EA024834B1 - Регуляция индуцируемых промоторов - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к получению гетерологических полипептидов в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, при котором указанную рекомбинантную клетку-хозяина делают не способной деактивировать промотор, управляющий экспрессией указанного гетерологического полипептида в отсутствие индуктора.

Description

Настоящее изобретение относится к получению гетерологических полипептидов в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине. В частности, данное изобретение относится к регуляции экспрессии гетерологической последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей этот полипептид, путём использования промотора, индуцируемого специфическим субстратом (индуктором). Более конкретно, данное изобретение относится к регуляции экспрессии гетерологического полипептида в бактериальной клеткехозяине, при которой эту бактериальную клетку-хозяина делают не способной деактивировать промотор, управляющий экспрессией указанного гетерологического полипептида в отсутствие индуктора.

Уровень техники

Важным аспектом при получении гетерологических полипептидов в рекомбинантном микроорганизме является выбор промотора, используемого для управления экспрессией гетерологическими последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют этот целевой полипептид.

Пригодный для этой цели промотор должен быть сильным, то есть вырабатывать соответствующую мРНК с высокой скоростью, позволяя вырабатывать большой объем полипептида. Кроме того, этот промотор должен легко подвергаться регуляции и запускать получение данного гетерологического полипептида только после индукции.

Однако существует сложность, заключающаяся в том, что обычно индуцирующий субстрат представляет собой питательное вещество для данного микроорганизма и потребляется этим микроорганизмом. Однако когда используемая для культивирования этого микроорганизма среда истощается в этом индуцирующем субстрате, то данный микроорганизм деактивирует этот промотор, и, таким образом, экспрессия целевого полипептида прекращается. Во избежание нежелательного прекращения экспрессии генов этот индуктор должен добавляться в больших количествах и/или должен вводиться непрерывно. Потребность в значительных объемах индуктора повышает стоимость данного ферментационного процесса. Кроме того, является ограниченным использование эффективных промоторов, которые при этом требуют дорогостоящих индукторов.

Таким образом, для получения рекомбинантных полипептидов желательны клетки-хозяева, у которых активность промотора, управляющего экспрессией гетерологических полипептидов, не зависит от присутствия этого индуктора, но у которых экспрессия этого гетерологического полипептида тем не менее может чётко регулироваться.

Заявка на патент \УО 2006/133210 А2 относится к способу получения рекомбинантных пептидов в бактериальной клетке-хозяине с использованием промотора, индуцируемого маннитолом, арабитом, глюцитом или глицерином, при котором данную бактериальную клетку-хозяина делали не способной разрушать или метаболизировать названный индуктор. Согласно названному способу, ген или гены, кодирующие ферменты, требуемые для метаболизации данного индуктора, подвергаются генным модификациям или делеции в этом геноме, вследствие чего эта клетка не может осуществлять экспрессию, из своего генома, функционального фермента, необходимого для метаболизирования или разрушения данного индуктора. С целью обеспечения поглощения этого индуктора, не подвергаются модификации гены, относящиеся к переносу этого индуктора в данную клетку. Однако данный способ требует при этом добавления индуктора для катализа активации соответствующего промотора, управляющего экспрессией целевого полипептида. Наряду с этим накопление индуктора в данной клетке может отрицательно влиять на развитие этой клетки.

Многие бактерии способны использовать различные источники углерода. При наличии смеси источников углерода выбирается тот источник углерода, который способствует наиболее быстрому росту (первичный источник углерода). Одновременно с этим, под воздействием явления, называемого углеродной катаболитной репрессией (ССК), происходит ингибирование функций, задействованных при использовании вторичных источников углерода.

Кроме ССК, те специфические катаболитные гены, которые задействованы в использовании менее предпочтительного вторичного источника углерода, подвергаются экспрессии только в присутствии указанного вторичного источника углерода. В результате экспрессия генов, задействованных в катаболизме вторичного источника углерода, зависит от присутствия указанного вторичного источника углерода (индукция), и от отсутствия первичного источника углерода (катаболитная репрессия).

Публикация авторов Τί;·ιικ|ΐιί 8ии е! а1. Описание системы по использованию маннозы в ЬасШик 8иЬίίΐίδ, 1оитпа1 о£ Вас1етю1о§у, Атепсаи 8ос1е1у Ют М1стоЫо1о§у, νοί. 192, Αρτίΐ 1, 2010, стр. 2128-2139, относится к идентификации оперона маннозы и его генов, также как и промоторов РтапР и РтапК, регуляция которых осуществляется маннозой. Описано, что метаболизм маннозы зависит от системы фосфоенолпируват: углеводная фототрансфераза и что оперон маннозы дополнительно зависит от катаболитной углеродной репрессии. Для описания и идентификации функции отдельных генов были приготовлены нокаут-мутанты, у которых отсутствуют соответствующие гены и, следовательно, у них отсутствуют соответствующие белки, кодируемые указанными генами. Было выявлено, что удаление генатранспортёра маннозы тапР приводило к конститутивной экспрессии как от промоторов РтапР и РтапК, что указывает на то, что переносчик маннозы МапР обладает негативным воздействием на регуляцию оперона маннозы, так и от гена тапК, кодирующего маннозо-специфичный транскрипционный регулятор МапК.

- 1 024834

Авторы ТоЪкск е! а1. Регуляция Нс-оперона у ВасШик киЪ!Шк и описание потенциальных сайтов фосфорилирования белка-регулятора ЬгК. с помощью сайт-специфического мутагенеза, в 1оигиа1 о£ Вас!егю1о§у, νοί. 181, № 16,19 августа 1999 г., стр. 4995-5003, сообщают, что обмен аминокислоты, связывающей фосфорилгруппу, в области ΕΙΙΑ регулятора ЫсР другой аминокислотой приводит к активности регулятора мутанта ЫСР при отсутствии индуцирующего субстрата.

Авторы Оогке е! а1. Катаболитная углеродная репрессия у бактерий: Множество путей получения максимума из питательных веществ в Ыа1иге Ре\1е\У5. М1сгоЪю1о§у, νο1. 6, № 8, август 2008 г., стр. 613624, описывают штаммы-мутанты §1гер1ососси8, у которых отсутствует транспортёр маннозы ΕΙΙΑΒ, и влияние системы фосфоенолпируват : углеводная фосфотрансфераза. Показано, что транспортёр маннозы ΕΙΙΑΒ не ограничен только фосфорилированием маннозы, но также и фосфорилирует глюкозу, фруктозу и 2-деоксиглюкозу. Наряду с этим, показано, что даже при отсутствии транспортёра маннозы ΕΙΙΑΒ, манноза может забираться через специфический транспортёр фруктозы ΕΙΙ^ρρυ

Авторы Пеи18скег е! а1. Механизмы катаболитной углеродной репрессии у бактерий (Сиггеи! Ορίηюи ίη МюгоЪю1о§у, Сиггеп! Вю1о§у ЬТО, Великобритания, том 11, № 2, 1 апреля 2008 г., стр. 87-93) приводят общий обзор углеродной катаболитной репрессии в разных бактериях, например Ε.^1ί и В.киЪШк.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении используются эти механизмы регуляции катаболизма углерода путём получения бактериальной клетки-хозяина, при этом промотор, регулирующий экспрессию генов, участвующих в метаболизме вторичного источника углерода, не деактивируется при отсутствии своего соответствующего источника углерода, и согласно настоящему изобретению данный промотор только находится под контролем углеродной катаболитной репрессии.

Согласно настоящему изобретению, используемый промотор - это промотор, который регулирует использование вторичного источника углерода данной бактериальной клетки-хозяина.

В присутствии первичного источника углерода этот промотор подвергается ССР. Когда в среде, используемой для культивирования рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина, заканчивается первичный источник углерода или же концентрация первичного источника углерода падает ниже уровня, требуемого для ССР, ССР этого промотора больше не работает, и этот промотор автоматически начинает экспрессию генов, управляемых указанным промотором.

Настоящим изобретением обеспечивается получение рекомбинантной бактериальной клеткихозяина, в соответствии с ним данная рекомбинантная бактериальная клетка-хозяин способна использовать больше одного источника углерода, в соответствии с ним в катаболизме углерода этих источников углерода данной бактериальной клетки-хозяина участвует система фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза (РТ8) и ССР, в соответствии с ним данная бактериальная клетка-хозяин подвергается генетическим модификациям для предотвращения деактивации белка-регулятора транскрипции промотора, индуцируемого источником углерода, в отсутствие названного вторичного источника углерода, но под контролем ССР, в соответствии с ним данный источник углерода представляет собой вторичный источник углерода для данной бактериальной клетки-хозяина.

В соответствии с ещё одним аспектом настоящего изобретения данная рекомбинантная бактериальная клетка-хозяин согласно настоящему изобретению трансформируется вектором, содержащим гетерологическую последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, индуцируемым вторичным источником углерода, при этом данный промотор вектора управляется названным белком-регулятором транскрипции, для которого данная бактериальная клетка-хозяин была генетически модифицирована с тем, чтобы не быть подверженной деактивации в отсутствие конкретного соответствующего источника углерода.

Наряду с этим настоящее изобретение обеспечивает создание процесса пригодготовления гетерологических полипептидов путём культивирования рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, трансформированной вектором, который содержит последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую этот полипептид.

Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению при получении гетерологических полипептидов.

В соответствии с одним конкретным аспектом настоящее изобретение относится к режиму индукции генной экспрессии, требующему уменьшенное количество индуктора, и, в частности, при полном отсутствии индуктора. Согласно ещё одному специфическому аспекту, настоящее изобретение относится к системе экспрессии бактерий, пригодной для ферментации с высокой плотностью клеток.

В частности, предметом настоящего изобретения является способ получения гетерологического полипептида в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине, в котором используется рекомбинантная бактериальная клетка-хозяин, катаболизм источников углерода которой находится под контролем углеродной катаболитной репрессии и системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза, и которая генетически модифицирована так, что она не способна деактивировать белок-регулятор транскрипции, специфический для промотора, индуцируемого вторичным источником углерода при отсутствии индуцирующего вторичного источника углерода, и который содержит вектор с гетерологической последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей полипептид, оперативным путём связываемый с промото- 2 024834 ром, который индуцируется этим вторичным источником углерода и регулируется этим белкомрегулятором транскрипции, при этом указанный способ включает в себя этапы выращивания бактериальной клетки-хозяина в среде для культивирования клеток, причём последняя не содержит данного индуцирующего вторичного источника углерода, а содержит иной источник углерода, индуцирующий экспрессию указанного полипептида этим иным источником углерода в момент времени, когда концентрация этого иного источника углерода падает ниже уровня, необходимого для углеродной катаболитной репрессии, и извлечение этого полипептида из этих клеток или из данной клеточной культуры.

В дополнение к этому, предметом настоящего изобретения являются рекомбинантные бактериальные клетки-хозяева, пригодные для осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Например, настоящее изобретение относится к рекомбинантной бактериальной клетке-хозяину, катаболизм источников углерода которой находится под контролем углеродной катаболитной репрессии и системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза, и которая генетически модифицирована таким образом, что она не способна деактивировать белок-регулятор транскрипции, специфический для промотора, способного индуцироваться вторичным источником углерода при отсутствии индуцирующего вторичного источника углерода путём удаления из генома указанной бактериальной клетки-хозяина того гена, который кодирует переносящий фосфорилгруппу фермент ΕΙΙ, специфичный к белкурегулятору транскрипции, и который содержит вектор с гетерологической последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, который регулируется этим белком-регулятором транскрипции, по отношению к которому данная бактериальная клетка-хозяин генетически модифицирована с тем, чтобы быть не способной к деактивации, и в которой в названный вектор встроен ген, кодирующий данный специфический белок-регулятор транскрипции.

Кроме того, предметом настоящего изобретения является рекомбинантная бактериальная клеткахозяин, катаболизм источников углерода которой находится под контролем углеродной катаболитной репрессии и системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза, и которая генетически модифицирована таким образом, что она не способна деактивировать белок-регулятор транскрипции, специфический для промотора, способного индуцироваться вторичным источником углерода при отсутствии индуцирующего вторичного источника углерода путём генетической модификации генома указанной бактериальной клетки-хозяина того гена, который кодирует белок-регулятор транскрипции так, что этот белок-регулятор транскрипции, экспрессируемый указанным геном, не способен связывать фосфорилгруппу, переносимую ферментом ΕΙΙ, специфичным для указанного белка-регулятора транскрипции, и которая содержит вектор с гетерологической последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, который регулируется этим белкомрегулятором транскрипции, по отношению к которому данная бактериальная клетка-хозяин генетически модифицирована так, чтобы быть не способной к деактивации, и в которой в названный вектор дополнительно встроен модифицированный ген, кодирующий белок-регулятор транскрипции, не способный связывать фосфорилгруппу, переносимую соответствующим ферментом ΕΙΙ.

В соответствии с ещё одним аспектом настоящее изобретение относится к способу получения гетерологического полипептида путём культивирования рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина, при котором используется рекомбинантная бактериальная клетка-хозяин, катаболизм источников углерода которой находится под контролем углеродной катаболитной репрессии и системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза, и которая генетически модифицирована таким образом, что она не способна метаболизировать индуцирующий источник углерода промотора, индуцируемого источником углерода, при котором данный индуцирующий источник углерода является вторичным источником углерода для данной бактериальной клетки-хозяина, и которая содержит вектор с названным промотором, индуцируемым указанным вторичным источником углерода, и гетерологическую последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид, оперативным путём связанный с этим промотором, при этом названный процесс представляет собой периодическое культивирование с подпиткой, при этом после этапа периодического культивирования запускают индукцию добавлением первой порции индуцирующего вторичного источника углерода с одновременным началом подачи второй порции.

Другие задачи и преимущества станут очевидными для специалистов в данной области техники при рассмотрении нижеследующего подробного описания со ссылкой на прилагаемые иллюстрирующие чертежи и на приложенную формулу изобретения.

В соответствии с вариантом осуществления, относящимся к вышеописанному, индукция экспрессии целевого полипептида не зависит от присутствия индуцирующего источника углерода для данного промотора. Таким образом, данный вариант осуществления особенно целесообразен в том, что не требуется индуцирующего источника углерода. Однако с точки зрения экономичности было бы полезным также, чтобы можно было уменьшить количество источника углерода, требуемое для индукции данного промотора.

Таким образом, согласно одному альтернативному решению, предметом настоящего изобретения является способ получения целевого полипептида путём экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей указанный целевой полипептид, при котором данная экспрессия находится под контролем промотора, индуцируемого источником углерода, при котором процесс катаболизма данного индуци- 3 024834 рующего источника с помощью указанной бактериальной клетки-хозяина, которая будет трансформироваться с помощью вектора, несущего данный промотор и нуклеотидную последовательность целевого полипептида, прерывается или по крайней мере затягивается во времени.

Согласно настоящему изобретению, данный альтернативный вариант реализуется путём удаления или генетического изменения, в геноме данной бактериальной клетки-хозяина, названной нуклеотидной последовательности, кодирующей специфическую изомеразу индуцирующего источника углерода, которая преобразует данный индуцирующий источник углерода после переноса в эту клетку, во фруктозо-6фосфат. Изомеризация во фруктозо-6-фосфат - это первый этап в катаболизме источника углерода, как только данный источник углерода был перенесён в данную клетку. Прерывание или задержка во времени процесса изомеризации источника углерода означает, что этот источник углерода доступен для индукции в течение продолжительного периода времени. Таким образом, объём индуцирующего источника углерода может быть уменьшен.

В соответствии с одним примером, данный альтернативный вариант относится к индуцируемому промотору маннозы и к бактериальной клетке-хозяину для такого промотора, в котором в геноме данной бактериальной клетки-хозяина был удалён или генетически модифицирован ген, кодирующий маннозо6-фосфат-изомеразу, также называемую МапА, вследствие чего изомеризация маннозы, после её переноса в данную клетку, невозможна или, по крайней мере, затягивается во времени.

Краткое описание чертежей

На нижеследующих фигурах изображено фиг. 1 - схематически структура оперона маннозы с размещением и ориентацией соответствующих генов и промоторов, и их активация с помощью МапК, указываемого стрелками;

фиг. 2 - технологическая схема катаболизма маннозы с переносом в данную клетку, фосфорилирование маннозы в маннозо-6-фосфат во время переноса и преобразования во фруктозо-6-фосфат;

фиг. 3 - схематически структура белка-активатора МапК с различными областями и потенциальными сайтами фосфорилирования;

фиг. 4 - последовательность нуклеиновых кислот промоторной области у В.зиЬОПз. включающей в себя промотор тапК;

фиг. 5 - последовательность нуклеиновых кислот у В.киЬйНк, используемую в векторе промоторазонда ρδυΝ272.1 для изучения индуцируемости и катаболитной репрессии промотора тапР маннозой и глюкозой и определения сайта связывания МапК;

фиг. 6 - механизм катаболитной репрессии и активации в В.киЬййк через СсрА; фиг. 7 - плазмидная карта вектора экспрессии ρδυΝ279.2;

фиг. 8 - β-галактозидазная активность В.киМШк 3ΝΑ, содержащей плазмиды ρδυΝ279.2, ρδυΝ284.1 и ρδυΝ291 соответственно;

фиг. 9 - β-галактозидазная активность В.киЬйНк 3ΝΑ, содержащей плазмиду ρδΠΝ284.1, так же как и другие плазмиды, содержащие фрагменты различной длины последовательности нуклеиновых кислот, показанной на фиг. 5;

фиг. 10 - β-галактозидазная активность В.киМШк 3ΝΑ, содержащей векторы ρδυΝ291, ρδυΝ385.2 и ρδυΝ386.9 с последовательностями нуклеиновых кислот, как изображено на фиг. 4;

фиг. 11 - плазмидная карта вектора экспрессии ]эМ\У 168.1;

фиг. 12 - плазмидная карта инсерционного вектора ρδυΝ356.7 (ДтапР);

фиг. 13 - диаграмма, отображающая в логарифмическом виде концентрацию сухой биомассы, представленную в течение всего периода ферментации В.киМШк Т^356/ρМ\V168.1 (ДтапР-мутант), и сигнал флуоресценции (ΚΡυ), отображенный в виде кривой в течение всего процесса;

фиг. 14 - изображение содержания додецилсульфата натрия при электрофорезе в полиакриламидном геле (δΌδ-ΡΑΟΕ) клеточных проб, взятых при ферментации с В.зиЫШб Т^356/ρМ\V168.1. и фиг. 15 - технологическая карта с получением плазмиды ρМ^VI68.1.

Подробное описание изобретения

Нижеследующие определения понятий, используемых здесь, представлены в целях облегчения понимания настоящего изобретения.

Фермент ΕΙΙ, ΕΙΙ или переносчик относятся к пермеазе, специфичной к источнику углерода системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза (РТ§), которая катализирует транспорт и сопутствующее фосфорилирование этого источника углерода.

Система РТ§ содержит ряд ферментов ΕΙΙ, каждый из которых является специфическим для определённого источника углерода, например какого-то вида сахара.

Ферменты ΕΙΙ представляют собой комплексные соединения, обычно состоящие из трёх областей А, В и С и иногда из четвёртой области Ό, в которых ΕΙΙΑ и ЕПВ участвуют в фосфорилировании соответствующего источника углерода, а мембранная граница ЕПС (ΕΙΙΌ, если таковая присутствует) является медиатором перехода этого конкретного источника углерода в данную клетку.

При отсутствии этого специфического источника углерода соответствующий фермент ΕΙΙΑ и в некоторых случаях ΕΙΙΕ деактивируют соответствующий белок-регулятор транскрипции, специфичный к

- 4 024834 углеродному источнику, путём переноса фосфорилгрупп к соответствующим сайтам фосфорилирования, имеющимся в относящемся к ним белке-регуляторе транскрипции - в зависимости от области ЕП - ΕΠΆ и ΕΙΙΒ соответственно.

Белок-регулятор транскрипции или регулятор положительно регулирует (т.е. активирует) катаболитный оперон (опероны) этого специфического источника углерода. Белки-регуляторы транскрипции обычно содержат две сохраняющиеся регуляторные области, которые могут подвергаться фосфорилированию (регуляторные области РТ§ или фосфорилируемые регуляторные области ΡΚΌ). Кроме того, некоторые белки-регуляторы дополнительно содержат сайты дальнейшего фосфорилирования, относящиеся к ΕΙΙΑ и ΕΙΙΒ. В зависимости от белка-регулятора транскрипции этот белок-регулятор транскрипции деактивируется переносом фосфорилгруппы из фермента ΙΙ в один или более из вышеуказанных фосфорилсвязывающих сайтов в области ΕΙΙΑ и ΕΙΙΒ и/или ΡΚΌΙ и активируется переносом фосфорилгруппы из белка гистидина (НРг) в область ΡΚΌΙΙ. Все эти различные белки-регуляторы транскрипции, специфичные к источнику углерода, из системы РТ§ могут являться активаторами или антитерминаторами.

Вектор, способный к экспрессии в хозяине или вектор экспрессии - это конструкция на основе полинуклеиновых кислот, получаемая рекомбинантным путём или в результате синтеза, с целым рядом указанных элементов полинуклеиновых кислот, которые позволяют транскрипцию конкретной последовательности нуклеиновых кислот в клетке-хозяине. Обычно этот вектор включает в себя транскрипционную единицу, содержащую подлежащую транскрипции специфическую последовательность нуклеиновых кислот, оперативным путём связываемую с промотором. Вектор, способный к экспрессии в хозяине, может, например, представлять собой плазмиду с автономной репликацией или с саморепликацией, космиду, фаг, вирус или ретровирус.

Термины трансформация, трансформированный или вводящий нуклеиновую кислоту в клеткухозяина обозначают любой процесс, в котором внеклеточная нуклеиновая кислота, такая как вектор, с сопровождающим материалом или без него, входит в клетку-хозяина.

Трансформация соответствующих клеток-хозяев, например, с вектором экспрессии, может проводиться хорошо известными способами, такими как микроинъекция, электропорация, бомбардировка частицами, или химическими методами, такими как опосредованная через фосфат кальция трансформация, и с помощью природных систем трансформации, описанных, например, в работах авторов Машайке е! а1., Молекулярное клонирование, Лабораторный учебник, Лаборатория Со1б δρτίη§ НатЬот (1982 г.) или авторов Аи8иЬе1 е! а1., Рабочие протоколы в молекулярной биологии, изд. бойп \УПеу апб §опк (1984 г.).

Гетерологическая последовательность нуклеиновых кислот или последовательность нуклеиновых кислот, гетерологическая к хозяину обозначают последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует, например, продукт экспрессии, такой как полипептид, который является чужим для данного хозяина, гетерологическая экспрессия или гетерологический продукт, т.е. последовательность нуклеиновых кислот, источником которой является донор, отличный от данного хозяина, или химически синтезированная последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует, например, такой продукт экспрессии, как полипептид, который является чужеродным для этого хозяина. В случае, если хозяин представляет собой конкретную прокариотную разновидность, указанная гетерологическая последовательность нуклеиновых кислот предпочтительно происходит от иного рода семьи и более предпочтительно от иного отряда или класса, в частности от иного типа раздела) и наиболее предпочтительно от иной области (империи) организмов.

Гетерологическая последовательность нуклеиновых кислот, происходящая от донора иного, чем данный хозяин, может быть модифицирована перед её введением в данную клетку-хозяина путём мутаций, инсерции, делеции или замещений одиночных нуклеиновых кислот или части данной гетерологической последовательности нуклеиновых кислот до тех пор, пока такие модифицированные последовательности не будут демонстрировать ту же самую функцию (функциональный эквивалент), что и эталонная последовательность. Гетерологическая последовательность нуклеиновых кислот, как она понимается в данном описании, заключает в себе и нуклеиновые последовательности, происходящие от иной области (империи) организмов, например, от эукариотов (эукариотной природы), такой, например, как человеческие антитела, которые были использованы в библиотеке рисунков фагов, и у которых одиночные нуклеиновые кислоты или часть данных последовательностей нуклеиновых кислот были модифицированы в соответствии с правилами использования кодонов прокариотного хозяина.

Гетерологический полипептид или целевой полипептид в рамках смысла настоящего изобретения могут представлять собой гетерологический белок, происходящий от человека, млекопитающего или прокариота. Другие белки - это антигены, такие как гликопротеины и углеводы от микробных патогенов, как вирусных, так и антибактериальных, и от новообразований. Другими гетерологическими полипептидами являются такие ферменты, как химозин, протеазы, полимеразы, дегидрогеназы, нуклеазы, глюканазы, оксидазы, альфа-амилаза, оксидоредуктазы, липазы, амидазы, нитрил-гидратазы, эстеразы или нитрилазы.

Источник углерода относится к источнику углерода, обычно углеводу, который может отбираться и метаболизироваться бактериальной клеткой и который подвергается воздействию системы РТ§ и углеродной катаболитной репрессии (ССК), типичными примерами углеводов являются сахара и производ- 5 024834 ные Сахаров.

Многие бактерии могут использовать более одного углевода в качестве источника углерода и энергии. Благодаря использованию специфических внеклеточных ферментов, такие бактерии как ВасйП, способны разлагать несколько полисахаридов, которые присутствуют в значительном объеме в растительной биомассе. Получаемые в результате олиго-, ди- или моносахариды переносятся в эту клетку и далее перерабатываются. Обычно эти катаболитные ферменты, задействованные в метаболизме или разложении сахаридов, синтезируются только в присутствии этого специфического субстрата в культуральной среде, а предпочтительные источники углерода и энергии отсутствуют. Предпочтительный путь для транспорта углеводов для переноса углеводов через мембрану клетки бактерии - это РТ§.

В системе РТ§ транспорт углевода сквозь эту мембрану и последующее фосфорилирование осуществляются через посредство фермента, специфичного к указанному углеводу, относящемуся к ферменту II (ΕΙΙ). Так как ΕΙΙ служит медиатором при переносе его соответствующего источника углерода в клетку, то ΕΙΙ также называют переносчиком.

В присутствии смеси углеводов клетки селективно отбирают тот источник углерода, который обеспечивает их максимальной энергией и преимуществом роста (первичный источник углерода). Одновременно они подавляют разнообразные функции, задействованные в этом катаболизме, и отбор из этих менее предпочтительных источников углерода (вторичный источник углерода).

Обычно первичный источник углерода для большинства бактерий - это глюкоза, и в зависимости от бактерии, различные сахара и производные сахаров используются в качестве вторичных источников углерода. Однако первичный источник углерода также может представлять собой иное соединение. Например, в случае псевдомонад, первичным источником углерода может являться ароматическое соединение.

Вторичные источники углерода включают, например, маннозу, лактозу и мелибиозу, без ограничения этими последними.

В системе РТ§ все эти разнообразные катаболитные гены, участвующие в метаболизме этого специфического источника углерода, управляются белками-регуляторами транскрипции. Эти белкирегуляторы транскрипции могут действовать как антитерминаторы, и они активны только в присутствии специфического источника углерода (индуктора). Было выявлено, что ΕΙΙ оказывает отрицательное (деактивирующее) действие на свой соответствующий белок-регулятор транскрипции в результате переноса фосфорилгрупп в специфический сайт связывания, присутствующий в этом белке-регуляторе транскрипции.

При отсутствии первичного источника углерода и при наличии промотора, специфичного к индуцирующему источнику углерода, этот промотор активируется его соответствующим белком-регулятором транскрипции, и происходит экспрессия генов, находящихся под контролем этого промотора. При отсутствии индуцирующего источника углерода белок-регулятор транскрипции, регулирующий этот промотор, деактивируется переносом фосфорилгруппы из его ΕΙΙ на этот соответствующий сайт связывания на белке-регуляторе транскрипции, деактивируя таким образом этот промотор и прекращая экспрессию генов, находящихся под контролем указанного промотора.

Иным образом, при наличии предпочтительного первичного источника углерода -независимо от наличия или отсутствия менее предпочтительных вторичных источников углерода - экспрессия катаболитных генов указанных вторичных источников углерода подавляется с помощью ССР,

В общем, настоящее изобретение основано на ингибировании регуляции белка-регулятора транскрипции, специфичного к этому углеродному источнику при отсутствии указанного специфичного источника углерода. В частности, настоящее изобретение основано на предотвращении репрессии или деактивации переносом фосфорилгруппы через соответствующий фермент ΕΙΙ к белку-регулятору транскрипции.

Если предотвращается репрессия белка-регулятора транскрипции, специфичного к источнику углерода, то промотор, для которого данный белок-регулятор транскрипции является активатором, будет действовать, независимо от наличия источника углерода, являющегося индуктором для данного промотора. Таким образом, для экспрессии гена, находящегося под контролем такого промотора, не требуется индуцирующего источника углерода, и в дальнейшем процесс экспрессии этого гена будет непрерывным.

Из вышеизложенного следует, что в настоящем изобретении используется промотор, индуцируемый вторичным источником углерода, когда этот промотор находится под контролем системы РТ§ с одной стороны и с помощью ССР, с другой стороны.

В соответствии с этим целью настоящего изобретения является предотвращение деактивации индуцируемого источником углерода промотора, используемого в качестве промотора в экспрессии целевого полипептида, путём предотвращения деактивации белка-регулятора транскрипции, специфичного к указанному промотору.

Согласно первому подходу данная цель достигается прерыванием фосфорилирования белкарегулятора транскрипции его специфичным ферментом ΕΙΙ путём лишения способности связывания с указанной фосфорил-группой по крайней мере одного сайта связывания этого белка-регулятора транс- 6 024834 крипции для фосфорил-группы, переносимой ферментом ΕΙΙ.

С этой целью в геноме данной бактериальной клетки-хозяина можно подвергнуть генетической манипуляции ген, кодирующий этот белок-регулятор транскрипции, в результате чего этот ген будет обеспечивать экспрессию белка-регулятора транскрипции, который не способен связывать фосфорил-группу, переносимую из фермента ΕΙΙ.

В соответствии со вторым подходом фосфорилирование прерывается путем удаления из генома этой бактериальной клетки-хозяина, гена, кодирующего фермент ΕΙΙ, т.е. фермента, регулирующего активность белка-регулятора транскрипции.

Согласно настоящему изобретению, экспрессия гетерологического полипептида устанавливается под контроль промотора, который является специфичным к вышеописанному белку-регулятору транскрипции, для которого генетической модификацией бактериальной клетки-хозяина предотвращается деактивация переносом фосфорилгруппы через фермент ΕΙΙ.

Настоящее изобретение обеспечивает получение целесообразной системы выработки гетерологических полипептидов путём ферментации рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, трансформируемой вектором, содержащим гетерологическую нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, индуцируемым источником углерода, при этом данный промотор является активным даже при отсутствии индуцирующего источника углерода в данной ферментационной среде. Так как этот промотор, контролирующий экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей целевой полипептид, всё ещё находится под контролем углеродной катаболитной репрессии, то никакой экспрессии не происходит в присутствии первичного источника углерода, такого как глюкоза, однако индукция завершается автоматически, когда в этой системе иссякнет первичный источник углерода (автоиндукция). Так как активность промотора, контролирующего экспрессию этого гетерологического полипептида, не зависит от наличия индуцирующего источника углерода, в ферментационной среде индукция экспрессии целевого полипептида достигается без необходимости в индуцирующем источнике углерНодаас.тоящее изобретение выгодно в том отношении, что указанные рекомбинантные бактериальные клетки-хозяева можно выращивать до высокой плотности клеток в присутствии их первичного источника углерода, и как только будет достигнута необходимая плотность клеточной массы, автоматически запускается выработка целевых полипептидов при запуске катаболитной углеродной репрессии промотора, контролирующего экспрессию.

Ещё одним преимуществом настоящего изобретения является то, что доливное периодическое культивирование во время фазы периодического культивирования выработка целевого полипептида не происходит или почти не происходит, то есть имеет место мощная катаболитная репрессия.

Подходящими для данного изобретения бактериальными клетками-хозяевами являются такие, которые могут использовать более одного источника углерода, при этом использование этих различных источников углерода происходит при углеродной катаболитной репрессии, а транспорт источника углерода сквозь клеточную мембрану и её фосфорилирование находятся под воздействием системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза.

Бактериальные клетки-хозяева для настоящего изобретения могут быть грамположительными или грамотрицательными бактериями. Предпочтительными примерами являются те, которые относятся к рНу1иш РНпнсШек, и, в частности, те, которые принадлежат классу ВасПН. Специфическими примерами являются примеры рода ВасШик, такие как В.киЫШк, В.ату1ойци|Гас1епк, В.ПсНсшГогтк В.иаНо, В.теда1егшт и т.д., другие предпочтительные примеры включают в себя также 81гер1ососсик, 81арНу1ососсик, БасЮйасШик, ЕксНеНсЫа или другой вид Еп1егоЬас1епа, без ограничения вышеприведёнными.

Обычно РитюЫек являются грамположительными и имеют низкое содержание ОС. Под низким содержанием ОС понимается, что меньше 52% этих базовых пар в геноме бактерии являются парами ОС. Например, грамположительные бактерии, такие как ВасШик и С1ок1г|Шит, содержат 40% или меньше пар ОС в этом геноме.

Ещё подходящими бактериальными клетками-хозяевами являются брюшные бактерии, такие как принадлежащие к отряду Еп1егоЬас1епа1ек. Примерами таких брюшных бактерий являются те, которые относятся к грамотрицательным, как, например, рода ЕксНеНсЫа. Конкретными примерами являются штаммы Е.соН, такие как ΤΟΙ, ^3110, ΌΗ1, ХЬ 1-Синий и Огщапн.

Е.соН и брюшные бактерии содержат примерно 50% содержания ОС в геноме и поэтому они являются организмами с низким содержанием ОС.

Грамположительные и грамотрицательные организмы определяются в соответствии с хорошо известной процедурой окрашивания по Грамму. Грамположительные организмы - это такие, которые имеют фиолетовый цвет под стандартным окрашиванием по Грамму. Грамотрицательные организмы содержат контрастный краситель, а не этот первичный краситель по Грамму.

Существуют разные механизмы ССК в Р1гтюи1ек и в брюшных бактериях, которые были интенсивно изучены в ВасШик киНННк и Е.соН в качестве организмов-моделей (приводится ссылка, например, на Т8Ш1ке е! а1., Регуляция катаболизма углерода в ВасШик крешек, Лили. Кеу. МюгоЫок (2000) 54: 849880; Оогке В. е! 81й1ке. 1., Углеродная катаболитная репрессия в бактериях: многочисленные пути полу- 7 024834 чения максимума из питательных веществ, ΝαΙ. Кеу. ΜίοΓοόίοΙ. (2008) 6: 613-624; Со55е1 С. с1 а1., Транскриптомный анализ Сгр-зависимого катаболитного контроля экспрессии генов в Е^сНепсЫа сой, 1. Вас1епо1.. (2004) 186:3516 -3524, Маг0пе/-Ап1ошо А. е1 а1., Идентификация глобальных регуляторов в транскрипционных регуляторных сетях в бактериях Сигг. Θρίη. МюгоЪю1. (2003) 6: 482-489). Хотя общий механизм ССК и различен, но результат такой же, в частности в том, что в присутствии первичного источника углерода репрессируются все различные катаболитные опероны, участвующие в отборе и фосфорилировании вторичных источников углерода.

Рекомбинантная бактериальная клетка-хозяин согласно настоящему изобретению подвергается генетической модификации для предотвращения репрессии индуцируемого источником углерода промотора, управляющего экспрессией гетерологической последовательности нуклеиновых кислот, путём ингибирования деактивации специфичного промотору белка-регулятора транскрипции при отсутствии указанного индуцирующего источника углерода.

Таким образом, в рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине согласно настоящему изобретению индуцируемый источником углерода промотор, управляющий экспрессией гетерологической последовательности нуклеиновых кислот, испытывает только углеродную катаболитную репрессию. В присутствии первичного источника углерода экспрессия этого гетерологического полипептида подавляется от ССК.

Согласно настоящему изобретению промотор, индуцируемый источником углерода, находится в своём активном состоянии, вне зависимости от наличия индуцирующего источника углерода, если только углеродная катаболитная репрессия не будет стимулироваться более предпочтительным первичным источником углерода.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает получение гетерологического полипептида без необходимости иметь индуктор для индуцирования промотора, управляющего геном (генами), кодирующим (и) этот полипептид.

В общем, для данного изобретения подходят такие промоторы, которые находятся под воздействием системы РТ§ и ССК в бактериальных клетках. В частности, соответствующие транскрипционные белки-регуляторы являются активаторами или антитерминаторами для катаболитного оперона, находящегося под управлением названных промоторов. Такие промоторы известны в данной области техники. Примеры промоторов, пригодных для данного изобретения, приведены в нижеследующей таблице со ссылкой на соответствующий оперон:

Оперон	Регулятор а)	Тип б)	Индуктор	Организм
засРА	8асТ	АТ	сахароза	В.зиЬННз
засВ	5асУ	АТ	Сахароза	В.зиЫШз
Ъ§1РН	1ЛсТ	АТ	β-глюкозиды	В.зиЬННз
НсВСАН	ЫсК	А	олиго-р-глюкозиды	В.зиЪННз
ΙβνΰΕΡΰ засЬ	Ι.βνΚ	А	фруктоза	В.зиЬПНз
т1\АИ	мик	А	манит	В.зиЪННз
тапРА-)у'(1Р	МапК	А	манноза	В.зиЪННз
тапК	МапК	А	манноза	В.зиЪННз
Ъ%1РВ Ь&С	в§ю	АТ	β-глюкозиды	Е,соН
1асТЕСР	ЬасТ	АТ	лактоза	Ь.сазе1

а: белок-регулятор транскрипции б: А: активатор АТ: антитерминатор

Далее настоящее изобретение более подробно поясняется со ссылкой на оперон маннозы В.5иЪйЙ5.

В.5иЪйЙ5 может использовать множество различных моно- или ди-сахаридов в качестве источников углерода, таких как глюкоза, мальтоза, сахароза, манноза, маннит и фруктоза. Эти сахариды отбираются системой РТ§. Транспорт в клетку и фосфорилирование проводятся опосредованно через фермент ΕΙΙ, специфичный соответствующему сахариду.

Как и во многих бактериях предпочтительным источником углерода у В.5иЪйЙ5 является глюкоза. В присутствии глюкозы потребление другого сахарида в рамках системы РТ§ подавляется через ССК.

Структура оперона маннозы показана на фиг. 1, а транспорт маннозы в клетку и её катаболизм - на фиг. 2. Оперон маннозы у В.5иЪйЙ5 содержит три катаболитных гена (Кип51 Ρ.Ν. е1 а1., Полная последовательность генома грамположительной бактерии В.5иЪйЙ5, №киге (1997) 390: 249-256).

Первый ген - тапР, кодирует специфичный маннозе фермент ΕΙΙ, относящийся к МапР. МапР осуществляет перенос маннозы сквозь мембрану и одновременно с этим фосфорилирование маннозы до

- 8 024834 маннозо-6-фосфата. Второй ген - тапА, кодирует маннозо-6-фосфат-изомеразу, которая преобразует маннозо-6-фосфат в соответствующий фруктозо-6-фосфат. Функция третьего гена-у)йР пока ещё не известна. Выше по потоку и при одинаковой ориентации этих трёх генов размещён регуляторный ген тапК, который кодирует белок-регулятор транскрипции, относящийся к МапК.

Оперон маннозы является положительно регулируемым катаболитным опероном, и он управляется двумя разными промоторами. Один промотор - промотор тапК (РтапК) отвечает за белок-регулятор транскрипции МапК. Второй промотор - промотор тапР (РтапР) отвечает за транскрипцию генов тапРтапА-у)йР (совместно называемых тапРА-у)йР). В присутствии маннозы и при отсутствии глюкозы МапК связывается с РтапР и активирует экспрессию тапРА-у)йР. Удивительным образом было выявлено, что МапК является не только белком-регулятором транскрипции для промотора тапРА-у)йЕ но и является авторегулятором для самого тапК.

На фиг. 3 схематически изображена структура белка-регулятора транскрипции МапК и потенциальных сайтов фосфорилирования. Как изображено, МапК содержит две РКЭ (регуляторные области РТ8), одну область ΕΙΙΑ и область ΕΙΙΒ, также как и НТН (Область Спираль-виток-Спираль). Области РКЭ сохраняют регуляторные области, присутствующие в белках-регуляторах транскрипции, которые могут фосфорилироваться в ходе катаболизма углерода. Области ΕΙΙΑ и ΕΙΙΒ представляют собой сайты связывания фосфорилгруппы, переносимой через МапР, область ΕΙΙ - переносчик оперона маннозы. Область НТН представляет собой структурный мотив в белке, способном связывать ДНК.

В отсутствие индуктора маннозы ΕΙΙΑ и ΕΙΙΒ и, возможно, область РРО! от МапК фосфорилируется с помощью МапР, специфичного к маннозе фермента ΕΙΙ оперона маннозы, и таким образом теряет свою активность.

Следовательно, согласно первому подходу настоящего изобретения, предотвращается деактивация МапК при отсутствии индуктора, т.е. маннозы, если сайты фосфорилирования в ΕΙΙΑ и/или ΕΙΙΒ у МапК модифицируются или эти области удаляются, в результате чего он не может принимать фосфорилгруппу.

С этой целью ген тапК в геноме бактериальной клетки-хозяина, подвергается генетической модификации путём удаления или изменения соответствующей последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей соответствующий сайт (сайты) фосфорилирования в МапК.

Далее, согласно второму подходу настоящего изобретения, деактивация промотора оперона маннозы предотвращается прерыванием переноса маннозы, что может быть осуществлено делецией или инактивацией гена, кодирующего МапР, в геноме этой бактериальной клетки-хозяина.

Эти изменения могут выполняться путём изменения или делеции, в данной бактериальной клеткехозяине, кодирующей последовательности генов, кодирующих белки, участвующие в фосфорилировании белка-регулятора транскрипции, в данном случае, в опероне маннозы, тапК и/или тапР.

Такие генетически изменённые, выведенные из строя клетки-хозяева могут быть получены в соответствии с любым из разнообразных известных методов в данной области техники для такой цели. Например, гомологические рекомбинантные векторы, содержащие гомологические генные последовательности-мишени 5' и 3' мишеневой последовательности делеции нуклеиновых кислот, могут быть трансформированы внутрь клетки-хозяина. После гомологической рекомбинации может быть получена необходимая модифицированная клетка.

Методы модификации генов хорошо известны в данной области техники. Например, инактивация гена инсерцией полинуклеотида была описана, например, в работе авторов Койег ΌΧ с1 а1., Мутагенез с обменом маркера гена изофермента пектатлиазы в хризантеме Эрвиния», 1. ΒηεΚποΙ. (1985) 164 (1:5156). Специфические мутации или делеции в гене могут быть выполнены с использованием, например, кассетного мутагенеза, как описано в работе авторов ^Уе11з ЕА. е1 а1., Кассетный мутагенез: эффективный метод генерирования многочисленных мутаций в определённых сайтах», Сепе (1985) 34 (2-3): 315323; посредством которого в выбранном участке гена выполняются прямые или произвольные мутации, а затем они вводятся в хромосомную копию этого гена путём гомологической рекомбинации.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что промоторы, регулирующие оперон маннозы, в частности, РтапК и РтапРА-у)йР, представляют собой сильные промоторы, которые, таким образом, являются многообещающими кандидатами для получения гетерологических полипептидов. Однако манноза - источник углерода, индуцирующий эти промоторы, является дорогостоящим сахаром, который пока ещё сужает использование промоторов, индуцируемых маннозой.

Так как согласно настоящему изобретению для экспрессии гетерологического полипептида в бактериальной клетке-хозяине не требуется индуцирующего источника углерода для начала экспрессии, а также использование промоторов, таких как промоторы маннозы, что обеспечивает конкурентоспособность не только с точки зрения прочности, но и стоимости.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к использованию промоторов оперона маннозы РтапК и РтапРА-у)йР в качестве промотора для управления гетерологической последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей целевой полипептид в данной рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине согласно настоящему изобретению.

Последовательность нуклеиновых кислот от Β.δΐιΐΐίΐίδ, содержащая промоторную область промото- 9 024834 ра тапР, как это используется в различных векторах экспрессии, таких как ρδυΝ284.1, отображается на фиг. 5 с выделенным шрифтом сайтом инициации транскрипции на адениннуклеотиде, при этом блоки 35 и -10 курсивом и жирным шрифтом, а конец тапК отмечен стрелкой, и сайты рестрикции Вд/ΙΙ, ХЬа1, ΑίΙΙ, Νύοΐα ΝπιΓ подчёркнуты. Показан стартовый кодон информационного гена ΙαοΖ.

Последовательность нуклеиновых кислот, полученная от В.8иЬйЙ8, содержащая промоторную область промотора тапК, показана на фиг. 4, с выделенным сайтом инициации транскрипции, при этом блоки -10 и -35 представлены курсивом и жирным шрифтом, начало гена тапК показано стрелкой, и сайты рестрикции ΗίηάΙΙΙ приведены жирным шрифтом и подчёркнуты, а предполагаемая последовательность сге подчёркнута.

Под промоторными областями оперона маннозы понимают промоторные области, которые регулируют экспрессию тапРА-у_)йР, так же как и тапК, с участием или без участия последовательности сге.

Промотор тапРА-у)йР. как это приводится в данном описании, состоит главным образом из области -35, области -10 (блок Прибнова), сайта инициации транскрипции и сайта связывания МапК.

Промотор тапК, как это приводится в данном описании, состоит главным образом из области -35, области -10, сайта инициации транскрипции и сайта связывания МапК и, возможно, из последовательности сге.

Последовательность сге (катаболитный репрессивный элемент) представляет собой длинную последовательность дНК с 14 нуклеотидами, с которой связывается СсрА (катаболитный белок управления А), являющийся общим белком-регулятором ССК у НгписнЮх. Механизм катаболитной репрессии и активация в В.8иЫЛ18 показан на фиг. 6. Путём связывания СсрА, переводимого в комплексное соединение с помощью 8етш-46 фосфорилированного гистидинового белка НРг с последовательностью сге, этот промотор репрессируется. Это второй механизм катаболитной репрессии оперона маннозы. С помощью этого механизма экспрессия гена-регулятора тапК подавляется в присутствии глюкозы. В результате это ингибирует активацию промотора тапР. В присутствии глюкозы клетки отбирают глюкозу через ΡΐδΟ, представляющую собой ΡΤδ-зависимую систему переноса, сходную с транспортёром маннозы ΕΙΙ. В этой клетке промежуточные соединения фруктозо-6-фосфат (Рти-6-Р) и фруктозо-1,6-бифосфат (Рти-1,6ΌΡ) накапливают и стимулируют НРг-киназу. НРг-киназа (НРгк) фосфорилирует НРг на 8етш-46. 8ет-46НРг образует комплексное соединение с ДНК-связывающим белком СсрА, который связывается с так называемыми сайтами сге, присутствующими во многих катаболит-репрессируемыми и катаболитактивируемыми промоторами В.зиЬйНз. Находится ли сайт сге в прямом направлении последовательности промотора -10, или перекрывает эту последовательность -10, связывание комплексного соединения 8ет-46-НРг/СсрА ингибирует экспрессию от этого промотора. Эта ситуация выявлена на промоторе МапК (фиг. 4).

Последовательность нуклеиновых кислот, содержащая промоторную область МапРА-у_)йР, предпочтительно содержит последовательность нуклеиновых кислот с фиг. 5 от Ьр-80 до инициирующего кодона у Ι;κΖ (последовательность № 1), и более предпочтительно последовательность нуклеиновых кислот с фигуры 5 от Ьр-80 и включая Ьр-1, т.е. выше в обратном направлении относительно сайта инициации транскрипции А в точке Ьр+1 (последовательность № 2).

Последовательность нуклеиновых кислот, содержащая промоторную область тапК, предпочтительно содержит последовательность нуклеиновых кислот с фиг. 4 от Ьр-122 до инициирующего кодона у тапК (последовательность № 3), более предпочтительно последовательность нуклеиновых кислот с фиг. 4 от Ьр-122 и Ьр+7, т.е. включая предположительную последовательность сге (последовательность № 4), и, в частности, последовательность нуклеиновых кислот с фиг. 4 от Ьр-122 и Ьр-1, т.е. в обратном направлении относительно сайта инициации транскрипции О в точке Ьр+1 (последовательность № 5). Промоторные области как тапР, так и тапК содержат сайт связывания для белка-регулятора транскрипции МапК (на фиг. 4 обозначен как ΙΡΙ-К, а на фиг. 5 как ΙΗΙ-Р), который представляет собой активатор транскрипции для промоторов оперона маннозы.

В соответствии с ещё одним аспектом, настоящее изобретение относится к такой генетически модифицированной бактериальной клетке-хозяину, содержащей вектор с последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей необходимый полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, индуцируемым от источника углерода, в которой промотор этого вектора регулируется белкомрегулятором транскрипции, для которого данная бактериальная клетка-хозяин до этого была генетически модифицирована для исключения возможности её деактивации при отсутствии источника углерода, специфичного для указанного белка-регулятора транскрипции.

Что касается вышеупомянутого оперона маннозы, то промотором этого вектора может быть, например, РтапР или РтапРА-у_)йР, любой из последовательностей от номера 1 до 5, также как и любым элементом из вышеприведённой таблицы.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, в вектор, используемый в настоящем изобретении, может быть введён этот генетически модифицированный ген, кодирующий соответствующий белок-регулятор транскрипции, не способный связывать фосфорилгруппу, переносимую соответствующим ΕΙΙ. В результате в данной рекомбинантной бактериальной клетке-хозяине этот белокрегулятор транскрипции не только экспрессируется этим хромосомным геном, но и соответствующим

- 10 024834 геном, интегрированным в этот вектор, что приводит к более высокой концентрации белка-регулятора транскрипции и к улучшению индукции. Например, когда промотор этого вектора является промотором оперона маннозы, то ген тапК может быть интегрирован в этот вектор, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая область ΕΙΙ, была подвергнута делеции (таиКАЕПА).

Вектором, подходящим для настоящего изобретения, предпочтительно является автономно или самостоятельно реплицирующаяся плазмида, космида, фаг, вирус или ретровирус. Для настоящего изобретения может быть применено широкое разнообразие комбинаций хозяин/вектор.

Полезные экспрессирующие векторы, например, могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных и/или синтетических последовательностей нуклеиновых кислот.

Подходящие векторы включают векторы со специфическим диапазоном хозяев, такие как векторы, специфичные, например, к В.зиЬППв и Е.сой. соответственно, так же как и векторы с широким диапазоном хозяев, такие как векторы, полезные для грамположительных бактерий и грамотрицательных бактерий. Могут использоваться плазмиды со слабой репликацией, со средней репликацией, также как и с высокой репликацией.

Например, в В.8иЬПН8 плазмида со слабой репликацией - это рАМЬе!а1, плазмиды со средней репликацией - это производные рВ872, а плазмидой с высокой репликацией является рИВ110. Полезные векторы, например, для Е.сой, это рВК322, рИС18, рАСУС177, рАСУС184, рК8Р1010 и рВ\У22 или их производные, такие как плазмида рВЬЬ15 или плазмида рАКЬ15Е.

Генетически модифицированная бактериальная клетка-хозяин согласно настоящему изобретению не способна деактивировать белок-регулятор транскрипции, управляющий промотором при отсутствии индуцирующего источника углерода указанного промотора. Так как этот промотор вектора управляется тем же самым белком-регулятором транскрипции, что и соответствующий хромосомный промотор, продолжается экспрессия гетерологической последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей целевой полипептид, даже в отсутствие индуцирующего источника углерода.

Наряду с этим, предметом настоящего изобретения является способ получения гетерологического полипептида в генетически модифицированной бактериальной клетке-хозяине согласно настоящему изобретению, включающий в себя этапы:

а) культивирования в условиях, позволяющих экспрессию этого полипептида, генетически модифицированной бактериальной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, трансформированной вектором, содержащим последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид, оперативным путём связываемый с промотором, при этом промотор этого вектора регулируется белкомрегулятором транскрипции, который не может быть деактивирован при отсутствии источника углерода, специфичного для данного белка-регулятора транскрипции, и

б) извлечения этого полипептида из клеток или из клеточной культуры. Согласно настоящему изобретению экспрессия целевого полипептида запускается автоматически в момент времени, когда в культуральной среде заканчивается первичный источник углерода или же концентрация первичного источника углерода падает ниже уровня, требуемого для ССК.

Чтобы дать возможность клеткам расти после индукции, первичный источник углерода может подаваться в культуральную среду в дальнейшем, на уровне, который не позволяет углеродную катаболитную репрессию. Например, первичный источник углерода вводится в количестве, которое немедленно потребляется клетками, в результате чего в культуральной жидкости практически отсутствует первичный источник углерода, который мог бы стимулировать ССК.

В общем, можно сказать, что если объём первичного источника углерода, присутствующий в среде, превышает 1,0 г/л, то наблюдается углеродная катаболитная репрессия, тогда как если объём составляет 0,01 г/л или меньше, то углеродную катаболитную репрессию не наблюдают.

Так как граница углеродной катаболитной репрессии и индукции промотора коррелирует со скоростью роста клеток, которая в свою очередь находится в определённой связи с объёмом первичного источника углерода, вводимого в эту среду или присутствующего в этой среде, то объем первичного источника углерода, который не вызывает углеродную катаболитную репрессию, можно регулировать путём контроля за скоростью роста. Если при заданной скорости роста происходит углеродная катаболитная репрессия, то объем первичного источника углерода, добавляемый к среде, должен быть уменьшен, в результате чего уменьшится скорость роста до величины, при которой не будет отмечаться углеродная катаболитная репрессия.

Для большинства ферментационных процессов на стадии индукции целесообразна корректировка добавления первичного источника углерода до определённого объема, что приводит к удельной скорости роста μ < 0,2 ч^-1.

В любом случае, для конкретного ферментационного процесса опытным путём легко определяется подходящее значение для удельной скорости роста μ.

Применяемые векторы, так же как и построение и трансформация хозяина соответствуют вышеописанным.

В качестве системы культивирования клеток непрерывное или периодическое культивирование, та- 11 024834 кое, как периодический метод или периодический с подпиткой, может быть реализовано в пробирках, встряхиваемых колбах или в ферментёрах для культивирования микроорганизмов и т.д. Предпочтительно на стадии индукции, когда экспрессируется целевой полипептид, первичный источник углерода вводится по экспоненте в культуральную среду.

Для культивирования генетически модифицированных бактериальных клеток-хозяев могут использоваться обычные среды, как это известно в данной области техники, такие как комплексные среды, так называемая среда на питательном бульоне с дрожжами, представляющая собой содержащую глицерин среду, как это описано авторами Κοήζ е! а1., ί. Вю1есйпо1. (1955) 39:59-65, среду с минеральными солями, описанную авторами Ки11а е! а1., Агсй. М1сгоЪю1. (1983) 135: 1, среду ЬВ, описанную авторами Вейаш е! а1., 1. Вас1егю1. 1951) 62: 293-300, или среду для периодического культивирования для ферментации Е.сой, как описано авторами ^йтк е! а1., Вю1есйио1. Вюеид. (2001) 73: 95-103.

Эта среда содержит подходящий источник углерода, например сахар, такой как глюкоза, для выращивания клетки-хозяина до необходимой клеточной плотности. В качестве источника углерода для соответствующей клетки-хозяина используется первичный источник углерода, который отличается от индуктора, каким является вторичный источник углерода для указанной клетки-хозяина.

Эта среда может быть модифицирована необходимым образом, например, добавлением дополнительных ингредиентов, таких как буферные растворы, соли, витамины, аминокислоты, антибиотики или другие микроэлементы, каковые общеизвестны для специалистов в данной области техники. Также могут использоваться различные среды или комбинации сред во время культивирования этих клеток.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, к культуральной среде добавляют казаминовые кислоты. Было выявлено, что присутствие казаминовых кислот в этой среде может помочь в подавлении экспрессии по уровню основности.

Обычно казаминокислоты могут добавляться в объёме от 0,05 до 0,1% (вес./об.).

В соответствии с одним вариантом данного способа получения гетерологического полипептида может использоваться бактериальная клетка-хозяин, содержащая гены, кодирующие оперон маннозы в её геноме, то есть для которой манноза является вторичным источником углерода и для которой, например, глюкоза является первичным источником углерода. Для того чтобы подходить для данного способа, эта бактериальная клетка лишается способности деактивировать белок-регулятор транскрипции, контролирующий промоторы оперона маннозы.

Например, нуклеотидную последовательность тапР, кодирующая МапР, можно удалить, ингибируя таким образом деактивацию МапР фосфорилированием через МапР.

В бактериальную клетку-хозяин с удалённым тапР вводят вектор, содержащий промотор РтапР или промотор РтапР, оперативным путём связанный с последовательностью нуклеиновых кислот, кодирующей целевой полипептид.

Рекомбинантную бактериальную клетку-хозяин выращивают в культуральной среде, подходящей для указанной бактериальной клетки-хозяина, при этом эта культуральная среда может содержать глюкозу, и/или глюкоза может вводиться в эту культуральную среду в объёме, достаточном для размножения этой бактериальной клетки-хозяина и для подавления экспрессии целевого полипептида вследствие углеродной катаболитной репрессии - через посредство глюкозы - промотора маннозы, содержащегося в векторе.

Как только уровень глюкозы в среде упадёт ниже значения, требуемого для углеродной катаболитной репрессии, углеродная катаболитная репрессия промотора маннозы этого вектора пропадает, и промотор маннозы начинает экспрессию этого полипептида без необходимости индукции маннозой. Кроме того, так как в бактериальном геноме последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая МапР, удалена, то промотор маннозы не может деактивироваться в результате фосфорилирования через МапР. Таким образом, способ согласно данному изобретению позволяет осуществить экспрессию целевого полипептида под контролем промотора, индуцируемого специфическим источником углерода, без наличия индуцирующего источника углерода.

Обычно во время фазы индукции в ходе ферментационного процесса с использованием бактериальной клетки-хозяина, трансформированной вектором, содержащим промотор оперона маннозы, в ферментационную среду может вводиться глюкоза, являющаяся первичным источником углерода этих промоторов оперона маннозы, в количестве, обеспечивающем удельную скорость роста μ < 0,2 ч^-1. Кроме того, предпочтительно вводить экспоненциальное количество.

В принципе, пояснения, приведённые выше в отношении первого альтернативного варианта настоящего изобретения, совсем не требующего индуцирующего источника углерода для индуцирования промотора, также применимы и ко второму альтернативному варианту настоящего изобретения, в соответствии с которым снижено количество источника углерода, требуемое для индукции.

Настоящее изобретение целесообразно в том, что промоторы, контролирующие экспрессию гетерологической последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей целевой полипептид, обеспечивают точную регуляцию.

Добавление или присутствие индуцирующего источника углерода не требуется.

Согласно первому альтернативному варианту настоящего изобретения промотор находится в ак- 12 024834 тивном состоянии без индуцирующего источника углерода, то есть в отсутствие индуктора.

Промотор маннозы РтапР оперона маннозы В.киЪбйк, как было доказано, является сильным промотором. Подробное описание этого оперона маннозы приведено в работе авторов §ии Τ. Εΐ а1., Определение характеристик системы использования маннозы в ВасШик киЪббк 1. Вас1етю1. 192, 2010, 2128-2139, которая включена в настоящее описание в виде ссылки.

Надёжный контроль свойств экспрессии генов с помощью РтапР делает этот промотор пригодным для гетерологического получения ценных полипептидов. Однако с помощью настоящего изобретения было выявлено, что система экспрессии В.киЪбйк, в которой задействован оперон маннозы, требует большого объёма маннозы для получения постоянно высоких скоростей экспрессии. Мы считаем, что причина быстрого потребления маннозы в качестве индуктора состоит в том, что манноза - это один из предпочтительных источников углерода для В.киЪбНк. Однако манноза является довольно дорогостоящим сахаром, что делает такую систему экспрессии экономически нереализуемой для промышленных установок большого объема.

В целях оптимизации такой системы экспрессии для промышленного применения, этот индуктор не должен метаболизироваться.

Согласно настоящему изобретению, это достигается путём модификации или предпочтительно разрыва гена тапА маннозо-6-фосфат изомеразы в хромосомном геноме клетки-хозяина для лишения этой клетки-хозяина способности преобразовывать исходный маннозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат, что впоследствии вызывает гликолиз.

Такая система экспрессии требует намного меньший объём индуктора и, тем не менее, могут быть достигнуты высокие скорости экспрессии.

Как описано выше, конкретная целесообразная система экспрессии будет такой, что она является самоиндуцируемой, это такая система, которая не требует больше никакого индуктора. Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения такую самоиндуцируемую систему экспрессии получают путём лишения способности к деактивации гена тапР в опероне маннозы генома бактериальной клетки-хозяина в отношении белка-регулятора МапК в результате предотвращения фосфорилирования областей Е11В и аналогичных ΕΙΙΑ у МапК через МапР.

Предпочтительно хромосомный ген тапР удаляется (нокаутированный мутант).

В такой системе экспрессии промотор РтапР находится только под регуляторным контролем от ССК, осуществляемым с помощью глюкозы. До тех пор, пока глюкоза не начнёт ограничивать, регулятор МапК сможет связываться со своей системой оператора и начнёт эту экспрессию. Такая самоиндуцируемая система экспрессии очень ценна для промышленных случаев применения, так как в виртуальном смысле не происходит преждевременной экспрессии гена.

Например, при периодическом ферментационном культивировании с подпиткой в виртуальном плане не наблюдается нежелательной экспрессии на фазе периодического культивирования, и не требуется добавления никакого индуктора для достижения высоких уровней экспрессии в течение всей фазы периодического культивирования с подпиткой. Такая система экспрессии особо подходит для ферментации высоких объемов клеток и позволяет достичь высоких уровней экспрессии.

Новая система экспрессии, созданная настоящим изобретением, в частности, новая система автоиндукции, действительно вносит значительный вклад в улучшение выхода продукта и в снижение затрат, связанных с её техническим применением.

Как показано в нижеследующих примерах, настоящее изобретение обеспечивает получение гетерологических полипептидов путём культивирования генетически модифицированной бактериальной клетки-хозяина согласно настоящему изобретению, при котором во время выращивания генетически модифицированных бактериальных клеток-хозяев и до индукции, происходит очень слабая - или совсем не происходит - преждевременная экспрессия полипептида, то есть фактически нет утечки промотора, контролирующего экспрессию генов, кодирующих этот полипептид. Кроме того, получение полипептида начинается сразу же после автоиндукции с высокими уровнями производительности с высокой конечной производительностью.

Также приведён пример дальнейшего альтернативного варианта настоящего изобретения, в котором в геноме бактериальной клетки-хозяина, несущей вектор с индуцируемым маннозой промотором и гетероциклических нуклеиновых кислот, осуществляют делецию гена, кодирующего маннозо-6-фосфат изомеразу.

Вышеприведённое описание будет понятным более полно при ознакомлении с нижеследующими примерами. Такие примеры, однако, являются показательными в отношении способов практического осуществления настоящего изобретения, и они не ограничивают объём данного изобретения.

I) Выделение и идентификация промоторных областей промотора тапК и промотора тапР оперона маннозы

Если не указано иное, то были использованы следующие материалы и методы:

Бактериальные штаммы и условия роста

В качестве главных хозяев для клонирования и экспрессии использовали Е.сой 1М109 (УашксйРеггоп С. е1 а1., Оепе 33,1985,103-119) и ВасШик киЪИНк 3ΝΑ, не образующий спор штамм В.киЪбНк с му- 13 024834 тацией в гене δροΟΑ (ΜίοΗοΙ ГР. с1 а1., 1. Αρρί. Вас1епо1. 33,1970, 220-227). Дополнительными штаммами, используемыми для экспериментов с ферментацией, были В.знЫШз 3ΝΑ, штаммы-мутанты ТЭ281 (δροΟΑ Δ тапА:: егтс) (8ип Т. е1 а1., 1. Вайегю1. 192,2010, 2128-2139) и ТО356 (δροΟΑ Δ тапА:: егтс) (см. ниже II, Эксперимент 4, б).

Штаммы выращивали при 37°С в среде ЬВ (Вейот О., 1. Вас1егю1. 62, 1951, 293-300).

Условия селекции были следующими: 100 мкг мл^-1 ампициллина, 100 мкг мл^-1 спектиномицина, 5 мкг.мл^-1 эритромицина.

Для индукции промотора маннозы добавляли стерильную фильтрованную или автоклавированную Ό-маннозу до конечной концентрации 0,2 % вес./об.

Материалы

Все химикаты были получены от компаний Сигма-Олдридж (Тауфкихен, Германия), Флука (Бухс, Германия) или Мерк (Дармштадт, Германия). Олигонуклеотиды с синтетической ДНК были приобретены у компании Еитойпз М\УО Ορе^οη (Эберсберг, Германия). Ферменты рестрикции и ДНКмодифицирующие ферменты были приобретены у компании КосНе ΑρρΧά 8с1епсе (Маннгейм, Германия) или Νον Епд1ап6 Вю1аЪз (Франкфурт-на-Майне, Германия).

Полимеразно-цепьевые реакции (РСК) проводили с использованием полимеразы с высокодостоверной ДНК от компании Регтейаз (8Т. Ьеоп-Κοΐ, Германия) на ферментёре М1тСус1ет ТМ от компании М1 КезеагсН 1пс. (Уолтан, Массачусетс, США).

Приготовление ДНК и трансформация

Выделение ДНК из Е.соП и В.зиЪййз или из геля агарозы проводили с помощью комплектов приготовления ДНК компании О1адеп (Нт16еп, Германия) или КосНе (Маннгейм, Германия), как описано изготовителем. В ходе выполнения всех примеров использовали стандартные молекулярные методики.

Е.сой трансформировали с помощью ДНК плазмиды согласно описанному авторами СНипд СТ. е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Αсаά. δα. υδΑ 86, 1989, 2172-2175. В.зиЪ!Шз трансформировали с помощью ДНК плазмиды в соответствии с модифицированным Парижским методом (Натбетооб С.К. Молекулярнобиологические методы для ВасШиз, 1990, 1оНп \УПеу & δοπδ Б-Ιά.. Англия).

Измерение β-галактозидазной активности 0,1 мл исследуемых клеток обрабатывали в 900 мкл буферного раствора Ζ и 10 мкл толуола в течение 30 мин при 37°С. β-галактозидазную активность определяли с помощью о-нитрофенил-в-галактопиранозида при 22°С согласно методике Миллера (МП1ет 1.Н., 1972, Эксперименты в молекулярной генетике, Со16 δρηπβ НагЪог, Нью-Йорк).

Используемые олигонуклеотиды (праймеры)

Таблица 1

Олиго- нуклеотид	Последовательность	Цель
54693	5’-ААА ААА АСС ССТ СТТ ТАА АСТ САА ТТТ СТС СТС ААТ АТА СА-3’	Амплификация РСК фермента МапК от ВлиЬННз
54694	5’-ААА ААА ТСТ АСА ААС ТСТ САА ТАА ТАА САТ СТТ С-3’	Амплификация РСК фермента МапК от Β.ιιώΐίΐϊί
54802	5’-ААА ААА АСТ АСТ СТТ ТАА АСА ССС ААА ААТ ССС ТТТ АТТ АС-3’	Прямой праймер для амплификации РтапР

- 14 024834

$4833	5’-ΑΑΑ ААА СТТ ΤΑΑ АСС ССТ ССС САА ТСС ССА Т-3’	Амплификация $рс из плазмиды ρϋΟ1730
$4835	5’-ААА ААА САА ТТС АТТ АСА АТС ААТ АТТ ТСС САА АТ-3’	Амплификация $рс из плазмиды ρϋΟ1730
$4956	5’-ААТ ТСС СТС САС АСС ССТ СТО ССТ СТС СТС СТТ ТТТ ТСС АТС ССС ССС ССА ССТ ССС ТАС СС-3’	Инсерция терминатора (иГА
54957	5’-ТТА АСС СТА ССС АСС ТСС ОСО ССС ОАТ ССА ААА ААС ОАО АСС САС АОО СОТ СТС ОАС ОС-3’	Инсерция терминатора ш/А
55006	5’-Су5-ТАО ССТ ТТТ ТТА ТАО ТТО ТТС АОС САС ТСТ-3’	Меченый праймер для расширения праймера
55007	5’-Су5-АТС САС ОСС ΑΤΑ АТО САТ ОСС ОСС АТТ ААТ-3’	Меченый праймер для расширения праймера
$5019	5’-Па аеС ТСТ ТАА ОСАО ОАТ ТТТ АОА АТО ОТС ААА ОАА АААТТСв-З’	ΤΙ-область у (иГА
55020	5’-(Ш аеО ААТ ТТТ ТСТ ТТА ОСС АТТ СТА ААА ТСС ТСС ТТА АОАОв-З’	ΤΙ-область у 1иГА (дополн.)
$5069	5’-ААА ААА ОАА ТТС ОАТ АТС АОА ТСТ АСС СОТ ТАА ССС ООО С-3’	РСК гена устойчивости к эритромицину
$5070	5’-ААА ААА САА ТТО ААТ СОА ТТС АСА ААА ААТ АСО-3’	РСК гена устойчивости к эритромицину
55071	5*-ААА ААА АОА ТСТ САТ ООС АОО ОСТ ТОА ОАА-3’	Делецня пгапА
55072	5’-ААА ААА ОАА ТТС ТТА ТТТ АСС ТСТ ОТО СТТ СТТ-3’	Деления тапА
55097	5’-Су5-САСТОТАСССТАТСТОССААА-3’	Меченый праймер для расширения праймера
$5098	5’-Су5-АТТОАОАТААТССТСОАТСАСТТ-3’	Меченый праймер для расширения праймера
55139	5'-ааа ааа ΐ£3 1са ТТА СТТ ОТА САС СТС ОТС-31	Г-праймер РтапР-еОРР

- 15 024834

55156	5’-ааа ааа (§а (са сс§ £1С САТ ТСС САС АТТ ААА СО-3’	г-праймер РтапР-еСРР
«5203	5’-САТАТССТОСАССАТССТС-3’	Обратный праймер для амплификации РтапР для изучения промотора
55208	5’-СОТАССАТТСТТССТСААТА-3’	Амплификация области РтапК'от ρδυΝ279.2
55209	5’-СТТААОССТОТСАОТАТСТАСТТОАО'3 ’	Амплификация области РтапК' от ρ8υΝ279.2
55234	5’-ааа ааа сс§ СТС СТС ТТС СТА АСС АТС СТ-3’	Реп. Г-праймера (рОВ110)
55235	5’-ааа ааа §аа -(ТС САС АТС АСС ОАА ТСА ОТТ Т-3'	Реп. г-праймера (риВ110)
55236	5’-ааа а§А АТТ ААА ССА ОСА АТТ САА ДАТ ССС АСА	ΤΙ-область у §а1В
	САА ТАА САА А§-3’
55237	5’-®а1 ссТ ТТС ТТА ТТС ТСТ ССС АТТ ТТС ААТ ТСС ТСС ТТТ ААТТс-3’	ΤΙ-область у ξίΐΒ (допаян)
«5262	5’-ААА’ААА ОСТ АСС ОТТ ТАА АСА ААА АСС ОАТТ ТТА АТС АССТО-З’	Прямой праймер для амплификации РтапР
55362	5’-ССТ АСС ССС ССС ТАС ССТ ОСА ТСС АТС АСА А-3’	Делеция тапР
55363	5’-АСТ ЛОТ ОАА ТТС СТТ ТТС САА ТСС СА-3’	Делеция тапР
55407	5’-ААА ААА ССС ССС ССТ АСС ТОО АСА АТА ТАА ССС ТТ- 3’	Делеция тапР
$5408	5’-АСА СТС СТТ ААС ТСТ АСА АА-3’	Делеция тапР
«5617	5’-ООА ССС САС ААА АСА ССТ А-3’	Делеция тапР
$5618	5’-ААА ААА САТ АТС ТСА АСА ААА ТСС ССС ОСТ ТТ-3’	Делеция тапР
55932	5’-А А А ААА ССТ АСС ОТТ ТАА АСА ОТА ТАА ААА ТСС СТТ ТТТ ТСС-3’	Прямой праймер для амплификации РтапК
55933	5’-ААА ААА ССТ АСС ОТТ ТАА АСС ОСА АСС ТТС СОТ ААА АА-3’	Прямой праймер для амплификации РтапК
55934	5’-СТС САС САС СТС СТТ АТС-3’	Обратный праймер для амплификации РтапК

Эксперимент 1:

Выделение фрагмента ДНК, несущего промоторные области оперона маннозы, и определение сай- 16 024834 тов инициации транскрипции промотора таиР и промотора таиР.

Хромосомную ДНК ВасШик киЪбйк 168 выделяли с использованием комплекта для крови и тканей ОЫеаку компании Ц1адеи (Хильден, Германия).

Фрагмент ДНК размером примерно 2,3 кб с полным геном таиР и с промотором таиР и с межгенной областью между таиР и таиР с промотором таиР амплифицировали из полученной ДНК с помощью РСР с использованием праймера к4693/к4694.

Полученный фрагмент ДНК размером примерно 2,3 кб использовали для эксперимента по удлинению праймера с целью определения сайтов инициации транскрипции промотора таиР и промотора таиР.

Для выделения тРНК для первого удлинения был сконструирован шаттл-фактор из вектора Н.соП ρΚ’20ΗΕ (Α1Ρώ^Η^Γ е! а1., 1992, МеШобк Εиζутο1. 216, 457-466) и вектора В.киШШк риВ110 (МасКеи/1е е! а1., 1986, Р1акт1б 15, 93-103). Этот вектор содержал ген 1ук в качестве информационного гена, который кодирует зрелую форму лизостафина из 8!арйу1ососсик к1ти1аик (Реска1 е! а1., 1987, Ргос. №Ш. Αсаб. 8с1. υδΑ 84, 1127-1131).

В эту производную риВ110 с высоким качеством копии клонировали в обратном направлении относительно гена лизостафина фрагмент ДНК на 2,3 кб. Полученную плазмиду назвали р8иЫ178.4 и вводили её в ВасШик киЪбкк 3ΝΑ.

ВасШик киЪ!Шк 3ΝΑ с плазмидой р8иМ78.4 выращивали в среде ЬВ с канамицином. На экспериментальной фазе роста эту культуру индуцировали с помощью 0,2% вес/об. маннозы. Через 1 ч роста при 37°С собирали урожай индуцированных и неиндуцированных клеток. Общую РНК выделяли с помощью миникомплекта Р1адеи-Р№аку.

Использовали праймеры к5006, к5007, к5097 и к5098, меченые с Су5 на окончании 5'. Праймер к5006 и к5007 подвергали гибридизации соответственно из +21 до +50 и от +76 до +105 относительно стартового кодона гена лизостафина. Праймер к5097 и к5098 подвергали гибридизации соответственно от +81 до +101и от +131 до +153 относительно стартового кодона у таиР.

Для реакции секвенирования плазмиды ДНК от р8иШ78.4. которая служила в качестве стандарта размера, использовали те же самые праймеры. Для обратной транскрипции и секвенирования ДНК использовали ЛМУ-обратную транскриптазу и Т7-ДНК полимеразу от компании РОСНБ. Продукты обратной транскрипции и секвенирования анализировали на денатурирующем полиакриламидном геле для секвенирования (Поставщик ΟΕ йеа1Шсаге). Все другие использованные реагенты поставлялись от компании Амершам Фармация Биотех в комплекте для секвенирования ЛШогеаб.

Сайт инициации транскрипции у промотора тапР определяли с использованием праймера к5006. Реакции последовательности ДНК плазмиды ρ8υN 178.4 с тем же самым праймером готовили и проводили на том же самом денатурирующем геле для сравнения. На фиг. 5 показана последовательность ДНК вокруг промотора таиР с выделенным сайтом инициации транскрипции в точке А (аденин-нуклеотид). При этом отслеживаемые блоки -10 и -35 приводятся курсивом, окончание гена таиР отмечено стрелками, а сайты рестрикции для Вд|11 №ц1, ХЪа1, №е1 Αί|11 подчеркнуты. ΙΗΙ-Р указывает на несовершенную инвертированную повторяющуюся последовательность, то есть предположительный сайт связывания МаиР.

Сайт инициации транскрипции промотора таиР определяли при выполнении выделения РНК и секвенирования ДНК согласно вышеописанному в отношении промотора тапР, за исключением того, что использовался праймер к5098, который связывается в гене таиР.

На фиг. 4 последовательность ДНК промоторной области таиР показана с выделенным сайтом инициации транскрипции в О (гуанин-нуклеотид), отслеживаемые блоки -10 и -35 приводятся курсивом, а начало гена таиР соответственно отмечается стрелкой. Сайты рестрикции и предположительная последовательность сге подчеркнуты. ΙΗΙ-Р указывает на несовершенную инвертированную повторяющуюся последовательность, то есть предположительный сайт связывания МаиР.

Транскрипция из промотора таиР и в частности из промотора таиР была существенно увеличена при индуцировании этих клеток маннозой, как это было отмечено более сильными сигналами в эксперименте по удлинению праймера.

Использованные праймеры показаны в нижеприведенной табл. 1.

Эксперимент 2.

Эксперимент по удлинению праймера согласно эксперименту 1 определил местоположение сайта инициации транскрипции промотора таиР вблизи окончания 3' межгенной области между таиР и началом таиР. Для более точного определения промоторной области тапР, фрагмент ДНК 2.3 кЪ укорачивали пошагово с помощью амплификации по процедуре РСР, при этом на полученных фрагментах последовательностей различной длины проводили обратное клонирование до того же самого базового вектора экспрессии, и исследовали экспрессию.

а) Построение базового вектора экспрессии

Конструировали вектор экспрессии с промотором Ι;κΖ в качестве информационного гена. Этот вектор экспрессии был создан в качестве шаттл-вектора, способного реплицироваться как в В.киШШк, так и в Ε.^Η, и был назван р8иШ72.Е

Информационный ген Ι;κΖ вырезали с помощью Ше1 и Хта1 из ρ^Α2 (авторы На1б1таии Α. е! а1.,

- 17 024834

2001, 1. Вас1ег1о1. 183, 6384-6393) и соединяли в ρ1ΘΕ5531.1, являющимся дериватом индуцируемого рамнозой вектора экспрессии ρ\νΑ21 (авторы ХУедегег е! а1., 2008, ВМС. В1о!есЬпо1. 8,2), который содержал терминатор транскрипции ΙιιΓΛ из В.§иЪ!Ш§ на сайте Хта1. В эту плазмиду вводили пару олигонуклеотидов §4956/4957 между сайтами рестрикции ЛД11Мип1 с целью добавления того же самого терминатора транскрипции ΙιιΓΛ в обратном направлении от ΕκΖ. Поэтому сплошное считывание от плазмидных промоторов в Ι;κΖ. так же как и сплошное считывание из ΕκΖ в расположенные по бокам плазмидные последовательности предотвращалось этими терминаторами. Ген 8рс устойчивости к спектиномицину как для Ε^οΐί, так и для В.§иЬоН§, амплифицировали из плазмиды ρΌΟ1730 (авторы Оеигои!Иеигу е! а1., 1996, Оепе 180, 57-61) с олигонуклеотидами §4833/4835 и вводили в полученную выше плазмиду. В дополнение к этому, часть вектора Б.соП была укорочена путем удаления фрагмента В§рН1/Нш6111. Таким образом, фрагмент Ε^ΡνδρΜ с областью репликации от В.§иЪ1Ш§ рМТЬВ§72 (авторы ЬадоФсй е! а1., 2005, Мо1. Вю1. (Мо§к) 39, 345-348) был лигирован в эту плазмиду.

Фрагмент ДНК на 2.3 кЪ, полученный в ходе эксперимента 1, был введен в ρ§υΝ272.1 напротив ΕκΖ путем разложения с помощью ΑΓ111 и Ше1 и лигирования, в результате чего получали вектор экспрессии ρ§υΝ279.2 с плазмидной картой, что отображено на фиг. 7.

Используемые праймеры показаны в вышеприведенной табл. 1.

б) Определение эффективности экспрессии вектора ρ§ϋΝ279.2

Плазмиды ρ§υΝ279.2 и ρ§υΝ272.1, полученные в вышеприведенном разделе а), вводили в В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ. Последний служил в качестве контроля фона. Штаммы В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ, несущие ту или другую плазмиду, выращивали в среде ЬВ со спектиномицином, и в ходе экспоненциальной фазы роста к культурам для индуцирования добавляли либо 0,2% маннозы, 0,2% маннозы плюс 0,2% глюкозы, или же не добавляли никакого сахара (неиндуцированное управление). После часа индуцирования определяли βгалактозидазную активность клеток с помощью метода Миллера. Результаты приведены на фиг. 8.

Неиндуцированная культура В.щЬШй, содержащая ρ§υΝ279.2, уже демонстрировала довольно высокий базовый уровень β-галактозидазной активности. Присутствие маннозы приводило к дальнейшему 4-х-кратному росту β-галактозидазной активности, тогда как активность с маннозой и глюкозой была снижена, но была всё ещё значительно выше указанного базового уровня. Эти результаты ясно показывают, что активность промотора, отмеченная в ρ§ϋΝ279.2, могла бы происходить из области между тапР и тапР, из области в обратном направлении к тапР или из обеих областей.

Таким образом, область в обратном направлении к тапР, так же как и наибольшая часть тапР, были обе удалены из ρ§ϋΝ279.2 путем отсекания фрагмента ДНК на 2.3 кЪ от ρ§υΝ279.2, как показано на фиг. 7 между §Го1 и №и1, в результате чего получена плазмида ρ§υΝ284.1.

В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ трансформировали с помощью этой плазмиды ρ§υΝ284.1, и эффективность экспрессии определяли согласно вышеописанному. Результат показан на фиг. 8. Как следует из фиг. 8, этот удаленный вектор ρ§υΝ284.1 из тапР в В.§иЪИ11§ 3ΝΑ демонстрировал только примерно половину базового уровня β-галактозидазной активности по сравнению с ρ§υΝ279.2 в В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ, что представляет в равной степени более значительное увеличение с помощью индукции маннозой и вновь более значительное уменьшение в присутствии глюкозы. Эти результаты доказывают, что промотор тапР располагается между тапР и тапР, и показывают, что хромосомная копия тапР достаточна для регулирования копий промотора тапР на плазмидах с низшей степенью копирования.

в) Определение местоположения промоторной области тапР

Для определения местоположения промоторной области тапР, в дополнение к укороченному фрагменту ДНК от ρ§υΝ284.1, из ДНК-фрагмента 2.3 кЪ приготовляли дополнительные фрагменты с укороченной последовательностью путём амплификации фрагментов ДНК с помощью процесса РСР, которые укорачивали в различных положениях в обратном направлении относительно сайта инициации транскрипции промотора тапР и вводили фрагменты в ρ§υΝ272.1, как показано на фиг. 5.

Выполнение делеции вплоть до Ъρ -81 и Ъρ -80 в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции от тапР приводило к получению второй последовательности делеции, включающей в себя последовательность № 1.

Дальнейшую делецию выполняли в прямом направлении до -41 и до -40 Ъρ по отношению к сайту инициации транскрипции тапР (третья последовательность делеции).

Плазмиды, содержащие вторую последовательность делеции, ρ§υΝ290 и третью последовательность делеции ρ§υΝ297.5, конструировали сходным образом с плазмидой ρ§υΝ284.1 согласно изложенному выше в разделе 26, путём инсерции продуктов операции РСР, амплифицируемых с праймерами §4802/§5203 и §5262/§5203, соответственно, в ρ§υΝ272.1 через ферменты рестрикции ΕсοРVη Ше1.

Эти плазмиды вводили в В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ и культивировали согласно изложенному в эксперименте 26. Спустя 1 ч после индукции определяли β-галактозидазную активность клеток согласно изложенному выше в эксперименте 6). Результаты показаны на фиг. 9.

Как показано на фиг. 9, ни один из штаммов с ρ§υΝ290 и ρ§υΝ284.1 не проявлял отличий в отношении индукции ΕκΖ маннозой. Однако в В.§иЪ!Ш§ 3ΝΑ, содержащей ρ§υΝ297.5, индукция маннозой была полностью аннулирована, и базовый уровень экспрессии был близок к 0. Эти результаты показы- 18 024834 вают, что сайт связывания МапК у промоторной области маннозы тапР располагается между Ьр -80 и -35 относительно сайта инициации транскрипции тапР.

Эксперимент 3: Определение промотора тапК

а) Идентификация последовательности сге

Так как наибольшая часть углеродной катаболитной репрессии ССК в РитюФек происходит опосредованно через белок управления катаболитом А (СсрА), то поиск соответствующих сайтов связывания (последовательность сге) проводился во всём опероне маннозы с использованием функции выравнивания ДНК в программе управления клонированием. Для этого выравнивания использовали согласованную последовательность сге 5'-\ν\νΤΟΝΑΑΡ.ί'.Ό\ν\ν\νί'.Ά\ν\ν-3'.

Только в промоторной области тапК была обнаружена одна предположительная последовательность сге, что показано на фиг. 4, которая располагается в прямом направлении к блоку -10.

б) Оценка эффективности экспрессии промотора тапР

Для оценки эффективности экспрессии промотора тапК был построен вектор экспрессии, такой как ρ§υΝ284.1, согласно вышеизложенному, и который был назван ρ§υΝ291. Для этой цели фрагмент ДНК, включающий предположительный промотор тапК и примерно 600 Ьр в обратном направлении относительно тапК, амплифицировали с праймером §5208/85209 и линеаризованной плазмидной ДНК ρ§υΝ279.2 в качестве матрицы и вводили напротив ΕκΖ в плазмиду ρ§ϋΝ272.1, путём разложения с помощью Крп1 и ΑΠΙ лигирования.

ДНК-последовательность показана на фиг. 4.

Плазмиду ρ§ϋΝ291 вводили в В.киЬййк 3ΝΑ и замеряли β-галактозидазную активность, согласно изложенному в эксперименте 2б).

Результат отображён на фиг. 10. Здесь базовая экспрессия уже была относительно высокой, и она была ещё увеличена трёхкратно добавлением 0,2% маннозы. Добавление глюкозы привело к подавлению β-галактозидазной активности практически до базового уровня экспрессии.

Этот результат показал, что промотор тапК не является просто слабым составным промотором, а способен регулироваться маннозой и процессом ССК.

в) Локализация местоположения промоторной области тапК

Как и в эксперименте 2в) для последующей локализации положения промоторной области у тапК, были приготовлены фрагменты ДНК различной длины из ДНК-последовательности, содержащейся в ρ§υΝ291 с помощью процедуры РСК с амплификацией ДНК праймерами, связанными в различных положениях в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции промотора тапК (праймер §5932 и §5933) и к праймеру, связанному в прямом направлении в гене ΕκΖ (85934) (фиг. 4).

Первую последовательность делеции получали отсечением последовательности, показанной на фиг. 4, вплоть до Ьρ -82 и Ьρ -81 в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции О, а вторую делецию получали отрезанием вплоть до Ьρ -62 и Ьρ -61 в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции О.

Аналогично эксперименту 2в) полученные после операции РСК фрагменты разлагали с помощью епбоК §аI и ΝΜ и лигировали с ρδυΝ279.2, при этом ДНК разлагали с помощью тех же самых ферментов рестрикции, а полученные плазмиды называли ρδυΝ385.2 и ρδυΝ386.9 соответственно.

Каждую плазмиду вводили в В.киЬййк 3ΝΑ и культивировали согласно изложенному в эксперименте 26. Спустя час после индукции определяли β-галактозидазную активность клеток согласно изложенному в эксперименте 26. Результаты показаны на фиг. 10. Нет значительной разницы между индукцией ΕκΖ маннозой от В.киЫШк 3ΝΑ, содержащей ρδυΝ385.2, по сравнению с ρδυΝ291. Однако в В.киЫШк 3ΝΑ ρδυΝ386.9 со второй последовательностью делеции, индукция маннозой была полностью устранена, и базовый уровень экспрессии был почти равен 0. Из этих результатов следует, что сайт связывания МапК промоторной области тапК располагается между ^-81 и Ьρ-35 по отношению к сайту инициации транскрипции от тапК. Сайт связывания МапК мог бы даже перекрывать последовательность -35, как это выявлено в отношении классических активаторов, так как инвертированная повторяющаяся последовательность, найденная в предложенном сайте связывания, продолжается внутрь предложенной последовательности -35.

ΙΙ) Построение рекомбинантной клетки-хозяина с генетически изменёнными областями оперона маннозы

Эксперимент 4. Трансформация

а) Конструирование плазмиды ρМV 168.1 как вектора экспрессии

При использовании последовательности нуклеиновых кислот промоторной области тапР, в том виде, как она введена в плазмиду ρδυΝ284.1, какая показана на фиг. 5, и в том виде, как она используется в эксперименте 2в, плазмиду ρМV168.1 конструировали согласно изложенному ниже и вводили в В.8иЫШ8 3ΝΑ как в хозяина.

Шаттл-вектор, реплицируемый как в Ε.^Η, так и в В.киЬййк, строили согласно изложенному в эксперименте 2а), за исключением того, что еОРР использовали в качестве информационного гена вместо ΕκΖ. Также область инициации транскрипции у тапР была заменена областью инициации транскрипции

- 19 024834 гена д§1В (стрессовый белок; авторы Лидеп с1 а1., см. выше). Таким образом, стартовый кодон от еСЕР и 6 кодонов, следующих за стартовым кодоном, были заменены.

Схематическая структура полученных промоторной области и области инициации транскрипции была следующей:

Показано расположение генов (стрелки) и областей (блоки) с соответствующими сайтами рестрикции. Последовательность области инициации транскрипции дмВ в используемом виде была такой:

5’-сПаааААТТАААООАООААТТСААААТСОСАОАСААТААСААеса1сс-3’

А/|И δϋ Старткодон АзтН1

В общем плазмиду ]эМ\У 168.1 получали так, как показано в технологическом карте в соответствии с фиг. 15.

На схеме технологического процесса используемые здесь названия ДНК векторов, ДНК вставок и комплементарных олигонуклеотидов представлены согласно указанному в блоках; что касается продуктов полимеразно-цепных реакций (РСК), то эти праймеры и матрицы ДНК были такими, какие представлены в скобках, используемые ферменты рестрикции указывались на соответствующих сайтах.

Этапы клонирования выполнялись с использованием Б.соП ДМ109.

Используемые плазмиды представляли собой ρυС 18 - вектор клонирования для продуктов РСК с устойчивостью к ампициллину (авторы УапоксН-Реггоп е1 а1., см. выше); ρ\νΑ21 - вектор экспрессии и клонирования для Б.соП 6 устойчивостью к ампициллину (ХУедегег е1 а1., 2008, ВМС В1о1есНпо1. 8,2); ρδυΝ202.4 -дериват ρυВ 110 с промоторной областью тапР и с устойчивостью к ампициллину и к кап, представляющий собой шаттл-вектор для Б.соП и В.киЫШк; и ρδϋΝ266.1 - дериват ρυθ8 с сайтом интеграции между трет-последовательностями и с устойчивостью к 8ρс и к ампициллину.

Плазмида ρδυΝ266.1 является производной индуцируемого рамнозой вектора экспрессии ρ^Α21. где промотор рамнозы и ген еСЕР заменяли на последовательность, содержащую два терминатора транскрипции гена ΦίΑ от ВасШик 8иЬНП8 в прямой ориентации и разделенных сайтами рестрикции для ВатШ, §та1 и ΑΓ|ΙΙ (см. нижеприведённую последовательность), так же как и ген устойчивости к спектиномицину. Последний амплифицировали из плазмиды |эОС1730 (Сиетои1-Е1еигу е1 а1., 1996) с праймерами к4833 и §4835 (табл. 1). В конечной конструкции ]эМ\У168 промотор маннозы и ген еСЕР вставляется между обеими последовательностями терминатора транскрипции ίπΓΑ.

ДаотН! 5та1 Л/|П

Л.Л.ПССаТССАОАССССТСТвОСТСТСОТТТТТТТОаАТССССОаОАСатСвАСАССССТСТО

ПААСССАССТСТССавАСАСССАСАССААААААССТАОССОСССТОСАССТСТССССАСАС

Рте! Н1пЛЯ

ССГСГСС7Т7ТГТСТТТАААСААССТТ

ССЛСЛСС4ЛЛЛЛЛСАААТТТСТТССАА

Нуклеотидная последовательность обеих последовательностей терминаторов ΙιιΓΑ (жирный шрифт, курсив) и сайты рестрикции между ними и в конце последовательности (подчёркнуто).

Замещение области инициации транскрипции, включая стартовый кодон и кодоны, следующие за стартовым кодоном, было произведено с использованием комплементарных олигонуклеотидов и через одиночные сайты рестрикции Вд/11, ΑΓ11 и ВатНЕ Конструирование вектора начинали с замещения области инициации транскрипции гена Т7 10 вектора ρ\νΑ21 (авторы ХУедегег е1 а1., см. выше) областью инициации транскрипции от ίπΓΑ из В.киЬййк через комплементарные олигонуклеотиды 85019 и 55020, соответственно. При последующих этапах клонирования эту область инициации транскрипции замещали областью от д51В (Олигонуклеотиды §5236/85237). Конечная плазмида |эМ\У 168.1 содержала замещающий (κρ) ген, включающий в себя оп+ от ρυΕ 110.

Плазмидная карта от |эМ\У 168.1 показана на фиг. 11.

б) Штаммы-мутанты делении, в которых отсутствуют тапР (ДтапР) и тапЛ (ДтапЛ) б 1) Инсерционный вектор для делении тапР

Был использован инсерционный вектор ρδυΝ356.7 для делеции гена тапР, кодирующего маннозоспецифичный ΕΙΙ из оперона маннозы на хромосоме, не способной к споруляции В.киЬйБк ΝΑ, и полученный штамм был назван В.8иЬйЙ8 ТО356 (8ροΟΑ тап::егтС). В качестве маркера селекции использовали кассету устойчивости к эритромицину.

Вектор ρδυΝ356.7 - это дериват ρυθ8 (устойчивость к ампициллину) и содержит ген устойчивости к эритромицину, охватываемый по бокам последовательностями тапК и таηΑ, а снаружи - сменную кассету с геном устойчивости к спектиномицину. Ген устойчивости к спектиномицину амплифицировали из 1ЭЭС1730 (см. выше в отношении ρδυΝ266.1). Ген устойчивости к эритромицину амплифицирова- 20 024834 ли из плазмиды рЭС1730 праймером §5069 и 55070. С-концевую область гена тапК амплифицировали из ДНК ВасШив 8иЫШ8 праймером §5407 и §5408 и вставляли на одну сторону гена эритромицина. Νконцевую область у тапА амплифицировали из хромосомы ВасШик 8иЫШ8 праймером §5362 и §5363 и вставляли с другой стороны гена устойчивости к эритромицину. Плазмидная карта р8Ц№56.7 показана на фиг. 12.

62) Делеция тапА

Затем получали нокаут-мутант В.8иЬ11118 с удалённым тапА из оперона маннозы на хромосоме не способной к споруляции В.8иЫШ8 3NА, с инсерционным вектором р8И№81, в результате получали В.киЫШк ТО281 (§роОА3 тапА::егтС) (см. выше 8ип Т. е1 а1.).

Ген тапА кодирует маннозо-6-фосфат изомеразу, которая преобразует маннозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат.

Для отслеживания успешности делеции использовали кассету устойчивости к эритромицину.

63) Трансформация

Каждую из В.8иЫШ8 ТО356 и В.киЫШк ТО281 трансформировали согласно вышеприведённым б1) и б2) плазмидой рМ\У168.1, полученной в а1).

Использованные среды:

а) Среда с минимальным содержанием глюкозы (МГ):

2,0 г (ΝΗ₄)8Ο₄

6,0 г КН₂РО₄

14,0 г К₂НРО₄

1,0 г Ναι Цитрат

0,2 г М§80₄*7 Н₂О

5,0 г Глюкоза (отдельно в виде 20-50% маточного раствора)

б) Среда I:

9,5 мл МО

0,20 мл Казаминокислоты (1% маточного раствора)

0,05 мл М§30₄ (маточный раствор ΙΜ)

в) Среда II:

8,00 мл МО

0,10 мл Казаминокислоты (1% маточного раствора)

0,05 мл М§8О₄ (маточный раствор 1М)

Трансформацию выполняли в соответствии с протоколом Аηадио8ΐори1о8 е1 а1., Требования к трансформации в ВасШиз 8иЫШ8, 1. Вас1епо1. (1961) 81: 741-746.

Одиночную колонию каждого бактериального штамма вводили в 5 мл среды I и инкубировали при 37°С во вращающемся сосуде всю ночь. 1 мл культуры утром (оптическая плотность ΟΌ₆₀₀ в пределах от 1 до 2) переносили в 8 мл среды II в 100-мл колбе Эрленмейера с отбойниками и инкубировали при 37°С в течение 85 мин. Затем 1 мл соответствующих клеток переносили в пробирки компании Шютт и смешивали с соответствующими инсерционными векторами. До смешивания с соответствующими клетками эти инсерционные векторы укорачивали в сайте без существенной важности одиночным ножом. Полученную смесь осаждали изопропанолом и обеспечивали лигирование при комнатной температуре в течение не менее 2 ч.

Затем полученные трансформированные клетки инкубировали при 37°С в течение 30 мин во вращающемся сосуде, центрифугировали при 4.500 об/мин при комнатной температуре. Дебрис вновь переводили в суспензию в остаточной жидкости и разливали в планшеты.

Эксперимент 5. Ферментация

5.1 Материалы и методы

В общем, и для экспериментов по ферментации использовали стандартные молекулярные технологии, если не указано иное.

Состав сред, использованных для ферментации

Культивирование в течение ночи, и предварительное культивирование № 1 проводили в минимальной солевой среде Шпицицена (8ММ) (8р1/1/еп 1., Ргос. №Ш. АсаФ 8ск И.8.А. 44, 1958,1072-1078), с добавлением 0,02% (вес/об.) казаминокислот (ВИ ИФсо™, 8ратк8, Мэриленд, США), также как и 100 мкг.мл^-1 спектиномицина для селекции плазмид и 5 мкг.мл^-1 эритромицина для селекции штаммов (в случае с ТО281 и ТО356). Выращивание предварительной культуры № 2 и ферментационное культивирова- 21 024834 ние (периодическое) проводили с использованием минеральной среды, модифицированной из среды Вилмса и др. (\УПтк В. е! а1., Вю1есНпо1. Вюепд. 73,2001, 95-103), состоящей из: 1,0 г.л^-1 (ΝΗ4)2^- Нцитрат, 2,0 г.л^-1 №2§О₄, 2,68 г.л^-1 ΝΗ48Ο4, 0,5 г.л^-1 ИН4С1, 14,6 г.л^-1 К2НРО4, 4,0 г.л^-1 №2НРО₄ х 2 Н₂О, 1,0 г.л^-1 Мд§О4 х 7 Н2О, 3 мл.л^-1 раствора микроэлементов (ТЕ§), 5 г.л^-1 глюкозы для предварительной культуры № 2 и 25 г.л^-1 глюкозы для среды периодического культивирования. ТЕ§ содержит 0,5 г.л^-1 СаС12, 0,18 г.л^-1 2п§О4 х 7 Н2О, 0,1 г.л^-1 Мп§О4 х Н₂О, 10,5 г.л^-1 №2-ЭДТА, 8,35 Г.Л^-1 РеС13, 0,16 г.л^-1 Си§О4 х 5 Н2О и 0,18 г.л^-1 СоС12 х 6 Н₂О. Культуральная среда для процессов ферментации с высокой клеточной плотностью содержала 200 г.л^-1 глюкозы, 7,89 г.л^-1 Мд§О4 х 7 Н2О, 40 мл.л^-1 ТЕ§ и 63,36 г.л^-1 (ИН4)₂НО₄, когда использовали реактор КЬР. Величину рН регулировали до 3,3 с целью обеспечения растворимости всех компонентов. Использовали две отдельных питательных среды при применении 30-литрового реактора. Первая среда содержала 654,76 г.л^-1 глюкозы х Н2О, 23,5 г.л^-1 Мд§О4 х 7 Н₂О, 120 мл.л^-1 ТЕ§, вторая 396 г.л^-1 (ИН4)2НРО4. Для индукции промотора тапР использовали либо 20%-ный раствор Όманнозы, либо отдельный питательный раствор, содержащий 200 г.л^-1 маннозы, 7,89 г.л^-1 Мд§О4 х 7 Н₂О, 40 мл.л^-1 ТЕ§ и 63,36 г.л^-1 (1\1Н₄)₂НРО₄.

Условия культивирования предварительных культур и периодического культивирования с подпиткой

Одиночные колонии из чашек с агаром ЬВ инокулировали в 5 мл минимальной среды Спициценса (§ММ) и оставляли расти на всю ночь в течение не менее 14 ч при 37°С. 25 мл среды §ММ переносили в 250-миллилитровые качалочные колбы и инокулировали выросшей за ночь культурой до оптической плотности 0,05 (предварительная культура № 1) на 600 нм (Оптическая плотность ОИ₆₀₀). Через 5 ч инкубирования при 37°С использовали 20 мл предкультуры № 1 для инокуляции 200 мл среды предкультуры № 2 в 1000-миллилитровых качалочных колбах (предкультура № 2). Ещё через 5 ч инкубации при 37°С среду для периодического культивирования инокулировали предкультурой № 2.

Использовали ранее разработанную установку для периодического культивирования с подпиткой, которую оптимизировали для Е.соН с глюкозой в качестве главного источника углерода (Ког/ Ό.Ι. е! а1., 1. Вас!егю1. 39,1995, 59-65; \УПтк, см. выше). Объём для периодического культивирования был 1,5 л при использовании малого лабораторного ферментёра КЬР на 3,7 л (Компания ВюепдшееНпд АО, \Уа16, Швейцария) и при объёме питательной среды 1,0 л. При работе на 30-литровом лабораторном ферментёре Ό598 (Лабораторный ферментёр ЬР, Компания Вюепфпееппд АО, \Уа16, Швейцария) объём для периодического культивирования составлял 8,0 л, содержащая глюкозу среда составляла 4,2 л и аммониевая питательная среда была 1,0 л. Среды с глюкозой и аммонием вводили в реактор при соотношении 81%: 19%. Питательные среды подавали в биореактор в соответствии с:

Р(1)=[(26е, / + т]х [С_м х У₀)/См] х ехр^ х (1 Уравнение 1, где Р (л.ч^-1) - это скорость расхода,

Цзе! (ч^-1) - это желательная удельная скорость роста, т (г.г^-1 .ч^-1) - это удельный коэффициент поддержания культуры (= 0,04 г.г^-1.ч^-1),

У_х/к - это коэффициент удельного выхода биомассы/субстрата (примерно 0,5 для глюкозы),

Сх₀ (г.л^-1) -это концентрация биомассы в начале расхода питательных растворов,

У_о (л) - объём реактора в начале расхода питательных растворов,

С_к0 (г.л^-1) - это концентрация глюкозы в питательном растворе и ! (ч) - это время после начала ввода питательных растворов.

Удельная скорость роста μ в 0,1 ч^-1 была выбрана такой во избежание получения неспецифических и нежелательных побочных продуктов и во избежание ограничений по кислороду.

Периодическое культивирование проводили при 37°С до падения температуры до 30°С с началом фазы подпитки во избежание образования нежелательных внутриклеточных телец экспрессируемого гетерологического белка. Величину рН регулировали до уровня 7,0 с помощью 24%-ного (об./об.) ИН₄ОН и 20%-ной (об./об.) Н₃РО₄ соответственно. Значение рО₂ поддерживали на уровне 50%-ного насыщения с помощью автоматически регулируемой скорости мешалки. Скорость аэрации сохраняли постоянной при 2 л.мин^-1 при работе на ферментёре КЬР и в диапазоне 15-25 л.мин^-1 при использовании ЬР. Превышение давления над атмосферным сохраняли на уровне 0,5 бар. Плотность определяли измерением оптической плотности ОИ₆₀₀ периодически с помощью спектрофотометра для УФ/Видимой области марки ИНгокрес™ 1100 рго (компании ОЕ НеаННсаге, ранее АтегкНат Вюкшепсек, Соединённое Королевство). Сухой вес клеток (с6\у) определяли умножением значения ОИ₆₀₀ на коэффициент 0,322 г _сн^.л^-1, который получали в виде среднего значения после нескольких определений влажности прибором На1одеп МВ 835 (компания ОНаик СогрогаНоп, Рте Вгоок, Нью-Джерси, США) во время ферментационных процессов. Для управления параметрами ферментации использовали Пакет программного обеспечения Вю1од 1.7 (Институт биохимической технологии, Штутгартский университет, Германия |НПр://\у\у\уаЬу1.и1ик!и!!да!.6е]. Процессы периодического культивирования с подпиткой завершали примерно через 40 ч проведения процесса.

- 22 024834

Измерения флуоресценции в реальном времени и автономно, независимо от работы оборудования

Для отслеживания в реальном времени скорости экспрессии вырабатываемых рекомбинантных микроорганизмов еОРР внутри биореактора использовали детектор флуоресценции (М1кгораск НРХ2000, мощный ксеноновый источник света; компания Осеап Орйск, 1пс.; волоконный оптический спектрометр 82000 компании ИипеЛп, Флорида, США) был использован внутри биореактора. Длина волны экстинкции составляла 485 нм, тогда как эмиссию детектировали на 535 нм и регистрировали в реальном времени с помощью пакета программного обеспечения 8рес!га 8иПе (компании Осеап Орйск, ИипеФи, Флорида, США). Флуоресцентный свет направляли через оптический фильтр с интенсивностью 0,6. Время интегрирования детектора составляло 50 мс. Из-за того, что это программное обеспечение было способно обсчитывать только величины до 4.000 импульсов, время интеграции пошагово уменьшали как раз перед достижением более высоких уровней. В результате импульсы флуоресценции после этого умножали на соответствующий коэффициент приведения для получения величин, которые соответствуют 50 мс. Эти замеренные величины были специфичными для определённого объема реактора.

В дополнение к этому измерения в автономном режиме (независимо от работы оборудования) проводили с использованием микропланшет-ридера 8рес1гаР1иог МюгоркИе Реайег (Компания Тесап Огоир Ый., Мэннедорф, Швейцария). Таким образом, измеряли 3 х 250 мкл неразбавленной клеточной культуры в 96-ячеечных микропланшетах (компания Огешег-Вю Опе ОтЪН, Фрикенхаузен, Германия), используя 3 х 250 мкл среды периодического культивирования в качестве контрольной пробы (фильтр возбуждения: 485 нм; эмиссионный фильтр: 535 нм; усиление (ручное): 60; время интеграции: 20 мкс; число вспышек: 3; режим считывания: сверху). Среднее значение контрольных величин вычитали из среднего значения образцов для получения конечной величины. Клеточную культуру разбавляли в среде для периодического культивирования по достижении 20.000 единиц счёта.

По результатам калибровки относительно внутреннего очищенного стандартного образца еОРР (чистотой примерно 95%, 1,3 г.л^-1), можно было заключить, что примерно 120.000 единиц счёта, измеренных не в режиме реального времени, соответствуют 1 г еОРР .л^-1. Удалось доказать, что между величинами, замеренными в режиме реального времени и в автономном режиме, существует линейная связь, которая даёт корреляцию в 1,5 г еОРР .л^-1 на каждые 7470 замеренных в режиме реального времени единиц отсчета.

Определение стабильности плазмид

Стабильность вектора рМ^168/1 определяли измерения фракции плазмид-содержащих клеток согласно работе Харвуда и Каттинга (Напгоой С.Р. е! а1., Молекулярно-биологические методы для ВасШик, 1990, 1ойп \УПеу & 8опк Ый., Чичестер, Англия.

Анализ белков по методике Додецилсульфат натрия - Электрофорез в полиакриламидном геле (8И8-РАСЕ)

Экстракты из сырых клеток получали следующим образом: собирали и центрифугировали 10¹⁰ клеток. Клеточный осадок после центрифугирования вновь переводили в суспензию с помощью 1 мл 50 мМ буферного раствора фосфата натрия (рН 7,5) и солюбилизировали с использованием ультразвука (компания Неа! 8у51ет5-ийга8отс8, 1пс., Ультразвуковой аппарат ν-385, Фармингдейл, Нью-Йорк, США; 3 х 30 с, цикл с 50%-ной нагрузкой). Растворимую белковую фракцию получали из надосадочной жидкости после центрифугирования, а нерастворимую фракцию получали повторным суспендированием осадка после центрифугирования с помощью 1 мл 50мМ буферного раствора фосфата натрия (рН 7,5). Белковые фракции анализировали по методике 8И8-РАОЕ (Ьаетт1 и.К., ЫаЮге 227,1970, 680-685; ЬеВ1апс Эй. е! а1., АпйписгоЬ. АдеЮз Сйето!йег 35,1991, 1804-1810).

5.2 Процессы ферментации с высокой клеточной плотностью с использованием В.киЪййк 3ЫА/рМ^168.1.

Система экспрессии маннозы с В.8иЪйЙ8 3ЫА/рМ^ 168.1 испытывали в ходе процессов периодического культивирования с подпиткой. Использовали такую установку, какая описана выше (Кога е! а1., \νί1πΐ5 е! а1., см. выше).

В ходе первого процесса ферментации, проведённого в ферментёре с мешалкой ЬР, в культуральную жидкость добавляли добавку в количестве 0,2% (вес/об.) Ό-маннозы, сразу же с началом фазы культивирования с подпиткой. Сигнал флуоресценции датчика, который до этого не показывал значительной флуоресценции, очень быстро вырос сразу же после индукции. После достижения пикового значения примерно на 2.200 отсчётов после 4 ч на этапе периодического культивирования с подпиткой, сигнал начал снова быстро падать. Это его снижение сопровождалось расходованием индуктора (замеряемого с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, данные не приведены). В конце процесса было получено 0,2 г _еОРР .л^-1 или 3 мг _еОРР на г _еОРР .

В ходе второго процесса ферментации использовали дополнительное введение экспоненциального объёма Ό-маннозы. Его начинали одновременно со вводом глюкозы при сохранении суммарной концентрации сахаров в обоих добавлениях такой же высокой, что и в первом процессе ферментации. Сигнал флуоресценции запускался сразу же после добавления индуктора и продолжался до конца процесса. Для поддержания этого увеличения в культуральную жидкость реактора добавляли суммарно 50 г Ό- 23 024834 маннозы. При этом режиме индукции получали 2,1 г _еСРР .л^-1 или 53 г _еСРР на г _ей„ Подробные результаты этих двух процессов ферментации, проведённых на Β.δΐώΐίΐίδ 3ΝΑ / рМ\У 168.1, сведены в таблицу, отображающую результаты в разделе 5.5.

Выработка еСРР росла в течение всей фазы периодического культивирования с подпиткой, но медленнее, чем выработка биомассы. Проверка стабильности плазмид выявила, что примерно 95% клеток всё ещё несли этот вектор по окончании обоих ферментационных процессов.

5.3 Процесс ферментации с высокой клеточной плотностью с использованием штамма ДтапА ТЦ281.

Штамм ТЦ281 делеции МапА, не способный расти на маннозе как единственном источнике углерода (8ип Т. Εΐ а1., см. выше), был выбран для дальнейших экспериментов по ферментации. Β.δίΛΟΐίδ ^п^А/рМ\У168.1, трансформированная с помощью рМ\У168.1, проявляла чувствительность относительно Ό-маннозы в экспериментах во встряхиваемых колбах.

Было проведено два периодических процесса ферментации с подпиткой с использованием ТЦ281/рМ^ 168.1. В ходе первого индукция происходила при однократном добавлении маннозы с началом этапа периодического культивирования с подпиткой. В ходе второго одновременно начинали ввод дополнительного экспоненциального количества маннозы. Индукция с Ό-маннозой не продемонстрировала заметного влияния на удельную скорость роста во время стадии периодического культивирования с подпиткой. При стратегии однократного добавления можно было добиться 0,71 г _еСРР .л^-1, что соответствует 36 м г _еСРР на г _сй£ . Подробные результаты этих двух процессов ферментации сведены в таблицу в разделе 5.5 Результаты

5.4 Разработка и применение системы экспрессии с автоиндукцией при ферментации с высокой клеточной плотностью с использованием штамма ДтапР ТЦ356

Штамм Β.δΐιόΐίΐίδ ДтапР ТЦ356 показал существенную экспрессию в условиях без индукции от Р_тапР, так же как и эффект ССК в присутствии глюкозы (8ип Т. Εΐ а1., см. выше). Этот штамм трансформировали с помощью рМ\У 168.1, что приводило к получению колоний с довольно слабой флуоресценцией. После добавления 0,5% (вес./об.) глюкозы к выбранной среде, рост колоний нормализовался. В ходе экспериментов в колбах со встряхиванием были достигнуты высокие уровни экспрессии, когда глюкоза расходовалась полностью (данные не показаны).

В процессе периодического культивирования с подпиткой (фиг. 13) затем использовали Β.δΐιόΐίΐίδ ТЦ356, содержащую рМ\У168.1. На этапе периодического культивирования не смогли обнаружить значительной флуоресценции, сходной с периодическим культивированием штаммов ^п^А/рМ\У186 ТЦ281/рМ^168 на Β.δΐώΙίΐίδ. С началом фазы подпитки при периодическом культивировании сигнал флуоресценции от детектора реактора начинал непрерывно возрастать. Спустя 36 ч от начала ферментации уровень экспрессии в этих клетках достигал максимума, как это можно видеть через постоянное значение Ур/х в 14,6% до конца ферментационного процесса, что соответствует постоянной удельной производительности. Было получено примерно 10 г еСРР.л^-1, без добавления какого бы то ни было индуктора, что соответствует 146 мг еСРР на г сйР . Результаты ферментации сведены вместе и сравниваются с другими проведёнными процессами ферментации в нижеприведённой таблице в разделе 5.5 Результаты. Проводили 808-электрофорез на полиакриламидном геле для получения карты-отпечатка в отношении процентного значения экспрессированного еСРР по сравнению с суммарным белком (фиг. 14). Как можно видеть, по крайней мере 20% от суммарного белка составляют молекулы еСРР. Только малая фракция нерастворима и присутствует в форме внутриклеточных телец (фиг. 14, столбик 7). Неразбавленную надосадочную культуральную жидкость также анализировали с помощью 808-электрофореза на полиакриламидном геле (фиг. 14, столбик 8) и измеряли на спектрофотометре. В этой надосадочной жидкости было найдено примерно 1% от суммарного замеренного еСРР, что могло бы быть вызвано текущим лизисом клеток в течение всего ферментационного процесса.

Стабильность плазмид и морфологию клеток проверяли в течение всего ферментационного процесса.

5.5 Результаты

Результаты ферментационных процессов из разделов 5.2-5.4 сведены в нижеследующей таблице.

Сравнение проведённых ферментационных процессов в отношении различных режимов индукции и применения штаммов Β.δΐώΙίΐίδ с вектором экспрессии рМ\У168.1.Ь.

Штамм В.5иЬ/Ша с рМ\У168,1	Режим индукции	Реактор с мешалкой	[Ч]	конечный (г^л*1]	ЗЕсонечный (Га|«г-Л }	Ср, конечный [ГеОГР-Л * ]	Р<ОРР, хомечхый [г]	[%]	гр (ГеОРР· Рс** * 4 ']	Чр [Георр.л’.ч·1]
3ΝΑ (тап*У	5А	ЬР	22,5	73	897	0,2	2,8	0,3	0,14 х КГ '	0,01
3ΝΑ (тап*)	ЕГ	КХР	23,8	39	103	2,1	5,5	5,3	2,32 хКГ	0,09
Т<32$1 (АтапА)	ЗА	КЕР	11,8	20	39	0,7	1,4	3,6	2,98 х 1<Г’	0,06
Тр281 (АтапА)	ЕГ	ЬР	25,5	59	782	1,9	25	3,2	1,37 х 10~’	0,08
Т<3356 (АтапР)	ΑΙ	ЬР	23,5	67	758	9,8	111	14,6	6,23 х 10’1	0,40

Сокращения и наименования параметров:

8А: Одиночное добавление индуктора (манноза);

- 24 024834

ЕР: экспоненциальный ввод индуктора (манноза);

ΑΙ: автоиндукция;

ЬР: 30-литровый лабораторный ферментёр;

КЬР:3,7-литровый малый лабораторный ферментёр;

Δίίό: время периодического культивирования с подпиткой, конечное; сх: конечная концентрация клеток по сухому весу;

Х, конечный: абсолютный сухой вес клеток; сР, конечный: концентрация продукта;

РеОРР, конечный: абсолютный продукт (еОРР);

УР/Х: продукт на грамм клеток по сухому весу; гР: удельная производительность;

с|Р: объёмная производительность.

Как показывают эти результаты, во время фазы периодического культивирования виртуально не происходила экспрессия информационного еОРР. В ходе самоиндуцируемой ферментации из эксперимента 5.4 инициация самоиндукции в начале ограниченной переходной фазы глюкозы между этапом периодического культивирования и культивирования с подпиткой и её сохранение в течение всей внутренней фазы культивирования с подпиткой при ограничении объёма глюкозы приводили к трёхкратному увеличению выхода продукта до 146 мг ОРР на г сй\у.

Далее, как показывают результаты, полученные с ТЦ281 (процесс ферментации 5.3), выход, полученный при единичном добавлении индуктора в 0,7 г (еОРР)/л, может быть значительно увеличен в результате дополнительного ввода индуктора во время экспоненциальной фазы до 1,9 г/л.

5.6 Обсуждение

В процессах ферментации 5.2-5.4 были использованы системы экспрессии ВаиЬйНк, содержащие промотор маннозы РтапР в векторе рМ\У 168.1 для усиления экспрессии еОРР. Промотор РтапР показал, что он является сильным промотором, который активируется после добавления Ό-маннозы.

В ходе процесса ферментации 5.2, не спорулирующий штамм 3ΝΑ бактерии В.8иЬй118, который был трансформирован этим вектором, обеспечил получение высоких уровней продукта, т.е. 2,1 г _еОРР .л^-1. По сравнению с недавно описанной системой с В.тедаЮгшт (81аттеп е1 а1., Арр1. Епуноп. МюгоЬю1. 76,2010,4037-4046), представляющей собой многообещающую систему хозяина для получения рекомбинантного белка, система В.киЬГШк ведёт к получению более высоких результатов. Система получения белка с внутриклеточной В.тедаЮпит, которая индуцируется ксилозой, давала 1,25 г еОРР .л^-1, что соответствует 36,8 мг на г с,|„. при периодических процессах ферментации с подпиткой. В дополнение к этому, 81аттеп е1 а1. (см. выше) использовали антибиотики до конца ферментационного процесса, с тем результатом, что во время этого ферментационного процесса не было потерь плазмид.

Ферментационный процесс 5.2 показывает, что система маннозы довольно эффективна в отношении уровней производительности, однако однократное добавление индуктора не приводило к постоянно высоким скоростям экспрессии. Это вызвано быстрым потреблением маннозы-индуктора, так как она является одним из предпочтительных источников углерода для В.киЬГШк.

Таким образом, настоящая заявка относится к способу получения гетерологического полипептида в неспорулирующей клетке-хозяине В.8иЬй118, включающему этап трансфекции неспорулирующей клетки В.8иЬйН8 вектором, содержащим промотор тапР, оперативным путём связываемый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей этот полипептид, выращивание трансформированной клетки-хозяина в среде в подходящих условиях для обеспечения экспрессии указанного полипептида и выделение этого полипептида из этой клетки или из клеточной культуры, посредством чего экспрессия этого полипептида индуцируется добавлением маннозы-индуктора. Согласно предпочтительному варианту настоящей заявки, маннозу-индуктор добавляют в начале фазы подпитки при периодическом культивировании. В другом предпочтительном варианте осуществления маннозу-индуктор добавляют в первый раз в начале этапа подпитки при периодическом культивировании, а второе добавление маннозы выполняют во время экспоненциальной стадии выращивания одновременно с вводом глюкозы.

Систему экспрессии с пониженными требованиями к индуктору получали с помощью процесса ферментации 5.3 путём модификации гена тапА маннозо-6-фосфат изомеразы. Это приводит к получению системы, в которой требуется меньше индуктора для получения высоких скоростей экспрессии, что можно было отмечать в экспериментах со встряхиваемыми колбами.

Однако эта система сопровождается самоинтоксикацией клеток, так как рост был ингибирован при использовании объёмов свыше 0,5% (вес./об.) маннозы. Этот эффект может быть вызван внутриклеточным накоплением маннозо-6-фосфата. Другая возможная причина чувствительности штамма ТЦ281 ΔтаηΑ к маннозе может заключаться в сильном уменьшении доступных фосфатных групп, так как фосфат необратимым путём связывается с маннозой при вхождении в клетки через РТ8.

Таким образом, настоящая заявка относится к способу получения гетерологического полипептида в клетке-хозяине В.8иЬ1Ш8, которой недостаёт гена тапА, включающему этап трансфекции клетки В.8иЬШ18, которой недостаёт гена тапА, вектором, содержащим промотор тапР, оперативным путём свя- 25 024834 зываемый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей этот полипептид, выращивание трансформированной клетки-хозяина в среде в подходящих условиях для обеспечения экспрессии указанного полипептида и выделение этого полипептида из этой клетки или из клеточной культуры, посредством чего экспрессия этого полипептида индуцируется добавлением маннозы-индуктора в объёме, не превышающем 0,5% (вес./об.). Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящей заявки манноза-индуктор добавляется в начале фазы периодического культивирования с подпиткой. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления манноза-индуктор добавляется в первый раз в начале этапа подпитки при периодическом культивировании, а второе добавление маннозы выполняют во время экспоненциальной стадии выращивания одновременно с вводом глюкозы.

Режим индукции, который больше не нуждается ни в каком индукторе, показан в примере 5.4. Эта система автоиндукции была реализована с помощью штамма ДтаиР ТЦ356 и вектора экспрессии рМА16 8.1.

В негативном штамме транспортёра, таком как ТЦ356, промотор маннозы находится только под регуляторным контролем с помощью системы ССК, осуществляемым глюкозой, как обстоит дело, например, в случае фазы периодического культивирования при процессе ферментации. Устранён отрицательный регуляторный эффект от родственного транспортёра МапР. Тем не менее, регулятор остаётся в неактивном состоянии до тех пор, пока глюкоза присутствует. В дополнение к этому отсутствуют достаточные объёмы МапК, так как сайт-оператор тапК заблокирован. До тех пор, пока глюкоза будет не лимитирующей, МапК сможет связываться со своей последовательностью оператора и начинать экспрессию. Эта система автоиндукции сняла необходимость в наличии этого довольно дорогостоящего индуктора. Эта усовершенствованная стратегия индукции является многообещающей для случаев промышленного использования, так как на фазе периодического культивирования не имеет места нежелательная базовая экспрессия и не требуется добавлять никакого индуктора для обеспечения высоких уровней экспрессии в течение всей фазы периодического культивирования с подпиткой.

В дополнение к этому, также могут быть получены высокие скорости экспрессии с высокими уровнями производительности по сравнению с процессами ферментации 5.2 и 5.3. Удалось получить примерно 10 г.л^-1 рекомбинантного белка (еОРР), что соответствует 146 мг _еОРР на г _сЙ№. Этот продукт равномерно распределялся в клетках благодаря своей растворимости, как это могло быть отмечено с помощью флуоресцентной микроскопии и δΌδ-электрофореза на полиакриламидном геле. Высокая скорость экспрессии, т.е. высокая производительность могла быть сохранена на постоянно высоком уровне до конца этого ферментационного процесса.

Таким образом, настоящая заявка также относится к способу получения гетерологических полипептидов в клетке-хозяине В.киЪббк с негативным транспортёром, такой, как в клетке, которой недостаёт гена тапР, содержащему этап трансфекции клетки В.киЫШк с негативным транспортёром, с вектором, содержащим промотор тапР, оперативным путём связываемый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей этот полипептид, выращивание трансформированной клетки-хозяина в среде в подходящих условиях для обеспечения экспрессии указанного полипептида и выделение этого полипептида из этой клетки или из клеточной культуры, посредством чего экспрессия этого полипептида не индуцируется маннозой, а находится под контролем глюкозы.

- 26 024834

Перечень последовательностей <110> Лонца АГ <120> регуляция индуцируемых промоторов <130> 12ЕА-3 <150> РСТ/ЕР 2011/062921 <151> 2011-07-27 <160> 45 <170> Рахепхтп уегзтоп 3.5 <210> 1 <211> 143 <212> ϋΝΑ <213> Вас1'11и5 зиЬхтТтз <400> 1 тадддааааа хдссхххахх ассддаассх ахддхааааа аадсдахххх ааХдадсхда 60 хххсддхаха садххдадас аадахсххах хаххсасасх ххсхадааах ааххххсхха 120 адааддадах ахасахахда сас 143 <210> 2 <211> 80 <212> ϋΝΑ <213> ВастПиз зиЬхПтз <400> 2 хадддааааа хдссхххахх ассддаассх ахддхааааа аадсдаХХХХ ааХдадсхда 60 хххсддхаха садХХдадас 80 <210> 3 <211> 195 <212> ΡΝΑ <213> вастПи5 зиЬхЯтз <400> 3 хдаахххсхд схдаахахас аххасахадс ааасхсааад адхахааааа хсдсхххххх 60 ссддаадсхх сддхаааааа сдааасхххх дхсхсхахда ххххдхххха хаахдхааас 120 ддхххсххах аХадХаХасХ ХаХасХаХса аХХХдсХсаа дхадахасхд асаддсххаа 180 дааддадаха хасах 195 <210> 4 <211> 128 <212> ΡΝΑ <213> васПЧиз зиЬхтИз <400> 4 хдаахххсхд схдаахахас аххасахадс ааасхсааад адхахааааа хсдсхххххх 60 ссддаадсХХ сддхаааааа сдааасхххх дхсхсхахда ххххдхххха хаахдхааас 120 ддХХХсХХ 128 <210> 5

- 27 024834 <211>

<212>

<213>

121

ΡΝΑ

ВасШиз зиЬхШз <400> 5 хдаатсхд схдаахахас аххасахадс ааасгсааад адгахааааа хсдсххтх ссддаадехх сддхаааааа сдааасмхх дхсхсхахда ххххдхххса ХааХдХааас

120

121 <210> 6 <211> 41 <212> ΟΝΑ <213> ВасШиз зиЬгШ5 <400> 6 ааааааасдс дхдхххааас хдаахххсхд сгдаахасас а 41 <210> 7 <211> 34 <212> ΟΝΑ <213> агХШста! <22О>

<223> ргтшег 54694 <400> 7 аааааагсса дааадгдсда асаасаадас сССд <210> 8 <211> 41 <212> ΡΝΑ <213> аП-ИЧста1 <22О>

<223> рмтег з4802 <400> 8 ааааааасСа дСдСССааас адддаааааС дсссссасса с 41 <210> 9 <211> 31 <212> ΟΝΑ <213> агсШспа! <220>

<223> рп'гаег 54833 <400> 9 аааааадссс ааассссхдд сдаахддсда ΐ <210> 10 <211> 35 <212> ΟΝΑ <213> агхШста1 <220>

<223> ргттег 54835 <400> 10 аааааадаах хсаххадаах даахахххсс сааах 35

- 28 024834 <210> 11 <211> 59 <212> ΟΝΑ <213> агхт£тста1 <220>

<223> ргттег 54956 <400> 11 ааххдсдхсд адассссхдх дддхсхсдхх ххххддахсс ддсдсссасд хддсхадсс 59 <210> 12 <211> 59 <212> ΩΝΑ <213> βΓΧΐίϊεΐβΙ <22О>

<223> рптег 54957 <400> 12

ХХааддсХад ссасдХдддс дссддаХсса ааааасдада сссасадддд ХсХсдасдс 59 <210> 13 <211> 30 <212> ΟΝΑ <213> агхтНс1а1 <220>

<223> ргттег 55006 <220>

<221> т15с_£еахиге <222> (1)..(1) <223> Су 1аЬе1е<1 <400> 13 хадссххххх хахадххдхх садссасхдх 30 <210> 14 <211> 30 <212> ΡΝΑ <213> агХИ1С1а1 <220>

<223> ргтгаег 55007 <22О>

<2 21> тΐ5С_РеаХ и ге <ггг> <υ..<υ <223> су 1аЬе1еб <400> 14 ахссасдсса хаахдсахдс сдссаХХааХ 30 <210> 15 <211> 44 <212> ΟΝΑ <213> агхт’Ртста! <220>

<223> ргттег 55019

- 29 024834 <400> 15 «аадсхсхх ааддаддаН Иадаахддс гааадааааа нсд <210> 16 <211> 44 <212> ϋΝΑ <213> θΓΐιΐτσϊβΊ <220>

<223> рптег 55020 <400> 16

Пааддаан гггсгггадс саистаааа гссгссггаа дадд 44 <210> 17 <211> 40 <212> ϋΝΑ <213> агЬт Ή ст аЧ <22О>

<223> рптег 55069 <400> 17 аааааадааг гсдагагсад агсгасдсдг гаасссдддс <210> 18 <211> 33 <212> ΟΝΑ <213> βΓΐϊΉοβΊ <220>

<223> рптег 55070 <400> 18 аааааасааг гдаагсдагг сасааааааг адд 33 <210> 19 <211> 30 <212> ΡΝΑ <213> агМ ΐι ст а! <220>

<223> рптег 55071 <400> 19 ааааааадах схсахддсад ддеххдадаа <210> 20 <211> 33 <212> 0ΝΑ <213> агХЦЧстаТ <220>

<223> рптег 55072 <400> 20 аааааадааг хсгхагххас схсхдхдсхх ехх 33 <210> 21 <211> 21 <212> ΡΝΑ

- 30 024834

<213>	агХ1-Нс1а1
<22О> <223>	ргтшег 55097
<220> <221>	пл 5с_£еахиге
<222> <223>	¢1)..С1) Су ТаЬеТей
<400>	21
сасхдхассс хахсхдсдаа	а	21
<210>	22
<211>	23
<212>	ϋΝΑ
<213>	агХ1 Лета!
<220> <223>	ргтгаег 5 5098
<220> <221>	Щ15С_ТеаХиге
<223>	су 1аЬе1еб
<400>	22
аххдадахаа ХссХсдаХса	схх	23
<210>	23
<211>	30
<212>	ΟΝΑ
<213>	аггИ1с1а1
<220> <223>	рп’тег $5139
<400>	23
аааааахдах саххасххдх	асадсхсдхс	' 30
<210>	24
<211>	35
<212>	ΡΝΑ
<213>	апННста!
<220> <223>	рптег 55156
<400>	24
аааааахдах сассддгсда	ххдссасахх ааадд	35
<210>	25
<211>	19
<212>	ОМА
<213>	агхтН ста1
<220> <223>	ргзтег 55203
<400>	25
дагахссХдс ассахсдхс		19

- 31 024834 <210> 26 <211> 21 <212> ϋΝΑ <213> аггтНста!

<220>

<223> рптег 55208 <400> 26 ддсассат ссгдссдаах а 21 <210> 27 <211> 26 <212> βΝΑ <213> аптШсла!

<220>

<223> рптег 55209 <400> 27 смаадсссд ссадгагсга сггдад 26 <210> 28 <211> 29 <212> ΡΝΑ <213> аПл Л еп а!

<220>

<223> рптег $5234 <400> 28 аааааассдс ссдгсмсст аадсаСссе 29 <210> 29 <211> 31 <212> ΟΝΑ <213> аггтЛста!

<220>

<223> рптег з5235 <400> 29 аааааадаас гсдадагсад ддаасдади ΐ 31 <210> 30 <211> 44 <212> ΡΝΑ <213> ΗΓΐιίΊσίβΙ <22О>

<223> рптег 5 5236 <400> 30 «аадаагга ааддаддаах тсаааагддс адасаагаас ааад 44 <210> 31 <211> 44 <212> ОНА <213> агп’Пел а! <220>

<223> рптег 55237

- 32 024834 <400> 31 даХссХХХдХ ХаХХдХсХдс саххххдаах хссхссххха аххс 44 <210> 32 <211> 42 <212> ϋΝΑ <213> агХЮ'спа!

<220>

<223> рптег 55262 <400> 32 аааааадсха дсдхххааас ааааадсдах ХХХааХдадс Хд 42 <210> 33 <211> 31 <212> ΟΝΑ <213> агХтГтста!

<22О>

<223> рптег $5362 <400> 33 ддхасссссд ддхадссХдд аХддаХсада а 31 <210> 34 <211> 26 <212> ΡΝΑ <213> агхтГтсба!

<220>

<223> рптег 55363 <400> 34 асхадхдаах хссххххсса ахсдса 26 <210> 35 <211> 35 <212> ϋΝΑ <213> агхтГтстаТ <220>

<223> рптег 55407 <400> 35 ааааааддсд ссдсхадсхд дадаахахаа сддхх 15 <210> 36 <211> 20 <212> ΟΝΑ <213> агХ1 Γι' ел а!

<220>

<223> рптег 55408 <400> 36 асасхссхха адхсхадааа 20 <210> 37 <211> 19 <212> ΟΝΑ <213> агХтГтста!

- 33 024834 <220» <223» ришег 55617 <400» 37 ддаддддада ааасассеа 19 <210» 38 <211» 32 <212» ϋΝΑ <213» агС1Яс1а1 <220» <223» ргтшег 55618 <400» 38 аааааадаГа гсссаадааа агсссссдсг ΐΐ 32 <210» 39 <211» 42 <212» ΟΝΑ <213» агп£тс1а1 <220» <223» ргттег 55932 <400» 39 аааааадс!а дсд«гааас адгагааааа гсдсптг сс 42 <210» 40 <211» 38 <212» ΟΝΑ <213» аггИ1с1а1 <22О>

<223» ргттег 55933 <400» 40 аааааадсга дсдЬЫааас сддаадсИс ддГааааа 38 <210» 41 <211» 18 <212» 0ΝΑ <213» агг1£1С1а1 <220» <223» ргшег 55934 <400» 41 дъдсаддадс гсдггагс 18 <210» 42 <211» 18 <212» ϋΝΑ <213» агп'Ыста!

<220» <223» сге соп5еп5115 зедиепсе <220» <221» тт5с_£еа1иге <222» (5).-(5)

- 34 024834

<223>	η 15 а, с,	9.	ог	ΐ
<220>
<221>	пп зс_£еатиге
<222>	¢5)..(5)
<223>	η тз а, с,	9.	ог	ί
<220>
<221>	Ш1зс_£еагиге
<222>	¢11)..(11)
<223>	η 15 а, с,	9.	ог	ΐ

<400> 42 ммсдпаагсд пыншсамж 18 <210> 43 <211> 50 <212> ΟΝΑ <213> васгеМорЬаде т7 <400> 43 сГГаадааГТ аааддаддаа ГГсааааГдд садасаагаа саааддагсс 50 <210> 44 <211> 89 <212> ϋΝΑ <213> агеЮ'ста!

<22О>

<223> зедиепсе 5-3 <400> 44 аапдсдхсд адассссСдС дддссссдгс ««ддагсс ссдддасдгс дадассссгд 60 гдддгсгсдг ггггсдггга аасаадсгг 89 <210> 45 <211> 89 <212> ΟΝΑ <213> аггтЛста!

<22О>

<223> сотр1етепгагу го зеч. ίά. Νο. 44 <400> 45

Ггаасдсадс гсгддддаса сссададсаа аааассгадд ддсссгдсад сгсгддддас 60 асссададса ааааасаааг гтдггсдаа дд

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения гетерологического полипептида путём культивирования рекомбинантной бактериальной клетки-хозяина, катаболизм источников углерода которой находится под контролем углеродной катаболитной репрессии и системы фосфоенолпируват:углеводная фосфотрансфераза и которая генетически модифицирована так, что она не способна метаболизировать индуцирующий источник углерода через индуцируемый источником промотор, причем индуцирующий источник углерода представляет собой вторичный источник углерода для данной бактериальной клетки-хозяина и содержит вектор с промотором, индуцируемым указанным вторичным источником углерода, и гетерологическую последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полипептид, оперативным путём связываемый с этим промотором, причём процесс представляет собой непрерывный процесс культивирования с подпиткой, в котором после периодической стадии культивирования начинают индукцию добавлением первой порции индуцирующего вторичного источника углерода, а введение второй порции начинают во время экспоненциальной стадии выращивания одновременно с вводом питательного раствора.
2. 2. Способ по п.1, в котором в геноме бактериальной клетки-хозяина осуществляют делецию гена, кодирующего специфичную к индуктору 6-фосфат-изомеразу.
3. 3. Способ по п.2, в котором этот ген представляет собой ген таηΑ оперона маннозы.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором бактериальную клетку-хозяина выбирают из ВасШи§.