖操縱子中搜尋各相應之結合位置(cre序列)。cre共同序列5’-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’被作為序列對比使用。

只有在manR之啟動子區域中發現到如圖4中所示之一推測性之cre序列，其位在於-10框盒之下游處。

b)manR 啟動子表現效率之評估

為評估manR啟動子表現之效率，依據上文中所示之方式建構一表現載體，如pSUN284.1，並將其命名為pSUN291。為達到此目的，利用引子對s5208/s5209和作為模板之線形化質體pSUN279.2擴增一DNA片段，其包含該推測性之manR-啟動子和大約600個位在於manR基因上游處之鹼基對，並將其在限制酶KpnI及AflIII之切割及黏接下插進質體pSUN272.1之lacZ之前端處。

該DNA之序列顯示於圖4中。

將質體psUN291送入枯草芽胞桿菌3NA中，並依據上文於實驗2b)中所述之方法測定β-半乳糖水解酶之活性。

該試驗之結果顯示於圖10中。於此，基礎表現水準已經相當高，且於添加0.2%甘露糖之後表現又再增加3倍。添加葡萄糖造成-半乳糖水解酶之活性被抑制到近乎基礎表現之水準。

此結果顯示出manR啟動子不僅是一微弱之結構性啟動子，而且亦受到甘露糖和CCR之調控。

c)manR 啟動子區域之定位

如實驗2c)中，其中進一步定位manR之啟動子區域，以PCR放大DNA之方式，從含藏於pSUN291中之DNA序列製備出一系列不同長度之DNA片段，其以兩個引子在manR啟動子轉錄起始位置上游不同位置上之結合(引子s5932和s5933)和一引子於lacZ基因下游處之結合(s5934)(圖4)。

第一個經過刪除之序列，其取得之方式係經由切除如圖4中所示之序列，其從轉錄起始位置G上游處往下至鹼基對-82及鹼基對-81，且 第二個刪除序列，其取得之方式係經由切除序列，其從轉錄起始位置G上游處往下進行至鹼基對-62及鹼基對-61。

依照實驗2c)之方法，將PCR之片段先以endoR SacI和NheI切割，然後再將其接合至經過相同限制酶切割過之pSUN279.2 DNA上，所生成之質體分別被命名為pSUN385.2及pSUN386.9。

將每種質體送入枯草芽胞桿菌3NA中，並依據實驗2b)中所述之方法進行培養。經過一小時之誘發後，依據實驗2b)中所述之方法測定該等細胞β-半乳糖水解酶之活性。該試驗之結果顯示於圖10中。相較於pSUN291，含有pSUN385.2之枯草芽胞桿菌3NA在關於甘露糖誘發lacZ基因方面沒有顯著之差異性。然而，在包含有攜帶第二個刪除序列之pSUN386.9之枯草芽胞桿菌3NA中，甘露糖之誘發作用卻完全被消除，且基礎表現水準近乎等於0。由此等結果可得到結論，即manR啟動子區域之ManR結合位置位在於由manR轉錄起始位置算起之鹼基對-81和鹼基對-35之間。該ManR結合位置甚至可能與-35序列重疊，如其在第I類活化因子上所發現，因為於該被推薦之結合位置中所發現之反向重複序列延伸進入該被推薦之-35序列。

II)建構含甘露糖操縱子基因區域經過基因修改之重組宿主細胞 實驗4：轉化作用 a)建構作為表現載體之質體pMW168.1

使用依據如圖5中所示如質體pSUN284.1中所介紹以及如於實驗2c中所使用之manP啟動子區域核酸序列建構如下文中所示之質體pMW168.1，並以轉化之方式將其送入作為宿主之枯草芽胞桿菌3NA中。

如實驗2a)中所示，除不以lacZ而使用eGFP為報導基因以外，設計一能夠於枯草芽胞桿菌及大腸桿菌中複製之穿梭載體。同時manP 之轉錄起始區域亦以gsiB基因之轉錄起始區域取代之(Stress protein；Jürgen et al.,supra)。因此，eGFP之起譯密碼子和緊跟在該起譯密碼子後面之六個密碼子亦被取代。

所得到之啟動子和轉錄起始區域之圖示結構顯示於下文中： 所示者為基因(箭頭)及區域(框盒)之排列，以及一些有關限制酶之剪切位置。

所使用gsiB轉錄起始區域之序列為：

一般而言，質體pMW168.1之製備如下列之流程圖所示：

於該流程圖中，所使用之載體DNA、插片DNA及互補性寡聚核苷酸之名稱皆如框盒中所示；在PCR產物方面，引子對及模板DNA皆如括號中所示；所使用之限制酶皆示於其各別之位置上。

所有選殖之步驟係以大腸桿菌JM109所進行。

所使用之質體有pUC 18，其為一用於PCR產物之選殖載體，含抗ampicillin之能力(Yanosch-Perron et al.,supra)；pWA21，其為一適用於大腸桿菌之表現及選殖載體，含抗ampicillin之能力(Wegerer et al.,2008,BMC Biotechnol.8,2)；pSUN202.4，其為一由pUB 110所衍生之載體，具有manP啟動子區域及抗ampicillin和kanamycin之能力，係為適用於大腸桿菌及枯草芽胞桿菌之穿梭載體；和pSUN266.1，其為一由pUC 18所衍生之載體，具有介於ter-序列和spc之間之嵌入位置及含抗ampicillin之能力。

質體pSUN266.1係可經由鼠李糖誘發之表現載體pWA21之一衍生載體，其中鼠李糖啟動子和eGFP基因被一含有兩個枯草芽孢桿菌tufA基因之轉錄終止子序列於直接之方向所取代，並且被BamHI、SmaI和AflII等限制酶之切割位置(請見下文中之序列)和一抗spectinomycin之基因所隔開。後者係以引子對s4833和s4835(表1)從質體pDG1730(Cuerout-Fleury et al 1996)放大而得。於最終之建構體pMW168中，甘露糖啟動子和eGFP基因被插進兩個tufA轉錄終止子序列之間。

這兩個tufA終止子序列之核苷酸序列(粗體字，斜體字)和位於這兩個序列之間及末端之限制酶切割位置(畫線於下方)。

取代包含起譯密碼子和起譯密碼子後面之密碼子在內之轉 錄起始區域係於使用互補寡聚核苷酸並經由BglII、AflII和BamHI等限制酶之單一切割位置之下進行。該載體之建構起始於將載體pWA21之T7基因10之轉錄起始區域(Wegerer et al.,supra)分別經由互補寡聚核苷酸s5019和s5020以枯草芽孢桿菌tufA之轉錄起始區域取代。於進一步之選殖步驟中，該轉錄起始區域被gsiB之轉錄起始區域所取代(寡聚核苷酸s5236/s5237)。此最終之質體pMW168.1含有包括從pUB110之ori+在內之rep基因。

pMW168.1之質體圖譜被顯示於圖11中。

b)缺少 manP(ΔmanP)和 manA(ΔmanA)之刪除突變菌種 b1)用以刪除 manP 之插入載體

插入載體pSUN356.7係被用以從無法產生孢子之枯草芽孢桿菌NA之染色體上之甘露糖操縱子中刪除掉編有對甘露糖具專一性之EII密碼之基因manP，且所得到之菌種被稱為枯草芽孢桿菌TQ356(spo0A manP：：ermC)。抗紅黴素框盒被使用作為篩選標記。

載體pSUN356.7係為pUC18之一衍生載體(抗ampicillin)，且含有一抗紅黴素之基因，該基因之左右兩側有manR和manA之序列，於基因取代盒之外面有一抗spectinomycin之基因。該抗spectinomycin之基因係從pDG1730放大而得(請參閱上文論述pSUN266.1之部分)。而抗紅黴素之基因則係利用引子對s5069和s5070從pDG1730放大而得。manR基因之C端係利用引子對s5407和s5408從枯草芽孢桿菌之DNA放大而得，且被插入於該抗紅黴素基因之一側。manA基因之N端係利用引子對s5362 and s5363從枯草芽孢桿菌之染色體放大而得，且被插入於該抗紅黴素基因之另外一側。

質體pSUN356.7之圖譜被顯示於圖12中。

b2)manA 之刪除

此外，一枯草芽孢桿菌之剔除基因突變種係從無法產生孢 子之枯草芽孢桿菌3NA染色體上之甘露糖操縱子中刪除掉基因manA所製備，以插入載體pSUN281產生枯草芽孢桿菌TQ281(spo0A3,manA：：ermC)(請參閱Sun T.et al,Supra)。

基因manA編有甘露糖-6-磷酸鹽異構酶之密碼，該酵素使甘露糖-6-磷酸鹽轉變成果糖-6-磷酸鹽。

抗紅黴素之基因盒係用於監控刪除是否成功。

b3)轉化

依據上文b1)和b2)中之枯草芽孢桿菌TQ356和枯草芽孢桿菌TQ281每一種皆被上文a1)中得到之質體pMW168.1所轉化。

所使用之培養基：

a)最低葡萄糖(MG)：

2.0公克 硫酸銨

6.0公克 磷酸二氫鉀

14.0公克 磷酸氫二鉀

1.0公克 檸檬酸鈉

0.2公克 硫酸鎂*7結晶水

5.0公克 葡萄糖(分別為20至50%儲備溶液)

b)培養基I：

9.50毫升 最低葡萄糖

0.20毫升 酪蛋白胺基酸(1%儲備溶液)

0.05毫升 硫酸鎂(1M儲備溶液)

c)培養基II：

8.00毫升 最低葡萄糖

0.10毫升 酪蛋白胺基酸(1%儲備溶液)

0.05毫升 硫酸鎂(1M儲備溶液)

轉化反應係依據Anagnostopulos等人，於1961年發表於J.Bacteriol.期刊第81期741頁至746頁「枯草芽孢桿菌中轉化作用之必需品」，之方法所進行。

將每一菌種之單一菌落接種至5毫升之培養基I中，然後將其置入一滾筒中於37℃下隔夜培養。將1毫升之隔夜培養(OD₆₀₀介於1和2之間)移入一裝有8毫升培養基II之100毫升震盪錐形瓶中，並於37℃下培養85分鐘。然後將1毫升之足夠細胞移至Schütt公司之試管中，並與各插入載體混合。在與足夠細胞進行混合之前，該等插入載體已被一切割酵素於一不重要之位置所切割。所得到之混合物以異丙醇沉澱，並令其於室溫下進行黏接至少2小時。

然後將所得到經過轉化之細胞於一滾筒中於37℃下培養30分鐘，並於室溫下將其以4,500rpm離心5分鐘。將離心沉澱物重新再懸浮於剩餘之液體中，並將其接種於平板培養基上。

實驗5：發酵 5.1材料與方法

大致上，標準之分子技術亦被使用於該等發酵實驗，如果沒有其他之說明時。

使用於發酵培養基之組成

隔夜培養和預培養#1係於Spizizen最低鹽類培養基(SMM)(Spizizen J.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44,1958,1072-1078)中進行，其中該培養基被補充0.02%(重量/體積)之酪蛋白胺基酸(美國，馬里蘭，Spark，BD Difco^TM)和100微克．毫升^-1之spectinomycin作為質體篩選之用及5微克．毫升^-1之erythromycin作為菌種篩選之用(如果用到TQ281和TQ356時)。預培養#2和發酵培養(批次)係於使用一從Wilms等人(Wilms B.et.al., Biotechnol.Bioeng.73,2001,95-103)所修改之礦物質培養基下所進行，該培養基由下列之成份所組成：1.0公克．公升^-1之檸檬酸氫二銨，2.0公克．公升^-1之硫酸鈉，2.68公克．公升^-1之硫酸銨，0.5公克．公升^-1之氯化銨，14.6公克．公升^-1之磷酸氫二鉀，4.0公克．公升^-1之磷酸氫二鈉×2結晶水，1.0公克．公升^-1之硫酸鎂×7結晶水，3毫升．公升^-1之微量元素溶液(TES)，5公克．公升^-1之葡萄糖用於預培養#2，和25公克．公升^-1之葡萄糖用於批次培養基。微量元素溶液(TES)含有0.5公克．公升^-1之氯化鈣，0.18公克．公升^-1之硫酸鋅×7結晶水，0.1公克．公升^-1之硫酸鎂×結晶水，10.05公克．公升^-1之乙二胺四乙酸二鈉(Na₂-EDTA)，8.35公克．公升^-1之氯化鐵，0.16公克．公升^-1之硫酸銅×5結晶水，和0.18公克．公升^-1之氯化亞鈷×6結晶水。用於高細胞密度發酵之供應培養基含有200公克．公升^-1之葡萄糖，7.89公克．公升^-1之硫酸鎂×7結晶水，40毫升．公升^-1之微量元素溶液(TES)，和63.36公克．公升^-1之磷酸氫二銨，當使用小型實驗室發酵槽時。pH值被調整至3.3以確保所有組成份之安定性。當使用一30公升之反應槽時，則使用到兩個分開之供應培養基。第一個培養基含有654.76公克．公升^-1之葡萄糖×結晶水，23.5公克．公升^-1之硫酸鎂×7結晶水，120毫升．公升^-1之微量元素溶液，第二個培養基含有396公克．公升^-1之磷酸氫二銨。於誘發manP啟動子時，使用20%(重量/體積)之D-甘露糖溶液或一分開之供應溶液，其含有200公克．公升^-1之甘露糖，7.89公克．公升^-1之硫酸鎂×7結晶水，40毫升．公升^-1之微量元素溶液，和63.36公克．公升^-1之磷酸氫二銨。

預培養和饋料批次培養之條件

將單一菌落從LB瓊脂平板培養基中取出，並將其接種入5毫升之SMM中，並於37℃下隔夜培養至少14小時。將25毫升之SMM培養基加進250毫升之搖瓶中，然後將該隔夜培養物接種入該搖 瓶中以達到於600nm下之光密度值(OD₆₀₀)為0.05(預培養菌#1)。經過5小時於37℃下之培養後，取20毫升之預培養菌#1，並將其接種入裝有200毫升預培養菌#2培養基之1000毫升搖瓶中(預培養菌#2)。再經過7小時於37℃下之培養後，將預培養菌#2接種入批次培養之培養基中。

使用過去針對以葡萄糖作為主要碳源之大腸桿菌(Korz D.J.et al.,J.Bacteriol.39,1995,59-65；Wilms supra)所研發和經過最佳化之饋料批次發酵設備。如果使用一3.7公升之小型實驗室發酵槽KLF(瑞士，Wald，Bioengineering AG)時，則批次之體積為1.5公升，且供料之體積為1.0公升。如果使用一30公升之實驗室發酵槽D598(瑞士，Wald，實驗室發酵槽；Bioengineering AG)時，則批次之體積為8.0公升，葡萄糖供應培養基為4.2公升，氨供應培養基為1.0公升。葡萄糖培養基和氨培養基以81%：19%之比例被加至反應器中。此等供應培養基被添加至該生物反應器中，係根據：F(t)=[(μ _set /Y _X/S )+m]×[(c _x0 ×V ₀ )/c _s0 ]×exp(μ _set ×t) 方程式1

其中：F(公升．小時^-1)係指供料之速率，μ_set(小時^-1)係指所希望得到之比生長速率，m(公克．公克^-1小時^-1)係指比維持係數(=0.04公克．公克^-1小時^-1)，Y_x/s係指比生物原料/受質產量係數(葡萄糖大約為0.5)，c_x0(公克．公升^-1)係指於開始供料時之生物原料濃度，V₀(L)係指於開始供料時反應器之體積，c_s0(公克．小時^-1)係指供應溶液中葡萄糖之濃度，和t(小時)係指於開始供料後之時間。選擇0.1小時^-1為比生長速率μ值係為避免製造出非專一性和不必要之副產物，並避免氧氣之限制。

於37℃下進行批次培養，直到溫度轉移至30℃開始進行饋料批次階段為止，以避免所表現之異源性蛋白質形成不必要之包涵體。分別以24%(體積/體積)之氨水和20%(體積/體積)之磷酸將pH值調整至7.0。氧氣壓力(pO₂)值靠著一自動調整攪拌器速度被維持在超過50%之飽和度。 當使用小型實驗室發酵槽時，通氣速率被維持恆定於2公升．分鐘^-1，而當使用實驗室發酵槽時則被維持在15至25公升．分鐘^-1之間。維持超壓於0.5巴。細胞密度測定之方式係於固定之時間以Ultrospec^TM 1100 pro紫外光/可見光分光光度計(英國，GE Healthcare，以前稱為Amersham Biosciences)測量OD₆₀₀之數值。細胞乾燥重量(cdw)之計算方式係將OD₆₀₀之測量值乘以係數0.322公克_{細胞乾燥重量}公升^-1，此係數係於發酵時經過以MB 835 Halogen(美國紐澤西州，Pine Brook，Ohaus Corporation)進行數次濕度量測後所得到之一平均值。Biolog 1.7套裝軟體(德國斯圖加特大學生物化學工程研究所[http：//www.ibvt.uni-stuttgart.de])被用於發酵參數之控制。該饋料批次發酵於經過大約40小時之處理時間後結束。

上線與離線之螢光測量

為追蹤所製造重組eGFP之實時表現率，於生物反應器內使用一螢光探針(Mikropack HPX-2000,High Power Xenon Lightsource；Ocean Optics,Inc.；S2000 fibre optic spectrometer；Dunedin，佛羅里達，美國)。消光波長為485nm，而發射波長則於535nm處被偵測到，且由Spectra Suite套裝軟體(Ocean Optics,Dunedin，佛羅里達，美國)於線上所記錄。傳送螢光使其通過一強度為0.6之濾光器。探針積分時間為50毫秒。由於軟體僅能計算數值到達4,000個計數值這個事實，所以積分時間就在達到更高之水準之前就逐步減少。因此，後面還要將該螢光計數乘以所對應減少之倍數以得到對應於50毫秒之數值。該等測量到之數值係特別針對於某一反應器之體積。

此外，螢光活性之離線測量係於使用SpectraFluor Microplate Reader(Tecan Group Ltd.,Männedorf，瑞士)之下所進行。因此，於96孔之微孔盤(德國，Frickenhausen，Greiner-Bio One GmbH)中測量3×250微升未經稀釋之細胞培養，其中使用3×250微升之批次培養基為空白值(激發光濾 鏡：485nm；發射光濾鏡：535nm；增益(徒手操作)：60；積分時間：20微秒；閃光次數：3；讀取模式：頂部)。由樣本之平均值減去空白值之平均值後得到最後之數值。當一達到20,000個計數值時，細胞培養即以批次培養基加以稀釋。

從一針對於純化後之eGFP(大約95%純度，1.3公克．公升^-1)為內校標準品所做之校正，可傳達出以下之訊息：大約120,000個離線測量計數值對應到1公克_eGFP公升^-1。此結果可顯示在離線和上線測量值之間存在一線性連貫，其產生每7470個上線測量計數值對應1.5公克_eGFP公升^-1之相關性。

質體安定性測定

載體pMW168.1安定性之測定係依據Harwood和Cutting等人所述之方法(Harwood C.R.et al,Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley & Sons Ltd.,Chichester,England)測量含有質體之細胞之比率。

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法之蛋白質分析

未經純化之細胞萃取物係以如下之方式所取得：收集10¹⁰個細胞並將其離心。以1毫升50mM之磷酸鈉緩衝溶液(pH 7.5)使被離心沉澱之細胞重新再懸浮於其中，並使用超音波(美國，紐約，Farmingdale，Heat Systems-Ultrasonics,Inc.,model W-385超音波細胞粉碎機；3×30秒，50%工作週期)將其溶解。離心之後，由上清液取得可溶性蛋白質之部份，而不可溶性蛋白質之部份則以1毫升50mM之磷酸鈉緩衝溶液(pH 7.5)使該沉澱物重新再懸浮於其中。接著以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)(Laemmli U.K.,Nature 227,1970,680-685；LeBlanc D.J.et al.,Antimicrob.Agents Chemother 35,1991,1804-1810)分析此等蛋白質之部分。

5.2利用枯草芽孢桿菌 3NA/pMW168.1之高細胞密度發酵

利用枯草芽孢桿菌3NA/pMW168.1之甘露糖表現系統被測試於一饋料批次培養中。所使用之設備如之前所述(Korz et al.,Wilms et al.,supra)。

於第一個發酵中，其進行於一實驗室發酵槽攪拌反應槽中，將額外0.2%(重量/體積)之D-甘露糖於開始進行饋料批次階段時立即添加至培養液中。截至目前為止未顯現明顯螢光之探針，於經過誘發之後其螢光訊號增加的非常迅速。在經過饋料批次階段4小時後達到大約2,200個計數之波峰值之後，訊號開始再次穩定衰減。此訊號之衰減半隨著誘發劑之消耗(由HPLC所測量，數據未顯示)。於該發酵過程結束時，產生0.2公克_eGFP．公升^-1或3毫克_eGFP每公克_{細胞乾燥重量}。

於第二個發酵中，使用另一以指數方式進行之D-甘露糖供應。該發酵在同時供應葡萄糖下開始進行，其目的在使兩者整個糖濃度之供應和於第一個發酵中之糖濃度一樣高。螢光訊號於添加誘發劑之後開始出現，並一直持續到該過程結束為止。將全部數量為50公克之D-甘露糖添加至反應槽內之培養液中以維持該增加。依據該誘發之方案，產生2.1公克_eGFP．公升^-1或53毫克_eGFP每公克_{細胞乾燥重量}。兩個由枯草芽孢桿菌3NA/pMW168.1所進行之發酵之詳細結果被總結於5.5結果中顯示之列表中。

eGFP之製造於整個饋料階段中雖有增加之現象，但其製造之速度卻比生物原料之製造還要慢。由質體安定性檢查之結果顯示大約有95%之細胞於兩個發酵過程結束時仍還一直攜帶著該載體。

5.3使用ΔmanA 菌種TQ281之高細胞密度發酵

選擇刪除manA之菌種TQ281，其不能夠在依靠甘露糖為唯一之碳源下生長(Sun T.et al.,supra)，進行更進一步之發酵實驗。由 pMW168.1所轉化之枯草芽孢桿菌TQ281顯示於搖瓶實驗中對D-甘露糖具有敏感度。

兩個饋料批次發酵皆係由TQ281/pMW168.1所建立。於第一個發酵中，誘發係於饋料批次階段開始進行時以單次添加甘露糖之方式進行。於第二個發酵中，則是同時開始另一以指數方式進行之甘露糖供應。D-甘露糖之誘發顯示對於饋料批次階段中之比生長速率沒有顯著之影響。以單次添加之方式，可達到0.71公克_eGFP．公升^-1相當於36毫克_eGFP每公克_{細胞乾燥重量}，而以指數方式進行之供應方式，則可達到1.9公克_eGFP．公升^-1相當於32毫克_eGFP每公克_{細胞乾燥重量}。兩種發酵之詳細結果被表列於5.5結果之表中。

5.4可自體誘發之表現系統於使用ΔmanP 菌種TQ356之高細胞密度發酵中之發展和應用

枯草芽孢桿菌ΔmanP菌種TQ356在無P _manP 誘發之情況下及一於葡萄糖存在時之CCR作用下顯示一持續性之表現(Sun T.et al.,supra)。此菌種為pMW168.1所轉化，其產生相當小之螢光菌落。經過將0.5%(重量/體積)之葡萄糖添加至該選擇培養基之後，菌落之生長遂趨於正常。於搖瓶實驗中，當葡萄糖耗盡時，便達到高表現之水準(數據未顯示)。

含有pMW168.1之枯草芽孢桿菌TQ356然後被使用於一饋料批次之發酵中(圖13)。於批次培養之階段中，結果類似於枯草芽孢桿菌菌種3NA/pMW186和菌種TQ281/pMW168批次發酵，沒有明顯之螢光可被偵測到。但於開始進入饋料批次階段時，反應槽探針之螢光訊號即開始不斷增加。經過36小時全部發酵時間之後，細胞內之表現水準達到最高點，如其可由一固定之Y_P/X值直至發酵過程結束為止皆為14.6%所見，該數值與一固定之比生產率相對應。在無添加任何誘發劑之下，達到近乎10公克_eGFP．公升^-1相當於146毫克之eGFP每公克_{細胞乾燥重量}。下文於5.5結果所列舉之表中總 結該等發酵之結果，並與其他進行之發酵做比較。SDS-PAGE電泳法之施做係要得到一關於所表現之eGFP相較於總蛋白質百分比之印象(圖14)。如其可被看見，總蛋白中至少有20%係eGFP分子，僅有一小部份係為不溶性的，而且以包涵體之形式存在(圖14，第7行)。未經稀釋之培養液上清液亦以SDS-PAGE電泳法進行分析(圖14，第8行)，並以分光光度計測量。全部被測量到之eGFP當中大約有1%被發現於上清液之中，其可能係因為整個發酵過程中不間斷之細胞溶解所致。

質體之安定性和細胞之形態於整個發酵之過程中皆被檢驗。

5.5結果

5.2至5.4發酵進行之結果被總結於下表中。

有關於不同誘發方案與所使用含表現載體pMW168.1.b之枯草芽孢桿菌菌種於所進行發酵之比較

b縮寫和參數說明：SA：單次添加誘發劑(甘露糖)；EF：以指數方式供應誘發劑(甘露糖)；AI：自體誘發；final：於發酵過程結束時；LF：30-公升實驗室發酵槽；KLF：3.7-公升小型實驗室發酵槽；tfb：饋料批次時間/所維持之時間，final：於發酵過程結束時；cx,final：細胞乾燥重量濃度；Xfinal：絕對細胞乾燥重量；cP,final：產物濃度；PeGFP,final：絕對產物(eGFP)；YP/X：產物每公克細胞乾燥重量；rP：比生產率，qP：體積生產 率。

如該等於批次培養階段所得到之結果顯示，實際上並沒有發生報導基因eGFP之表現。於可自體誘發之5.4發酵中，啟動自體誘發在介於培養之批次階段和饋料批次階段間受葡萄糖限制之過渡階段初期以及維持其自體誘發於整個限制內部葡萄糖之饋料批次階段造成產物之產量增加三倍至146毫克GPF每公克_{細胞乾燥重量}。

此外，如由TQ281(5.3發酵)所得到之結果顯示，由單次添加0.7公克(eGFP)/公升之誘發劑所得到之產率可藉由另外於指數階段供應誘發劑至1.9公克/公升而得到明顯之增加。

5.6討論

於5.2至5.4之發酵中，使用枯草芽孢桿菌之表現系統，其包含有於載體pMW 168.1中之甘露糖啟動子PmanP以促進eGFP之表現。啟動子PmanP已被證明為一強力之啟動子，其係於添加D-甘露糖時被活化。

於5.2之發酵中，枯草芽孢桿菌無孢子產生之菌種3NA，其被該載體所轉化，造成高度之產物水準，亦即2.1公克_eGFP．公升^-1。相較於一最近被描述之B.megaterium系統(Stammen et al.,Appl.Environ.Microbiol.76,2010,4037-4046)，其為一用於製造重組蛋白上相當具有前途之宿主細胞，本枯草芽孢桿菌系統產生更佳之結果。此於B.megaterium細胞內之蛋白質製造系統，其可為木醣所誘發，於饋料批次發酵中產生1.25公克_eGPF．公升^-1，相當於36.8毫克每公克_{細胞乾燥重量}。此外，Stammen等人(supra)一直到該發酵過程結束為止都使用抗生素，結果於發酵過程中沒有發生質體漏失情形。

5.2之發酵顯示甘露糖系統從生產率之角度而言是非常具有效率的，然而一次性之添加誘發劑卻不會產生恆定之高度表現率。此係因為誘發劑甘露糖快速地被消耗，因為甘露糖係枯草芽孢桿菌最喜愛之碳源 中之其中一者。

因此，本申請案關係到一方法，其於一無孢子產生之枯草芽孢桿菌宿主細胞中製造一異源性之多胜肽，該方法包含以下之步驟：將該無孢子產生之枯草芽孢桿菌細胞以一載體轉染，其中該載體含有marP啟動子，其可經由剪接操作方式與編有該多胜肽密碼之核苷酸序列相連接，接著讓該經過轉化之宿主細胞生長於一可讓所述多胜肽表現之適當條件下之培養基中，然後從細胞或細胞培養基中回收該多胜肽，其中該多胜肽之表現係由添加誘發劑甘露糖所誘發。於本申請案一較佳之實施例中，誘發劑甘露糖係於開始進入饋料批次階段時被添加。於另一較佳之實施例中，第一次添加於誘發劑甘露糖係於開始進入饋料批次階段時，而第二次甘露糖之添加則係於指數生長期時，且同時一起進行葡萄糖之供應。

5.3之發酵實現一減少誘發劑需求之表現載體，其方法是瓦解甘露糖-6-磷酸鹽異構酶之基因manA。此產生一系統，其中需要較少之誘發劑以得到高度之表現率，此可於搖瓶實驗中被觀察到。

然而，此系統卻伴隨著該細胞之自體中毒，因為如果使用數量超過0.5%(重量/體積)之甘露糖時，細胞之生長即受到抑制。此作用可能係因為甘露糖-6-磷酸鹽在細胞內累積所致。manA剔除菌種TQ281對甘露糖具敏感度之另一可能原因可能是可利用之磷酸基猛然減少，因為磷酸基係以不可逆之方式與甘露糖結合，當甘露糖經由PTS系統進入細胞時。

因此，本申請案關係到一方法，其於一缺少manA基因之枯草芽孢桿菌宿主細胞中製造一異源性之多胜肽，該方法包含以下之步驟：將該缺少manA基因之枯草芽孢桿菌細胞以一載體轉染，其中該載體含有manP啟動子，其可經由剪接操作方式與編有該多胜肽密碼之核苷酸序列相連接，接著讓該經過轉化之宿主細胞生長於一可讓所述多胜肽表現之適當 條件下之培養基中，然後從細胞或細胞培養基中回收該多胜肽，其中該多胜肽之表現係由添加數量不超過0.5%(重量/體積)之誘發劑甘露糖所誘發。於本申請案一較佳之實施例中，誘發劑甘露糖係於開始進入饋料批次階段時被添加。於另一較佳之實施例中，誘發劑甘露糖係於開始進入饋料批次階段時第一次被添加，而第二次甘露糖之添加則係於指數生長期時被執行，但同時一起進行葡萄糖之供應。

實施例5.4中顯示一不再需要任何誘發劑之誘發方案。此可自體誘發之系統與manP剔除菌種TQ356和表現載體pMW168.1一起被付諸實行。

於一缺乏傳輸蛋白之菌種，如TQ356當中，甘露糖啟動子僅受到由葡萄糖所促使之CCR之調節控制，其例如在發酵過程之批次培養階段中是如此之情況。由同源傳輸蛋白ManP所產生之負向調節作用已被消除。然而，只要有葡萄糖存在時，調節蛋白仍一直處在不活化之狀態。此外，沒有充足數量之ManR，因為manR操作子之位置被阻擋住。不用等到葡萄糖達到限制量時，ManR便能夠和其操作子序列結合，並開始進行表現。此種自體誘發系統讓非常昂貴誘發劑之需求顯得沒有必要。此種先進之誘發系統對於工業上之應用是非常有希望的，因為在批次培養階段中沒有發生明顯非必要之基礎表現，而且於整個饋料批次培養階段中沒有需要添加任何誘發劑以取得到高度之表現水準。

除此之外，還可得到相當高之表現率和高生產率，相較於5.2和5.3之發酵。由此發酵可製得近乎於10公克．公升^-1之重組蛋白(eGFP)相當於146毫克_eGFP每公克_{細胞乾燥重量}。該產物因其溶解度而均勻地分佈於細胞之中，如其可由螢光顯微鏡和SDS-PAGE電泳法之分析所觀察。該高表現率，即高生產率，可被維持在一固定之高水準，直到該發酵過程結束為止。

因此，本申請案亦關係到一方法，其於一缺少傳輸蛋白之枯草芽孢桿菌宿主細胞中，諸如於一缺少manP基因之細胞中製造異源性之多胜肽，該方法包含以下之步驟：將該缺少傳輸蛋白之枯草芽孢桿菌細胞以一載體轉染，其中該載體含有manP啟動子，其可經由剪接操作方式與編有該多胜肽密碼之核苷酸序列相連接，接著讓該經過轉化之宿主細胞生長於一可讓所述多胜肽表現之適當條件下之培養基中，然後從細胞或細胞培養基中回收該多胜肽，其中該多胜肽之表現並不是由甘露糖所誘發，而是受葡萄糖所控制。

<110> 隆查股份有限公司

<120> 可誘發啟動子之調節

<130> 9200-9329

<150> EP11162420.1

<151> 2011-04-14

<150> EP10171252.9

<151> 2010-07-29

<160> 45

<170> 3.5版專利

<210> 1

<211> 143

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 1

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 2

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<211> 195

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 3

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<211> 128

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 4

<210> 5

<211> 121

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 5

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<400> 6

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s4694

<400> 7

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s4802

<400> 8

<210> 9

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<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 引子s4833

<400> 9

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s4835

<400> 10

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s4956

<400> 11

<210> 12

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<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s4957

<400> 12

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5006

<220>

<221> 其他特性

<222> (1)..(1)

<223> 以Cy做標記

<400> 13

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5007

<220>

<221> 其他特性

<222> (1)..(1)

<223> 以Cy做標記

<400> 14

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5019

<400> 15

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5020

<400> 16

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5069

<400> 17

<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5070

<400> 18

<210> 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5071

<400> 19

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5072

<400> 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5097

<220>

<221> 其他特性

<222> (1)..(1)

<223> 以Cy做標記

<400> 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5098

<220>

<221> 其他特性

<223> 以Cy做標記

<400> 22

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5139

<400> 23

<210> 24

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5156

<400> 24

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5203

<400> 25

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5208

<400> 26

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5209

<400> 27

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5234

<400> 28

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5235

<400> 29

<210> 30

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5236

<400> 30

<210> 31

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5237

<400> 31

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5262

<400> 32

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5362

<400> 33

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5363

<400> 34

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5407

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5408

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5617

<400> 37

<210> 38

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5618

<400> 38

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5932

<400> 39

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5933

<400> 40

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 引子s5934

<400> 41

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> cre一致性序列

<220>

<221> 其他特性

<222> (5)..(5)

<223> n為a,c,g,或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n為a,c,g,或t

<220>

<221> 其他特性

<222> (11)..(11)

<223> n為a,c,g,或t

<400> 42

<210> 43

<211> 50

<212> DNA

<213> 噬菌體T7

<400> 43

<210> 44

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 序列5-3

<400> 44

<210> 45

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> 與流水號第44號序列互補

<400> 45

Claims (13)

1. 一種於一重組細菌性宿主細胞中製造一異源性多胜肽之方法，其中，使用到一重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制及磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致其不能夠在沒有誘發性次級碳源之存在下使對一啟動子具有專一性之轉錄調節蛋白去活化，該啟動子可被一次級碳源所誘發，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子可被該次級碳源所誘發，並且被該轉錄調節蛋白所調節，所述之方法包含下列之步驟：讓該細菌性之宿主細胞生長於一細胞培養基中，該培養基不含該具誘發性之次級碳源，但卻包含一不同之碳源，由該不同之碳源誘發所述之多胜肽之表現，當該不同之碳源濃度下降至碳降解代謝產物抑制所需之水準之下時，及從該細胞或從該細胞培養基中回收該多胜肽。
2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中使用到一細菌性宿主細胞，其中藉由修改基因之方式，避免轉錄調節蛋白因被酵素EII磷酸化而去活化，酵素EII對所述之轉錄調節蛋白具有專一性。
3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中，i)於該細菌性宿主細胞之基因體上刪除基因，該基因編有磷酸基轉移酵素EII之密碼，酵素EII對轉錄調節蛋白具有專一性，或其中，ii)於該細菌性宿主細胞之基因體上將編有該轉錄調節蛋白 密碼之基因做基因之修改，使得由所述基因表現之轉錄調節蛋白不能夠與由酵素EII轉移之磷酸基結合。
4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中於情況i)於該載體中嵌入該基因，其編有控制該載體啟動子之轉錄調節蛋白密碼；或其中於情況ii)於該載體中嵌入該細菌性宿主細胞經過修改之基因，其編有該不能夠與由對應酵素EII轉移之磷酸基結合之轉錄調節蛋白密碼。
5. 根據申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其中該細菌性宿主細胞係由芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌和埃希氏桿菌。
6. 根據申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其中於培養基中包含酪蛋白胺基酸。
7. 根據申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法，其中多胜肽之表現係在無誘發劑之誘發下被啟動。
8. 根據申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中將所述至少碳源以一定數量添加至培養基中，其中該數量足以維持該細菌性宿主細胞預定之生長速率而不會誘發碳降解代謝產物抑制。
9. 根據申請專利範圍第1項至第8項中任一項之方法，其中該可由碳源誘發之啟動子係甘露糖操縱子之一啟動子，且其中該具誘發性之碳源係甘露糖。
10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該啟動子係甘露糖操縱子之P_manP或P_manR啟動子。
11. 根據申請專利範圍第10項之方法，其中i)於該細菌性宿主細胞之基因體上，其編有manP之密碼被刪除，或其中ii)於該細菌性宿主細胞之基因體上將編有該轉錄調節蛋白ManR密碼之基因做基因之修改，使得由所述基因表現之ManR不能夠與由專一性之酵素EII所轉移之磷酸基結合。
12. 一種重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致其不能夠在沒有誘發性次級碳源之存在下使對一啟動子具有專一性之轉錄調節蛋白去活化，該啟動子可被一次級碳源所誘發，其修改基因之方式係刪除該細菌性宿主細胞基因體上編有磷酸基轉移酵素EII密碼之基因，酵素EII對該轉錄調節蛋白具有專一性，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子被該轉錄調節蛋白所調節，其中該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白於基因上經過修改以致於不能夠被去活化，且其中於該載體中嵌入一編有該專一性轉錄調節蛋白密碼之基因。
13. 一種重組細菌性宿主細胞，其碳源之降解代謝係受碳降解代謝產物抑制和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸轉移酶系統之控制，且其在基因上被做修改，以致其不能夠在沒有誘發性次級碳源之存在下使對一啟動子具有專一性之轉錄調節蛋白去活化，該啟動子可被一次級碳源所誘發，其修改基因之方式係將細菌性宿主細胞基因體上編有該轉錄調節蛋白密碼之基因做基因上之修改，使得由所述基因表現之轉錄調節蛋白不能夠與由酵素EII所轉移之磷酸基結 合，酵素EII對該轉錄調節蛋白具有專一性，且其包含一載體，其攜帶有一編有一多胜肽密碼之異源性核酸序列，且該序列可經由剪接操作方式與一啟動子相連接，該啟動子被該轉錄調節蛋白所調節，其中該細菌性宿主細胞之轉錄調節蛋白於基因上經過修改以致於不能夠被去活化，且其中於該載體中額外嵌入該經過修改之基因，其編有該不能夠與由對應酵素EII所轉移之磷酸基結合之轉錄調節蛋白之密碼。