KR102022884B1 - 유도 프로모터의 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 박테리아 숙주세포는 유도인자가 없는 경우 상기 이종 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 프로모터를 비활성화할 수 없게 된다.

Description

유도 프로모터의 조절 방법 {REGULATION OF INDUCIBLE PROMOTER}

본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

더욱 상세하게, 본 발명은 특정 기질(유도인자)에 의해 유도되는 프로모터를 사용하여 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 더 상세하게, 본 발명은 박테리아 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 방법으로, 박테리아 숙주세포는 유도인자가 없는 경우 이종 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 프로모터를 비활성화할 수 없게 된다.

재조합 미생물 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하는 데 있어 중요한 점은 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열의 발현을 제어하기 위해 사용되는 프로모터를 선택하는 것이다.

적절한 프로모터로는 효과가 강력한 것이어야 한다. 즉, 많은 양의 폴리펩타이드가 생성될 수 있도록 빠른 속도로 각 mRNA를 생성하는 것이어야 한다. 또한, 쉽게 조절되고, 도입되는 즉시 이종 폴리펩타이드의 생산을 개시하는 것이어야 한다.

일반적으로 유도성 기질은 미생물이 필요한 양분을 포함하고 있어 미생물에 의해 소모되는 문제가 있다. 그러나, 미생물을 배양하기 위해 사용되는 배지가 유도성 기질을 모두 소모하면, 미생물은 프로모터를 비활성화시키고, 이에 따라 목적 폴리펩타이드의 발현은 중단된다. 유전자의 발현이 원치 않게 중단되는 것을 방지하기 위해, 많은 양의 유도인자를 첨가하거나 그리고/또는 계속해서 보충해야 한다. 이렇게 많은 양의 유도인자가 필요함에 따라 발효과정에서 드는 비용이 증가하게 된다. 또한, 값비싼 유도인자를 요하는 효과적인 프로모터를 사용하는 것은 제한적이다.

그 결과, 재조합 폴리펩타이드 생산을 위해서는 숙주세포가 필요하고, 이종 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 프로모터의 활성은 유도인자의 존재유무와는 무관하기는 하지만, 이종 폴리펩타이드의 발현은 철저하게 조절될 수 있다.

WO2006/133210에는 만니톨, 아라비톨, 글루시톨 또는 글리세롤 유도 프로모터를 이용하여 박테리아 숙주세포에서 재조합 펩타이드를 생산하는 방법이 개시되어 있는데, 이러한 박테리아 숙주세포는 유도인자를 분해하거나 대사할 수 없게 되어있다. 상기 방법에 따르면, 유도인자 대사에 필요한 효소를 암호화하는 유전자는 게놈 내에서 유전적으로 변형 또는 삭제되어 세포가 자신의 게놈으로부터 유도인자를 대사하거나 분해하기 위해 필요한 기능 효소를 발현할 수 없다. 이러한 유도인자를 사용하기 위해서 유도인자의 세포 내 수송과 관련된 유전자는 영향을 받지 않는다.

그러나, 이러한 방법에서는 목적 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 각 프로모터의 활성을 촉진하기 위한 유도인자의 첨가하는 것이 필요하다. 또한, 세포 내에 유도인자가 축적되면 세포 성장에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다.

다양한 종류의 박테리아는 서로 다른 탄소원을 사용할 수 있다. 탄소원이 혼합물로 존재하는 경우, 가장 빠른 성장을 가능하게 하는 탄소원(제1 탄소원)이 선택된다. 동시에, 제2 탄소원의 이용과 관련된 기능들은 탄소 이화대사 억제(carbon catabolite repression (CCR)) 현상에 의해 억제된다.

탄소 이화대사 억제 현상 외에도, 차선의 제2 탄소원을 이용하는 데 필요한 특이 이화작용 유전자는 상기 제 2 탄소원이 존재하는 경우에만 발현된다. 그 결과, 제2 탄소원의 이화에 필요한 유전자의 발현은 상기 제2 탄소원의 존재하고(유도) 및 제1 탄소원의 부재함(이화대사 억제)에 따라 결정된다.

Tianqui Sun et al. "Characterization of a mannose utilization system in bacillus subtilis," Journal of Bacteriology, American Society for Microbiology, vol. 1 92 , no 8, April 1 , 2010, pages 2128 bis 2139는 만노오스 오페론 및 그 유전자 그리고 만노오스에 의해 조절되는 프로모터인 PmanP and PmanR이 확인되었다고 대해 공개했다. 이 문헌에서는 만노오스의 대사는 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되고, 만노오스 오페론은 탄소 이화대사 억제에 의해 더 제어된다고 보고되어 있다. 이러한 각 유전자의 기능을 정의하고 확인하기 위해, 각각의 유전자가 결핍되고 이에 따라 이 유전자에 의해 암호화되는 각 단백질이 결핍된 녹아웃 돌연변이를 준비하였다. 만노오스 운반체 유전자 manP가 결실되면 프로모터 PmanP 및 PmanR로부터 구성적 발현이 야기된다는 사실이 밝혀졌고, 이는 만노오스 운반체 ManP가 만노오스 오페론 및 만노오스 특이 전사조절 ManR을 암호화하는 manR유전자의 조절에 있어 부정적인 영향을 끼친다는 것을 의미한다.

Tobisch et al. "Regulation of the lie operon of Bacillus subtilis and characterization of potential phosphorylation sites of the LiR regulator protein by site-directed mutangenesis" in Journal of Bacteriology, vol. 181, no. 16, August 19, 1999, pages 4995-5003에는 조절인자 LicR의 EIIA영역에 있는 아미노산에 결합된 포스포릴기를 다른 아미노산으로 교체하면 유도성 기질이 없어도 돌연변이 조절인자인 LicR을 활성화시킬 수 있다는 것이 보고되어 있다.

Gorke et al. "Carbon catabolite repression in bacteria: Many ways to make the most out of nutrients" in Nature Reviews. Microbiology, vol. 6, no. 8, August 2008, pages 613-624에는 만노오스 운반체인 EllAB가 결핍된 연쇄상구균(Streptococcus) 돌연변이 숙주 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 미치는 영향에 대해 개시되어 있다. 이 문헌에는 만노오스 운반체인 EllAB는 만노오스만 인산화하는 것이 아니라 포도당, 과당, 2-디옥시글루코오스도 인산화한다고 기재되어 있다. 또한, 만노오스 운반체인 EllAB가 없는 경우에도, 만노오스가 과당 특이 운반체인 EII^FRU에 의해서 이용될 수 있다고 기재되어 있다.

Deutscher et al. "The mechanisms of carbon catabolite repression in bacteria" (Current Opinion in Microbiology, Current Biology LTD, GB, vol. 1 1 , no. 2, April 1 , 2008, pages 87-93)에서는 대장균 및 바실루스 섭티리스와 같은 다양한 박테리아에서의 탄소 이화대사 억제 메커니즘에 대한 일반적인 개요를 제공하고 있다.

본 발명은 박테리아 숙주세포를 제공함으로써 탄소 이화작용의 조절메카니즘을 이용하는 방법을 제공하는 것으로, 제2 탄소원의 대사에 필요한 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 해당하는 탄소원이 존재하지 않을 경우 비활성화되지 않으며, 상기 프로모터는 탄소 이화대사 억제에 의해서만 제어된다.

본 발명에 따르면, 사용되는 프로모터는 상기 박테리아 숙주세포의 제 2 탄소원 이용을 조절하는 프로모터이다.

제1 탄소원이 존재하는 경우, 상기 프로모터는 탄소 이화대사 억제에 의해 제어된다. 상기 재조합 박테리아 숙주세포를 배양하기 위해 사용되는 배지가 제1 탄소원을 모두 소모했거나 제1 탄소원의 농도가 탄소 이화대사 억제에 필요한 수준 이하로 떨어졌을 때, 상기 프로모터의 탄소 이화대사 억제는 작동하지 않는 상태가 되며, 상기 프로모터는 자동으로 상기 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 발현을 개시한다.

본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포를 제공하기 위한 것으로, 상기 재조합 박테리아 숙주세포는 하나 이상의 탄소원을 이용할 수 있으며, 이러한 박테리아 숙주세포 탄소원의 탄소 이화작용은 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템 및 탄소 이화대사 억제에 의해 제어되며, 상기 박테리아 숙주세포는 제2 탄소원이 없는 경우 탄소원 유도 프로모터의 전사조절 단백질이 비활성화되는 것을 방지하기 위해 유전적으로 변형되지만, 탄소 이화대사 억제에 의해 제어되며, 상기 탄소원은 박테리아 숙주세포의 제2 탄소원인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 박테리아 숙주세포는 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산서열을 포함하는 벡터에 의해 형질 전환되며, 상기 벡터의 프로모터는 전사조절 단백질에 의해 제어되는데 이는 특정 해당 탄소원이 없는 경우 상기 박테리아 숙주세포가 비활성화될 수 없도록 유전적으로 변형되기 때문이다.

또한, 본 발명은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 형질 전환된 본 발명의 재조합 박테리아 숙주세포를 배양함으로써 이종 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 이종 폴리펩타이드를 생산함에 있어 본 발명에 따른 재조합 박테리아 숙주세포를 이용하는 방법에 관한 것이다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 적은 양의 유도인자, 특히 유도인자를 필요로 하지 않는 유전자 발현 유도체계에 관한 것이다. 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 고 세포밀도 발효에 적합한 박테리아 발현 시스템에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포에서 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 재조합 박테리아 숙주세포가 사용되며, 상기 숙주세포 탄소원의 이화작용은 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며, 이러한 숙주세포는 유도성 제2 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 특이성을 지닌 전사조절 단백질을 비활성화할 수 없도록 유전적으로 변형되고, 상기 제2 탄소원에 의해 유도되고 상기 전사조절 단백질에 의해 조절되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 방법은 유도성 제2 탄소원이 아닌 다른 종류의 탄소원을 포함하는 세포 배양 배지에서 상기 박테리아 숙주세포를 성장시키는 단계, 상기 다른 탄소원의 농도가 탄소 이화대사 억제에 필요한 수준 이하로 감소하는 경우 한 번에 상기 다른 탄소원에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 단계, 및 세포 및 세포 배양물에서 폴리펩타이드를 수거하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기에 적합한 재조합 박테리아 숙주세포를 제공한다.

예를 들면, 본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포에 관한 것으로 상기 세포 탄소원의 이화작용이 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며, 상기 숙주세포는 제1 탄소원과 다른 유도성 제2 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 특이성을 지닌 전사조절 단백질을 비활성화할 수 없도록 상기 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 포스포릴기 이송 효소 EII을 암호화하는 유전자를 박테리아 숙주세포의 게놈에서 결실함으로써 유전적으로 변형되며, 상기 숙주세포는 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 상기 박테리아 숙주세포가 비활성화할 수 없도록 유전적으로 변형되어 상기 전사조절 단백질에 의해 조절되는 프로모터와, 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열과, 상기 특이 전사조절 단백질을 암호화는 유전자를 포함하고, 상기 전사조절 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 재조합 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 존재하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포에 관한 것으로 상기 세포의 탄소원의 이화작용은 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며,

상기 숙주세포는 제1 탄소원과 다른 유도성 제2 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 특이성을 지닌 전사조절 단백질을 비활성화할 수 없도록, 상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 상기 전사조절 단백질을 암호화하는 유전자를 유전적으로 변형하는 것에 의해, 상기 유전적으로 변형된 유전자에 의해 발현되는 상기 전사조절 단백질이 상기 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 효소 EII에 의해 이송된 포스포릴기를 결합시킬 수 없게 됨으로써 유전적으로 변형되고, 상기 유전적으로 변형된 유전자는 상기 재조합 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 존재하며, 상기 재조합 박테리아 숙주세포는 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 상기 박테리아 숙주세포가 비활성화할 수 없도록 유전적으로 변형되어 상기 전사조절 단백질에 의해 조절되는 프로모터와, 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열과, 상기 효소 EII에 의해 이송되는 포스포릴기를 결합시킬 수 없는 전사조절 단백질을 암호화하는 상기 유전적으로 변형된 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 재조합 박테리아 숙주세포를 배양하여 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공하는 것으로, 재조합 박테리아 숙주세포가 사용되며, 상기 세포 탄소원의 이화작용은 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며, 상기 숙주세포는 탄소원 유도 프로모터의 유도성 탄소원을 대사할 수 없도록 유전적으로 변형되고, 상기 유도성 탄소원은 상기 박테리아 숙주세포를 위한 제2 탄소원이고, 상기 세포는 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터 및 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열을 포함하는 벡터를 포함하며, 상기 방법은 유가배양 과정이며, 회분배양단계 후 상기 유도성 제2 탄소원의 제1 부분을 첨가하여 유도를 개시하고, 동시에 제2 부분의 공급을 개시하는 것을 특징으로 한다.

그 외의 본 발명의 이점 및 목적은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 첨부되는 도면 및 청구항과 함께 상세하게 후술되어 있는 설명을 참조하면 명확하게 이해할 것이다.

상기에서 설명한 본 발명의 실시예에 따르면, 목적 폴리펩타이드의 발현유도는 상기 프로모터를 위한 유도성 탄소원이 존재하는 것과는 무관하다. 따라서, 이러한 실시예는 유도성 탄소원이 반드시 필요한 것은 아니라는 점에서 유리하다.

그러나, 또한 상기 프로모터를 유도하는 데 필요한 탄소원의 양을 줄일 수 있으면 비용적인 관점에서 유익할 것이다.

따라서, 다른 대안으로 본 발명은 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 발현은 탄소원 유도 프로모터에 의해 제어되고, 상기 프로모터 및 상기 목적 폴리펩타이드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질 전환되어야 하는 상기 박테리아 숙주세포에 의한 상기 유도성 탄소원의 이화과정은 중단되거나 적어도 지연된다.

본 발명에 따르면, 이러한 대안은 일단 체내로 이송된 상기 유도성 탄소원을 과당-6-인산으로 전환하는 상기 유도성 탄소원 특이 이성화효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 제거하거나 유전적으로 변형함으로써 구현할 수 있다.

과당-6-인산으로 이성질체화하는 것은 탄소원이 일단 세포 내로 이송되면 수행되는 탄소원 이화작용의 첫 번째 단계이다. 탄소원의 이성질체화를 중단 또는 지연한다는 것은 탄소원이 오랜 시간 동안 유도반응에 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 그 결과, 유도성 탄소원의 양을 줄일 수 있게 된다.

일 예에 따르면, 이러한 대안 방법은 만노오스 유도 프로모터 및 이러한 프로모터를 위한 박테리아 숙주세포에 관한 것으로, 만노오스-6-인산이성질체화효소인 ManA를 암호화하는 유전자를 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 제거하거나 유전적으로 변형하여 만노오스가 일단 세포 내로 이송되면 만노오스의 이성질체화가 일어나지 않도록 하거나 적어도 중단된다.

도 1은 각각의 유전자와 프로모터가 배열 및 배향되어 있는 만노오스 오페론의 구조 및 화살표로 표시된 ManR에 의한 만노오스 오페론의 활성화를 개략적으로 도시하며,
도 2는 만노오스의 이화작용을 설명하기 위한 흐름도로, 운반체가 세포 내로 이송되어, 이송되는 동안 만노오스를 만노오스-6-인산으로 인산화하고, 과당-6-인산으로 전환되는 과정을 도시하며,
도 3은 다양한 영역 및 잠재적인 인산화 부위를 포함하는 ManR 활성체 단백질의 구조를 개략적으로 도시하며,
도 4는 manR 프로모터를 포함하는 바실루스 섭티리스의 프로모터 영역의 핵산서열을 도시하며,
도 5는 만노오스 및 글루코오스에 의한 manP 프로모터의 유도성 및 이화대사 억제 그리고 ManR 결합부위 확인을 검토하기 위해 프로모터 프로브 벡터 pSUN272.1에서 사용되는 바실루스 섭티리스로부터 획득한 핵산서열을 도시하며,
도 6은 CcpA를 통한 바실루스 섭티리스에서의 이화대사 억제 및 활성화 메커니즘을 도시하며,
도 7은 발현벡터 pSUN279.2의 플라스미드 맵을 도시하며,
도 8는 본 발명에 따른 플라스미드 pSUN 279.2, pSUN 284.1 및 pSUN 291을 각각 포함하고 있는 바실루스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 9은 플라스미드 pSUN284.1과 서로 다른 길이의 도 5의 핵산서열 단편을 포함하는 추가 플라스미드를 포함하는 바실루스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 10은 도 4의 핵산서열을 포함하는 벡터 pSUN 291, pSUN 385.2 및 pSUN 386.9를 포함하는 바실루스 섭티리스 3NA의 베타 갈락토시다아제 활성을 도시하며,
도 11은 발현벡터 pMW168.1의 플라스미드 맵을 도시하며,
도 12는 삽입벡터 pSUN356.7(ΔmanP)의 플라스미드 맵을 도시하며,
도 13 바실루스 섭티리스 TQ356/pMW168.1(ΔmanP 돌연변이)의 발효과정 기간 동안의 건조 바이오매스 농도 및 형광신호 (RFU)를 대수적으로 보여주는 그래프이고,
도 14는 바실루스 섭티리스 TQ356/pMW168.1을 사용한 발효산물에서 얻은 세포시편의 SDS-PAGE결과를 도시하며,
도 15는 플라스미드 pMW168.1의 준비과정을 도시한 흐름도이다.

본 명세서에서 사용하는 바와 같이, 하기에 기재된 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것임을 밝힌다.

"효소 EII", "EII", 또는 "운반체(transporter)"라 함은 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템(phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system (PTS))의 탄소원 특이 투과효소를 의미하는 것으로, 탄소원의 운반 및 이에 수반되는 인산화 반응을 촉진한다.

인 전이효소 시스템은 다양한 EII을 포함하며, 각 EII은 설탕과 같은 탄소원에 특이성을 지닌다.

EII은 일반적으로 A, B, C 세 개의 영역, 또는 D를 포함한 네 개의 영역으로 구성되는 복합체로서, EIIA와 EIIB는 해당 탄소원의 인산화에 관여하고, 막 연결 EIIC (EIID가 존재하는 경우 이를 포함)는 특정 탄소원이 세포 내로 통과하도록 조정하는 역할을 한다.

특정 탄소원이 존재하지 않는 경우, 해당 EIIA 및 일부의 경우 EIIB는 포스포릴기를 전사조절 단백질 내에 존재하는 해당 인산화 영역으로 이동함으로써 각 탄소원 특이 전사조절 단백질을 비활성화시키고, 이러한 인산화 영역은 인산화 EII에 따라 각각 EIIA 및 EIIB 영역이라 한다.

"전사조절 단백질" 또는 "조절인자"는 특정 탄소원의 이화 오페론을 양성적으로 조절(즉, 활성화)한다. 상기 전사조절 단백질은 일반적으로 인산화 가능한 두 개의 보존 조절 영역(PTS 조절 영역, PRD)을 포함한다. 또한, 일부 전사조절 단백질 EIIA와 EIIB라 하는 인산화 영역을 더 포함한다. 전사조절 단백질은 그 종류에 따라 포스포릴기가 효소 II에서 EIIA 및 EIIB 그리고/또는 PRDI 영역 내 하나 이상의 상기 포스포릴 결합 영역으로 이동함에 따라 비활성화되고, 포스포릴기가 히스티딘 단백질(HPr)에서 PRDII영역으로 이동함에 따라 활성화된다. 이러한 PTS의 다양한 탄소원 특이 전사조절 단백질은 활성체 또는 전사 종결 방지인자로 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. "프로모터 영역(promoter region)"이라 함은 세포 내에서 RNA 중합효소를 결합시키고 다운스트림 (3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 조절 영역을 의미한다. 프로모터 영역 내에서는 -35번째 구역 및 -10번째 구역 (프리브노 구역 (Pribnow box))와 같은 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 영역 (공통서열)이 발견될 것이다. 또한, 프로모터 영역은 이들의 특정 전사조절 단백질에 대한 전사 개시부위 및 결합부위를 포함할 수 있다.

"변이체" 또는 "서열의 변이체"은 보존 핵산 치환체에 의해 참고 서열로부터 변형된 핵산서열을 의미하며, 이에 의해 하나이상의 핵산은 동일한 특징을 가진 다른 핵산으로 치환된다. 또한 변이체는 변형된 서열이 참고 서열과 동일한 기능을 나타내는 (기능적으로 동일한) 범위 내에서 삭제 및 삽입부분을 포함하는 서열인 퇴화서열을 포함한다.

"숙주 내에서 발현 가능한 벡터" 또는 "발현벡터"라 함은 재조합 또는 합성하여 생성되는 폴리핵산 구조체를 의미하며, 이는 숙주세포에서 특정 핵산 서열이 전사 가능하도록 하는 일련의 특정 폴리핵산 성분을 포함한다. 일반적으로 이러한 벡터는 프로모터와 작동 가능하게 연결되도록 전사되는 특정 핵산서열을 포함하는 전사단위를 포함한다. 숙주에서 발현 가능한 벡터의 예로는 자체 혹은 자기 복제 플라즈미드, 코스미드, 파지 (phage), 바이러스 또는 레트로 바이러스 (retrovirus)가 있다.

"형질전환", "형질 전환된" 또는 "숙주세포 내로 핵산을 도입하는" 등의 표현은 벡터와 같은 세포 외 핵산이 다른 물질을 수반하거나 수반하지 않고 숙주세포로 진입하는 모든 과정을 의미한다.

발현 벡터를 이용한 적절한 숙주세포의 형질전환은 현미주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), 입자충격법 (particle bombardment) 와 같은 잘 알려진 공지의 방법이나, 예를 들면 Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) or in Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons (1984)에 기술된 인산 칼슘을 매개로 한 형질전환 방법과 같은 화학적인 방법 및 자연적인 형질전환 방법에 의해 이루어 질 수 있다.

"이종 핵산서열" 또는 "숙주에 이종인 핵산서열"은 예를 들면 숙주에 이질적인 폴리펩타이드와 같은 발현생성물 (이종 발현 또는 이종생성물)을 암호화 하는 핵산, 즉 상기 숙주와는 다른 공여체로부터 유래한 핵산서열이나 예를 들면 상기 숙주에 이질적인 폴리펩타이드와 같은 발현 생성물을 암호화하는 화학적으로 합성된 핵산서열을 의미한다. 상기 숙주가 특정 원핵 종인 경우, 이종 핵산서열은 숙주와는 다른 속 (genus)이나 과 (family)에서 유래한 생물인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 다른 목 (order)이나 강 (class), 특히 다른 문 (phylum, division), 보다 구체적으로는 다른 도메인 (domain, empire)에서 유래한 생물인 것이 바람직하다.

숙주와는 다른 공여체로부터 유래한 이종 핵산서열은 숙주세포에 도입되기 전 변형될 수 있는데, 변형된 서열이 참조 서열과 동일한 기능을 나타내는 (기능적으로 동일한) 범위 내에서 단일 핵산 또는 이종 핵산서열 일부분을 변이, 삽입, 삭제 또는 치환함으로써 가능하다. 또한 본 명세서에서 언급된 바와 같이, 이종 핵산서열은 파지 디스플레이 라이브러리에서 사용되고 단일 핵산 또는 핵산서열의 일부가 원핵 숙주의 코돈 사용빈도에 따라 변형된 인간의 항체와 같은 진핵 생물(진핵 계통)과는 다른 생물 도메인(계)에서 유래한 핵산서열을 포함한다.

본 발명의 범위 내에서 "이종 폴리펩타이드" 또는 "목적 폴리펩타이드"라는 용어는 인간, 포유류 또는 원핵 생물의 이종 단백질을 의미할 수 있다. 그 밖의 단백질로는 바이러스성 및 항균성 미생물 병원체 및 종양에서 나온 당단백 및 탄수화물과 같은 항원이 있다. 또한, 다른 이종 폴리펩타이드로는 키모신, 단백질 분해효소, 중합효소, 탈수소효소, 핵산 가수분해효소, 글루칸 가수분해효소, 산화효소, 알파 아밀라아제, 산화환원효소, 지방분해효소, 아미드 가수분해효소, 니트릴 수화효소, 에스테르 가수분해효소, 나이트릴 가수분해효소와 같은 효소가 있다.

"탄소원"은 일반적으로 탄수화물과 같은 탄소원을 의미하며, 이러한 탄소원은 박테리아 세포에 의해 이용 및 대사될 수 있고 PTS 및 CCR에 의해 제어되며, 탄수화물의 전형적인 예로는 당 및 당 유도체가 있다.

다양한 종류의 박테리아가 하나 이상의 탄수화물을 탄소 및 에너지원으로 사용할 수 있다. 특정 세포 외 효소를 사용함으로써, 바실루스와 같은 박테리아는 식물 바이오매스에 대량으로 존재하는 여러 종류의 다당류를 분해할 수 있다. 이로 인해 생성되는 올리고당, 이당류 또는 단당류는 세포 내로 이송되어 추가적으로 처리된다. 일반적으로 당류의 대사 및 분해에 필요한 분해 효소는 배양 배지에 특정 기질이 존재하고 원하는 탄소 및 에너지원이 존재하지 않는 경우에만 합성된다. 박테리아 세포막을 통해 탄수화물을 이송하기 위한 탄수화물 이송 경로는 PTS가 바람직하다.

PTS에서 세포막을 통해 탄수화물을 이송하고 그 후에 일어나는 인산화 반응은 상기 탄수화물에 특이성을 지닌 효소인 효소II (EII)에 의해 조정된다. EII이 해당 탄소원을 세포 내로 이송하는 것을 조정하기 때문에 EII는 운반체(transporter)라고도 한다.

탄수화물 혼합물이 존재하는 경우, 세포는 가장 많은 에너지를 제공하고 성장에 유리한 탄소원(제1 탄소원)을 선택적으로 이용한다. 동시에 세포는 이화작용 및 선호도가 떨어지는 탄소원(제2 탄소원)을 흡수하는 데 필요한 다양한 기능은 억제한다.

일반적으로 대부분의 세균에 있어 제1 탄소원은 포도당(글루코오스)이고, 박테리아 종류에 따라 그 밖의 다양한 당류 및 당 유도체가 제2 탄소원으로 사용된다. 그러나, 다른 화합물이 제1 탄소원으로 사용되는 경우도 있는데, 예를 들어 슈우도모나드(pseudomonad)의 경우, 제1 탄소원은 방향족 화합물일 수 있다.

제2 탄소원은 예를 들면, 만노오스, 젖당, 멜리비오스 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

PTS에서 특정 탄소원의 대사에 필요한 다양한 이화작용 유전자는 전사조절 단백질에 의해 제어된다. 이러한 전사조절 단백질은 전사 종결 방지인자 또는 전사 활성체로 작용할 수 있으며, 특정 탄소원(유도물질)이 존재하는 경우에만 활성화된다. EII는 포스포릴기가 상기 전사조절 단백질에 존재하는 특정 결합 부위로 이송됨으로써 해당 전사조절 단백질을 조절하는 데 있어 부정적인(비활성화시키는) 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

제1 탄소원이 없고 프로모터 특이 유도성 탄소원이 있는 경우, 프로모터는 이에 대응하는 전사조절 단백질에 의해 활성화되고, 이러한 프로모터에 의해 제어되는 유전자는 발현된다. 유도성 탄소원이 없는 경우, 상기 프로모터를 조절하는 전사조절 단백질은 포스포릴기가 EII에서 전사조절 단백질의 각 결합 부위로 이동됨에 따라 비활성화되고, 이에 의해 상기 프로모터는 비활성화되고 상기 프로모터에 의해 제어되는 유전자의 발현은 중단된다.

반면에, 원하는 제1 탄소원이 있는 경우에는 차선의 제2 탄소원의 존재 유무와는 관계없이 상기 제2 탄소원의 이화작용 유전자의 발현이 CCR에 의해 억제된다.

일반적으로 본 발명은 특이 탄소원이 없는 경우 탄소원 특이 전사조절 단백질의 조절을 억제하는 것을 기반으로 한다. 특히, 본 발명은 포스포릴기가 해당 EII를 거쳐 전사조절 단백질로 이송됨으로써 억제 또는 비활성화되는 것을 방지하는 것을 기반으로 한다.

탄소원 특이 전사조절 단백질의 억제가 방지되면, 상기 전사조절 단백질이 프로모터의 활성체이기 때문에 유도인자인 탄소원의 존재유무와 상관없이, 프로모터가 활성화된다.

그 결과, 이러한 프로모터에 의해 제어되는 유전자 발현을 위해 유도성 탄소원이 필요하지 않으며, 또한 유전자는 계속해서 발현된다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터를 활용하기 위한 것으로, 상기 프로모터는 한 쪽에서는 PTS에 의해 다른 쪽에서는 CCR에 의해 제어된다.

이에 따라, 본 발명은 프로모터 특유의 전사조절 단백질이 비활성화되는 것을 방지함으로써 목적 폴리펩타이드의 발현에 있어 프로모터로 사용되는 탄소원 유도 프로모터가 비활성화되는 것을 방지하는 것을 목적으로 한다.

일 실시예에 따르면, 이러한 목표는 EII에 의해 이동되는 포스포릴기에 대한 전사조절 단백질의 적어도 하나의 결합부위가 포스포릴기를 결합시키지 못하도록 함으로써 전사조절 단백질이 특이 EII에 의해 인산화되는 것을 차단함으로써 이루어진다.

이에, 박테리아 숙주세포의 게놈에서, 상기 전사조절 단백질을 위한 유전자 암호화가 유전적으로 조작되어 상기 유전자는 EII로터 이송된 포스포릴기를 결합시킬 수 없는 전사조절 단백질을 발현한다.

다른 실시예에 따르면, 인산화는 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서, 전사조절 단백질의 활성을 조절하는 효소인 EII을 위한 유전자 암호화를 삭제함으로써 중단된다.

본 발명에 따르면, 이종 폴리펩타이드의 발현은 상기에서 언급한 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 프로모터에 의해 제어되는데, 이는 포스포릴기가 EII을 거쳐 이동함에 따른 비활성화가 박테리아 숙주세포의 유전적 변화에 의해 방지되기 때문이다.

본 발명은 탄소원 유도 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 위해 암호화되는 이종 핵산을 포함하는 벡터를 이용하여 형질 전환된 본 발명의 재조합 박테리아 숙주세포를 발효시킴으로써 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 프로모터는 발효배지에 유도성 탄소원이 존재하지 않는 경우에도 활성화된다. 상기 목적 폴리펩타이드를 위해 암호화되는 핵산 서열의 발현을 제어하는 상기 프로모터는 CCR에 의해 계속 제어되기 때문에, 포도당과 같이 제1 탄소원이 존재하는 경우에 발현은 일어나지 않지만, 상기 시스템이 제1 탄소원을 모두 소진하면 유도반응은 자동적으로 이루어진다 (자동유도). 상기 이종 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 프로모터의 활성은 유도성 탄소원의 존재 유무와는 별개이므로, 발효배지에서 목적 폴리펩타이드의 발현 유도는 유도성 탄소원 없이 이루어진다.

본 발명은 재조합 박테리아 숙주세포가 제1 탄소원이 존재하는 경우 높은 세포밀도로 성장할 수 있고, 원하는 세포밀도에 도달하면, 발현을 제어하는 프로모터의 탄소 이화대사 억제가 해제되는 순간 폴리펩타이드가 자동적으로 생산되기 시작한다는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 유가 배양식 발효에서 배치(batch) 단계 중 목적 폴리펩타이드가 생산되지 않거나 거의 생산되지 않는 이점이 있다. 즉, 이화대사 억제가 강력하게 이루어진다.

본 발명에 적합한 박테리아 숙주세포는 하나 이상의 탄소원을 이용할 수 있는 것으로, 서로 다른 탄소원의 사용은 탄소 이화대사 억제에 의해 제어되며, 세포막을 통한 탄소원의 이송 및 탄소원의 인산화는 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템(PTS)에 의해 제어된다.

본 발명에 적합한 박테리아 숙주세포는 그램양성균 또는 그램음성균일 수 있다. 바람직한 예로 피르미쿠테스 문(phylum Firmicutes)에 속하는 균주로, 특히 바실루스 강(class Bacilli)에 속하는 균주를 포함한다. 구체적으로 바실루스 섭티리스(B. subtilis), 바실루스 아밀로리케파시넨스 (B.amyloliquefaciens), 바실루스 리체니포르미스 (B. licheniformis), 바실루스 나토 (B.natto), 바실루스 메가테리움(B. megaterium) 등과 같은 바실루스 속(genus Bacillus)에 속하는 균주를 포함하며, 다른 예로는 연쇄상구균, 포도상구균, 젖산균, 대장균 또는 그 밖의 장내세균에 속하는 박테리아를 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

일반적으로 피르미쿠테스는 그램양성균으로 지시함량(GC content) 낮다. "지시함량이 낮다"는 것은 박테리아 게놈 내 염기쌍 중 52%미만이 GC쌍인 것을 의미한다. 예를 들면, 바실루스 및 클로스트리듐과 같은 그램양성 박테리아는 게놈 내에 GC쌍을 40% 이하로 포함한다.

또한, 본 발명에 적합한 박테리아 숙주세포는 장내세균 (order Enterobacteriales) 목에 속하는 장내세균을 포함한다. 이러한 장내 박테리아의 예로는 대장균 속에 속하는 세균과 같은 그램음성균을 들 수 있다. 구체적으로, TG1, W3110, DH1, XL1-Blue 및 오리가미(Origami)와 같은 대장균 (E.coli) 균주를 포함한다.

대장균 및 장내세균은 게놈 내 지시함량이 약 50%로 지시함량이 낮은 미생물이다.

그램양성균 및 그램음성균은 공지의 그램염색법에 따라 결정된다. 그램양성균은 표준 그램염색법에 의해 자주색을 띄는 미생물이다. 그램음성균은 주요 그램염색제보다는 대비염색제를 포함한다.

다양한 CCR 메커니즘이 피르미쿠테스 및 장내세균 내에서 존재하는데, 이러한 메커니즘에 대해 표본 미생물로 바실루스 섭티리스 및 대장균을 이용하여 많은 연구가 이루어졌다(J. Stulke et al., "Regulation of carbon catabolism in Bacillus species," Annu. Rev. Microbiol. (2000) 54:849-880; Gorke B. et Stulke J., "Carbon catabolite repression in bacteria: many ways to make the most out of nutrients," Nat. Rev. Microbiol. (2008) 6:613-624; Gosset G. et al., Transcriptome analysis of Crp-dependent catabolite control of gene expression in Escherichia coif, J. Bacteriol., (2004) 186:3516-3524, Martinez-Antonio A. et al., Identifying global regulators in transcriptional regulatory networks in bacteria" Curr. Opin. Microbiol. (2003) 6:482-489 참고). 전반적인 CCR 메커니즘은 달라도 결과는 동일하다. 즉, 제1 탄소원이 존재하는 경우, 제2 탄소원을 흡수하고 인산화하는 데 필요한 다양한 이화작용 오페론이 억제된다.

본 발명의 재조합 박테리아 숙주세포는 유전적으로 변형되어 유도성 탄소원이 없는 경우 프로모터 특이 전사조절 단백질이 비활성화되는 것을 억제함으로써 이종 핵산서열의 발현을 제어하는 탄소원 유도 프로모터의 억제를 방지한다.

따라서, 본 발명의 재조합 박테리아 숙주세포에서는 상기 이종 핵산서열의 발현을 제어하는 탄소원 유도 프로모터가 탄소 이화대사 억제에 의해서만 제어된다. 제1 탄소원이 존재하는 경우, 상기 이종 폴리펩타이드의 발현은 CCR에 의해 제어된다.

본 발명에 따르면, 상기 탄소원 유도 프로모터는 보다 바람직한 제1 탄소원이 탄소 이화대사 억제를 촉진하지 않는 한 상기 유도성 탄소원의 유무에 관계없이 활성 상태로 존재한다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 제어하는 프로모터를 유도하기 위한 유도인자 없이도 이종 폴리펩타이드를 생산할 수 있도록 하는 것이다.

일반적으로 본 발명에 적합한 프로모터는 박테리아 세포 내에서 PTS 및 CCR에 의해 제어되는 프로모터이다. 특히, 각 전사조절 단백질은 이러한 프로모터의 제어에 의해 이화작용 오페론에 대해 활성체나 전사종결 방지인자의 역할을 한다. 이러한 프로모터는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다. 본 발명에 적합한 프로모터의 예는 각각의 오페론과 관련하여 아래의 표에 나타나 있다.

a: 전사조절 단백질

b: A: 활성체

AT: 전사종결 방지인자

이하에서는 바실루스 섭티리스의 만노오스 오페론을 참조하여 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.

바실루스 섭티리스는 탄소원으로 포도당, 엿당, 자당, 만노오스, 마니톨 및 과당과 같은 다수의 다양한 단당류 또는 이당류를 이용할 수 있다. 이러한 당류는 PTS에 의해 이용된다. 세포 내 이송 및 인산화는 각각의 당류에 특이성을 갖는 효소 EII에 의해 조정된다.

많은 종류의 박테리아와 마찬가지로, 바실루스 섭티리스의 탄소원은 포도당이 바람직하다. 포도당이 존재하는 경우, PTS에 의해 제어되는 그 밖의 모든 당류의 흡수는 CCR에 의해 억제된다.

만노오스 오페론 구조는 도 1에 도시되어 있으며, 만노오스의 세포 내 이송 및 이화작용은 도 2에 도시되어 있다. 바실루스 섭티리스의 만노오스 오페론은 세 개의 이화작용 유전자를 포함하고 있다 (Kunst F. N. et al., "The complete genome sequence of gram-positive bacterium B.subtilis," Nature (1997) 390:249-256).

첫 번째 유전자인 manP는 ManP이라 하는 만노오스 특이 EII 효소를 암호화한다. ManP는 세포막을 통해 만노오스를 이송하며, 동시에 만노오스를 만노오스-6-인산으로 인산화한다. 두 번째 유전자인 manA는 만노오스-6-인산을 해당 과당-6-인산으로 전환하는 만노오스 6-인산이성질체화효소를 암호화한다. 세 번째 유전자인 yjdF의 기능은 아직 알려져 있지 않다. 이러한 세 유전자의 업스트림 위치 및 동일한 방향에는 전사조절 단백질인 ManR을 위해 암호화하는 조절 유전자인 manR가 위치한다.

만노오스 오페론은 양성적으로 조절되는 이화작용 오페론이며 두 개의 서로 다른 프로모터에 의해 제어된다. 하나의 프로모터는 manR 프로모터(PmanR)로 전사조절 단백질 ManR을 담당한다. 다른 프로모터는 manP프로모터(PmanP)로 세 개의 유전자 manP-manA-yjdF ("manPA-yjdF"로 총칭함)의 전사를 담당한다. 만노오스는 있고 포도당은 없는 경우, ManR은 PmanP에 결합하여 manPA-yjdF의 발현을 활성화시킨다. 놀랍게도 ManR이 manPA-yjdF 프로모터를 위한 전사조절 단백질일 뿐만 아니라 manR 자체를 위한 자기조절인자라는 것이 밝혀졌다.

도 3은 전사조절 단백질 ManR 및 잠재적 인산화 영역의 구조를 개략적으로 도시한다. 도시된 바와 같이, ManR은 두 개의 PRD(PTS regulatory domain) 영역을 포함하며, 이는 하나의 EIIA 및 EIIB 영역과 나선 대 나선 연결구조 (Helix-turn-Helix (HTH))영역이다. PRD 영역은 탄소 이화작용 과정에서 인산화될 수 있는 전사조절 단백질에 존재하는 보존 조절 영역이다. EIIA 및 EIIB 영역은 만노오스 오페론의 EII 운반체인 ManP에 의해 이송된 포스포릴기의 결합부위이다. HTH영역은 DNA를 결합할 수 있는 단백질 내의 구조상 모티브이다.

유도성 만노오스가 존재하지 않는 경우, ManR의 EIIA 및 EIIB 그리고 결국에는 PRDI 영역이 만노오스 오페론의 만노오스 특이 EII인 ManP에 의해 인산화되고 이에 의해 비활성화된다.

그 결과, 본 발명의 일 측면에 따르면, ManR의 EIIA 및/또는 EIIB 내의 인산화 부위가 조작되거나 상기 영역이 삭제되면 유도인자인 만노오스가 존재하지 않을 경우 ManR가 비활성화되는 것이 방지되어, 포스포릴기를 수용할 수 없게 된다.

이에, 박테리아 숙주세포 게놈 내에서 manR 유전자는 ManR내의 각 인산화 부위를 암호화하는 해당 핵산서열이 삭제되거나 조작됨으로써 유전적으로 변형된다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 만노오스 오페론 프로모터의 비활성화는 만노오스의 이동을 차단함으로써 방지되는데, 이러한 이동 차단은 박테리아 숙주세포 게놈 내에서 ManP를 암호화하는 유전자를 삭제하거나 비활성화시킴으로써 이루어질 수 있다.

이러한 변형은 박테리아 숙주세포 내에서 상기 전사조절 단백질의 인산화에 필요한 단백질을 암호화하는 유전자의 코딩 서열을 삭제함으로써 달성될 수 있는데, 만노오스 오페론의 경우, manR 및/또는 manP이다. 이렇게 유전적으로 변형된 녹아웃 숙주세포는 이러한 목적에 따라 다양한 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 목표하는 핵산 결실 서열의 상동 목적 유전 서열 5' 및 3'를 포함하는 상동 재조합 벡터가 이와 같은 숙주세포로 형질 전환될 수 있다. 상동 재조합되면, 원하는 녹아웃 세포가 생성될 수 있다.

유전자 녹아웃 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 삽입함으로써 유전자를 비활성화하는 방법은 Roder D. L. et al. "Marker-exchange mutagenesis of a pektate lyase isozyme gene in Erwinia chrys anthemy" J. Bacteriol. (1985) 164 (1:51-56)에 기술되어 있다. 유전자 내 특정 돌연변이 및 결실과정은 카세트 돌연변이 유발법을 이용하여 구성할 수 있으며, 이는 Wells J. A. et al., "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites," Gene (1985) 34 (2-3): 315-323에 기술되어 있는데, 이에 의해 직접 또는 임의의 돌연변이가 유전자의 선택부분에서 발생하고, 이후 상동 재조합에 의해 유전자의 염색체 복제본에 포함된다.

본 발명의 발명자들은 상기 만노오스 오페론을 조절하는 프로모터인 PmanR 및 PmanPA-yjdF가 이종 폴리펩타이드를 생산하는 데 있어 유망한 강력한 프로모터라는 것을 발견했다. 그러나, 이러한 프로모터를 유도하는 탄소원인 만노오스는 고가의 당류이기 때문에 만노오스 유도 프로모터의 사용에는 아직 많은 제약이 있다.

본 발명에 따르면, 박테리아 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 발현함에 있어 발현을 개시하기 위해서 유도성 탄소원이 필요하지 않기 때문에, 만노오스 프로모터와 같은 프로모터의 사용은 효과적으로나 비용적으로 경쟁력이 있다.

이에 따라, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 박테리아 숙주세포 내에서 목적 폴리펩타이드를 위해 암호화하는 이종 핵산서열을 조절하기 위한 프로모터로 만노오스 오페론 프로모터인 PmanR 및 PmanPA-yjdF를 사용하는 방법을 제공한다.

도 5에는 pSUN284.1과 같은 다양한 발현 벡터에서 이용되는 바와 같은 상기 manP 프로모터의 프로모터 영역을 포함하는 바실루스 섭티리스로부터 획득한 핵산서열이 도시되어 있는데, 아데닌 뉴클레오티드에서 전사개시부위는 하이라이트로, -10 및 -35 구역은 이탤릭체 및 볼드체로, manR 말단은 화살표로, 제한부위 BglII, XbaI, AflII, NdeI 및 NruI 는 밑줄로 표시되어 있다. 리포터 유전자 lacZ의 개시코돈도 표시되어 있다.

도 4에는 manR 프로모터의 프로모터 영역을 포함하는 바실루스 섭티리스로부터 획득한 핵산서열이 도시되어 있는데, 전사개시부위는 하이라이트로, -10 및 -35 구역은 이탤릭체 및 볼드체로, manR 시작부분은 화살표로, 제한부위 HindIII는 볼드체 및 밑줄로, 추정 cre서열은 밑줄로 표시되어 있다.

"만노오스 오페론의 프로모터 영역"은 cre 서열이 존재하거나 존재하지 않는 경우 manR 뿐 아니라 manPA-yjdF의 발현을 조절하는 프로모터 영역을 의미한다.

"ManPA-yjdF 프로모터"는 본 명세서에서 설명한 바와 같이 기본적으로 -35영역, -10영역 (프리브노 구역), 전사개시부위 및 ManR 결합부위로 이루어진다.

"ManR 프로모터"는 본 명세서에서 설명한 바와 같이 기본적으로 -35영역, -10영역, 전사개시부위 및 ManR 결합부위로 이루어지고, 여기에 선택적으로 cre 서열을 포함한다.

cre 서열(이화대사 억제요소)은 피르미쿠테스 내의 CCR의 포괄조절 단백질인 CcpA(이화생성물 제어단백질 A)에 결합하는 보존된 14개 뉴클레오티드 길이의 DNA 서열을 의미한다. 도 6에는 바실루스 섭티리스 내 이화대사 억제 및 활성화 메커니즘이 도시되어 있다. 세린(Serin)-46 인산화 HPr(히스티딘 단백질)에 의해 복합화된 CcpA를 cre 서열에 결합함으로써 상기 프로모터는 억제된다. 이러한 과정은 만노오스 오페론의 이화대사 억제의 제2 메커니즘을 나타낸다. 이러한 방법에 의해 조절유전자 manR의 발현은 포도당이 존재하는 경우 억제된다. 결과적으로 이러한 과정은 manP 프로모터의 활성화를 억제한다. 포도당이 존재하는 경우, 세포는 EII 만노오스 운반체와 유사한 PTS 의존 운반시스템인 PtsG를 통해 포도당을 이용한다. 세포 내에서 중간물질인 과당-6-인산 (Fru-6-P) 및 과당-1,6-이인산 (Fru-1,6-DP)은 히스티딘 단백질 키나아제 (HPrk)을 축적하고 촉진한다. 히스티딘 단백질 키나아제는 세린-46의 히스티딘 단백질을 인산화한다. Ser-46-HPr는 바실루스 섭티리스의 많은 이화대사 억제 및 이화생성물 활성 프로모터에 존재하는 cre 부위라 하는 영역에 결합하는 DNA 결합 CcpA와 복합체를 형성한다. -10 프로모터 서열의 다운스트림 또는 -10서열과 중복되는 Cre 부위에서는 Ser-46-HPr/CcpA 복합체의 결합으로 인해 이러한 프로모터로부터 발현되는 것이 억제된다. 이러한 상황은 manR 프로모터에서 발견된다 (도 4).

manPA-yjdF 프로모터 영역을 포함하는 핵산서열은 bp-80에서 lazZ의 개시코돈에 이르는 도 5의 핵산서열(SEQ ID NO.1)을 포함하는 것이 바람직하고, bp-80에서 bp-1를 포함한, 즉 bp+1에서 전사개시부위 A의 업스트림에 위치한 도 5의 핵산서열 (SEQ ID NO.2)을 포함하는 것이 보다 바람직하다.

manR 프로모터 영역을 포함하는 핵산서열은 bp-122에서 manR의 개시코돈에 이르는 도 4의 핵산서열(SEQ ID NO.3)을 포함하는 것이 바람직하고, bp-122에서 bp+7, 즉 추정 cre 서열을 포함하는 도 4의 핵산서열(SEQ ID NO. 4)를 포함하는 것이 보다 바람직하며, 특히 bp-122에서 bp-1, 즉 bp+1에서 전사개시부위 G의 업스트림에 위치한 도 4의 핵산서열 (SEQ ID NO.5)을 포함하는 것이 바람직하다. manP 및 manR 프로모터 영역 모두 전사조절 단백질 ManR(도 4에서는 IRI-R로, 도 5에서는 IRI-P로 표시됨)을 위한 결합부위를 포함하며, 이는 만노오스 오페론 프로모터를 위한 전사활성인자이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 탄소원 유도 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있는 관심 폴리펩타이드를 위해 암호화하는 핵산서열을 갖는 벡터를 포함하는 유전적으로 변형된 박테리아 숙주세포에 관한 것으로, 상기 벡터의 프로모터는 전사조절 단백질에 의해 조절되며, 이를 위해박테리아 숙주세포는 상기 전사조절 단백질에 특이성을 갖는 탄소원이 존재하지 않는 경우 비활성화될 수 없도록 유전적으로 변형된다.

상기의 만노오드 오페론을 참고하면, 상기 벡터의 프로모터는 PmanR 또는 PmanPA-yjdF일 수 있고, 예를 들면 서열번호 1 내지 5 및 상기 표에 나타난 프로모터 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에서 사용되는 벡터에는 각각의 EII에 의해 이송되는 포스포릴기를 결합시킬 수 없는 각 전사조절 단백질을 위해 암호화하는 상기 유전적으로 변형된 유전자가 포함될 수 있다. 그 결과, 상기 재조합 박테리아 숙주세포에서 상기 전사조절 단백질은 염색체 유전자 뿐 아니라 상기 벡터에 통합된 해당 유전자에 의해서도 발현되어, 전사조절 단백질의 농도는 증가하고 유도반응은 향상된다. 예를 들면, 상기 벡터의 프로모터가 만노오스 오페론 프로모터인 경우, 유전자 manR은 상기 벡터에 통합되는데, 여기서 뉴클레오티드 서열 코딩 EIIA영역은 삭제되어 있다 (manRΔEIIA).

본 발명에 적합한 벡터로는 자체 혹은 자기 복제 플라즈미드, 코스미드, 파지(phage), 바이러스 또는 레트로 바이러스 (retrovirus)가 있다. 본 발명에서는 다양한 종류의 숙주/벡터 조합이 사용될 수 있다.

예를 들어, 유용한 발현 벡터는 염색체성, 비염색체성 및/또는 합성 핵산서열의 단편으로 구성될 수 있다.

적절한 벡터의 예로는 바실루스 섭티리스 및 대장균에 특이성을 지닌 벡터와 같은 숙주 범위가 특정한 벡터 및 그램양성균 및 그램음성균에 유용한 벡터와 같은 숙주 범위가 다양한 벡터를 포함한다. 또한, 저 복제(low-copy), 중간 복제(medium-copy) 및 고 복제(high-copy) 플라스미드도 사용될 수 있다.

일 예로, 바실루스 섭티러스에서는 저 복제 플라스미드로 pAMbetal , 중간 복제 플라스미드로 pBS72 유도체, 고 복제 플라스미드로 pUB1 10가 사용된다. 대장균 내 발현에 유용한 벡터로는 pBR322, pUC18, pACYC177, pACYC184, pRSF1010 및 pBW22 또는 이들의 유도체인 플라스미드 pBLL 15 또는 플라스미드 pAKL15E를 들 수 있다.

본 발명의 유전적으로 변형된 박테리아 숙주세포는 상기 프로모터의 유도성 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 프로모터를 제어하는 전사조절 단백질을 비활성화시킬 수 없다. 상기 벡터의 프로모터는 각 염색체성 프로모터와 동일한 전사조절 단백질에 의해 제어되기 때문에, 상기 목적 폴리펩타이드를 위해 암호화되는 이종 핵산서열의 발현은 유도성 탄소원이 없는 경우에도 진행된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법을 제공하며, 이러한 방법은 a) 폴리펩타이드가 발현 가능한 조건에서 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 벡터에 의해 형질 전환된 본 발명의 유전적으로 변형된 박테리아 숙주세포를 배양하는 단계 및 b) 상기 세포 또는 세포 배양액으로부터 폴리펩타이드를 수거하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 벡터의 프로모터는 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 탄소원이 존재하지 않는 경우 비활성화 될 수 없는 전사조절 단백질에 의해 제어된다.

본 발명에 따르면, 상기 목적 폴리펩타이드의 발현은 상기 배지가 제1 탄소원을 모두 소진하거나 제1 탄소원의 농도가 CCR에 요구되는 수준 미만으로 감소하는 시점에서 자동적으로 개시된다.

유도반응 후 상기 세포가 성장할 수 있도록 하기 위해, 탄소 이화대사 억제를 허용하지 않는 정도로 제1 탄소원을 배지에 더 공급할 수 있다. 일 예로, 상기 세포가 바로 소모할 정도의 양을 공급하여 발효액에서는 CCR을 촉진할 수 있는 제1 탄소원이 기본적으로 존재하지 않도록 한다.

일반적으로, 배지 중 제1 탄소원의 양이 1.0g/l를 초과하면, 탄소 이화대사 억제가 관찰되며, 제1 탄소원의 양이 0.01g/l 이하이면, 탄소 이화대사 억제는 나타나지 않는다.

탄소 이화대사 억제 및 상기 프로모터의 유도반응의 경계선은 상기 세포의 성장률과 연관되기 때문에, 즉 배지에 공급되거나 존재하는 제1 탄소원의 양과 관계가 있기 때문에, 탄소 이화대사 억제를 유발하지 않는 제1 탄소의 양은 생장률을 모니터함으로써 조절될 수 있다. 정해진 생장률에서 탄소 이화대사 억제가 일어나는 경우, 배지에 첨가된 제1 탄소원의 양을 줄여야 하며, 이에 의해 탄소 이화대사 억제가 관찰되지 않는 수준까지 생장률을 감소시킨다.

대부분의 발효과정에서 있어서, 유도단계에서는 제1 탄소원의 첨가량을 적절하게 조절하여 특수생장률이 μ= 0.2 h^-1의 범위가 되도록 한다.

특정 발효과정에 있어서, 특수생장률 μ은 일반적인 방법에 의해 용이하게 적절한 값으로 결정될 수 있다

사용되는 벡터 및 숙주의 구성 및 형질전환은 상기에서 정의된 바와 같다.

세포 배양 시스템으로서 회분 배양이나 유가 배양과 같은 연속적 또는 비연속적 배양이 배양관, 셰이커 플라스크 또는 박테리아 발효기 등에 적용될 수 있다. 바람직하게는, 유도 단계에서 상기 목적 폴리펩타이드가 발현될 때, 제1 탄소원을 매우 빠른 속도로 배양 배지에 공급한다.

상기 유전적으로 변형된 박테리아 숙주세포를 배양하기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 바와 같은 종래의 배지가 이용될 수 있는데, 이러한 배지로는 Kortz et al. , J. Biotechnol. (1995) 39: 59-65에 기술된 바와 같은 글리세롤을 포함하는 배지, Kulla et. al. Arch. Microbiol. (1983) 135: 1에 기술된 무기염 배지, Bertani et al., J. Bacteriol. 1951) 62: 293-300에 기술된 LB 배지, 또는 Wilms et al., Biotechnol. Biong. (2001 ) 73: 95-103에 기술된 대장균 발효를 위한 배치 배지와 같은 "양분 이스트 배지액"인 복합 배지를 들 수 있다.

배지는 적절한 탄소원을 포함하고 있는데, 예를 들면 상기 숙주세포가 원하는 세포밀도가 될 때까지 성장할 수 있도록 하는 포도당과 같은 당류를 포함한다. 탄소원으로는 각 숙주세포를 위한 제1 탄소원이 사용되며, 이는 유도인자와는 구별되는 것으로, 유도인자는 상기 숙주세포를 위한 제2 탄소원이다.

배지는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 공지된 범위 내에서 적절하게 변경될 수 있는데, 예를 들면 완충제, 염류, 비타민군, 아미노산, 항생제, 또는 그 밖의 미량 영양소와 같은 성분을 더 첨가함으로써 변경할 수 있다. 또한, 상기 세포를 배양하는 동안 다른 종류의 배지 또는 배지를 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실예에서는, 배양 배지에 카사미노산이 첨가된다. 카사미노산이 배지에 포함되면 기저 수준 발현을 억제하는 데 도움이 될 수 있다.

일반적으로, 카사미노산은 0.05 내지 0.1% (w/v) 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법에서는 게놈 내에 만노오스 오페론을 위해 암호화되는 유전자를 포함하는, 즉 이를 위해 만노오스가 제2 탄소원이고, 예를 들면 포도당이 제1 탄소원인 박테리아 숙주세포를 이용할 수 있다. 본 방법에서 적절한 숙주로 이용되기 위해, 상기 박테리아 세포는 만노오스 오페론의 프로모터를 제어하는 전사조절 단백질인 ManR을 비활성화할 수 없는 상태가 된다.

예를 들면, ManP를 위해 코딩되는 핵산서열 manP가 결실될 수 있으며, 이에 의해 ManP를 통한 인산화에 의한 ManR의 비활성화가 억제된다.

manP가 결실된 박테리아 숙주세포 내로 목적 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 PmanR 또는 PmanP를 포함하는 벡터가 도입된다.

상기 재조합 박테리아 숙주세포는 상기 박테리아 숙주세포에 적절한 배양배지에서 성장하며, 이러한 배양배지는 포도당을 포함 그리고/또는 박테리아 숙주세포가 증식하거나 상기 벡터에 포함된 만노오스 프로모터의 포도당에 의해 조절되는 탄소 이화대사 억제에 의해 목적 폴리펩타이드의 발현을 억제하기에 충분한 양의 포도당을 배양배지에 공급할 수 있다.

배지 내 포도당 수치가 탄소 이화대사 억제에 요구되는 수준 이하로 떨어지면, 상기 벡터의 만노오스 프로모터의 탄소 이화대사 억제가 곧 해제되고, 만노오스 프로모터는 만노오스에 의한 유도 없이 폴리펩타이드 발현을 개시한다. 또한, 박테리아 게놈 내에서 ManP를 위해 암호화되는 핵산서열이 결실되어 있으므로, 만노오스 프로모터는 ManP를 통한 인산화에 의해 비활성화될 수 없다. 따라서, 본 발명은 유도성 탄소원 없이도 특정 탄소원 유도 프로모터의 제어에 의해 목적 폴리펩타이드의 발현이 가능하도록 한다.

일반적으로 만노오스 오페론 글루코스 프로모터를 포함하는 벡터를 이용하여 형질 전환된 박테리아 숙주세포를 사용한 발효 과정 중 유도 단계에서는 만노오스 오페론 프로모터의 제1 탄소원을 특수생장률이 μ≤0.2 h^-1이 될 수 있는 양으로 발효배지에 공급할 수 있다.

또한, 제1 탄소원은 공급은 매우 빠른 속도로 이루어진다.

이론적으로, 프로모터를 유도하기 위한 유도성 탄소원을 전혀 필요로 하지 않는 본 발명의 제 1변형예에서 언급된 내용은 유도에 필요한 탄소원의 양을 줄인 본 발명의 제2 변형예에서도 적용될 수 있다.

본 발명은 상기 목적 폴리펩타이드를 위해 암호화되는 이종 핵산서열의 발현을 조절하는 프로모터가 확실하게 조절을 수행할 수 있도록 한다.

상기 유도성 탄소원이 반드시 첨가되거나 존재해야 하는 것은 아니다.

본 발명의 제1 변형예에 따르면, 상기 프로모터는 유도성 탄소원이 없는 경우에도, 즉 유도인자가 없어도 활성화 상태로 존재한다.

바실루스 섭티리스 만노오스 오페론의 만노오스 프로모터 PmanP는 강력한 프로모터라는 것이 증명되었다. 참고로, 만노오스 오페론에 관한 상세한 내용은 Sun T. et al. "Characterization of a mannose utilization system in Bacillus subtilis," J. Bacteriol 192, 2010, 2128-2139에 기술되어 있다.

PmanP에 의한 유전자 발현에 있어 강력한 제어특성 덕분에 이러한 프로모터는 값비싼 폴리펩타이드의 이종생산에 적합하다. 그러나, 본 발명에 따르면, 만노오스 오페론을 이용한 바실루스 섭티리스 발현체계는 영구적으로 높은 발현율을 확보하기 위해 많은 양의 만노오스를 필요로 한다는 것이 밝혀졌다. 유도성 만노오스가 급격히 소모되는 것은 만노오스가 바실루스 섭티리스가 선호하는 탄소원 중 하나이기 때문인 것으로 추정된다. 그러나, 만노오스는 상당히 비싼 당류이기 때문에 경제적인 측면을 고려하면 이러한 발현체계를 대규모 산업에 응용하기는 힘들다.

이러한 발현체계를 산업적으로 활용하기 위해서는 상기 유도인자는 대사되지 않아야 한다.

본 발명에 따르면, 이는 숙주세포가 도입되는 만노오스-6-인산을 이후 당 분해되는 과당-6-인산으로 전환할 수 없도록 하기 위해 상기 숙주세포의 염색체성 게놈 내에서 만노오스 6-인산이성질체화효소 유전자 manA를 조작하거나 바람직하게는 파괴함으로써 이루어진다.

이러한 발현체계는 훨씬 더 적은 유도인자를 필요로 하지만 높은 발현율을 달성할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 특정 발현체계는 자기유도성(auto-inducible)을 지닌 것이 바람직하며, 즉 유도인자가 필요하지 않은 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 이러한 자기유도 발현체계는 ManP에 의한 ManR의 EIIB 및 EIIA와 같은 영역의 인산화를 방지함으로써 박테리아 숙주세포 게놈의 만노오스 오페론에서 유전자 manP가 조절 단백질 ManR을 비활성화시킬 수 없는 상태가 되도록 함으로써 얻어진다.

바람직하게는, 염색체성 유전자 manP는 결실된다 (녹아웃 돌연변이).

이러한 발현체계에서 PmanP 프로모터는 글루코오스에 의한 CCR에 의해서만 조절 제어된다. 글루코오스가 조절인자를 제한하고 나면 ManR는 작동 시스템에 결합하여 발현을 개시한다. 이러한 자기유도 발현체계를 산업적으로 이용하기에는 매우 많은 비용이 드는데, 이는 사실상 조기유전자(premature gene)의 발현이 일어나지 않기 때문이다.

예를 들면, 유가배양식 발효의 경우, 사실상 배치 단계에서 원하지 않는 발현이 관찰되지 않으며, 유가 단계 중에 높은 발현율을 확보하기 위해 유도인자를 첨가할 필요도 없다. 이러한 발현체계는 특히 높은 밀도로 세포를 발효시키는데 적합하고, 확보될 높은 발현율을 감소시킨다.

본 발명에 따른 이러한 새로운 발현체계, 특히 새로운 자기유도 시스템은 생산물의 수율을 향상시키고 기술관련 비용을 줄일 수 있도록 한다.

하기의 예에 도시된 바와 같이, 본 발명은 유전적으로 변경된 박테리아 숙주세포를 배양하여 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법을 제공하며, 상기 유전적으로 변경된 박테리아 숙주세포가 성장하는 동안 그리고 유도반응이 일어나기 전 상기 폴리펩타이드는 매우 낮은 수준으로 조기 발현되거나 조기 발현되지 않는다. 즉, 상기 폴리펩타이드를 위해 인코딩되는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 기본적으로 누설되지 않는다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 자기유도가 일어나는 즉시 높은 생산성으로 생산되기 시작하며, 최종 생산성도 높다.

본 발명의 다른 변형예에 따른 예에서는, 만노오스 유도 프로모터 및 이종 핵산서열을 포함하는 벡터를 수용하는 상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 만노오스 6-인산이성질체화효소를 위해 인코딩되는 상기 유전자는 결실되어 있다.

상기에서 설명한 내용은 다음의 실시예를 참고하여 완전하게 이해될 수 있을 것이다. 다만, 이러한 실시예는 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 방법으로 제시된 것이며 본 발명의 범위를 한정하기 위해 제공된 것은 아니다.

I) 만노오스 오페론의 manR 및 manP 프로모터영역의 분리 및 확인

본 명세서에서 특별히 언급되지 않는 한, 본 발명에서는 하기에 기재된 물질 및 방법이 사용된다.

박테리아 균주 및 성장조건

복제 및 발현을 위해 대장균 JM109 (Yanisch-Perron C. et al., Gene 33, 1985, 103-1 19) 및 spo0A 유전자 내에 변이를 포함하는 비포자형성 바실루스 섭티리스 균주인 바실루스 섭티리스 3NA (Michel J. F. et al., J. Appl. Bacteriol. 33, 1970, 220-227)를 주요 숙주로 사용했다. 또한, 발효 실험을 위해, 바실루스 섭티리스 3NA 돌연변이 균주 TQ281 (spoOA A manA:: ermc, Sun T. et. al., J. Bacteriol. 192, 2010, 2128-2139) 및 TQ356 (spoOA Δ manP:: ermc, see below II, Experiment 4, b)를 추가적으로 사용했다.

균주는 37℃ LB배지에서 성장시켰다(Bertoni G., J. Bacteriol. 62, 1951 , 293-300).

선택조건으로 암피실린 100 ㎍ ml^-1, 스펙티노마이신 100 ㎍ ml^-1, 에리트로마이신 100 ㎍ ml^{- 1} 을 사용했다.

만노오스 프로모터를 유도하기 위해, 살균 여과 또는 오토클레이브된 D-만노오스를 최종 농도 0.2 %(w/v)로 첨가하였다.

실험 재료

사용되는 화학물질은 모두 Sigma-Aldrich (Taufkrichen, 독일), Fluka (Buchs, 독일) 또는 Merck (Darmstadt, 독일)에서 입수했다. 합성 DNA 올리고뉴클레오티드는 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, 독일)에서 구입했다. 제한효소 및 DNA 조절 효소는 Roche Applied Science (Mannheim, 독일) 또는 New England Biolabs. (Frankfurt am Main, 독일)에서 구입했다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 Fermentas (ST. Leon-Rot, 독일)사의 High Fidelity-DNA 중합효소를 사용하여 MJ Research사 (Walthan, Massachusetts, 미국)의 MiniCycler TM에서 수행되었다.

DNA 준비 및 형질전환

제조사에서 설명한 방법에 따라, DNA 준비 키트 Qiagen (Hilden, 독일) 또는 Roche (Mannheim, 독일)을 사용하여 대장균 및 바실루스 섭티리스 또는 아가로스 겔로부터의 DNA 분리를 수행하였다. 모든 실시예에서 표준 분자 기술이 사용되었다.

대장균은 Chung CT. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, 2172-2175에 설명된 바와 같이 플라스미드 DNA를 사용하여 형질 전환하였다. 바실루스 섭티리스는 수정된 파리방법(?aris method, Harwood CR. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd., 영국)에 따라 플라스미드 DNA를 사용하여 형질 전환하였다.

베타 갈락토시다아제 활성 측정

실험대상 세포 0.1ml를 Z버퍼 900μl와 톨루엔 10μl를 사용하여 37℃에서 30분간 처리했다. Miller 방법(Miller J. H., 1972, experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, NY)에 따라 22℃에서 o-니트로페닐-β-D-갈락토파이노사이드 (o-nitrophenyl-β-galactopyranoside)를 사용하여 베타 갈락토시다아제(β-galactosidase) 활성을 측정하였다.

사용된 올리고뉴클레오티드 ( 프라이머 )

올리고 뉴클레오티드	서열	목적
s4693	5'- AAA AAA ACG CGT GTT TAA ACT GAA TTT CTG CTG AAT ATA CA-3'	바실루스 섭티러스에서 얻은 manR을 PCR 증폭
s4694	5'-AAA AAA TCT AGA AAG TGT GAA TAA TAA GAT CTT G-3'	바실루스 섭티러스에서 얻은 manR을 PCR 증폭
s4802	5'-AAA AAA ACT AGT GTT TAA ACA GGG AAA AAT GCC TTT ATT AC-3'	PmanPΔ3의 증폭을 위한 포워드 프라이머
s4833	5'-AAA AAA GTT TAA ACC CCT GGC GAA TGG CGA T-3'	플라스미드 pDG1730에서얻은 spc을 증폭
s4835	5'-AAA AAA GAA TTC ATT AGA ATG AAT ATT TCC CAA AT-3'	플라스미드 pDG1730에서 얻은 spc을 증폭
s4956	5'-AAT TGC GTC GAG ACC CCT GTG GGT CTC GTT TTT TGG ATC CGG CGC CCA CGT GGC TAG CC-3'	tufA종결부 삽입
s4957	5'-TTA AGG CTA GCC ACG TGG GCG CCG GAT CCA AAA AAC GAG ACC CAC AGG GGT CTC GAC GC-3'	tufA종결부 삽입
s5006	5'-Cy5-TAG CCT TTT TTA TAG TTG TTC AGC CAC TGT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5007	5'-Cy5-ATC CAC GCC ATA ATG CAT GCC GCC ATT AAT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5019	5'-tta agC TCT TAA GGAG GAT TTT AGA ATG GCT AAA GAA AAA TTCg-3'	tufA Tl 영역
s5020	5'-tta agG AAT TTT TCT TTA GCC ATT CTA AAA TCC TCC TTA AGA Gg-3'	tufA Tl 영역 (상보적)
s5069	5'-AAA AAA GAA TTC GAT ATC AGA TCT ACG CGT TAA CCC GGG C-3'	PCR 에르트로마이신 내성 유전자
s5070	5'-AAA AAA CAA TTG AAT CGA TTC ACA AAA AAT AGG-3'	PCR 에르트로마이신 내성 유전자
s5071	5'-AAA AAA AGA TCT CAT GGC AGG GCT TGA GAA-3'	manA 결실
s5072	5'-AAA AAA GAA TTC TTA TTT ACC TCT GTG CTT CTT-3'	manA 결실
s5097	5'-Cy5-CACTGTACCCTATCTGCGAAA-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5098	5'-Cy5-ATTGAGATAATCCTCGATCACTT-3'	프라이머 연장을 위한 표지 프라이머
s5139	5'-aaa aaa tga tea TTA CTT GTA CAG CTC GTC-3'	f-프라이머PmanP-eGFP
s5156	5'-aaa aaa tga tea ccg gtC GAT TGC CAC ATT AAA GG-3'	r-프라이머 PmanP-eGFP
s5203	5'-GATATCCTGCACCATCGTC-3'	프로모터 연구를 위한 PmanP의 증폭을 위한 백워드 프라이머
s5208	5'-GGTACCATTTCTTGCTGAATA-3'	pSUN279.2로부터의 PmanR- 영역을 증폭
s5209	5'-CTTAAGCCTGTCAGTATCTACTTGAG-3'	pSUN279.2로부터의 PmanR- 영역을 증폭
s5234	5'-aaa aaa ccg CTC GTC TTC CTA AGC ATC CT-3'	f-프라이머 rep (pUB110)
s5235	5'-aaa aaa gaa tTC GAG ATC AGG GAA TGA GTT T-3'	r-프라이머 rep (pUB110)
s5236	5'-tta agA ATT AAA GGA GGA ATT CAA AAT GGC AGA CAA TAA CAA Ag-3'	gsiB Tl 영역
s5237	5'-gat ccT TTG TTA TTG TCT GCC ATT TTG AAT TCC TCC TTT AATTc-3'	gsiB Tl영역 (상보적)
s5262	5'-AAAAAAGCTAGCGTTTAAACAAAAAGCGATT TTAATGAGCTG-3'	PmanPΔ4의 증폭을 위한 포워드 프라이머
s5362	5'-GGT ACC CCC GGG TAG CCT GGA TGG ATC AGA A-3'	manP 결실
s5363	5'-ACT AGT GAA TTC CTT TTC CAA TCG CA-3'	manP 결실
s5407	5'-AAA AAA GGC GCC GCT AGC TGG AGA ATA TAA CGG TT-3'	manP 결실
s5408	5'-ACA CTC CTT AAG TCT AGA AA-3'	manP 결실
s5617	5'-GGA GGG GAG AAA ACA CCT A-3'	manA 결실
s5618	5'-AAA AAA GAT ATC TCA AGA AAA TCC CCC GCT TT-3	manA 결실
s5932	5'-AAA AAA GCT AGC GTT TAA ACA GTA TAA AAA TCG CTT TTT TCC-3'	PmanRΔ4의 증폭을 위한 포워드 프라이머
s5933	5'-AAA AAA GCT AGC GTT TAA ACC GGA AGC TTC GGT AAA AA-3'	PmanRΔ4의 증폭을 위한 포워드 프라이머
s5934	5'-GTG CAG GAG CTC GTT ATC-3'	PmanRΔ4의 증폭을 위한 리버스 프라이머

실험 1: 만노오스 오페론의 프로모터영역을 포함하고 있는 DNA 단편의 분리 및 manR 프로모터 및 manP 프로모터의 전사 개시 부위 결정

DNeasy Blood & Tissue 키트 Qiagen(Hilden, Germany)을 사용하여 바실루스 섭티리스 168의 염색체성 DNA를 분리하였다.

완전한 manR 유전자와 manR 프로모터 그리고 manP 프로모터를 포함하는 manR과 manP사이의 유전자간 영역을 포함하는 약 2.3 kb DNA 단편을 프라이머 s4693/s4694을 사용하여 PCR에 의해 얻은 DNA로부터 증폭했다.

획득한 약 2.3 kb DNA 단편을 사용하여 manR 프로모터 및 manP 프로모터의 전사개시부위의 결정하기 위한 프라이머 연장실험을 실시하였다.

프라이머 연장을 위한 mRNA의 분리를 위해 대장균 벡터 plC20HE (Altenbuchner et al., 1992, Methods Enzymol. 216, 457-466) 및 바실루스 섭티러스 벡터 pUB110 (MacKenzie et al., 1986, Plasmid 15, 93-103)으로부터 셔틀인자를 구성한다. 이 벡터는 리포터 유전자로서 lys 유전자를 포함하는데, 이는 스테필로코커스 시뮬란(Staphylococcus simulans)으로부터 얻어진 리소스타핀의 성숙한 형태를 코드화한다 (Recsai et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1 127-1131).

이러한 고 복제 pUB110 유도체 내로 DNA 단편 2.3 kb를 리소스타핀 유전자의 업스트림위치로 복제했다. 이렇게 생성된 플라스미드를 pSUN178.4라 명명하고, 바실루스 섭티리스 3NA로 도입하였다.

플라스미드 pSUN178.4를 포함하는 바실루스 섭티리스 3NA를 카나마이신이 포함된 LB배지에서 성장시켰다. 급격한 성장단계에서 배양물을 0.2% (w/v) 만노오스를 사용하여 유도하였다. 37℃에서 1시간 성장시킨 후, 유도 및 유도되지 않은 세포를 수확하였다. Qiagen-RNeasy Mini Kit를 사용하여 모든 RNA를 분리하였다.

5' 말단에 Cy5를 포함한 표지 프라이머 s5006, s5007, s5097 및 s5098을 사용하였다.

프라이머 s5006 및 s5007는 리소스타핀 유전자의 시작 코돈에 대해 각각 +21에서 +50, +76에서 +105까지 하이브리드화되었다. 프라이머 s5097 및 s5098는 manR의 시작 코돈에 대해 각각 +81에서 +101, +131에서 +153까지 하이브리드화되었다.

플라스미드 DNA pSUN178.4의 서열분석을 위해 동일한 프라이머를 사용하였는데, 이는 크기측정을 위한 표준체(size standard)의 역할을 하였다. 역전사 및 DNA 서열분석을 위해 각각 Roche사의 AMV-Reverse 전사효소 및 T7-DNA 중합효소가 사용되었다. 역전사 및 서열분석으로 얻어진 생성물은 변성 폴리아크릴아미드 서열결정 겔 (GE healthcare)에서 분석되었다. 그 밖에 사용된 모든 시약은 Amersham Pharmacia Biotech AutoRead Sequencing 키트에서 제공하였다.

manP 프로모터의 전사개시부위는 프라이머 s5006를 사용하여 결정된다. 비교를 위해, 동일한 프라이머를 이용한 플라스미드 pSUN 178.4의 DNA 서열결정은 동일한 변성 겔에서 준비되어 수행되었다.

도 5에는 하이라이트로 표시된 A (아디닌 뉴클레오티드)에서 전사 개시부위를 갖는 manP프로모터 주위의 DNA서열을 도시되어 있다. 추정된 -10 및 -35 구역은 이탤릭체로, manR 유전자의 말단은 화살표로, BglII, NruI, XbaI, NdeI 및 AflII 에 대한 제한부위는 밑줄로 표시되어 있다. IRI-P는 불완전 역반복 서열인 추정 ManR 결합부위를 나타낸다.

manR 프로모터의 전사 개시부위는 manR 유전자 내에 결합된 프라이머 s5098이 사용된 것을 제외하고는 상기 설명된 바와 같이 manP 프로모터에 대해 수행된 RNA 분리 및 DNA 서열분석을 수행함으로써 결정되었다.

도 4에는 manR 프로모터 영역의 DNA 서열이 도시되어있는데, G (구아닌 뉴클레오티드)에서의 전사 개시부위는 하이라이트로, 추정된 -10 및 -35 구역은 이탤릭체로, 리보솜 결합부위(RBS)는 밑줄로, manR 유전자의 개시부위는 각각 화살표로 표시된다. IRI-P는 불완전 역반복 서열인 추정 ManR 결합부위를 나타낸다.

manR 프로모터 및 특히 manP 프로모터로부터의 전사는 세포가 프라이머 연장 실험에서 나타난 바와 같이 훨씬 더 강력한 신호에 의해 만노오즈에 의해 유도될 때 크게 증가했다.

사용된 프라이머는 상기 표 1에 도시되어 있다.

실험 2

실험 1의 프라이머 연장 실험에 의해 manP 프로모터의 전사 개시부위는 manR과 manP 시작부위 사이에 있는 세포간 영역의 3' 말단 근처로 이동되었다. manP 포로모터 영역을 보다 정밀하게 판단하기 위해, 2.3 kb DNA 단편의 길이를 PCR 증폭에 의해 조금씩 줄여, 서로 다른 길이로 얻어진 서열 단편을 동일한 기본 발현벡터에 다시 복제하여 발현을 조사하였다.

a) 기본 발현벡터 구성

리포터 유전자로서 프로모터가 없는 lacZ를 포함하는 발현벡터를 구성하였다. 발현벡터는 바실루스 섭티리스 및 대장균에서 모두 복제 가능한 pSUN272.1라 불리는 셔틀벡터로 구성되었다.

리포터 유전자 lacZ를 pLA2로부터의 NdeI 및 XmaI를 사용하여 절단하고 (Haldimann A. et al, 2001, J. Bacteriol. 183, 6384-6393) XmaI 부위에 바실루스 섭티리스 tufA 전사 종결부위를 포함하는 람노오스 유도 발현벡터 pWA21의 유도체인 pJOE5531.1(Wegerer et al., 2008, BMC. Biotechnol. 8, 2)에 연결한다. lacZ의 업스트림 위치에 동일한 tufA 전사 종결부위를 첨가하기 위해 이 플라스미드 내로 올리고펩티드s4956/4957 한 쌍을 AflII/MunI 제한부위 사이에 삽입한다. 따라서 종결부위에 의해 플라스미드 프로모터에서 lacZ로 독파하는 것뿐만 아니라 lacZ로부터 측면 플라스미드 서열 내로 독파하는 것을 방지할 수 있다. 대장균과 바실루스 섭티리스 모두에 대해 스펙티노마이신에 내성이 있는 유전자 spc를 올리고뉴클레오티드 s4833/4835를 사용하여 플라스미드 pDG1730로부터 증폭하여 (Geurout-Fleury et al., 1996, Gene 180, 57-61) 앞에서 얻은 플라스미드에 삽입하었다. 또한 BspHI/HindIII 단편을 삭제하여 대장균 벡터 부분의 길이를 줄였다. 이어서, 바실루스 섭티리스 pMTLBS72의 복제 영역을 포함하는 EcoRI/SphI 단편 (Lagodich et al., 2005, MoI. Biol. (Mosk) 39, 345-348)을 상기 플라스미드에 연결했다.

실험 1에서 얻은 2.3 kb DNA 단편을 AflII와 NheI를 이용하여 정리하고 연결하여 lacZ 앞에 pSUN272.1에 삽입하여 도 7에 도시한 바와 같은 플라스미드 지도를 갖는 발현벡터 pSUN279.2를 얻었다.

사용된 프라이머는 상기 표 1에 도시되어 있다.

b) 벡터 pSUN279 .2의 발현효과 결정

상기 a)에서 얻은 플라스미드 pSUN279.2와 pSUN272.1를 바실루스 섭티리스 3NA에 삽입하였다. 후자는 백그라운드 대조군으로 사용되었다. 각각의 플라스미드를 포함하고 있는 바실루스 섭티리스 3NA 균주를 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에서 성장시킨 후, 급격한 성장이 이루어지는 단계에서 유도를 위해 만노오스 0.2%, 만노오스 0.2%와 글루코오스 0.2%를 각각 배양물에 첨가하거나 배양물에 당을 첨가하지 않았다 (비유도 대조군). 한 시간 동안 유도한 후, 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 밀러 분석(Miller? assay)을 통해 판단한다. 결과는 도 8에 도시되어 있다.

pSUN279.2를 포함하는 바실루스 섭티리스의 비유도 배양물은 이미 매우 높은 기저수준의 베타 갈락토시다아제 활성을 보였다. 만노오스가 존재하는 경우, 베타 갈락토시다아제 활성은 4배 더 증가하는 반면, 만노오스 및 글루코스가 함께 존재하는 경우, 활성은 감소하였지만 여전히 기저수준보다는 훨씬 높았다. 이러한 결과는 pSUN279.2에서 보여지는 프로모터의 활성이 manR과 manP 사이의 영역, manR의 업스트림 영역, 또는 이 두 프로모터로부터 비롯된 것일 수 있다는 것을 분명히 보여준다.

따라서, 도 7에 도시된 바와 같이 2.3 kb DNA 단편 pSUN279.2를 SfoI과 NruI사이에서 절단함으로써 manR의 업스트림 영역 뿐 아니라 manR의 대부분의 영역이 모두 pSUN279.2에서 삭제되어 플라스미드 pSUN284.1가 생성된다.

바실루스 섭티리스 3NA는 이러한 플라스미드 pSUN284.1을 사용하여 형질 전환되고, 상기 발현효율은 상기한 바와 같이 결정된다. 이 결과는 도 8에 도시되어 있다. 도 8에 도시된 바와 같이, 바실루스 섭티리스 3NA 내의 pSUN279.2와 비교하면, 바실루스 섭티리스 3NA 내에서 manR이 결실된 벡터 pSUN284.1의 베타 갈락토시다아제 활성은 겨우 기저 수준의 1/2정도이며, 만노오스 유도에 의해서는 매우 강한 증가를, 글루코스가 존재하는 경우에는 다시 강한 감소를 보인다. 이러한 결과는 manP 프로모터가 manR과 manP 사이에 위치하며, manR의 염색체 복제가 저 복제 플라스미드에서 모든 manP 프로모터 복제본을 조절하기에 충분하다는 것을 보여준다.

c) manP 프로모터 영역의 로컬라이제이션

줄어든 DNA 단편 pSUN284.1 뿐 아니라 manP 프로모터 영역을 로컬라이징하기 위해, 도 5에 도시된 바와 같이, manP 프로모터의 전사 개시부위 업스트림 방향의 서로 다른 위치에서 PCR에 의해 절단된 DNA 단편을 증폭하여 pSUN272.1에 삽입함으로써 2.3 kb DNA 단편으로부터 더 짧은 서열 단편을 준비하였다.

manP의 전사 개시부위 업스트림 방향으로 bp -81과 bp -80에 이르기까지 삭제하여 서열번호 1을 갖는 제 2 결실서열이 생성하였다.

또한 manP의 전사 개시부위 업스트림 방향으로 Bp -41과 bp -40에 이르기까지 삭제를 수행하였다 (3 결실서열).

제2 결실서열 pSUN290과 제3 결실서열 pSUN297.5를 포함하는 플라스미드를 2b)에서 설명한 플라스미드 pSUN284.1와 유사한 방식으로 프라이머 s4802/s5203과 s5262/s5203으로 각각 증폭된 PCR 생성물을 제한효소 EcoRV 및 NheI을 통해 pSUN272.1로 삽입하여 구성했다.

상기 플라스미드를 바실루스 섭티리스 3NA에 삽입하여 상기 b)에서 설명한 바와 같이 배양하였다. 1시간 동안 유도한 후, 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 b)에서 설명한 바와 같이 평가하였다. 결과는 도 9에 도시되어 있다.

도 9에 도시된 바와 같이, pSUN290 및 pSUN284.1를 포함한 숙주 모두 만노오즈에 의한 lacZ 유도와 관련하여 두드러진 차이를 나타내지 않았다. 그러나 pSUN297.5를 포함하는 바실루스 섭티리스 3NA에서는 만노오스에 의한 유도가 전적으로 없고, 기저 발현수준이 0에 가까웠다. 이러한 결과로부터 manP 만노오스 프로모터 영역의 ManR 결합부위가 manP의 전사개시부위에 대해 bp-80과 -35사이에 위치하는 것을 알 수 있다.

실험 3: manR 프로모터의 결정

a) cre 서열확인

대부분의 CCR은 이화대사억제단백질 A (CcpA)를 통해 조절되기 때문에, 클론 매니저 프로그램(Clone Manager program)에서 DNA 정렬 기능을 이용하여 전체 만노오스 오페론에서 각 결합부위(cre 서열)에 대한 검색이 수행되었다. 정렬을 위해 cre 공통배열 5'-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3'가 사용되었다.

도 4에 도시된 바와 같이, manR 프로모터 영역에서만 하나의 추정 cre 서열이 발견되었고, 이는 -10 구역의 다운스트림에 위치한다.

b) manR 프로모터의 발현효율 평가

manR 프로모터의 발현효율을 평가하기 위해, pSUN284.1과 같은 발현벡터를 상기에서 설명한 바와 같이 구성하여 pSUN291로 명명하였다. 이에, 추정 manR 프로모터 및 manR의 업스트림 방향의 약 600개의 염기쌍을 포함하는 DNA 단편을 프라이머 s5208/s5209로 증폭하고, 플라스미드 DNA pSUN279.2를 주형으로 선형화하고, KpanI와AfIIII를 사용하여 정리하여 연결함으로써 플라스미드 pSUN272.1 내의 lacZ 앞에 삽입하였다.

DNA 서열은 도 4에 도시되어 있다.

플라스미드 pSUN291을 바실루스 섭티리스 3NA에 도입하고, 상기의 실험 2b)와 같이 베타 갈락토시다아제 활성을 측정하였다.

결과는 도 10에 도시하였다. 여기서, 기저 발현은 이미 상대적으로 높았고, 0.2% 만노오스를 첨가하면 3배 더 증가하였다. 글루코오스를 첨가하면 베타 갈락토시다아제 활성이 거의 기저 발현수준으로 억제되었다.

이와 같은 결과는 manR 프로모터가 단지 약한 구성 프로모터가 아니라 만노오스 및 CCR 조절에 의해 영향를 받는다는 것을 의미한다.

c) manR 프로모터 영역의 로컬라이제이션

실험 2c)에서와 같이 manR 프로모터 영역을 더 로컬라이제이션하기 위해, manR 프로모터의 전사개시부위 업스트림 방향으로 서로 다른 위치에 결합된 프라이머(s5932, s5933)와 lacZ 유전자 내 다운스트림 방향에 결합된 프라이머(s5934)를 사용하여 DNA를 PCR 증폭함으로써 pSUN291에 포함된 바와 같은 DNA 서열로부터 서로 다른 길이의 DNA 단편을 준비하였다(도 4).

제 1결실서열은 도 4의 서열을 전사개시부위 G의 업스트림 방향으로 bp -82과 bp -81에 이르기까지 절단하여 확보하였고, 제 2결실서열은 도 4의 서열을 전사개시부위 G의 업스트림 방향으로 bp -62과 bp -61에 이르기까지 절단하여 확보하였다.

실험 2c)와 마찬가지로, PCR 단편을 endoR SacI와 Nhel을 이용하여 정리하고, 동일한 제한효소로 정리한 pSUN279.2 DNA에 연결하여 플라스미드 pSUN385.2와 pSUN386.9를 얻었다.

각각의 플라스미드를 바실루스 섭티리스 3NA에 삽입하여 실험 2b와 같이 배양했다. 1시간 동안 유도한 후, 세포의 베타 갈락토시다아제 활성을 실험 2b와 같이 평가하였다. 결과는 도 10에 도시되어 있다. pSUN291과 비교하면, pSUN385.2를 포함하는 바실루스 섭티리스 3NA의 만노오스에 의한 lacZ 유도와 관련하여 두드러진 차이가 나타나지 않았다. 그러나, 제2 결실서열을 포함하는 바실루스 섭티러스 pSUN386.9에서는 만노오스에 의한 유도가 전적으로 없고, 기저 발현수준이 0에 가까웠다. 이러한 결과로부터 manR 만노오스 프로모터 영역의 ManR 결합부위는 manR의 전사개시부위에 대해 bp-81과 -35사이에 위치하는 것을 알 수 있다. ManR 결합부위는 클래스I 활성체에 대해 발견됨에 따라 심지어 -35서열에 중복되어 있을 수도 있는데 이는 제안된 결합 부위에서 발견된 역반복 서열이 제안된 -35서열까지 연장되기 때문이다.

II) 만노오스 오페론의 유전적으로 변형된 유전자영역을 포함하는 재조합 숙주세포의 구성

실험 4: 형질전환

a) 발현 벡터인 플라스미드 pMW168.1의 구성

도 5에 도시되고 실험 2c에서 사용된 바와 같이, 플라스미드 pSUN284.1에 도입된 바와 같은 manP 프로모터 영역의 핵산서열을 사용하여 아래에서 설명된 바와 같이 플라스미드 pMW168.1을 구성하여 바실루스 섭티리스 3NA 숙주로 도입하였다.

lacZ 대신에 eGFP를 리포터 유전자로 사용한 것을 제외하고는 실험 2a)와 동일한 방법으로 대장균 및 바실루스 섭티리스에서 모두 복제 가능한 셔틀벡터를 구성하였다. 또한, manP 전사개시영역을 gsiB 유전자 의 전사개시영역으로 치환하였다(Stress protein; Jugen et al., supra). 이에 의해 eGFP의 개시코돈 및 개시코돈 다음에 오는 6개의 코돈도 치환되었다.

획득한 프로모터 및 전사개시영역의 개략적인 구조는 다음과 같다.

유전자 (화살표) 및 관련 제한부위를 포함하는 영역 (구역)의 배열을 도시한다.

사용된 바와 같은 gsiB의 전사개시영역의 서열은 아래와 같다.

일반적으로, 플라스미드 pMW168.1을 도 15의 흐름도에 도시되어 있는 바와 같이 획득하였다.

흐름도에 도시된 바와 같이, 사용된 벡터 DNA, 삽입 DNA 및 상보적 올리고뉴클레오티드의 명칭은 구역에 표시된 바와 같고, PCR 생성물에 대해 프라이머와 주형 DNA는 괄호 안에 표시된 바와 같고, 사용된 제한효소는 각 부위에 표시되어 있다.

복제 단계는 대장균 JM109를 사용하여 수행되었다.

플라스미드는 암피실린에 내성이 있는 PCR 생성물을 위한 복제벡터인 pUC18 (Yanosch-Perron et al., supra), 암피실린에 내성이 있는 대장균을 위한 발현 및 복제벡터인 pWA21 (Wegerer et al., 2008, BMC Biotechnol. 8,2), manP 프로모터 영역을 포함하고 암피실린 및 카나마이신에 내성이 있는 pUB 110 유도체로 대장균 및 바실루스 섭티리스의 셔틀 벡터인 pSUN202.4, 그리고 터서열 (ter-sequence)사이의 통합부위를 포함하고 스펙티노마이신 및 암피실린에 내성이 있는 pUC18유도체인 pSUN266.1이 사용되었다.

플라스미드 pSUN266.1은 람노오스 유도 발현 벡터 pWA21의 유도체로, 람노오스 프로모터 및 eGFP 유전자가 직행 방향으로 바실루스 섭티러스의 tufA 유전자로 이루어진 두 개의 전사종결인자를 포함하는 서열에 의해 치환되어 있으며, BamHI, SmaI 및 AflII 을 위한 제한 부위(아래의 서열 참조) 및 스펙티노 내성 유전자에 의해 분리되어 있다. 다음 플라스미드는 프라이머 s4833 및 s4835 (표 1)을 사용하여 pDG1730 (Cuerout-Fleury et al 1996)로부터 증폭하였다. 마지막으로 pMW168에서는, 만노오스 프로모터 및 eGFP 유전자가 두 개의 tufA 전사종결서열사이에 삽입되어 있다.

두 개의 tufA 종결서열(볼드체, 이탤릭체로 표시) 및 서열 말단(밑줄로 표시) 및 사이에 존재하는 제한부위로 이루어진 뉴클레오티드 서열.

시작코돈 및 시작코톤 다음에 오는 코돈을 포함하여 전사개시영역을 상보적 올리고뉴틀레오티드를 사용하고 단일 제한부위 BglII, AflII 및 BamHI를 통해 치환하였다. 상기 벡터의 구성은 벡터 pWA21 (Wegerer et al., supra)의 T7유전자 10의 전사개시영역을 각각 상보적 올리고뉴클레오티드 s5019 및 s5020를 통해 바실루스 섭티리스로부터 획득한 tufA의 전사개시영역으로 치환함으로써 개시되었다. 또한 추가 복제 단계에서, 이러한 전사개시영역이 gsiB (올리고뉴클레오티드 s5236/s5237)의 전사개시영역으로 치환되었다. 최종 플라스미드 pMW168.1은 pUB110로부터의 ori⁺를 포함하는 rep 유전자를 포함한다.

pMW168.1의 플라스미드 맵은 도 11에 도시되어 있다.

b) manP(ΔmanP)와 manA(ΔmanA)가 없는 결실 돌연변이 숙주

b1) manP 결실용 삽입벡터

삽입벡터 pSUN356.7을 사용하여 포자형성 결핍 바실루스 섭티러스 NA 염색체상의 만노오스 오페론으로에서 만노오스 특이 EII을 위해 인코딩하는 유전자 manP를 결실하고, 이에 따라 얻어진 숙주를 바실루스 섭티리스 TQ356(spoOA manP::ermC)라 명명했다. 선별표지유전자로 에리트로마이신 내성 카세트를 사용하였다.

벡터 pSUN356.7은 (앰피실린 내성) pUC18유도체로, manR과 manA의 서열이 측면에 위치하고 치환카세트인 스펙티노마이신 내성 유전자의 외부에 위치하는 에리트로마이신 내성 유전자를 포함한다. 상기 스펙티노마이신 내성 유전자는 pDG1730(상기 pSUN266.1용 참조)로부터 증폭되었다. 상기 에리트로마이신 내성 유전자는 프라이머 s5069 and s5070에 의해 플라스미드 pDG1730로부터 증폭된다. manR 유전자의 C 말단은 프라이머 s5407과 s5408에 의해 바실루스 섭티리스 DNA로부터 증폭되어 상기 에르트로마이신 유전자 한 쪽에 삽입된다. manA의 N 말단은 프라이머 s5362와 s5363에 의해 바실리스 섭티리스 염색체로부터 증폭되어 상기 에르트로마이신 내성 유전자의 다른 쪽에 삽입된다.

상기 플라스미드 pSUN356,7의 맵은 도 12에 도시되어 있다.

b2) manA의 결실

또한, 바실루스 섭티러스 녹아웃 돌연변이는 포자형성 결핍 바실루스 섭티러스 3NA 염색체 상의 만노오스 오페론으로부터 획득한 manA와 삽입벡터 pSUN281사용하여 생성하여 바실루스 섭티리스 TQ281로 명명하였다(spoOA3, manA::ermC) (Sun T. et al, supra 참고).

유전자 manA는 만노오스-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 만노오스 6-인산이성질체화효소를 암호화한다.

결실이 성공적으로 수행되었는지를 모니터하기 위해, 에리트로마이신 내성 카세트를 사용하였다.

b3) 형질전환

상기 b1)과 b2)에서 얻은 바실루스 섭티리스 TQ356과 바실루스 섭티리스 TQ281을 각각 a1)에서 얻은 플라스미드 pMW168.1를 사용하여 형질 전환하였다.

사용배지

a) 글루코스 최소 배지 (minimal glucose, MG)

2.0 g (NH₄)S0₄

6.0 g KH₂P0₄

14.0 g K₂HP0₄

1.0 g Na₃Citrat

0.2 g MgS0₄*7 H₂0

5.0 g 글루코스 (각각 20 - 50% 모액)

b) 배지 I

9.50 ml MG

0.20 ml 카사미노산 (1 % 모액)

0.05 ml MgS0₄ (1 M stock solution)

c) 배지 II

8.00 ml MG

0.10 ml 카사미노산 (1% 모액)

0.05 ml MgS0₄ (1 M 모액)

형질전환은 Anagnostopulos et al, "Requirements for transformation in Bacillus subtilis" J. Bacteriol. (1961) 81 : 741-746의 협약에 따라 수행하였다. 단일 군체의 각 박테리아 숙주를 5ml 배지 I에 넣고 37℃ 롤러에서 하룻밤 동안 배양했다. 이렇게 얻은 배양균 (OD₆oo는 1과 2사이) 1ml를 배지II 8ml를 포함한 100ml 삼각플라스크에 넣고 37℃에서 85분 동안 배양했다. 그 후, 형질 전환성 세포 1 ml을 Schutt사의 시험관에 옮겨 담고, 각 삽입 벡터와 혼합하였다. 형질 전환성 세포와 혼합하기 전, 삽입 벡터는 싱글커터를 사용하여 비필수 부위에서 절단했다. 이렇게 하여 얻은 혼합물을 이소프로필 알코올로 침전시키고 실온에서 적어도 2시간 묶어놓았다.

그 후, 획득한 형질전환 세포를 37℃ 롤러에서 30분간 배양하고, 실온에서 4,500rpm로 5분간 원심 분리했다. 획득한 펠렛을 남은 용액에 재부유하고 플레이트로 만들었다.

실험 5: 발효

5.1 재료 및 방법

특별히 지정되지 않는 한, 발효실험에서도 일반적인 표준 분자 기술이 사용되었다.

발효에 사용되는 배지의 조성

카사미노산 (BD Difco™ Sparks, Maryland, USA) 0.02 % (w/v), 플라스미드 선별을 위한 스펙티노마이신 100㎍/mL, 균주 선별을 위한 에리트로마이신 (TQ281와 TQ356의 경우) 5㎍/mL을 첨가한 Spizizen의 최소염배지 (minimal salts medium, SMM)에서 하룻 밤 배양 및 전배양 1을 수행하였다 (Spizizen J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44, 1958, 1072-1078). 전배양 2 및 발효(배치)는 (NH₄)₂-H-citrate 1.0 g/L, Na₂SO₄ 2.0 g/L, NH₄SO₄ 2.68 g/L, NH₄Cl 0.5 g/L, K₂HPO₄ 14.6 g/L, Na₂HPO₄×2H₂O 4.0 g/L, MgSO₄×7H₂O 1.0 g/L, 미량원소용액(TES) 3 ml/L, 전배양 2를 위한 글루코스 5 g/L 및 배치배지를 위한 글루코스 25 g/L으로 구성된 Wilms et al.로부터 조정된 미네랄 배지(Wilms B. et. al., Biotechnol. Bioeng. 73, 2001 , 95-103)에서 수행하였다. TES는 CaCl₂ 0.5 g/L, ZnSO₄x7H₂O 0.18 g/L, MnSO×H₂O 0.1 g/L, Na₂-EDTA 10.05 g/L, FeCl₃ 8.35 g/L, CuSO5H₂O 0.16 g/L 및 CoCl₂×6H₂O 0.18 g/L를 포함하였다. KLF 반응기가 사용되는 경우, 높은 세포밀도로 발효하기 위한 양분배지는 글루코스 200 g/L, MgSO₄×7H₂O 7.89 g/L, TES 40 ml/L 그리고 (NH₄)₂HPO₄ 63.36 g/L을 포함하였다. pH는 모든 구성요소가 용해될 수 있도록 3.3으로 조절했다. 30 L 반응기가 사용되는 경우, 서로 다른 두 개의 양분배지를 사용했다. 제1양분배지는 글루코오스 H₂O 654.76 g/L, MgSO₄×H₂O 23.5 g/L 및 TES 120 mL/L를 포함하고, 제2 양분배지는 (NH₄)₂HPO₄ 396 g/L를 포함하였다. manP 프로모터를 유도하기 위해, 20 % (w/v) D-만노오스 용액이나 만노오스 200 g/L, MgSO₄×7H₂O 7.89 g/L, TES 40 mL/L 및 (NH₄)₂HPO₄ 63.36 g/L을 포함하는 별도의 양분용액 중 어느 하나를 사용하였다.

전배양 및 유가배양 조건

LB 한천 플레이트로부터 얻은 단일 군체를 SMM 5 ml에 접종한 후 37℃에서 적어도 14시간 하룻밤 동안 배양했다. SMM 25 ml를 250 ml 진탕 플라스크에 넣고 상기 밤새 배양한 배양균을 접종하여 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀) 0.05를 얻었다(전배양1). 37℃에서 5시간 배양한 후, 전배양물1 20 ml을 사용하여 전배양2배지 200 ml를 1,000 ml 진탕 플라스크에 접종하였다 (전배양2). 37℃에서 7시간 배양한 후, 배치배양 배지에 전배양물2를 접종하였다.

주요 탄소원으로 글루코오스(Korz D. J. et al., J. Bacteriol. 39, 1995, 59-65; Wilms supra) 를 사용하는 대장균을 위해 개발되어 최적화된 기존의 유가 배양식 발효를 사용하였다. 3.7리터 소형 실험실 발효조 KLF(Bioengineering AG, Wald, Switzerland)를 사용하고 양분공급량이 1.0 L인 경우, 배치의 양은 1.5 L였다. 30리터 실험실 발효조 D598 (Laboratory Fermenter (LF), Bioengineering AG, Wald, Switzerland)를 사용하는 경우, 배치량은 8.0 L, 글루코오스 공급배지는 4.2 L 그리고 암모니아 공급배지는 1.0 L였다. 글루코오스 및 암모니아 배지는 81%:19%의 비율로 반응기 내로 공급되었다. 이러한 공급배지는 하기의 식에 따라 생물반응기로 공급되었다.

F(t)=[(μ_set /Y_x/s)+m]×(C_x0×V₀)/C_s0]×xp(μ_set×t) Eq. 1

여기서, F(Lh^{- 1})는 공급속도, μ_set(h^-1)는 원하는 특수생장율, m(gg^-1h^{- 1})는 특수 보전계수 (=0.04 gg^-1h^-1), Y_{x /s}는 특수 바이오매스/기질 수율 계수 (글루코오스 당 약 0.5), C_x0(gL^-1)은 공급이 시작될 때의 바이오매스 농도, V₀(L)은 공급이 시작될 때의 반응기 부피, C_s0(gL^-1)은 공급액에서의 글루코오스 농도, t(h)는 공급이 시작된 후의 시간이다. 특수생장율 μ는 0.1h^-1이 되도록 하는데, 이는 비특이 부산물 및 원치 않은 부산물이 생성되는 것이 방지하고, 산소가 제한되는 것을 방지하기 위함이다.

회분배양은 발현된 이종 단백질에서 원치 않은 봉입체가 형성되는 것을 방지하기 위해 유가배양단계의 시작과 함께 37℃에서 온도가 30℃가 될 때까지 수행하였다. pH는 각각 24%(v/v) NH₄OH 및 20%(v/v) H₃PO₄를 사용하여 7.0로 조절하였다. pO₂값은 자동적으로 조절되는 교반 속도에 의해 50%이상의 포화상태로 유지하였다. 통기율은 KLF를 이용할 경우에는 2 L/min으로 일정하게 유지하였고, LF를 이용할 경우에는 15 내지 25 L/min로 유지하였다. 초과압은 0.5 barr로 유지했다. 세포밀도는 Ultrospec™ 1100 pro UV/visible 분광계(GE Healthcare, formerly Amersham Biosciences, United Kingdom)를 사용하여 OD₆₀₀를 주기적으로 측정하여 평가하였다. 세포 건조질량(cdw)는 OD₆₀₀값에 인자값 0.322 g_cdw/L을 곱하여 계산했고, 이는 발효되는 동안 MB 835 Halogen(Ohaus Corporation, Pine Brook, New Jersey, USA)을 사용하여 여러 번 수분측정을 한 후 평균값으로 계산했다. Biolog 1.7 소프트웨어 패키지(Institute of Biochemical Engineering, University of Stuttgart, Germany [http://www.ibvt.uni-stuttgart.de])를 사용하여 발효 변수를 제어했다. 유가 배양식 발효는 약 40시간의 처리 후 종료되었다.

온라인 및 오프라인 형광발광 측정

상기 생산된 재조합 eGFP의 발현율을 실시간으로 추적하기 위해 형광 탐침(Mikropack HPX-2000, High Power Xenon Lightsource; Ocean Optics, Inc. ; S2000 fibre optic spectrometer; Dunedin, Florida, USA)이 생물반응기 내에서 사용되었다. 소멸파장은 485 nm였고, 방출파장은 535 nm에서 감지되어 Spectra Suite 소프트웨어 패키지(Ocean Optics, Dunedin, Florida, USA)에 의해 온라인으로 기록되었다. 형광은 0.6 세기로 광학 필터를 통해 보냈다. 탐침의 검출시간은 50 msec였다. 상기 소프트웨어는 4,000까지만 카운트할 수 있기 때문에, 그보다 높은 값이 되기 바로 전에 검출시간을 단계적으로 줄였다. 따라서, 상기 형광수(fluorescence count)를 나중에 해당 감소인자와 곱해서 50 msec에 해당하는 값을 얻었다. 상기에서 측정된 값은 일정 반응기 부피에 특정되어 있다.

추가적으로, SpectraFluor Microplate Reader(Tecan Group Ltd . , Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 오프라인으로 형광활성을 측정하였다. 이에 따라, 희석하지 않은 세포 배양물 250 ㎕ 세 개를 96개짜리 웰(well) 마이크로 플레이트(Greiner-Bio One GmbH, Frickenhausen, Germany)에서 세 개의 250 ㎕ 배치 배지를 이용하여 공시험값으로 측정하였다(여기필터: 485 nm; 방출필터: 535 nm; 증가량(수동): 60; 검출시간: 20 μsec; 섬광수: 3; 판독모드: Top). 공시험값의 평균값을 시편의 평균값에서 차감하여 최종값을 얻었다. 20,000 카운트가 되면, 세포 배양물을 배치 배지에서 희석하였다.

내부 정제 eGFP 기준(약 95% 순도, 1.3 g/L)에 따라 보정함으로써, 총 오프라인 측정값 약 12,000개가 1 g_eGFP/L에 해당하는 것으로 할 수 있다. 오프라인 및 오라인 측정값은 선형적으로 일관성이 있는데, 오라인 측청값 7,470개 당 1.5 g_eGFP/L라는 상관값이 주어진다.

플라스미드의 안정성 확인

Harwood and Cutting(Harwood C. R. et al, Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England)방법에 따라 플라스미드를 포함하고 있는 세포의 분획을 측정하여 벡터 pMW168.1의 안정성을 확인했다.

SDS-PAGE에 의한 단백질 분석

조세포 추출물을 다음과 같이 획득하였다. 10¹⁰개의 세포를 수거하여 원심 분리하였다. 펠렛으로 만든 세포를 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5) 1 mL를 사용하여 재현탁시키고 초음파를 이용하여 용해하였다 (Heat Systems-Ultrasonics, Inc., model W-385 sonicator, Farmingdale, New York, USA; 3 x 30 sec, 50 % duty cycle). 원심분리 후, 이 용해성 단백질 분획을 상청액으로부터 수거하고, 불용해성 분획은 상기 펠렛을 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5) 1 mL를 사용하여 재현탁시켜 획득했다. 단백질 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다 (Laemmli U.K., Nature 227, 1970, 680-685; LeBlanc D. J. et al. , Antimicrob. Agents Chemother 35, 1991 , 1804-1810).

5.2 바실루스 섭티리스 3NA/pMW168.1을 사용한 고세포밀도 발효

바실루스 섭티리스 3NA/pMW168.1을 사용한 만노오스 발현시스템을 유가 배양식 발효에서 실험했다. 상기에서 설명한 바와 같이 구성하여 사용하였다 (Korz et al. , Wilms et al., supra).

제1 발효단계는 LF 교반반응기에서 수행되었으며, 유가 배양단계가 시작되는 즉시 추가로 0.2% (w/v) 만노오스를 배양액에 첨가하였다. 이제까지 두드러진 형광발광을 보이지 않았던 탐침의 형광신호는 유도 직후 매우 빠르게 증가하였다. 유가배양 단계에서 4시간 후 약 2,200카운트에서 최고값에 도달한 후, 상기 신호는 다시 서서히 감소하기 시작했다. 이러한 감소는 유도인자가 소비(HPLC에 의해 측정, 데이터는 도시되지 않음)됨에 따라 수반되었다. 단계 마지막에서, g_cdw 당 0.2 g_eGFP/L 또는 0.3 g_eGFP/L가 생산되었다.

제2 발효단계에서는 D-만노오스의 추가 공급을 기하급수적으로 증가시켰다. 이러한 공급은 글루코오스 공급과 동시에 시작하여 D-만노오스 및 글루코오스 공급량의 전체 당농도를 제1 발효단계에서만큼 높게 유지하였다. 형광신호는 유도인자가 첨가된 직후에 나타나기 시작하여 단계가 끝날 때까지 계속되었다. 이러한 증가세를 유지하기 위해 총 50 g의 D-만노오스를 반응액에 첨가하였다. 이러한 유도체제에서 g_cdw 당 2.1 g_eGFP/L 또는 53 mg_eGFP/L가 생산되었다. 이렇게 바실루스 섭티러스 3NA/pMW168.1을 사용하여 수행한 두 번의 발효과정의 결과는 5.5 실험결과에 도시된 표에 자세하게 요약되어 있다.

상기 eGFP 생산량은 전체 유가 배양 단계 내내 증가하였지만, 바이오매스의 생산 속도보다는 늦었다. 플라스미드 안정성 확인을 통해 상기 제1, 2 발효과정 마지막 단계에서 세포의 95%정도가 벡터를 계속 포함하고 있었다는 것이 밝혀졌다.

5.3 ΔmanA 균주 TQ281을 사용한 고세포밀도 발효

단독 탄소원인 만노오스에서 성장할 수 없는 manA 결실 균주 TQ281(Sun T. et al., supra)을 사용하여 추가 발효실험을 수행하였다. pMW168.1로 형질 전환된 바실루스 섭티러스 TQ281은 진탕 플라스크 실험에서 D-만노오스 민감성을 보였다

TQ281/pMW168.1을 사용하여 두 번의 유가배양식 발효단계을 준비했다. 제1 발효단계에서는 유가배양단계가 시작될 때 만노오스를 일회 첨가함으로써 유도반응이 일어났다. 제2 발효단계에서는 만노오스의 추가 공급을 한꺼번에 기하급수적으로 증가시켰다. D-만노오스를 사용한 유도는 유가배양단계에서 특수생장율에 큰 영향을 미치지 않았다. 일회 첨가하는 방법으로 g_cdw 당 36 mg_eGFP/L에 해당하는 0.7 g_eGFP/L가 얻어졌고, 기하급수적 공급방법으로는 g_cdw 당 32 mg_eGFP/L에 해당하는 1.9 g_eGFP/L가 생산되었다. 제1, 2 발효과정의 결과는 5.5 실험결과에 도시된 표에 자세하게 요약되어 있다.

5.4 ΔmanP 균주 TQ356을 사용한 고세포밀도 발효에서의 자기유도 발현시스템의 개발 및 적용

바실루스 섭티리스 ΔmanP 균주 TQ356은 비유도 조건에서 P_manP로부터 구성적 발현이 나타나지 않으며 또한 글루코오스가 존재하는 경우 CCR효과도 나타나지 않았다(Sun T. et al. , supra). 이러한 균주는 pMW168.1로 형질 전환되어 상당히 작은 형광군체를 형성한다. 글루코오스 0.5%(w/v)를 선별배지에 첨가한 후, 군체는 정상적으로 성장하였다. 진탕 플라스크 실험에서는 글루코오스가 모두 소모되었을 때 발현값이 높았다(데이터 도시하지 않음).

이후, pMW168.1을 수용하는 바실루스 섭티리스 TQ356가 유가 배양식 발효에서 사용되었다(도 13). 회분배양 단계에서는 바실루스 섭티리스 3NA/pMW186 및 TQ281/pMW168의 회분배양 발효에서와 마찬가지로 두드러진 형광특성이 나타나지 않았다. 유가배양 단계가 시작됨에 따라 반응 탐침의 형광신호가 지속적으로 증가하기 시작했다. 총 36시간의 발효 후, 발효과정이 끝날 때까지 일정한 특이 생산성에 해당하는 상수 Y_{P / X}값이 14.6%로 나타난 바와 같이 세포 내 발현수준은 최대에 이르렀다. 유도인자를 첨가하지 않고도 g_cdw 당 eGFP 146 mg에 해당하는 거의 10 g_eGFP/L가 생산되었다. 발효 결과는 하기 5.5 실험결과에 도시된 표에 요약, 다른 발효 결과와 비교되어 있다. SDS-PAGE를 수행하여 총 단백질에 대한 발현된 eGFP의 비율을 확인하였다(도 14). 도시된 바와 같이 총 단백질의 적어도 20%가 eGFP분자였다. 적은 양의 분획만이 용해되지 않고 봉입체의 형테로 존재했다(도 14, 7레인). 또한 희석하지 않은 배양액의 상청액을 SDS-PAGE로 분석하여(도 14, 8레인) 분광광도방법으로 측정했다. 측정된 총 eGFP의 약 1%가 상청액에서 검출되었는데, 이는 발효과정에 걸쳐 진행중인 세포용해로 인한 것으로 생각된다.

플라스미드 안정성 및 세포 형태는 발효과정에 걸쳐 확인하였다.

5.5 실험결과

5.2 내지 5.4에서 수행된 발효실험의 결과는 하기 표에 요약했다.

서로 다른 유도체계 및 pMW168.1을 포함하는 바실루스 섭티리스 균주를 이용한 발효결과 비교

<약어 및 변수에 대한 설명>

SA: 유도인자(만노오스)를 일회 첨가

EF: 유도인자(만노오스)를 기하급수적으로 공급

AI: 자기유도

final: 발효과정 종료시점

LF: 30리터 실험실 발효조

KLF: 33.7리터 소형 실험실 발효조

Δtfb: 유가배양 시간/기간

final: 발효과정 종료시점

cx, final: 세포 건조중량 농도

Xfinal: 절대 건조중량

cP, final: 생산물 농도

PeGFP, final: 완전 생산물 (eGFP)

YP/X: 세포건조중량 그램 당 생산량

rP: 특이생산성

qP: 부피생산성

상기 결과에 도시된 바와 같이, 회분배양 단계에서는 사실상 리포터 유전자 eGFP이 발현이 일어나지 않았다. 5.4의 자기유도 발효단계에서는 회분배양 및 유가배양 단계 사이의 글루코오스 제한 전사 단계가 시작되는 시점에서 자기유도가 개시되었고, 이는 내부 글루코오스 제한 유가배양 단계 내내 유지되어 생산물의 수율이 3배 증가되어 gcdw당 146 mg GPF가 생산되었다.

또한 TQ281을 사용하여 얻은 결과(발효과정 5.3)에서 알 수 있듯이 같이 유도인자 0.7 g(eGFP)/L을 일회 첨가하여 얻어진 수율은 기하급수적인 공급단계에서 유도인자를 추가적으로 공급함에 따라 1.9 g/L로 증가할 수 있다.

5.6 평가

발효과정 5.2 내지 5.4에서는 eGFP의 발현을 촉진하기 위해 pMW168.1 벡터 내에 만노오스 프로모터 PmanP를 포함하는 바실루스 섭티리스의 발현시스템을 사용하였다. 프로모터 PmanP은 D-만노오스가 첨가되면 활성화되는 강력한 프로모터라는 것이 증명되었다.

발효과정 5.2에서는 이러한 벡터로 형질 전환된 바실루스 섭티리스 포자형성 결핍 균주 3NA를 사용하여 2.1 g_eGFP/L이라는 높은 생산량을 달성하였다. 재조합 단백질 생산을 위한 유망한 숙주시스템으로 최근에 기재된 바실루스 메가테리움을 이용한 시스템(Stammen et al. , Appl. Environ. Microbiol. 76, 2010, 4037-4046)과 비교하면, 바실루스 섭티리스 시스템이 보다 우수한 결과를 보여줬다. 세포 내 바실루스 메가테리움 단백질 생산 시스템은 자일로스에 의해 유도되는 것으로 유가배양식 발효과정에서 g_cdw 당 36.8 mg에 해당하는 1.25 g_eGFP/L를 생산하였다. 또한 Stammen et al. (supra)는 발효과정이 끝날 때까지 항생제를 사용했는데, 그 결과 상기 발효과정 동안 플라스미드가 상실되지 않았다.

발효과정 5.2에 따르면, 상기 만노오스 시스템은 생산성 면에서는 훨씬 효율적이지만, 유도인자를 일회 첨가하는 방법으로는 높은 발현율을 지속할 수 없다. 이는 유도인자인 만노오스가 바실루스 섭티리스가 선호하는 탄소원 중의 하나여서 빨리 소모하기 때문이다.

따라서, 본 발명은 포자형성 결핍 바실루스 섭티리스 숙주세포에서 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법으로, 포자형성 결핍 바실루스 섭티리스 세포를 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 manP프로모터를 포함하는 벡터로 형질주입하는 단계, 상기 폴리펩타이드가 발현하기에 적절한 조건의 배지에서 상기 형질 전환된 숙주세포를 성장시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 배양물에서 폴리펩타이드를 수거하는 단계를 포함하며, 이러한 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현은 유도인자인 만노오스를 첨가함에 따라 유도된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면. 유도인자인 만노오스는 유가배양 단계가 시작되는 시점에 첨가된다. 다른 실시예에 따르면, 상기 유도인자인 만노오스는 유가 배양 단계가 시작되는 시점에 1차로 첨가되고, 기하급수적으로 성장하는 동안 상기 글루코오스를 공급하면서 2차로 첨가된다.

유도인자의 요건이 완화된 발현시스템은 발효과정 5.3에 의해 만노오스 6-인산이성질체화효소 유전자 manA를 파괴함으로써 구현되었다. 이에 따라 진탕 플라스크 실험에서 관찰되는 바와 같이 적은 양의 유도인자로 높은 발현율을 얻는 시스템이 구현되었다.

그러나, 이러한 시스템은 만노오스를 0.5%(w/v)이상 사용하면 성장이 저해되기 때문에 세포의 자기독소화(self-toxification)를 수반하였다. 이러한 결과는 만노오스 6-인산이 세포 내 축적되기 때문이다. ΔmanA 균주 TQ281이 만노오스에 민감한 또 다른 가능한 이유로는 이용 가능한 인산기가 강력하게 줄어들기 때문으로, 이는 인산염이 PTS를 통해 세포에 들어갈 때 만노오스에 비가역적으로 결합되기 때문이다.

따라서, 본 발명은 manA유전자가 결핍된 바실루스 섭티리스 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것으로, manA유전자가 결핍된 바실루스 섭티리스 세포를 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 manP프로모터를 포함하는 벡터로 형질주입하는 단계, 상기 폴리펩타이드가 발현하기에 적절한 조건의 배지에서 상기 형질 전환된 숙주세포를 성장시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 배양물에서 폴리펩타이드를 수거하는 단계를 포함하며, 이러한 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현은 유도인자인 만노오스를 0.5%(w/v)가 넘지 않도록 첨가함에 따라 유도된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면. 유도인자인 만노오스는 유가배양 단계가 시작되는 시점에 첨가된다. 다른 실시예에 따르면, 상기 유도인자인 만노오스는 유가배양 단계가 시작되는 시점에 1차로 첨가되고, 기하급수적으로 성장하는 동안 상기 글루코오스를 공급하면서 2차로 첨가된다.

유도인자가 필요하지 않은 유도체계는 실시예 5.4에 도시되어 있다. 자가유도 시스템은 ΔmanP 균주 TQ356 및 발현벡터 pMW168.1을 사용하여 수행되었다.

TQ356와 같은 운반체 음성 균주에서 만노오스 프로모터는 글루코오스에 의한 CCR에 의해서만 조절 제어되는데, 이러한 경우는 예를 들면 발효과정 중 회분배양 단계에서이다. 관련 운반체 ManP에 의한 음성조절효과는 종료된다. 그럼에도 불구하고, 글루코오스가 존재하는 한 조절인자는 비활성상태로 남는다. 또한, manR 동작부위가 차단되기 때문에 ManR의 양은 충분하지 않다. 글루코오스가 한정되어야 ManR이 작동서열에 결합하여 발현을 시작할 수 있게 된다. 이러한 자기유도시스템은 값비싼 필요 이상의 유도인자를 필요로 한다. 이러한 정교한 유도방법은 산업적으로는 매우 적합한데, 이는 회분배양 단계에서 원치 않은 기저발현이 현저하게 일어나지 않고, 유가배양 단계 내내 높은 발현값을 얻기 위해 유도인자를 첨가할 필요가 없기 때문이다.

이 외에도 5.2와 5.3의 발효방법에 비해 높은 생산성과 상대적으로 높은 발현율을 달성할 수 있다. g_cdw 당 146 mg_eGFP에 해당하는 거의 10 g/L의 재조합 단백질(eGFP)이 생산될 수 있다. 생산물은 세포 내에서 균질하게 분포되어 있는데, 이는 형광현미경 및 SDS-PAGE분석에 의해 관찰될 수 있는 용해도 덕분이다. 높은 발현율, 즉 높은 생산성이 발효과정이 끝날 때까지 일정하게 유지될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 manP유전자가 결핍된 세포와 같은 운반체 음성 바실루스 섭티리스 숙주세포 내에서 이종 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법으로, 운반체 음성 바실루스 섭티리스 세포를 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 manP프로모터를 포함하는 벡터로 형질주입하는 단계, 상기 폴리펩타이드가 발현하기에 적절한 조건의 배지에서 상기 형질 전환된 숙주세포를 성장시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 배양물에서 폴리펩타이드를 수거하는 단계를 포함하며, 이러한 방법에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현은 만노오스에 의해 유도되는 것이 아니라 글루코오스의에 의해 제어된다.

Claims (8)

1. 재조합 박테리아 숙주세포에 있어서,
   상기 세포의 탄소원의 이화작용은 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며,
   상기 숙주세포는 제1 탄소원과 다른 유도성 제2 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 특이성을 지닌 전사조절 단백질을 비활성화할 수 없도록 상기 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 포스포릴기 이송 효소 EII을 암호화하는 유전자를 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 결실함으로써 유전적으로 변형되고,
   상기 숙주세포는 벡터를 포함하고,
   상기 벡터는 상기 박테리아 숙주세포가 비활성화할 수 없도록 유전적으로 변형되어 상기 전사조절 단백질에 의해 조절되는 프로모터와, 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열과, 상기 특이 전사조절 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고,
   상기 전사조절 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 재조합 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 존재하고,
   상기 숙주세포는, 상기 유도성 제2 탄소원은 포함하지 않고 재조합 박테리아 숙주세포를 위한 상기 제1 탄소원을 포함하는 세포 배양지에서 성장된 것이고,
   상기 폴리펩타이드는, 상기 제1 탄소원의 농도가 탄소 이화대사 억제에 필요한 수준 아래로 감소하는 경우 한 번에 상기 제1 탄소원에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현이 유도되는 것으로, 상기 세포 또는 세포 배양물에서 수거된 것인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
2. 재조합 박테리아 숙주세포에 있어서,
   상기 세포의 탄소원의 이화작용은 탄소 이화대사 억제 및 포스포에놀피루브산염:탄수화물 인 전이효소 시스템에 의해 제어되며,
   상기 숙주세포는 제1 탄소원과 다른 유도성 제2 탄소원이 존재하지 않는 경우 상기 제2 탄소원에 의해 유도되는 프로모터에 특이성을 지닌 전사조절 단백질을 비활성화할 수 없도록, 상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 상기 전사조절 단백질을 암호화하는 유전자를 유전적으로 변형하는 것에 의해, 상기 유전적으로 변형된 유전자에 의해 발현되는 상기 전사조절 단백질이 상기 전사조절 단백질에 특이성을 지닌 효소 EII에 의해 이송된 포스포릴기를 결합시킬 수 없게 됨으로써 유전적으로 변형되고,
   상기 유전적으로 변형된 유전자는 상기 재조합 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 존재하며,
   상기 재조합 박테리아 숙주세포는 벡터를 포함하고,
   상기 벡터는 상기 박테리아 숙주세포가 비활성화할 수 없도록 유전적으로 변형되어 상기 전사조절 단백질에 의해 조절되는 프로모터와, 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산서열과, 상기 효소 EII에 의해 이송되는 포스포릴기를 결합시킬 수 없는 전사조절 단백질을 암호화하는 상기 유전적으로 변형된 유전자를 포함하며,
   상기 숙주세포는, 상기 유도성 제2 탄소원은 포함하지 않고 재조합 박테리아 숙주세포를 위한 상기 제1 탄소원을 포함하는 세포 배양지에서 성장된 것이고,
   상기 폴리펩타이드는, 상기 제1 탄소원의 농도가 탄소 이화대사 억제에 필요한 수준 아래로 감소하는 경우 한 번에 상기 제1 탄소원에 의해 상기 폴리펩타이드의 발현이 유도되는 것으로, 상기 세포 또는 세포 배양물에서 수거된 것인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 박테리아 숙주세포는 바실루스(Bacilli), 클로스트리듐(Chlostridia) 및 대장균(Escherichia) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 탄소원 유도 프로모터는 만노오스 오페론의 프로모터이고, 상기 유도성 탄소원은 만노오스인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 프로모터는 만노오스 오페론의 P_manP 또는 P_manR 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 ManP를 암호화하는 유전자가 결실되어 있거나, 또는
   상기 박테리아 숙주세포의 게놈 내에서 상기 전사조절 단백질 ManR을 암호화하는 유전자에 의해 발현되는 ManR이 상기 전사조절 단백질 ManR에 특이성을 지닌 효소 EII로부터 이송된 포스포릴기를 결합시킬 수 없도록 상기 유전자를 유전적으로 변형하는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 박테리아 숙주세포는 바실루스(Bacilli) 중 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 숙주세포.
8. 제 1항 또는 제 2항에 따른 재조합 박테리아 숙주세포의 이용 방법에 있어서,
   이종 폴리펩타이드의 생산 시에, 상기 이종 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현은 제 1항 또는 제 2항의 프로모터의 제어 하에 있는 것을 특징으로 하는 이용 방법.

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