JP5176114B2

JP5176114B2 - 細菌宿主細胞におけるマンニトール誘導のプロモーター系

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Publication number: JP5176114B2
Application number: JP2008515835A
Authority: JP
Inventors: シュナイダー，ジェイ．，キャリエ; ロスナー，ベティナ
Original assignee: フェネックスインコーポレイテッド
Priority date: 2005-06-06
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2026-06-06
Also published as: JP2008545436A; AU2006255060A1; EP1888763A4; CA2610405A1; KR20080018937A; US20090162899A1; EP1888763A2; PL1888763T3; US20060292671A1; CA2610405C; BRPI0611112A2; KR101304921B1; US8017355B2; AU2006255060B2; CN101193906A; WO2006133210A3; WO2006133210A2; EP1888763B1; MX2007015355A; US7476532B2

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年６月６日出願の米国仮特許出願第６０／６８７，７６３号の優先権を主張する。

本発明は組換えペプチド生産の分野に関する。特に、本発明は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターを利用し、プロモーターからペプチドを発現する宿主細胞を、プロモーターを誘導するために利用されるマンニトール、グルシトールまたはアラビトールを代謝または分解するその能力に関して欠損性にする、組換えペプチドの改善された生産を提供する。加えて、本発明は、細菌宿主細胞が、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの類似体または誘導体を代謝または分解するその能力に関して欠損性にされている、組換えペプチドの生産のための改善された細菌宿主細胞を提供する。

組換えペプチドを生産するための細菌細胞の使用は、商業的にますます重要になりつつある。細菌発現系を開発する上での目標の１つは、迅速且つ効率的で豊富な、高品質の標的ポリペプチドの生産である。そのような発現系のための理想的宿主細胞は、増殖のために炭素源を効率的に利用することができ、標的ポリペプチドを効率的に生産し、発酵工程において速やかに高い細胞密度に増殖し、誘導されたときのみ標的ポリペプチドを発現し、標的ポリペプチドの安価で効率的な誘導を可能にすることができる。

理想的宿主細胞の創製のための１つのハードルは、発酵工程における標的ポリペプチドの非効率的で低いレベルの生産を克服することである。最適宿主細胞密度と発酵条件が達成されるまで標的ペプチドの発現を制御することは、ポリペプチドのより効率的でより高い収量を可能にする。この理由は、炭素源のより効率的な利用と宿主細胞への長期的な代謝ストレスの低減を含めて、重層的である。

発酵工程の間標的ポリペプチドの発現を制御するために１つの方法は、ペプチドの発現を制御する誘導性または調節可能なプロモーターの使用を含む。プロモーターは、核酸の転写を指令する、一般に所望ペプチドコード配列から上流に位置する調節核酸配列である。プロモーターは一般に、構成的または調節性プロモーターに分類される。調節性プロモーターは、（１）アクチベーターペプチドが５’調節領域に結合するまで不活性である、活性化プロモーター；および（２）５’調節領域がリプレッサーペプチドによって結合されている間不活性である、抑制性プロモーターを含む。一部の遺伝子またはオペロンは２つ以上の機構によって調節される。

誘導性または調節可能なプロモーターは、そのような調節可能なプロモーターはペプチド生産の誘導の前に細胞密度が最適レベルに達することを可能にするので、高レベルの組換えペプチドの効率的な生産のための必須成分であり得る。理想的プロモーターの属性は以下を含み得る：増殖期の間ほとんどまたは全く標的ペプチドが生成されないような厳格な抑制；誘導物質の添加後の強力なプロモーター活性；低コストの誘導；発酵工程のペプチド蓄積期の間に誘導物質を１回だけしか添加する必要がないように細胞培養培地における誘導物質の安定性；誘導物質の外部濃度が細胞内の内部濃度と直接関係し、ペプチド生産と直線的に関係するように、細胞膜を通るプロモーターの誘導物質の容易な通過；および他のプロモーターと縦列で使用される能力。そのような理想的プロモーターは、組換えペプチドが効率よく安価に高レベルで誘導されることを可能にする。

組換えペプチドの生産のための細菌発酵工程において広く使用されてきた１つの調節可能プロモーターは、ｌａｃプロモーターおよびその誘導体、特にｔａｃおよびｔｒｃプロモーターである。ｌａｃ型プロモーターを使用する商業的発酵系では、誘導物質、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）がほとんど例外なく使用される。しかし、ＩＰＴＧは、高価であり、生物系に対して重大な毒性があるので、慎重に管理しなければならない。標準ＩＰＴＧ製剤は現在、グラム当たり約１８米ドルまたは１０グラム当たり約１２５米ドルで入手可能である。加えて、標準ＩＰＴＧ製剤は、毒素であるジオキサンを含有し得る。ジオキサン不含ＩＰＴＧは市場で入手可能であるが、値段は標準ＩＰＴＧの価格のおおよそ２倍である。さらに、ヒト、動物および他の生物へのＩＰＴＧ毒性の危険度を考慮すると、発酵または発酵から精製されたタンパク質におけるＩＰＴＧの存在に関して環境および保健衛生上の規制の問題が生じる。

ＩＰＴＧに関連する毒性とコストのゆえに、組換えペプチドの生産のための細菌発酵工程において使用するための選択的な誘導性プロモーター系が提案されてきた。たとえばλＰ_RおよびλＰ_Lなどの高温、ｔｒｐなどのトリプトファン飢餓、ａｒａＢＡＤなどの１−アラビノース、ｐｈｏＡなどのリン酸飢餓、ｒｅｃＡなどのナリジクス酸、ｐｒｏＵなどの浸透圧、ｃｓｔ−１などのグルコース飢餓、ｔｅｔＡなどのテトラサイクリン、ｃａｄＡなどのｐＨ、ｎａｒなどの嫌気的条件、Ｔ４遺伝子３２などのＴ４感染、Ｐｍなどのアルキルまたはハロベンゾエート、Ｐｕなどのアルキルまたはハロトルエン、Ｐｓａｌなどのサリシレート、およびＶＨｂなどの酸素によって誘導されるプロモーターは、すべてＩＰＴＧ誘導性プロモーターの代替物として検討された。たとえばMakrides, S. C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538; Hannig G. & Makrides, S.C. (1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C. (2000) Structures 8, R177-R185; J. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp. 460-74 (1999) (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer, Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445 (2001); and R. Slater & R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (2000) (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)参照。これらのタイプのプロモーターに関していくつかの問題が存在する。たとえば高温誘導は細胞に有害であり得、装置の制限のために大規模発酵のためには実用的でないと考えられる；酸素操作は発酵の細胞増殖密度の態様の全体的動力学に影響を及ぼし、理想的条件を低下させ得る；トルエンまたは他の同様のタイプの潜在的に毒性の化学物質の使用は、これらの化合物が最終産物中に存在しないことを確実にするため、さらなる精製を必要とし得る；およびｐＨは、対象ペプチドが宿主において正しく折りたたまれるまたは可溶化される能力に影響を及ぼし、精製をよりコストのかかる困難なものにし得る。

安価で非毒性の炭素源によって誘導され得るプロモーターは、細菌発酵工程における使用のために依然として魅力的である。そのようなプロモーターの１つの潜在的な利点は、細菌宿主が、誘導物質を効率的に取り込むための内在性機構を有し得ることである。誘導物質として使用できる潜在的炭素源は、マルトース、マルトデキストリン、グルコース、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、スクロース、グリセロール、マンノース、アセテートおよびラクトースを含む。他の潜在的炭素源誘導物質は、アルコール形態の炭糖、たとえばマンニトール、グルシトールおよびアラビトールを含む。
（潜在的誘導物質としてのマンニトール）

マンニトールはマンノースのアルコール形態であり、シュードモナス属（Pseudomonads）を含む多くの細菌のための安価な炭素源である。シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐ．フルオレセンス）におけるマンニトールの取込みと分解に関与するオペロンは７個の遺伝子を含み、そのうちの４個（ｍｔｌＥＦＧＫ）はマンニトール／グルシトール／アラビトールの取込みと輸送に関与するタンパク質をコードし、その３個（ｍｔｌＤＹＺ）はマンニトール、グルシトールおよびアラビトールの異化作用に関与するタンパク質をコードする。Brunker et al. (1998) 「Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106,」 Gene 206(l):117-126および図１参照。

Brunker et al.は、さらに、Ｐ．フルオレセンスＤＳＭ５０１０６オペロン、ｍｔｌＥ内の最初の遺伝子の開始コドンから９０ｂｐ上流の大腸菌Σ７０プロモーターについてのコンセンサスに類似する配列を特定した。図２参照。推定上のプロモーターを含む６６０ｂｐフラグメントが、大腸菌におけるマンニトール誘導性発現を付与するルシフェラーゼ遺伝子の上流でクローン化された。アラビトールは遺伝子の発現を同じレベルに誘導し、グルシトールは半分の高さのレベルまで発現を誘導した。

炭素源誘導性プロモーターの利点は、しかし、無制限というわけではない。炭素源誘導性プロモーターを使用することに関連する１つの潜在的な問題は、宿主細胞が、誘導物質を代謝し、誘導物質の有効性を低下させる能力、または誘導の間誘導物質を培地に持続的に添加することの必要性である。加えて、誘導物質は発酵工程の炭素利用パラメータを損なうことがあり、絶え間ない誘導物質の流入は所望未満のペプチド生産収率を生じさせ得る。誘導の間持続的に誘導物質を培地に添加するという必要条件は、発酵工程のコストを上昇させるというさらなる難点を有する。

本発明は、標的ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターを利用して、細菌宿主において組換えペプチドを生産するための細菌細胞および方法を提供する。１つの実施形態では、細菌宿主細胞は発現系として使用することができる。一部の実施形態では、細胞は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトールを分解または代謝することができないようにされている。細菌細胞は、マンニトール、グルシトール、アラビトール、およびそれらの誘導体または類似体、またはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択されるより選択される炭素源を代謝または分解する能力を欠くので、これらの炭素源はポリペプチドの発現を誘導するために利用されることが可能であり、前記ポリペプチドをコードする核酸は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、誘導物質は宿主細胞によって持続的に代謝または分解されない。誘導物質は、それ故、さらなる誘導物質を培地に添加することを必要とせずに、発酵の間持続的で安定な誘導レベルを提供することができる。

一部の実施形態では、対象ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたマンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターを有する核酸構築物を含む細菌細胞が提供される。あるいは、１つの実施形態は、同じかまたは異なる１または複数の対象ペプチドに作動可能に連結された２以上のマンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターを含む１または複数の核酸構築物を含む細菌細胞を含む。付加的な実施形態では、プロモーターの少なくとも１個はマンニトール誘導性プロモーターであり、対象組換えペプチドを発現する細菌細胞は、マンニトールの分解または代謝を阻害するように遺伝的に操作されている。あるいは、プロモーターは、マンニトールに加えてグリセロールによる誘導が可能であり、対象組換えペプチドを発現する細菌細胞は、マンニトールの分解または代謝を阻害するように遺伝的に操作されている。

本発明において使用されるプロモーターは、炭素源である糖、アルコールまたはそれらの誘導体による誘導が可能である。典型的には、プロモーターはマンニトール、アラビトールまたはグルシトールによって誘導され得る。あるいは、プロモーターはグリセロールによっても誘導され得る。一部の実施形態では、プロモーターはマンニトール誘導性プロモーターであり得る。また別の実施形態では、プロモーターは、内在性細菌マンニトールオペロンの推定上のプロモーターを含むことができ、マンニトール誘導体またはその類似体によって誘導される。他の実施形態では、マンニトールプロモーターは、マンニトール、グルシトール、アラビトール、グリセロール、またはそれらの誘導体または類似体、またはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択されるより選択される炭素源によって誘導され得る。

付加的な実施形態では、プロモーターは、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）ｍｔｌＥＦＧＫＤＹＺオペロンの推定上のプロモーターを含み得る。さらなる実施形態では、プロモーターはさらに、ｍｔｌアクチベータータンパク質（ＭｔｌＲ）結合領域として働く核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、プロモーターの核酸配列は、配列番号１〜１３から成る群より選択される。１つの実施形態では、プロモーターの核酸配列は配列番号９または配列番号１２を含む。１つの実施形態では、核酸配列は、シュードモナス・フルオレセンスＭＢ１０１ｍｔｌＥ遺伝子の上流の少なくとも２９９個の連続ヌクレオチドの範囲を含む。付加的な実施形態では、プロモーターは、シュードモナス・フルオレセンスｍｔｌＥＦＧＫＤＹＺオペロンの推定上のプロモーターのヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。付加的な実施形態は、プロモーターが、配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列であるものを含む。１つの実施形態では、プロモーターは、配列番号９および１２から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列である。１つの実施形態では、プロモーターは、配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列である。１つの実施形態では、プロモーターは、配列番号９または配列番号１２から選択される核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または配列番号９および１２から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列である。ある実施形態では、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシー条件下である。

本発明の実施形態はまた、対象組換えペプチドのための発現系として、炭素源を代謝または分解することができないようにした細菌細胞を含む。この炭素源は、マンニトール、グルシトール、アラビトール、およびそれらの誘導体または類似体から選択され得る。一部の実施形態では、突然変異は、誘導物質として使用される炭素源の代謝または分解のために必要な酵素をコードする少なくとも１個の遺伝子の突然変異または欠失を通しての外因性遺伝子操作の結果である。他の実施形態では、１突然変異または欠失遺伝子は、マンニトール、アラビトールまたはグルシトール、またはそれらの誘導体または類似体の代謝または分解において必要な酵素をコードする１遺伝子である。もう１つの実施形態では、１突然変異または欠失遺伝子は、マンニトール、またはその誘導体または類似体の代謝において必要な１遺伝子である。さらなる実施形態では、遺伝子はｍｔｌオペロンから選択される。たとえば突然変異または欠失遺伝子は、ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺから成る群より選択され得る。代替的実施形態では、突然変異または欠失は、ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺ（ｍｔｌＤＹＺ）の少なくとも２個の組合せを含む。１つの実施形態では、細胞は少なくともｍｔｌＤの突然変異または欠失を含む。付加的な実施形態では、細胞は、ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺ（ｍｔｌＤＹＺ）の各々における突然変異または欠失を含む。

一部の実施形態では、細菌細胞または発現系は、炭素源誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸を発現することができる何らかの細菌細胞から選択される。１つの実施形態では、細菌細胞は、シュードモナス属（Pseudomonads）および密接に関連する細菌から選択される。１つの実施形態では、細菌細胞はシュードモナス菌（Pseudomonas）である。ある実施形態では、細菌細胞はシュードモナス・フルオレセンスである。他の実施形態では、細菌細胞は大腸菌である。

本発明の実施形態はまた、炭素源誘導性プロモーターを利用して細菌宿主細胞において組換えペプチドを生産するための方法を提供する。付加的な実施形態は、低コストの炭素源化学物質によって誘導される大規模細菌発酵工程における使用のための選択的プロモーターを提供する。本発明の他の実施形態は、炭素源によって誘導されるプロモーターからの組換えタンパク質の発現のための改善された細菌宿主細胞を提供する。

本発明はさらに、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体を分解するまたは代謝することができないようにした細菌細胞を提供すること、誘導物質がマンニトール、グルシトール、アラビトール、グリセロール、またはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される、少なくとも１個の炭素源誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の対象ペプチドをコードする少なくとも１個の核酸を含む少なくとも１個の核酸構築物で細胞を形質転換すること、およびペプチド発現を促進する条件下で細胞を増殖させることを含む、組換えペプチドを生産するための方法を提供する。ある実施形態では、対象ペプチドの発現は、誘導物質濃度と直接相関して線形的に制御される。一部の実施形態では、少なくとも１個のプロモーターはマンニトール誘導性プロモーターであり、誘導物質はマンニトール、アラビトール、グルシトール、グリセロール、またはそれらの誘導体または類似体である。一部の実施形態では、少なくとも１個のプロモーターはマンニトール誘導性プロモーターであり、誘導物質はグリセロールまたはその誘導体または類似体である。一部の実施形態では、少なくとも１個のプロモーターはマンニトール誘導性プロモーターであり、細菌細胞はマンニトールを代謝または分解することができないようにされており、誘導物質はマンニトール、アラビトール、グルシトール、グリセロール、またはそれらの誘導体または類似体である。

他の実施形態では、本発明は、マンニトール、グルシトール、アラビトール、またはそれらの類似体または誘導体を分解または代謝するその能力を欠損するようにした細菌細胞における、他の誘導性プロモーターと組み合わせてマンニトール、グルシトール、アラビトールまたはグリセロール、またはそれらの類似体によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されたペプチドをコードする核酸の発現を提供する。他の実施形態では、付加的な誘導性プロモーターは、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターに縦列で作動可能に連結され得る。他の実施形態では、プロモーターは互いに独立しており、対象ペプチドをコードする核酸を分離するように作動可能に連結されている。本発明の付加的な実施形態は、少なくとも１個のマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターを含み、プロモーターは互いに独立しており、異なる対象ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている、多数のプロモーターの使用を含む。これらの実施形態では、プロモーターは、異なる時点で、またはたとえば誘導物質濃度勾配の使用によって制御される、異なる発現レベルで、差次的に誘導され得る。

本発明は、マンニトール、アラビトール、グルシトールまたはグリセロール誘導性プロモーターを利用して細菌宿主において組換えペプチドを生産するための方法を提供し、前記ペプチドを生産する宿主細菌細胞は、マンニトール、アラビトールまたはグルシトール、またはそれらの誘導体または類似体を分解するまたは代謝することができないようにされている。本発明は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体または類似体の代謝または分解を阻害するように遺伝的に変化した細菌細胞を提供する。ある実施形態では、マンニトール、アラビトール、グルシトールまたはグリセロールを、その後、誘導性プロモーターから標的ポリペプチドの発現を誘導するために使用することができ、組換えペプチドの生産のための発酵工程における安価で安定な炭素源誘導物質の使用を可能にする。細菌細胞はマンニトール、グルシトールまたはアラビトールを代謝するまたは分解する能力を欠くので、これらの炭素源を誘導物質として使用すれば、誘導物質が宿主細胞によって持続的に代謝または分解されることがなく、それ故、追加誘導物質を培地に添加する必要なしに発酵の間持続的で安定な誘導レベルを提供することができる。一部の実施形態では、細菌細胞は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体または類似体を分解するまたは代謝することができないようにされており、対象ペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターは、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体または類似体に加えて、グリセロールによる誘導も可能である。
Ｉ．マンニトール誘導性プロモーター

本発明における使用のためのプロモーターは、典型的には、対象ペプチドをコードする核酸配列の上流に位置する２５核酸以上の核酸配列である。プロモーターは一般に−３５領域を含み、前記領域は、一般に対象ペプチドについての転写開始部位の約３５塩基対上流から始まる５〜６核酸配列である。対象ペプチドについての転写開始部位は、一般に＋１と数えられる。

本発明では、炭素源による誘導が可能な誘導性プロモーターを利用する。一部の実施形態では、プロモーターは、マンニトール、アラビトール、グルシトールおよびグリセロール、またはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源によって誘導することができる。他の実施形態では、プロモーターは、マンニトールまたはマンニトール誘導体誘導性プロモーターである。付加的な実施形態では、プロモーターは、内在性細菌マンニトールオペロンの推定上のプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、シュードモナス・フルオレセンスｍｔｌＥＦＧＫＤＹＺオペロンの推定上のプロモーターおよび関連調節領域である。本発明の他の実施形態では、マンニトール誘導性プロモーターは、マンニトール以外の炭素源によって誘導され得る。そのような炭素源は、グルシトール、アラビトールおよびグリセロールを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、炭素源はグリセロールである。

一部の実施形態では、本発明のマンニトール誘導性プロモーターは、１５〜２０ヌクレオチドのリンカーによって、天然プロモーターの−１０領域の上流に結合されたシュードモナス属の天然ｍｔｌオペロンプロモーターの−３５領域を含む。他の実施形態では、リンカーは１７〜１８ヌクレオチド長である。もう１つの実施形態では、−３５領域は、核酸配列５’−ＴＴＧＴＣＡ−３’から構成される。さらにもう１つの実施形態では、−１０領域は、核酸配列５’−ＴＧＴＡＡＴ−３’から構成される。さらにもう１つの実施形態では、プロモーターは、１５〜２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列に連結された−３５領域５’−ＴＴＴＧＴＣ−３’から構成され、前記配列はさらに−１０領域５’−ＴＧＴＡＡＴ−３’に連結されている。

代替的実施形態では、マンニトール誘導性プロモーターは、５’−ＴＴＧＴＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴ−３’（配列番号１）（表１）を含むヌクレオチド配列を含む。もう１つの実施形態では、プロモーターは、５’−ＴＴＧＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴ−３’（配列番号２）（表１）を含むヌクレオチド配列を含む。さらにもう１つの実施形態では、プロモーターは、５’−ＴＴＧＴＣＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＡＴ−３’（配列番号３）（表１）を含むヌクレオチド配列を含む。さらにもう１つの実施形態では、プロモーターは、核酸配列５’−ＴＴＧＴＣＧＧＴＴＧＣＧＴＧＡＣＧＣＧＣＣＴＧＴＧＴＡＡ−３’（配列番号４）（表１）を含む。

一部の実施形態では、本発明のマンニトール誘導性プロモーターはさらに、アクチベーターまたはリプレッサーペプチド結合部位として働く核酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸配列はアクチベーターペプチド結合部位として働く。他の実施形態では、アクチベーター部位は、内在性シュードモナス属ＭｔｌＲタンパク質結合部位からの核酸配列である。他の実施形態では、アクチベーター部位は、内在性シュードモナス・フルオレセンスＭｔｌＲタンパク質結合部位からの核酸配列である。

一部の実施形態では、アクチベーター結合部位は、核酸配列５’−ＡＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＧＴＡＡＧＣＧＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴ−３’（配列番号５）（表２）を含む。もう１つの実施形態では、アクチベーター結合部位は、核酸配列５’−ＡＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＧＴＣＣＡＡＧＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴ−３’（配列番号６）（表２）を含む。あるいは、アクチベーター結合部位は、核酸配列５’−ＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＧＴＧＣＴＡＧＧＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号７）（表２）を含む。もう１つの実施形態では、アクチベーター結合部位は、５’−ＧＧＣＧＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴ−３’（配列番号８）（表２）を含む。

付加的な実施形態では、本発明のマンニトール誘導性プロモーターは、内在性シュードモナス属ｍｔｌオペロンの２９９塩基対領域である、配列番号９を含む（表３）。もう１つの実施形態では、本発明のマンニトールプロモーターは、内在性シュードモナス属ｍｔｌオペロンの２０３塩基対領域である、配列番号１０を含む（表３）。さらにもう１つの実施形態では、本発明のプロモーターは、内在性シュードモナス属ｍｔｌオペロンからの１２６塩基対領域、配列番号１１を含む（表３）。もう１つの実施形態では、本発明のプロモーターは、内在性シュードモナス属ｍｔｌオペロンからの１４７塩基対領域、配列番号１２を含む（表３）。付加的な実施形態では、本発明のプロモーターは、内在性シュードモナス属ｍｔｌオペロンからの７７塩基対領域、配列番号１３を含む（表３）。

付加的な実施形態は、プロモーターが、配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列であるものを含む。１つの実施形態では、プロモーターは、配列番号９および１２から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列である。

１つの実施形態では、プロモーターは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜１３から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列である。１つの実施形態では、プロモーターは、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号９または配列番号１２から選択される核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列、または、高ストリンジェンシー条件下で、配列番号９および１２から成る群より選択されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列である。

本明細書において列挙する配列は相同であり得る（類似の同一性を有し得る）。核酸および／または核酸配列は、それらが、天然にまたは人工的に、共通の祖先核酸または核酸配列に由来するとき、相同である。たとえば、いかなる天然に生じる核酸も、核酸配列内に１またはそれ以上の変化を含むように何らかの使用可能な突然変異誘発法によって修飾することができる。相同性は一般に、２またはそれ以上の核酸（またはその配列）の間の配列類似性から推測される。相同性を確立する上で有用な配列間の類似性の正確なパーセンテージは、問題となる核酸によって異なるが、わずかに２５％の類似性が相同性を確立するために日常的に使用される。より高レベルの配列類似性、たとえば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上も、相同性を確立するために使用できる。配列類似性パーセンテージを決定するための方法（たとえばデフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮ）はここで説明されており、一般に使用可能である。

ヌクレオチド配列を比較するとき、最大一致のために整列したとき２個の配列内の核酸の配列が同じである場合、２個の配列は「同一」と呼ばれる。２個の配列の間の比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定し、比較するために比較ウインドウ全体にわたって配列を比較することによって実施される。ここで使用する「比較ウインドウ」は、２個の配列を最適に整列した後、配列を同じ数の隣接位置の標準配列と比較し得る、少なくとも約２０の隣接位置、通常３０〜約７５、４０〜約５０の隣接位置のセグメントを指す。

比較のための配列の最適アラインメントは、デフォルトパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＬａｓｅｒｇｅｎｅセット中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献に述べられているいくつかのアラインメントスキームを具体化する：Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345 358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626 645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151 153; Myers, E. W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11 17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406 425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, Calif; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726730。

あるいは、比較のための配列の最適アラインメントは、Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482の局所的同一性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性に関する検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実施（ｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって実施し得る。

配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適し得るアルゴリズムの一例は、それぞれAltschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389 3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410に述べられている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性パーセントを決定するために、たとえばここで述べるパラメータと共に、使用することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用できる。各々の方向でのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からＸ量だけ減少する；１またはそれ以上の負のスコアリング残基の整列の蓄積のために、累積スコアがゼロまたはそれ以下になる；またはいずれかの配列の末端に達する、ときに中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸがアラインメントの感受性と速度を決定する。

１つのアプローチでは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較のウインドウにわたって２個の最適整列した配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のヌクレオチド配列の部分は、２個の配列の最適整列のための標準配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき、２０％またはそれ以下、通常５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列で同一核酸残基が生じる位置の数を測定してマッチする位置の数を導き、マッチした位置の数を標準配列内の位置の総数（すなわちウインドウの大きさ）で除して、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを導くことによって計算される。

ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、一般に、（１）洗浄のために低イオン強度と高温、たとえば５０℃で０．０１５ＭＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを用いる、または（２）ハイブリダイゼーションの間に、たとえばホルムアミドなどの変性剤を用いる、条件を指す。当業者は、明瞭で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るためにストリンジェンシー条件を決定し、適切に変化させることができる。たとえばストリンジェンシーは一般に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間に存在する塩濃度を上昇させること、温度を低下させること、またはそれらの組合せによって低下させ得る。たとえばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York, (1989)参照。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、配列の間に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％の同一性が存在する場合にハイブリダイゼーションが起こることを許容する条件を含む。高ストリンジェンシー条件下では、高度に相補的な核酸雑種が形成される；十分な度合いの相補性を持たない雑種は形成されない。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーは、雑種を形成する２本の核酸鎖の間に必要な相補性の量を決定する。
ＩＩ．宿主細胞

本発明はまた、誘導性プロモーターから発現を誘導するために使用できる、マンニトール、グルシトール、アラビトールおよびそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源を代謝または分解する能力を低下させるように遺伝的に修飾された細菌細胞を提供する。遺伝的修飾は、誘導性プロモーターから発現を誘導するために利用される、マンニトール、グルシトール、アラビトールおよびそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源を代謝または分解することに関与する代謝経路において作動性である酵素をコードする１または複数の遺伝子であり得る。好ましくは、宿主細胞は、誘導物質の代謝または分解に関連する酵素活性をコードする遺伝子への遺伝的修飾を有するが、誘導物質の輸送に関連する遺伝子は影響を受けず、その後の分解または代謝を伴わずに細胞内への輸送を許容する。一部の実施形態では、細菌細胞は大腸菌細胞である。一部の実施形態では、細菌細胞は、シュードモナス属および密接に関連する細胞から選択される。一部の実施形態では、細菌細胞はシュードモナス・フルオレセンス細胞である。

本発明における使用のために選択される細菌宿主細胞は、誘導性プロモーターから対象ペプチドの発現を誘導するために利用される何らかの誘導物質を代謝するまたは分解するその能力を欠損性にすることができる。たとえばマンニトールを誘導物質として選択する場合、宿主細胞を、マンニトールを代謝するために必要な酵素、またはマンニトールを代謝することができる何らかの有効な置換酵素を発現するその能力を欠損性にすることができる。一部の実施形態では、宿主細胞が、そのゲノムから、誘導物質の代謝または分解に関与する機能的酵素を発現することができないようにそのゲノムを変化させることによって、宿主細胞を誘導物質の代謝または分解に関して欠損性にする。この変化は、１または複数の代謝または分解酵素をコードする遺伝子の、細胞のゲノムコード配列を変化させることによって実施できる。他の実施形態では、コード配列の変化は、コード配列読み枠を変化させる挿入または欠失突然変異；十分な数のコドンを変化させる置換または逆位突然変異；および／または非機能的酵素を生産することができる十分に大きな群の隣接コドンを欠失させる欠失突然変異を導入することによって達成される。

そのようなノックアウト菌株は、有効であることが当分野において公知の様々な方法のいずれかに従って作製できる。たとえば所望核酸欠失配列の５’側と３’側の相同的標的遺伝子配列を含む相同的組換えベクターを宿主細胞に形質転換することができる。理想的には、相同的組換え時に、所望標的酵素遺伝子ノックアウトが生産できる。

遺伝子ノックアウト法の特定例は当分野において周知である。たとえばポリヌクレオチドの挿入による遺伝子不活性化がこれまでに記述されている。たとえばDL Roeder & A Collmer, Marker-exchange mutagenesis of a pectate lyase isozyme gene in Erwinia chrysanthemi, J Bacteriol. 164(l):51-56 (1985)参照。あるいは、トランスポゾン突然変異誘発と所望表現型（特定炭素源の代謝不能など）についての選択が、標的遺伝子が挿入によって不活性化された細菌株を単離するために使用できる。たとえばK Nida & PP Cleary, Insertional inactivation of streptolysin S expression in Streptococcus pyogenes, J Bacteriol. 155(3):1156-61 (1983)参照。遺伝子内の特定突然変異または欠失は、たとえばJA Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34(2-3):315-23 (1985)に述べられているように、カセット突然変異誘発を用いて構築することができ、前記カセット突然変異誘発によって直接またはランダム突然変異が遺伝子の選択部分内に作製され、その後相同的組換えによって遺伝子の染色体コピーに組み込まれる。

本発明の付加的な実施形態では、細菌細胞を、組換えペプチド発現のための誘導物質として使用される炭素源を代謝するために必要な酵素に関して欠損性にする。一部の実施形態では、細菌細胞を、炭素源であるマンニトール、グルシトール、アラビトールまたはそれらの誘導体を代謝するために必要な酵素に関して欠損性にする。一部の実施形態では、細菌細胞を、内在性マンニトールオペロン−ｍｔｌからの遺伝子によってコードされる酵素活性を欠くように構築する。もう１つの実施形態では、細菌細胞を、内在性ｍｔｌＤ遺伝子またはそのホモログによってコードされる酵素活性を欠くように構築する。代替的実施形態では、細菌細胞を、内在性ｍｔｌＹ遺伝子またはそのホモログによってコードされる酵素活性を欠くように構築する。さらにもう１つの実施形態では、細菌細胞を、内在性ｍｔｌＺ遺伝子またはそのホモログによってコードされる酵素活性を欠くように構築する。あるいは、細菌細胞を、ｍｔｌＤＹＺ遺伝子またはそれらのホモログによってコードされる酵素の何らかの組合せの活性を欠くように構築することができる。付加的な実施形態では、細菌細胞を、内在性ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺ遺伝子によってコードされる酵素活性を欠くように構築する。

代替的実施形態では、細菌細胞は、炭素源の分解または代謝のために必要な内在性遺伝子内で天然に生じる突然変異の故に、組換えペプチド発現のための誘導物質として使用される炭素源を分解または代謝することができない、天然変異型であり得る。

加えて、本発明はさらに、マンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターである、少なくとも１個の炭素源誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の対象ペプチドをコードする核酸配列を有する核酸構築物を含む細菌細胞を提供する。一部の実施形態では、炭素源誘導性プロモーターはマンニトール誘導性プロモーターである。他の実施形態では、マンニトール誘導性プロモーターはグリセロールによって誘導され得る。

あるいは、細菌細胞は、少なくとも１個の炭素源誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の対象ペプチドをコードする核酸配列を含む第一核酸構築物、および少なくとも１個の誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の対象ペプチドをコードする核酸配列を含む第二核酸構築物を含む。一部の実施形態では、炭素源誘導性プロモーターは、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターである。多数のプロモーターが、同じ核酸構築物上に位置する、または別々の核酸構築物上に位置することができる。発酵工程の間、対象ペプチドの発現は、異なる時点または異なる発現レベルを含む、差次的な方法で誘導することができる。ある実施形態では、本発明のマンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターと組み合わせて使用される誘導性プロモーター（及び関連誘導物質）は、たとえばｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｌａｃＵＶ５（ＩＰＴＧ）、ｔａｃ（ＩＰＴＧ）、ｔｒｃ（ＩＰＴＧ）、Ｐ_syn（ＩＰＴＧ）、ｔｒｐ（トリプトファン飢餓）、ａｒａＢＡＤ（１−アラビノース）、ｌｐｐ^a（ＩＰＴＧ）、ｌｐｐ−ｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｐｈｏＡ（リン酸飢餓）、ｒｅｃＡ（ナリジクス酸）、ｐｒｏＵ（浸透圧）、ｃｓｔ−１（グルコース飢餓）、ｔｅｔＡ（テトラサイクリン）、ｃａｄＡ（ｐＨ）、ｎａｒ（嫌気的条件）、ＰＬ（４２℃への温度シフト）、ｃｓｐＡ（２０℃への温度シフト）、Ｔ７（熱誘導）、Ｔ７−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ３−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ５−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ４遺伝子３２（Ｔ４感染）、ｎｐｒＭ−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｐｍ（アルキルまたはハロベンゾエート）、Ｐｕ（アルキルまたはハロトルエン）、Ｐｓａｌ（サリシレート）、ａｎｔ（アントラニレート）、ｂｅｎ（ベンゾエート）またはＶＨｂ（酸素）プロモーターを含み得る。たとえばMakrides, S.C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538; Hannig G. & Makrides, S.C. (1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C. (2000) Structures 8, R177-R185参照。たとえばJ. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (1999) (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer, Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445 (2001); and R. Slater & R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (2000) (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)参照。

細菌細胞に含まれる核酸構築物は、エピソームのように維持され得るかまたは細胞のゲノムに組み込まれ得る。

細菌生物
本発明は、対象ペプチドの発現を誘導するために利用される、マンニトール、グルシトールおよびアラビトールまたはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源の代謝のために必要な酵素を欠損している細菌細胞であって、前記対象ペプチドをコードする核酸配列が、マンニトール、グルシトール、アラビトールおよびそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結されている、前記細菌細胞を提供する。本発明は、組換えペプチドを発現することができるいかなる細菌細胞の利用も考慮する。そのような細胞は当分野において周知である。一部の実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞であり得る。もう１つの実施形態では、細胞は、シュードモナス属または密接に関連する細胞から選択される。他の実施形態では、細菌細胞はシュードモナス・フルオレセンスである。一部の実施形態では、細菌細胞は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトールまたはそれらの誘導体または類似体から成る群より選択される炭素源の代謝のために必要な酵素に関して欠損性であり得る。

シュードモナス属および密接に関連する細菌は、ここで使用するとき、ここで「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１（Proteobacteria Subgroup 1）」と定義する群と同一の広がりを有する（co-extensive）。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」は、より詳細には、R.E. Buchanan and N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289 (8th ed., 1974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, USA)(以下「Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）」)によって「グラム陰性好気性杆菌および球菌」と命名された分類「部分（Part）」に属すると表わされる科および／または属に属するプロテオバクテリア門の群と定義される。表４は、この分類「部分」楡居されている生物の科および属を示す。

「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、その下に分類されるすべてのプロテオバクテリア、ならびにその分類「部分」を形成するときに使用される判定基準に従って分類されるすべてのプロテオバクテリアを含む。その結果として、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、たとえば：すべてのグラム陽性細菌；このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）分類学の１９「部分」のその他に属する、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）；その科が、その後古細菌（Archaea）の非細菌科として認識されてきた、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「部分」の「科Ｖ．ハロバクテリウム科」全体；およびその属が、その後非プロテオバクテリア属の細菌として認識されてきた、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「部分」の中に列挙されるテルムス属を除外する。

「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「部分」の中で定義される属および科に属し（および以前はその種と呼ばれた）、その後他のプロテオバクテリア分類名を与えられたプロテオバクテリアをさらに含む。一部の場合には、これらの再命名は全く新しいプロテオバクテリア属の創造を生じさせた。たとえばアシドボラクス属(Acidovorax)、ブレブンジモナス属（Brevundimonas）、ブルクホルデリア属（Burkholderia）、ヒドロゲノファガ属（Hydrogenophaga）、オセアニモナス属（Oceanimonas）、ラルストニア属（Ralstonia）およびステノトロフォモナス属（Stenotrophomonas）は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）において定義されたシュードモナス属に属する（および以前はその種と呼ばれた）生物を再分類することによって創造された。同様に、たとえばスフィンゴモナス属（Sphingomonas）（およびそれに由来するブラストモナス属（Blastomonas））は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）において定義されたキサントモナス属（Xanthomonas）に属する（および以前はその種と呼ばれた）生物を再分類することによって創造された。同様に、たとえばアシドモナス属は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）において定義されたアセトバクター属（Acetobacter）に属する（および以前はその種と呼ばれた）生物を再分類することによって創造された。そのようなその後再指定された種も、ここで定義する「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」に含まれる。

また別の場合には、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「部分」の中で定義される属および科に属するプロテオバクテリア種は、単にプロテオバクテリアの他の既存の属に再分類された。たとえばシュードモナス属の場合、シュードモナス・エナリア（Pseudomonas enalia）（ＡＴＣＣ１４３９３）、シュードモナス・ニグリファシエンス（Pseudomonas nigrifaciens）（ＡＴＣＣ１９３７５）およびシュードモナス・プトレファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）（ＡＴＣＣ８０７１）は、その後それぞれアルテロモナス・ハロプランクティス（Alteromonas haloplanktis）、アルテロモナス・ニグリファシエンス（Alteromonas nigrifaciens）およびアルテロモナス・プトレファシエンス（Alteromonas putrefaciens）として再分類された。同様に、たとえばシュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）（ＡＴＣＣ１５６６８）およびシュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）（ＡＴＣＣ１１９９６）は、その後それぞれコマモナス・アシドボランス（Comamonas acidovorans）およびコマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）として再分類された；およびシュードモナス・ニグリファシエンス（ＡＴＣＣ１９３７５）およびシュードモナス・ピシシダ（Pseudomonas piscicida）（ＡＴＣＣ１５０５７）は、その後それぞれシュードアルテロモナス・ニグリファシエンス（Pseudoalteromonas nigrifaciens）およびシュードアルテロモナス・ピシシダ（Pseudoalteromonas piscicida）として再分類された。そのようなその後再指定されたプロテオバクテリア種も、ここで定義する「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」に含まれる。

「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」はまた、その後発見された、またはその後このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「部分」のプロテオバクテリア科および／または属に属すると再分類されたプロテオバクテリア種を含む。プロテオバクテリア科に関して、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」はまた、以下の科のいずれかに属すると分類されたプロテオバクテリアを含む：シュードモナス科、アゾトバクター科（現在はしばしば同義語、シュードモナス科の「アゾトバクター属」と呼ばれる）、リゾビウム科、およびメチロモナス科（現在はしばしば同義語、「メチロコッカス科」と呼ばれる）。その結果として、ここで述べる属に加えて、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」の中に含まれるさらなるプロテオバクテリア属は、以下を含む：１）アゾトバクター群のアゾリゾフィルス（Azorhizophilus）属の細菌；２）シュードモナス科のセルビブリオ（Cellvibrio）属、オリゲラ（Oligella）属およびテレジニバクター(Teredinibacter)属の細菌；３）リゾビウム科のケラトバクター（Chelatobacter）属、エンシファー（Ensifer）属、リベリバクター（Liberibacter）属（「カンジダタス・リベリバクター（Candidatus Liberibacter）」とも呼ばれる）およびシノリゾビウム（Sinorhizobium）属の細菌; およびメチロコッカス科のメチロバクター（Methylobacter）属、メチロカルダム（Methylocaldum）属、メチロミクロビウム（Methylomicrobium）属、メチロサルシナ（Methylosarcina）属およびメチロスフェラ（Methylosphaera）属の細菌。

本発明の実施形態は、宿主細胞が、上記で定義した「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」から選択されるものを含む。

もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される（カタログに列挙され、公的に入手可能である、その寄託菌株の総数を括弧内に示しており、異なる指示がない限りすべてＡＴＣＣに寄託されている）：アシドモナス（２）；アセトバクター（９３）；グルコノバクター（３７）；ブレブンジモナス（２３）；ベイジェリンキア（１３）；デルキシア（２）；ブルセラ（４）；アグロバクテリウム（７９）；ケラトバクター（２）；エンシファー（３）；リゾビウム（１４４）；シノリゾビウム（２４）；ブラストモナス（１）；スフィンゴモナス（２７）；アルカリゲネス（８８）；ボルデテラ（４３）；ブルクホルデリア（７３）；ラルストニア（３３）；アシドボラクス（２０）；ヒドロゲノファガ（９）；ズーグレア（９）；メチロバクター（２）；メチロカルダム（ＮＣＩＭＢにおいて１）；メチロコッカス（２）；メチロミクロビウム（２）；メチロモナス（９）；メチロサルシナ（１）；メチロスフェラ；アゾモナス（９）；アゾリゾフィルス（５）；アゾトバクター（６４）；セルビブリオ（３）；オリゲラ（５）；シュードモナス（１１３９）；フランシセラ（４）；キサントモナス（２２９）；ストエノトロフォモナス（５０）；およびオセアニモナス（４）。

「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」の例示的な宿主細胞種は、以下の細菌を含むが、これらに限定されない（その例示的な菌株のＡＴＣＣまたは他の寄託番号を括弧内に示す）：アシドモナス・メタノリサ（Acidomonas meihanolica）（ＡＴＣＣ４３５８１）；アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）（ＡＴＣＣ１５９７３）；グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）（ＡＴＣＣ１９３５７）；ブレブンジモナス・ジミニュータ（Brevundimonas diminuta）（ＡＴＣＣ１１５６８）；ベイジェリンキア・インディカ（Beijerinckia indica）（ＡＴＣＣ９０３９およびＡＴＣＣ１９３６１）；デルキシア・グモーサ（Derxia gummosa）（ＡＴＣＣ１５９９４）；ブルセラ・メリテンシス（Brucella melitensis）（ＡＴＣＣ２３４５６）、ブルセラ・アボラタス（Brucella abortus）（ＡＴＣＣ２３４４８）；アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＡＴＣＣ２３３０８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）（ＡＴＣＣ１９３５８）、アグロバクテリウム・リゾーゲネス（Agrobacterium rhizogenes）（ＡＴＣＣ１１３２５）；ケラトバクター・ヘインチ（Chelatobacter heintzii）（ＡＴＣＣ２９６００）；エンシファー・アドヘエレンス（Ensifer adhaerens）（ＡＴＣＣ３３２１２）；リゾビウム・レグミノザラム（Rhizobium leguminosarum）（ＡＴＣＣ１０００４）；シノリゾビウム・フレディ（Sinorhizobium fredii）（ＡＴＣＣ３５４２３）；ブラストモナス・ナタトリア（Blastomonas natatoria）（ＡＴＣＣ３５９５１）；スフィンゴモナス・パウチモビリス（Sphingomonas paucimobilis）（ＡＴＣＣ２９８３７）；アルカリゲネス・フェイシャリス（Alcaligenes faecalis）（ＡＴＣＣ８７５０）；ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）（ＡＴＣＣ９７９７）；ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）（ＡＴＣＣ２５４１６）；ラルストニア・ピケッチ（Ralstonia pickettii）（ＡＴＣＣ２７５１１）；アシドボラクス・ファシリス（Acidovorax facilis）（ＡＴＣＣ１１２２８）；ヒドロゲノファガ・フラバ（Hydrogenophaga flava）（ＡＴＣＣ３３６６７）；ズーグレア・ラミジェラ（Zoogloea ramigera）（ＡＴＣＣ１９５４４）；メチロバクター・ルーテウス（Methylobacter luteus）（ＡＴＣＣ４９８７８）；メチロカルダム・グラシーレ（Methylocaldum gracile）（ＮＣＩＭＢ１１９１２）；メチロコッカス・カプスラタス（Methylococcus capsulatus）（ＡＴＣＣ１９０６９）；メチロミクロビウム・アギール（Methylomicrobium agile）（ＡＴＣＣ３５０６８）；メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanica）（ＡＴＣＣ３５０６７）；メチロサルシナ・フィブラータ（Methylosarcina fibrata）（ＡＴＣＣ７００９０９）；メチロスフェラ・ハンソニイ（Methylosphaera hansonii）（ＡＣＡＭ５４９）；アゾモナス・アギリス（Azomonas agilis）（ＡＴＣＣ７４９４）；アゾリゾフィルス・パスパリ（Azorhizophilus paspali）（ＡＴＣＣ２３８３３）；アゾトバクター・クロオコクム（Azotobacter chroococcum）（ＡＴＣＣ９０４３）；セルビブリオ・ミクタス（Cellvibrio mixtus）（ＵＱＭ２６０１）；オリゲラ・ウレサラリス（Oligella urethralis）（ＡＴＣＣ１７９６０）；シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（ＡＴＣＣ１０１４５）、シュードモナス・フルオレセンス（ＡＴＣＣ３５８５８）；フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）（ＡＴＣＣ６２２３）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）（ＡＴＣＣ１３６３７）；キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)（ＡＴＣＣ３３９１３）；およびオセアニモナス・ドウドロッフィ(Oceanimonas doudoroffii）（ＡＴＣＣ２７１２３）。

もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；アグロバクテリウム；リゾビウム；シノリゾビウム；ブラストモナス；スフィンゴモナス；アルカリゲネス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロゲノファガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

もう１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群４」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群４」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロゲノファガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

１つの実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群６」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群６」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロゲノファガ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群８」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群８」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロゲノファガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；キサントモナス；およびオセアニモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群９」から選択される。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群９」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロゲノファガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびオセアニモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１０」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１０」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびキサントモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１１」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１１」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス；ステノトロフォモナス；およびキサントモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１３」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１３」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；およびキサントモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１４」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１４」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナスおよびキサントモナス。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群と定義される。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１６」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１６」は、以下のシュードモナス種のプロテオバクテリアの群と定義される（例示的な菌株のＡＴＣＣまたは他の寄託番号を括弧内に示す）：シュードモナス・アビエタニフィラ（Pseudomonas abietaniphila）（ＡＴＣＣ７００６８９）；シュードモナス・エルギノーサ（ＡＴＣＣ１０１４５）；シュードモナス・アルカリゲンス（ＡＴＣＣ１４９０９）；シュードモナス・アングリセプチカ（Pseudomonas anguilliseptica）（ＡＴＣＣ３３６６０）；シュードモナス・シトロネロリス（Pseudomonas citronellolis）（ＡＴＣＣ１３６７４）；シュードモナス・フラベセンス（Pseudomonas flavescens）（ＡＴＣＣ５１５５５）；シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）（ＡＴＣＣ２５４１１）；シュードモナス・ニトロレデュセンス（Pseudomonas nitroreducens）（ＡＴＣＣ３３６３４）；シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）（ＡＴＣＣ８０６２）；シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）（ＡＴＣＣ１７４４０）；シュードモナス・レジノボランス（Pseudomonas resinovorans）（ＡＴＣＣ１４２３５）；シュードモナス・ストラミネア（Pseudomonas straminea）（ＡＴＣＣ３３６３６）；シュードモナス・アガリシ（Pseudomonas agarici）（ＡＴＣＣ２５９４１）；シュードモナス・アルカリフィラ（Pseudomonas alcaliphila）;シュードモナス・アルギノボラ（Pseudomonas alginovora）；シュードモナス・アンダーソニイ（Pseudomonas andersonii）；シュードモナス・アスプレニ（Pseudomonas asplenii）（ＡＴＣＣ２３８３５）；シュードモナス・アゼライカ（Pseudomonas azelaica）（ＡＴＣＣ２７１６２）；シュードモナス・ベイジェリンキ（Pseudomonas beijerinckii）（ＡＴＣＣ１９３７２）；シュードモナス・ボレアリス（Pseudomonas borealis）；シュードモナス・ボレオポリス（Pseudomonas boreopolis）（ＡＴＣＣ３３６６２）；シュードモナス・ブラシカセラム（Pseudomonas brassicacearum）；シュードモナス・ブタノボラ（Pseudomonas butanovora）（ＡＴＣＣ４３６５５）；シュードモナス・セルローサ(Pseudomonas cellulosa)（ＡＴＣＣ５５７０３）；シュードモナス・アウランチアカ（Pseudomonas aurantiaca）（ＡＴＣＣ３３６６３）；シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）（ＡＴＣＣ９４４６、ＡＴＣＣ１３９８５、ＡＴＣＣ１７４１８、ＡＴＣＣ１７４６１）；シュードモナス・フラジ（Pseudomonas fragi）（ＡＴＣＣ４９７３）；シュードモナス・ルンデンシス（Pseudomonas lundensis）（ＡＴＣＣ４９９６８）；シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）（ＡＴＣＣ４６８３）；シュードモナス・シッシコラ（Pseudomonas cissicola）（ＡＴＣＣ３３６１６）；シュードモナス・コロナファシエンス（Pseudomonas coronafaciens）；シュードモナス・ジテルペニフィラ（Pseudomonas diterpeniphila）；シュードモナス・エロンガータ（Pseudomonas elongata）（ＡＴＣＣ１０１４４）；シュードモナス・フレクテンス（Pseudomonas flectens）（ＡＴＣＣ１２７７５）；シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）;シュードモナス・ブレンネリ（Pseudomonas brenneri）;シュードモナス・セドレラ（Pseudomonas cedrella）；シュードモナス・コルガータ（Pseudomonas corrugata）（ＡＴＣＣ２９７３６）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（Pseudomonas extremorientalis）；シュードモナス・フルオレセンス（ＡＴＣＣ３５８５８）；シュードモナス・ゲッサルジ（Pseudomonas gessardii）；シュードモナス・リバネンシス（Pseudomonas libanensis）；シュードモナス・マンデリイ（Pseudomonas mandelii）（ＡＴＣＣ７００８７１）；シュードモナス・マルジナリス（Pseudomonas marginalis）（ＡＴＣＣ１０８４４）；シュードモナス・ミグラエ（Pseudomonas migulae）;シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）（ＡＴＣＣ４６８５）；シュードモナス・オリエンタリス（Pseudomonas orientalis）;シュードモナス・ローデシエ（Pseudomonas rhodesiae）；シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxhantha）（ＡＴＣＣ９８９０）；シュードモナス・トラーシ（Pseudomonas tolaasii）（ＡＴＣＣ３３６１８）；シュードモナス・ベローニ（Pseudomonas veronii）（ＡＴＣＣ７００４７４）；シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス（Pseudomonas frederiksbergensis）；シュードモナス・ゲニクラタ（Pseudomonas geniculata）（ＡＴＣＣ１９３７４）；シュードモナス・ジンゲリ（Pseudomonas gingeri）；シュードモナス・グラミニス（Pseudomonas graminis）；シュードモナス・グリモンティ（Pseudomonas grimontii）;シュードモナス・ハロデニトリフィカンス（Pseudomonas halodenitrificans）;シュードモナス・ハロフィラ（Pseudomonas halophila）;シュードモナス・ヒビスキコラ（Pseudomonas hibiscicola）（ＡＴＣＣ１９８６７）；シュードモナス・フッチエンシス（Pseudomonas huttiensis）（ＡＴＣＣ１４６７０）；シュードモナス・ハイドロゲノボラ（Pseudomonas hydrogenovora）;シュードモナス・ジェッセンイ（Pseudomonas jessenii）（ＡＴＣＣ７００８７０）；シュードモナス・キロネンシス（Pseudomonas kilonensis）;シュードモナス・ランセオラタ（Pseudomonas lanceolata）（ＡＴＣＣ１４６６９）；シュードモナス・リニ（Pseudomonas lini）;シュードモナス・マルギナタ（Pseudomonas marginata）（ＡＴＣＣ２５４１７）；シュードモナス・メフィチカ（Pseudomonas mephitica）（ＡＴＣＣ３３６６５）；シュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）（ＡＴＣＣ１９２４４）；シュードモナス・ペルツシノゲナ（Pseudomonas pertucinogena）（ＡＴＣＣ１９０）；シュードモナス・ピクトラム（Pseudomonas pictorum）（ＡＴＣＣ２３３２８）；シュードモナス・サイクロフィラ（Pseudomonas psychrophila）;シュードモナス・フルバ（Pseudomonas fulva）（ＡＴＣＣ３１４１８）；シュードモナス・モンテイリ（Pseudomonas monteilii）（ＡＴＣＣ７００４７６）；シュードモナス・モッセリイ（Pseudomonas mosselii）;シュードモナス・オリジハビタンス（Pseudomonas oryzihabitans）（ＡＴＣＣ４３２７２）；シュードモナス・プレコグロッシシダ（Pseudomonas plecoglossicida）（ＡＴＣＣ７００３８３）；シュードモナス・プチダ（ＡＴＣＣ１２６３３）；シュードモナス・レアクタンス（Pseudomonas reactans）;シュードモナス・スピノサ（Pseudomonas spinosa）（ＡＴＣＣ１４６０６）；シュードモナス・バレアリカ（Pseudomonas balearica）;シュードモナス・ルテオラ（Pseudomonas luteola）（ＡＴＣＣ４３２７３）；シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）（ＡＴＣＣ１７５８８）；シュードモナス・アミグダリ（Pseudomonas amygdali）（ＡＴＣＣ３３６１４）；シュードモナス・アバラナエ（Pseudomonas avellanae）（ＡＴＣＣ７００３３１）；シュードモナス・カリカパパヤエ（Pseudomonas caricapapayae）（ＡＴＣＣ３３６１５）；シュードモナス・シッコリ（Pseudomonas cichorii）（ＡＴＣＣ１０８５７）；シュードモナス・フィクセレクタエ（Pseudomonas ficuserectae）（ＡＴＣＣ３５１０４）；シュードモナス・フスコバギナエ（Pseudomonas fuscovaginae）;シュードモナス・メリアエ（Pseudomonas meliae）（ＡＴＣＣ３３０５０）；シュードモナス・シリンジャエ（Pseudomonas syringae）（ＡＴＣＣ１９３１０）；シュードモナス・ビルジフラバ（Pseudomonas viridiflava）（ＡＴＣＣ１３２２３）；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Pseudomonas thermocarboxydovorans）（ＡＴＣＣ３５９６１）；シュードモナス・サーモトレランス（Pseudomonas thermotolerans）;シュードモナス・チベルバレン（Pseudomonas thivervalensis）;シュードモナス・バンクーベレンシス（Pseudomonas vancouverensis）（ＡＴＣＣ７００６８８）；シュードモナス・ウィスコンシネンシス（Pseudomonas wisconsinensis）；およびシュードモナス・キシアメンシス（Pseudomonas xiamenensis）。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」は、たとえば以下のシュードモナス種に属するものを含む、「蛍光シュードモナス属」として当分野で公知のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・コルガータ；シュードモナス・エクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレセンス；シュードモナス・ゲッサルジ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ；シュードモナス・マルジナリス；シュードモナス・ミグラエ；シュードモナス・ムシドレンス；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ローデシアエ；シュードモナス・シンキサンタ；シュードモナス・トラーシ；およびシュードモナス・ベローニ。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」は、たとえば以下に属するものを含む、シュードモナス・フルオレセンス種のすべての亜種、変種、菌株および他の下位特殊単位（sub-special units）と定義される（例示的な菌株のＡＴＣＣまたは他の寄託番号を括弧内に示す）：次亜種（biovar）１または次亜種Ｉとも呼ばれる、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプ（biotype）Ａ（ＡＴＣＣ１３５２５）；次亜種２または次亜種ＩＩとも呼ばれる、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプＢ（ＡＴＣＣ１７８１６）；次亜種３または次亜種ＩＩＩとも呼ばれる、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプＣ（ＡＴＣＣ１７４００）；次亜種４または次亜種ＩＶとも呼ばれる、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプＦ（ＡＴＣＣ１２９８３）；次亜種５または次亜種Ｖとも呼ばれる、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプＧ（ＡＴＣＣ１７５１８）；シュードモナス・フルオレセンス次亜種ＶＩ；シュードモナス・フルオレセンスＰｆ０−１；シュードモナス・フルオレセンスＰｆ−５（ＡＴＣＣＢＡＡ−４７７）；シュードモナス・フルオレセンスＳＢＷ２５；およびシュードモナス・フルオレセンス亜種セルロサ（ＮＣＩＭＢ１０４６２）。

宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」から選択され得る。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」は、シュードモナス・フルオレセンスバイオタイプＡのすべての菌株の群と定義される。このバイオタイプの１つの菌株は、Ｐ．フルオレセンスＭＢ１０１菌株（Ｗｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号参照）およびその誘導体である。

一部の実施形態では、宿主細胞は、シュードモナス目（Pseudomonadales）のプロテオバクテリアのいずれかである。他の実施形態では、宿主細胞は、シュードモナス科（Pseudomanadaceae）のプロテオバクテリアのいずれかである。

付加的な実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」から選択される。他の実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」から選択される。付加的な実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」から選択される。一部の実施形態については、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」から選択される。さらに、他の実施形態では、宿主細胞は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」、および／または「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」から選択される。

本発明において使用できる付加的なＰ．フルオレセンス菌株は、以下のＡＴＣＣ名称を有する、シュードモナス・フルオレセンスＭｉｇｕｌａおよびシュードモナス・フルオレセンスＬｏｉｔｏｋｉｔｏｋを含む：［ＮＣＩＢ８２８６］；ＮＲＲＬＢ−１２４４；ＮＣＩＢ８８６５ＣＯ１菌株；ＮＣＩＢ８８６６ＣＯ２菌株；１２９１［ＡＴＣＣ１７４５８；ＩＦＯ１５８３７；ＮＣＩＢ８９１７；ＬＡ；ＮＲＲＬＢ−１８６４；ピロリジン；ＰＷ２［ＩＣＭＰ３９６６；ＮＣＰＰＢ９６７；ＮＲＲＬＢ−８９９］；１３４７５；ＮＣＴＣ１００３８；ＮＲＲＬＢ−１６０３［６；ＩＦＯ１５８４０］；５２−１Ｃ；ＣＣＥＢ４８８−Ａ［ＢＵ１４０］；ＣＣＥＢ５５３［ＩＥＭ１５／４７］；ＩＡＭ１００８［ＡＨＨ−２７］；ＩＡＭ１０５５［ＡＨＨ−２３］；１［ＩＦＯ１５８４２］；１２［ＡＴＣＣ２５３２３；ＮＩＨ１１；ｄｅｎＤｏｏｒｅｎｄｅＪｏｎｇ２１６］；１８［ＩＦＯ１５８３３；ＷＲＲＬＰ−７］；９３［ＴＲ−１０］；１０８［５２−２２；ＩＦＯ１５８３２］；１４３［ＩＦＯ１５８３６；ＰＬ］；１４９［２−４０−４０；ＩＦＯ１５８３８］；１８２［ＩＦＯ３０８１；ＰＪ７３］；１８４［ＩＦＯ１５８３０］；１８５［Ｗ２Ｌ−１］；１８６［ＩＦＯ１５８２９；ＰＪ７９］；１８７［ＮＣＰＰＢ２６３］；１８８［ＮＣＰＰＢ３１６］；１８９［ＰＪ２２７；１２０８］；１９１［ＩＦＯ１５８３４；ＰＪ２３６；２２／１］；１９４［ＫｌｉｎｇｅＲ−６０；ＰＪ２５３］；１９６［ＰＪ２８８］；１９７［ＰＪ２９０］；１９８［ＰＪ３０２］；２０１［ＰＪ３６８］；２０２［ＰＪ３７２］；２０３［ＰＪ３７６］；２０４［ＩＦＯ１５８３５；ＰＪ６８２］；２０５［ＰＪ６８６］；２０６［ＰＪ６９２］；２０７［ＰＪ６９３］；２０８［ＰＪ７２２］；２１２［ＰＪ８３２］；２１５［ＰＪ８４９］；２１６［ＰＪ８８５］；２６７［Ｂ−９］；２７１［Ｂ−１６１２］；４０１［Ｃ７１Ａ；ＩＦＯ１５８３１；ＰＪ１８７］；ＮＲＲＬＢ−３１７８［４；ＩＦＯ１５８４１］；ＫＹ８５２１；３０８１；３０−２１；［ＩＦＯ３０８１］；Ｎ；ＰＹＲ；ＰＷ；Ｄ９４６−Ｂ８３［ＢＵ２１８３；ＦＥＲＭ−Ｐ３３２８］；Ｐ−２５６３［ＦＥＲＭ−Ｐ２８９４；ＩＦＯ１３６５８］；ＩＡＭ−１１２６［４３Ｆ］；Ｍ−１；Ａ５０６［Ａ５−０６］；Ａ５０５［Ａ５−０５−１］；Ａ５２６［Ａ５−２６］；Ｂ６９；７２；ＮＲＲＬＢ−４２９０；ＰＭＷ６［ＮＣＩＢ１１６１５］；ＳＣ１２９３６；Ａ１［ＩＦＯ１５８３９］；Ｆ１８４７［ＣＤＣ−ＥＢ］；Ｆ１８４８［ＣＤＣ９３］；ＮＣＩＢ１０５８６；Ｐ１７；Ｆ−１２；ＡｍＭＳ２５７；ＰＲＡ２５；６１３３Ｄ０２；６５１９Ｅ０１；Ｎ１；ＳＣ１５２０８；ＢＮＬ−ＷＶＣ；ＮＣＴＣ２５８３［ＮＣＩＢ８１９４］；Ｈ１３；１０１３［ＡＴＣＣ１１２５１；ＣＣＥＢ２９５］；ＩＦＯ３９０３；１０６２；またはＰｆ−５。
ＩＩＩ．核酸構築物

炭素源誘導性プロモーターに作動可能に連結された対象ペプチドをコードする核酸を含む、核酸構築物が本発明における使用のために提供される。一部の実施形態では、少なくとも１個の炭素源誘導性プロモーターが核酸構築物上に含まれ、および少なくとも１個の対象ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている。他の実施形態では、炭素源誘導性プロモーターは、マンニトール、グルシトール、アラビトールまたはそれらの誘導体である。対象ペプチドは単量体であり得る。代替的実施形態では、炭素源誘導性プロモーターは、２個以上の単量体をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。他の実施形態では、２個以上のマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターが核酸構築物上に含まれ、前記プロモーターは縦列に共有結合されており、および対象ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されている。もう１つの実施形態では、２個以上のマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターが核酸構築物上に含まれ、各々のプロモーターは、対象ペプチドをコードする核酸に別々に及び作動可能に連結されている。一部の実施形態では、対象ペプチドは、同じペプチドであるかまたは異なるペプチドであり得る。

もう１つの実施形態では、核酸構築物は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターおよびマンニトール、グルシトール、アラビトールまたはそれらの誘導体によって誘導されないもう１つ別のプロモーターを含み得る。マンニトール誘導性プロモーターは、縦列に共有結合され得るか、または分離していて、対象ペプチドをコードする別個の核酸に作動可能に連結され得る。たとえば１個のプロモーターがマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターであり、および他方のプロモーターが、ｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｌａｃＵＶ５（ＩＰＴＧ）、ｔａｃ（ＩＰＴＧ）、ｔｒｃ（ＩＰＴＧ）、Ｐ_syn（ＩＰＴＧ）、ｔｒｐ（トリプトファン飢餓）、ａｒａＢＡＤ（１−アラビノース）、ｌｐｐ^a（ＩＰＴＧ）、ｌｐｐ−ｌａｃ（ＩＰＴＧ）、ｐｈｏＡ（リン酸飢餓）、ｒｅｃＡ（ナリジクス酸）、ｐｒｏＵ（浸透圧）、ｃｓｔ−１（グルコース飢餓）、ｔｅｔＡ（テトラサイクリン）、ｃａｄＡ（ｐＨ）、ｎａｒ（嫌気的条件）、ＰＬ（４２℃への温度シフト）、ｃｓｐＡ（２０℃への温度シフト）、Ｔ７（熱誘導）、Ｔ７−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ３−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ５−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｔ４遺伝子３２（Ｔ４感染）、ｎｐｒＭ−ｌａｃオペレーター（ＩＰＴＧ）、Ｐｍ（アルキルまたはハロベンゾエート）、Ｐｕ（アルキルまたはハロトルエン）、Ｐｓａｌ（サリシレート）、ａｎｔ（アントラニレート）、ｂｅｎ（ベンゾエート）またはＶＨｂ（酸素）プロモーターであり得る。たとえばMakrides, S.C. (1996) Microbiol. Rev. 60, 512-538; Hannig G. & Makrides, S.C. (1998) TIBTECH 16, 54-60; Stevens, R.C. (2000) Structures 8, R177-R185参照。たとえばJ. Sanchez-Romero & V. De Lorenzo, Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonas strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes, in Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain & J. Davies, eds.) pp.460-74 (1999) (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer, Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads, Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445 (2001); and R. Slater & R. Williams, The Expression of Foreign DNA in Bacteria, in Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker & R. Rapley, eds.) pp.125-54 (2000) (The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK)参照。
他のエレメント

他の調節エレメントが核酸発現構築物に含まれうる。そのようなエレメントは、たとえば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始および終結シグナル、転写ターミネーター、シストロニック調節因子、ポリシストロニック調節因子、タグ配列、たとえばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、Ｂタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、シクロマルトデキストリングルコノトランスフェラーゼ、ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソネートシチジルトランスフェラーゼ、ｔｒｐＥまたはＴｒｐＬＥ、アビジン、ストレプトアビジン、Ｔ７遺伝子１０、Ｔ４ｇｐ５５、ブドウ球菌ペプチドＡ、連鎖球菌ペプチドＧ、ＧＳＴ、ＤＨＦＲ、ＣＢＰ、ＭＢＰ、ガラクトース結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、ＧＦＰ、ＫＳＩ、ｃ−ｍｙｃ、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＮｕｓＡ、ユビキチンおよびヘモシリンＡを含む、発現したポリペプチドの同定、分離、精製または単離を容易にする、ヌクレオチド配列「タグ」および「タグ」ペプチドコード配列を含むが、これらに限定されない。

本発明に従ったペプチドをコードする遺伝子は、ペプチドコード配列に加えて、それに作動可能に連結された以下の調節エレメントを含み得る：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、翻訳開始および終結シグナル。有用なＲＢＳは、本発明に従った発現系における宿主細胞として有用な種のいずれかから、好ましくは選択宿主細胞から入手できる。多くの特異的で多様なコンセンサスＲＢＳが公知であり、たとえばD. Frishman et al., Starts of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions, Gene 234(2):257-65 (8 JuI 1999); and B.E. Suzek et al., A probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes, Bioinformatics 17(12):1123-30 (Dec 2001)の中で記述されているおよび参照されているものが挙げられる。加えて、天然または合成ＲＢＳ、たとえば欧州特許第ＥＰ０２０７４５９号(合成ＲＢＳ); O. Ikehata et al., Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhodococcus species and its expression in Escherichia coli, Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 (1989)（ＡＡＧＧＡＡＧの天然ＲＢＳ配列）に述べられているものが使用し得る。本発明において有用な方法、ベクター、翻訳および転写エレメント、および他のエレメントのさらなる例は、たとえばGilroyへの米国特許第５，０５５，２９４号およびGilroy et al.への米国特許第５，１２８，１３０号; Rammler et al.への米国特許第５，２８１，５３２号；Barnes et al.への米国特許第４，６９５，４５５号および同第４，８６１，５９５号；Gray et al.への米国特許第４，７５５，４６５号およびWilcoxへの米国特許第５，１６９，７６０号に述べられている。
ベクター

一般に、核酸構築物は発現ベクター上に含まれ、細菌宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカーを含む。対象組換えペプチドは、適切な段階で翻訳開始および終結配列と組み合わされ、ある実施形態では、翻訳されたポリペプチドの分泌を指令することができるリーダー配列が核酸構築物に含まれ得る。場合により、および本発明に従って、組換えペプチド配列は、所望特徴、たとえば発現された組換え産物の安定化または精製の単純化を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードし得る。ある実施形態では、ベクターは、エピソームのように（染色体外で）維持され得るか、または宿主細菌細胞のゲノムに組み込まれ得る。

組換えペプチドを発現するときに細菌と共に使用するための有用な発現ベクターは、所望標的ペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始及び終結シグナルと共に、炭素源誘導性プロモーターを含む作動可能な読取り相に挿入することによって構築される。
ベクターは、１またはそれ以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確実にするためおよび、所望する場合は、宿主内での増幅を与えるための複製起点を含む。あるいは、ベクターは、宿主細胞のゲノム内への組み込みを可能にする配列をさらに提供することができる。本開示に従った形質転換のための適切な宿主は、炭素源誘導性プロモーターによって駆動される組換えペプチドを発現することができるいかなる細菌細胞も含む。一部の実施形態では、細菌は、エシェリキア（Escherichia）およびシュードモナス属内の様々な種を含み得る。

ベクターは、宿主細胞において組換えペプチドを発現するために有用であることが当分野において公知であり、これらのいずれもが、本発明に従った組換え対象ペプチドを発現するために修飾され、使用され得る。そのようなベクターは、たとえばプラスミド、コスミドおよびファージ発現ベクターを含む。本発明における使用のために修飾できる有用なプラスミドベクターの例は、発現プラスミドｐＢＢＲＩＭＣＳ、ｐＤＳＫ５１９、ｐＫＴ２４０、ｐＭＬ１２２、ｐＰＳ１０、ＲＫ２、ＲＫ６、ｐＲＯ１６００およびＲＳＦ１０１０を含むが、これらに限定されない。さらなる例は、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ１、ｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ、ｐＣａｌ−ｎ、ｐＣａｌ−ｎ−ＥＫ、ｐＣａｌ−ｃ、ｐＣａｌ−Ｋｃ、ｐｃＤＮＡ２．１、ｐＤＵＡＬ、ｐＥＴ−３ａ−ｃ、ｐＥＴ９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴＢｌｕｅ−１、ｐＥＴＢｌｕｅ−２、ｐＥＴＢｌｕｅ−３、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＧＥＸｌλＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ、ｐＧＥＸ−６Ｐ、ｐＨＡＴ１０／１１／１２、ｐＨＡＴ２０、ｐＨＡＴ−ＧＦＰｕｖ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＬＥＸ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｅ、ｐＭＡＬ−ｃ２ｇ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｅ、ｐＭＡＬ−ｐ２Ｇ、ｐＰｒｏＥＸＨＴ、ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３０／３１／３２、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−５０、ｐＱＥ−７０、ｐＱＥ−８０／８１／８２Ｌ、ｐＱＥ−１００、ｐＲＳＥＴ、およびｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＴｒｉＥｘ−１、ｐＴｒｉＥｘ−２、ｐＴｒｘＦｕｓを含み得る。そのような有用なベクターの他の例は、たとえばN. Hayase, in Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (Sep 1994); A.A. Lushnikov et al., in Basic Life Sci. 30:657-62 (1985); S. Graupner & W. Wackernagel, in Biomolec. Eng. 17(1):11-16. (Oct 2000); H.P. Schweizer, in Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45 (Oct 2001); M. Bagdasarian & K.N. Timmis, in Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982); T. Ishii et al., in FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13 (Mar 1, 1994); I.N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev, in Gene 140(l):63-65 (Mar 11, 1994); M. Tsuda & T. Nakazawa, in Gene 136(1-2):257-62 (Dec 22, 1993); C. Nieto et al., in Gene 87(l):145-49 (Mar 1, 1990); J.D. Jones & N. Gutterson, in Gene 61(3):299-306 (1987); M. Bagdasarian et al., in Gene 16(l-3):237-47 (Dec 1981); H.P. Schweizer et al., in Genet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001); P. Mukhopadhyay et al., in J. Bact. 172(l):477-80 (Jan 1990); D.O. Wood et al., in J. Bact. 145(3): 1448-51 (Mar 1981); and R. Holtwick et al., in Microbiology 147(Pt 2):337-44 (Feb 2001)によって述べられているものを含む。

細菌宿主細胞において有用であり得る発現ベクターのさらなる例は、表示されているレプリコンに由来する、表５に列挙されているものを含む：

発現プラスミド、ＲＳＦ１０１０は、たとえばF. Heffron et al., in Proc. Natl Acad. Sci. USA 72(9):3623-27 (Sep 1975)によって、およびK. Nagahari & K. Sakaguchi, in J. Bact. 133(3):1527-29 (Mar 1978)によって述べられている。プラスミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体は本発明でベクターとして使用される。当分野において公知である、ＲＳＦ１０１０の有用な例示的誘導体は、たとえばpＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１および関連プラスミド、およびｐＭＹＣ１０５０および関連プラスミド（たとえばThompson et al.への米国特許第５，５２７，８８３号および同第５，８４０，５５４号参照）、たとえばｐＭＹＣ１８０３を含む。プラスミドｐＭＹＣ１８０３は、調節されたテトラサイクリン耐性マーカーおよびＲＳＦ１０１０プラスミドからの複製および可動化遺伝子座を担持する、ＲＳＦ１０１０に基づくプラスミドｐＴＪＳ２６０（Wilcoxへの米国特許第５，１６９，７６０号参照)に由来する。他の有用な例示的ベクターは、Puhler et al.への米国特許第４，６８０，２６４号に述べられているものを含む。

付加的な実施形態では、発現プラスミドを発現ベクターとして使用する。もう１つの実施形態では、ＲＳＦ１０１０またはその誘導体を発現ベクターとして使用する。さらにもう１つの実施形態では、ｐＭＹＣ１０５０またはその誘導体、またはｐＭＹＣ１８０３またはその誘導体を発現ベクターとして使用する。
ＩＶ．細菌宿主細胞における組換えポリペプチドの発現

本発明の実施形態は、ペプチド生産における使用のための組換えペプチドを発現するための工程を含む。一般に、前記工程は、少なくとも１個のマンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の組換えポリペプチドをコードする核酸を含む核酸構築物の発現を提供し、前記核酸構築物は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体または類似体を代謝するまたは分解するその能力に関して欠損性にされている宿主細胞において発現される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、マンニトール誘導性プロモーターまたはその誘導体であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、プロモーター誘導における誘導物質として使用される、マンニトールの代謝または分解に関して欠損性にされている。１つの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。もう１つの実施形態では、宿主細胞はシュードモナス属または密接に関連する細菌細胞であり得る。付加的な実施形態では、宿主細胞はシュードモナス・フルオレセンス細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、マンニトール、アラビトールまたはグルシトール、またはそれらの類似体または誘導体の代謝または分解に関して欠損性であり、および少なくとも１個のマンニトール、アラビトール、グルシトール、またはグリセロール誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の組換えポリペプチドをコードする核酸を発現する。

前記方法は、一般に：
ａ）本発明において述べるように、宿主細胞、好ましくは大腸菌またはシュードモナス・フルオレセンスを提供すること；
ｂ）宿主細胞を、少なくとも１個のマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１個の対象組換えポリペプチドを含む少なくとも１個の核酸発現ベクターでトランスフェクトし、宿主細胞を十分な増殖培地で増殖させること；および
ｃ）マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの類似体または誘導体を、対象ペプチドの発現を誘導することができる量で増殖培地に添加すること（但し、宿主細胞は、添加されたマンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの類似体または誘導体を分解または代謝することができないようにされている）；および
ｄ）対象標的組換えポリペプチドを発現すること
を含む。

本発明の方法は、ｅ）少なくとも１個の対象ペプチドに作動可能に連結された付加的な誘導性プロモーターを含む少なくとも１個の核酸発現構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることをさらに含み得る。加えて、前記方法は、ｆ）少なくとも１個の組換えペプチドを単離することをさらに含み得る。その方法はまた、ｇ）少なくとも１個の組換えペプチドを精製することを含み得る。

あるいは、本発明の方法は、工程ｃ）において、グリセロール、またはその類似体または誘導体を、対象ペプチドを誘導することができる量で増殖培地に添加すること（但し、宿主細胞は、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの類似体または誘導体を分解または代謝することができないようにされている）を含み得る。

一部の実施形態では、誘導性プロモーターはマンニトール誘導性プロモーターである。他の実施形態では、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターはまた、グリセロールによっても誘導され得る。

前記方法が、ｅ）宿主細胞を、少なくとも１個の対象ペプチドに作動可能に連結された付加的な誘導性プロモーターを含む少なくとも１個の核酸構築物でトランスフェクトすることをさらに含む場合、対象ペプチドは、マンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によってコードされるものと同じかまたは異なる対象ペプチドであり得る。他の誘導性プロモーターは、たとえばｌａｃまたはｔａｃファミリーのプロモーターであり得、たとえばＰｌａｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ^a、ｌｐｐ−ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、Ｔ７ｌａｃ、Ｔ５ｌａｃ、Ｔ３ｌａｃおよびＰｍａｃ、ｔｒｐ（トリプトファン飢餓）、ａｒａＢＡＤ（１−アラビノース）、ｐｈｏＡ（リン酸飢餓）、ｒｅｃＡ（ナリジクス酸）、ｐｒｏＵ（浸透圧）、ｃｓｔ−１（グルコース飢餓）、ｔｅｔＡ（テトラサイクリン）、ｃａｄＡ（ｐＨ）、ｎａｒ（嫌気的条件）、ＰＬ（４２℃への温度シフト）、ｃｓｐＡ（２０℃への温度シフト）、Ｔ７（熱誘導）、Ｔ４遺伝子３２（Ｔ４感染）、Ｐｍ（アルキルまたはハロベンゾエート）、Ｐｕ（アルキルまたはハロトルエン）、Ｐｓａｌ（サリシレート）、ａｎｔ（アントラニレート）、ｂｅｎ（ベンゾエート）またはＶＨｂ（酸素）プロモーターを含み得る。

一部の実施形態では、本発明は、１個またはそれ以上の対象ペプチドを生産するとき２個以上のマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターを使用できる。他の実施形態では、複数のプロモーターは異なる配列を有することができ、各々のプロモーターは、使用される特定配列に基づき、異なる速度で同じ炭素源によって誘導され得る。たとえば１個のマンニトール誘導性プロモーター配列は、異なる固有の特徴または修飾に基づき、異なる核酸配列を有するマンニトール誘導性プロモーターよりも高い発現率で対象ペプチドを発現し得る。あるいは、プロモーター配列に加えて、プロモーター配列が同じかまたは異なるかに関わらず、エンハンサーエレメントへのそれぞれのプロモーターの空間的間隔または連鎖に基づき、プロモーター配列の発現速度に異なる影響を及ぼすエンハンサーエレメントをプロモーター領域内に含み得る。

本発明の実施形態では、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターを、細菌宿主細胞において、たとえばＰｌａｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｔｒｃ、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、Ｔ７ｌａｃ、Ｔ５ｌａｃ、Ｔ３ｌａｃおよびＰｍａｃを含むｌａｃまたはｔａｃファミリーのプロモーターと併用する。

一部の実施形態では、発現系は、少なくとも０．１ｇ／Ｌから少なくとも８０ｇ／Ｌのポリペプチド総生産性で標的ポリペプチドを発現することができる。他の実施形態では、組換えポリペプチドは、少なくとも０．３ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．７ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌまたは少なくとも８０ｇ／Ｌのレベルで発現される。

１つの実施形態では、少なくとも１個の組換えペプチドを、マンニトール、アラビトールまたはグルシトールを分解または代謝することができない細菌細胞において発現させることができ、前記組換えポリペプチドの発現は、マンニトール、アラビトール、グルシトールまたはグリセロール、またはそれらの誘導体または類似体を用いて誘導される。あるいは、２個以上の組換えペプチドを本発明の細胞において発現させることができ、それらの組換えペプチドをコードする核酸は、同じベクター上、あるいは複数のベクター上に含まれ、および少なくとも１個のマンニトール、アラビトールまたはグルシトール誘導性プロモーターを含む、２個以上のプロモーターに作動可能に連結され得る。

さらにもう１つの実施形態では、異なる標的ポリペプチドをコードする核酸構築物を、マンニトール、グルシトールまたはアラビトール、またはそれらの誘導体または類似体を分解または代謝することができない細菌宿主細胞内に維持することができ、標的ポリペプチドの発現を誘導するためにマンニトール、グルシトール、アラビトールまたはグリセロールを使用する。そのような実施形態では、第一対象ペプチドをコードする第一核酸と第二対象ペプチドをコードする第二核酸は、少なくとも１個のプロモーターがマンニトール、グルシトールまたはアラビトール誘導性プロモーターである、異なるプロモーターの使用を通して互いに独立して調節される。そのような多標的遺伝子発現系は、各々のペプチドの独立した調節と最適化を可能にする。ある実施形態では、１個の発現されたペプチドが、その他の対象ペプチドの発現または生じるペプチドの特徴を調節することができる。

そのような多標的遺伝子系の例は、（１）標的遺伝子の１個の発現産物がその他の標的遺伝子自体と相互作用する系；（２）標的遺伝子の１個の発現産物がその他の標的遺伝子の発現産物、たとえばペプチドおよびその結合ペプチドまたはαｎ−βｎペプチドのα−およびβ−ポリペプチドと相互作用する系；（３）２個の遺伝子の２個の発現産物の両方が第三の成分、たとえば宿主細胞内に存在する第三の成分と相互作用する系；（４）２個の遺伝子の２個の発現産物の両方が共通の生体触媒経路に関与する系；および（５）２個の遺伝子の２個の発現産物が互いに独立して機能する系、たとえばバイクローナル（biclonal）抗体発現系を含むが、これらに限定されない。

上記に列挙したタイプ（１）の多標的遺伝子系の一例では、第一標的遺伝子は、調節可能なプロモーターの制御下にあって、所望標的ペプチドをコードすることができ、第二標的遺伝子は、第一標的遺伝子のプロモーターを調節することに関与するペプチドをコードし得る、たとえば第二標的遺伝子は、第一標的遺伝子のプロモーターアクチベーターまたはリプレッサーペプチドをコードし得る。第二遺伝子が第一遺伝子についてのプロモーター調節ペプチドをコードする例では、第二遺伝子のコード配列はマンニトール誘導性プロモーターの制御下であり得る。一部の実施形態では、第二遺伝子は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０または５０コピー以上のコピー数が宿主細胞内に維持される高コピー数構築物として細胞内に維持される、または細胞のゲノムに組み込まれた、別個のＤＮＡ構築物の一部である。

二元標的遺伝子系のもう１つの例では、第二標的遺伝子は、第一標的遺伝子産物の折りたたみを助ける、または対象ペプチドを細胞画分へと向かわせるのを助けるペプチド（たとえばシャペロンタンパク質）をコードし得る。たとえば第一標的遺伝子産物は、誤った折りたたみ形態で細菌宿主細胞において正常に発現されるペプチドであり得る。あるいは、第一標的遺伝子産物は、不溶性形態で細菌細胞において正常に発現されるペプチドであり得る。第二標的遺伝子は、これらの場合、タンパク質を正しく折りたたむまたはタンパク質を細胞内の特定位置（たとえばペリプラズムなど）に向かわせるのを助けるタンパク質をコードし得る。そのようなペプチドまたはタンパク質の例は、ｃｂｐＡ、ｈｔｐＧ、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｆｋｂＰ２、ｇｒｏＥＳ、ｇｒｏＥＬ、ｈｔｐＧまたはｃｂｐＡ、ＨＳＰ７０タンパク質、ＨＳＰ１１０／ＳＳＥタンパク質、ＨＳＰ４０（ＤＮＡＪ関連）タンパク質、ＧＲＰＥ−様タンパク質、ＨＳＰ９０タンパク質、ＣＰＮ６０およびＣＰＮ１０タンパク質、サイトゾルシャペロニン、ＨＳＰ１００タンパク質、低分子ＨＳＰ、カルネキシンおよびカルレティキュリン、ＰＤＩおよびチオレドキシン関連タンパク質、ペプチジル−プロリルイソメラーゼ、シクロフィリンＰＰＩアーゼ、ＦＫ−５０６結合タンパク質、パーブリンＰＰＩアーゼ、個々のシャペロニン、タンパク質特異的シャペロンまたは分子内シャペロンを含むが、これらに限定されない。本発明において発現され得る他のタンパク質は、「Guidebook to Molecular Chaperones and Protein-Folding Catalysts」 (1997) ed. M. Gething, Melbourne University, Australiaの中で一般的に述べられている折りたたみ調節剤を含む。
形質転換

ベクターによる宿主細胞の形質転換は、当分野において公知の何らかの形質転換法を用いて実施でき、細菌宿主細胞は、無傷細胞としてまたはプロトプラスト（すなわち細胞質体を含む）として形質転換され得る。例示的な形質転換法は、穿孔法、たとえば電気穿孔法、プロトプラスト融合、細菌接合、および二価カチオン処理、たとえば塩化カルシウム処理またはＣａＣｌ₂／Ｍｇ²⁺処理、または当分野における他の周知の方法を含む。たとえばMorrison, J. Bact, 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology, 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983), Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)参照。
選択

好ましくは、成功裏に形質転換されない細胞をその後の形質転換に対して、および発酵の間持続的に選択する。選択マーカーは、栄養要求性選択マーカーまたは伝統的な抗生物質選択マーカーであり得る。細胞が多数の栄養化合物に対して栄養要求性であるときは、原栄養性回復ベクターで形質転換されるまで、それらの栄養化合物全部を添加した培地で栄養要求細胞を増殖させることができる。選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子であるときは、当分野で周知のように、非形質転換および復帰細胞に対して選択するために関連抗生物質を培地に添加することができる。
発酵

ここで使用する、「発酵」という用語は、文字通りの発酵を用いる実施形態と、他の非発酵培養方式を用いる実施形態の両方を含む。発酵はいかなる規模でも実施し得る。一部の実施形態では、発酵培地は、富化培地、最小培地、無機塩培地の中から選択し得る；富化培地は使用し得るが、好ましくは回避される。もう１つの実施形態では、最小培地または無機塩培地が選択される。

無機塩培地は、無機塩および炭素源、たとえばグルコース、スクロースまたはグリセロールから成る。無機塩培地の例は、たとえばＭ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ１７９）、ＤａｖｉｓとＭｉｎｇｉｏｌｉ培地(BD Davis & ES Mingioli, in J. Bact. 60:17-28 (1950)参照)を含む。無機塩培地を作製するために使用される無機塩は、たとえばリン酸カリウム、硫酸または塩化アンモニウム、硫酸または塩化マグネシウム、および微量無機塩類、たとえば塩化カルシウム、ホウ酸塩、および鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の硫酸塩の中から選択されるものを含む。有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母抽出物は無機塩培地には含まれない。その代わりに無機窒素源が使用され、これは、たとえばアンモニウム塩、アンモニア水およびアンモニアガスの中から選択され得る。典型的な無機塩培地は、グルコースを炭素源として含む。無機塩培地と比較して、最小培地も無機塩と炭素源を含み得るが、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたは他の成分を補充することができ、但しこれらはごく最小限のレベルで添加される。

理想的には、選択される培地は、細菌細胞の増殖のための高細胞密度培養（ＨＣＤＣ）を可能にする。ＨＣＤＣはバッチ工程として出発でき、二相流加培養がそれに続く。バッチ部分での無制限増殖後、バイオマス濃度が数倍に上昇し得る３倍加時間の期間にわたって増殖を低い比増殖速度に制御することができる。そのような培養手順のさらなる詳細は、Riesenberg, D.; Schulz, V.; Knorre, W. A.; Pohl, H. D.; Korz, D.; Sanders, E. A.; Ross, A.; Deckwer, W. D. (1991) 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate」 J Biotechnol: 20(1) 17-27によって述べられている。

本発明に従った発現系は、いかなる発酵方式でも培養することができる。たとえばバッチ、流加、半連続および連続発酵法がここで使用し得る。

本発明に従った発現系は、あらゆる規模（すなわち容積）の発酵において導入遺伝子発現のために有用である。すなわち、たとえばマイクロリットル規模、センチリットル規模およびデシリットル規模の発酵容積を使用し得る；および１リットル規模およびそれ以上の発酵容積が使用できる。一部の実施形態では、発酵容積は１リットルまたはそれ以上である。他の実施形態では、発酵容積は５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットルまたは５０，０００リットルまたはそれ以上である。

本発明では、形質転換した宿主細胞の増殖、培養および／または発酵は、宿主細胞の生存を許容する温度範囲内で、好ましくは約４℃から約５５℃（両端を含む）の範囲内の温度で実施する。
細胞密度

本発明の実施形態では、シュードモナス属および密接に関連する細菌を本発明において使用する。シュードモナス属、特にシュードモナス・フルオレセンスは高細胞密度で増殖し得る。このため、本発明に従ったシュードモナス・フルオレセンス発現系は約２０ｇ／Ｌまたはそれ以上の細胞密度を提供し得る。本発明に従ったシュードモナス・フルオレセンス発現系は、同様に、バイオマスを乾燥細胞重量として測定したとき、容積当たりのバイオマスで表わすと、少なくとも約７０ｇ／Ｌの細胞密度を提供し得る。

一部の実施形態では、細胞密度は少なくとも約２０ｇ／Ｌである。もう１つの実施形態では、細胞密度は、少なくとも２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌまたは少なくとも１５０ｇ／Ｌである。

もう１つの実施形態では、誘導時の細胞密度は、２０ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ；２０ｇ／Ｌ〜１２０ｇ／Ｌ；２０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；２５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；３０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；３５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；４５ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜７５ｇ／Ｌ；５０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌ；４０ｇ／Ｌ〜８０ｇ／Ｌである。
組換えペプチドの発現レベル

本発明に従った発現系は、全細胞ペプチドの５％〜８０％（％ｔｃｐ）のレベルでトランスジェニックポリペプチドを発現することができる。一部の実施形態では、発現レベルは、５％、８％、１０％、１２％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％ｔｃｐまたはそれ以上である。
単離及び精製

本発明に従って生産される組換えペプチドは、当分野で周知の標準手法、たとえば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーなどの物質による選択的沈殿、免疫精製法等を含むが、これらに限定されない手法によって単離され、実質的な純度に精製され得る。たとえば確立された分子付着特性を有するペプチドは、リガンドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドにより、ペプチドは精製カラムに選択的に吸着され、その後比較的純粋な形態でカラムから遊離され得る。融合ペプチドは、その後酵素作用によって除去される。加えて、ペプチドは免疫アフィニティーカラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製できる。一般的な手法は、たとえばR. Scopes, Peptide Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N. Y. (1982); Deutscher, Guide to Peptide Purification, Academic Press (1990);米国特許第４，５１１，５０３号; S. Roe, Peptide Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al, Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al., Peptide Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000); and R. Mukhija, et al., Gene 165(2): p. 303-6 (1995)においてさらに説明されている。また、たとえばAusubel, et al. (1987 and periodic supplements); Deutscher (1990) 「Guide to Peptide Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series; Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene, NY; and manufacturer's literature on use of peptide purification products, e.g., Pharmacia, Piscataway, N.J., or Bio-Rad, Richmond, Calif.も参照のこと。組換え手法との組合せは、適切なセグメント、たとえばＦＬＡＧ配列またはプロテアーゼ除去可能な配列によって融合され得る等価物への融合を可能にする。また、たとえばHochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Peptides with Metal Chelate Absorbent」 in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Peptide Purification System QIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.も参照のこと。

発現されたペプチドの検出は、当分野で公知の方法によって達成され、たとえば放射免疫測定法、ウエスタンブロット法または免疫沈降法を含む。

組換え生産され、発現されたペプチドは、数多くの方法によって組換え細胞培養から回収し、精製することができ、たとえば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、必要に応じて、最終精製工程のために使用できる。

本発明において発現されるある種のペプチドは不溶性集合体（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコールが封入体からのペプチドの精製に適する。たとえば封入体の精製は、典型的には、宿主細胞の破壊による、たとえば５０ｍＭＴＲＩＳ／ＨＣＬｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＡＴＰおよび１ｍＭＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによる、封入体の抽出、分離および／または精製を含む。細胞懸濁液を、典型的にはフレンチプレスに２〜３回通して溶解する。細胞懸濁液はまた、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（ＢｒｉｎｋｎａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて均質化するまたは氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する選択的な方法は当業者に明白である（たとえばSambrook et al., supra; Ausubel et al., supra参照)。

必要に応じて、封入体を可溶化することができ、溶解細胞懸濁液は、典型的には望ましくない不溶性物質を除去するために遠心分離することができる。封入体を形成したペプチドは、適合性緩衝液での希釈または透析によって再生し得る。適切な溶媒は、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容積／容積ベース）、および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）を含むが、これらに限定されない。塩酸グアニジンおよび類似物質は変性剤であるが、この変性は不可逆性ではなく、変性剤の除去（たとえば透析による）または希釈後に再生が起こることがあり、免疫学的および／または生物学的に活性なペプチドの再形成を可能にし得る。他の適切な緩衝液は当業者に公知である。

あるいは、宿主ペリプラズムから組換えペプチドを精製することが可能である。宿主細胞の溶解後、組換えペプチドが宿主細胞のペリプラズムに輸送されたとき、細菌のペリプラズム画分を、当業者に公知の他の方法に加えて、低温浸透圧ショック法によって単離することができる。組換えペプチドをペリプラズムから単離するため、たとえば細菌細胞を遠心分離してペレットを形成することができる。ペレットを、２０％スクロースを含む緩衝液に再懸濁することができる。細胞を溶解するため、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷５ｍＭＭｇＳＯ₄に再懸濁して、約１０分間氷浴中に保持することができる。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントして、保存することができる。上清中に存在する組換えペプチドを、当業者に周知の標準分離手法によって宿主ペプチドから分離することができる。

初期塩分画は、対象組換えペプチドから望ましくない宿主細胞ペプチド（または細胞培養培地に由来するペプチド）の多くを分離できる。１つのそのような例は硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、ペプチド混合物中の水分量を有効に減少させることによってペプチドを沈殿させる。ペプチドは、次に、それらの溶解度に基づいて沈殿する。ペプチドがより疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高い。典型的なプロトコールは、生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％になるように飽和硫酸アンモニウムをペプチド溶液に添加することを含む。この濃度は最も疎水性のペプチドを沈殿させる。その後沈殿物を廃棄し（対象ペプチドが疎水性でない限り）、対象ペプチドを沈殿させることが知られる濃度まで硫酸アンモニウムを上清に添加する。次に沈殿物を緩衝液に溶解し、必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションを通して過剰の塩を除去する。ペプチドの溶解度に基づく他の方法、たとえば低温エタノール沈殿法は当業者に周知であり、複雑なペプチド混合物を分画するために使用できる。

組換えペプチドの分子量は、種々の細孔径の膜（たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通しての限外ろ過を用いてより大きいまたはより小さいサイズのペプチドから単離するために使用できる。最初の工程として、ペプチド混合物を、対象ペプチドの分子量より低い分子量カットオフ値を有する細孔径の膜を通して限外ろ過することができる。限外ろ過の保持液を、次に、対象ペプチドの分子量より大きい分子量カットオフ値を有する膜に対して限外ろ過することができる。組換えペプチドは膜を通過してろ液中に入る。その後ろ液を以下で述べるようにクロマトグラフィーにかけることができる。

組換えペプチドはまた、その大きさ、正味表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて他のペプチドから分離することができる。加えて、ペプチドに対して惹起した抗体をカラムマトリックスに複合し、ペプチドを免疫精製することができる。これらの方法はすべて当分野において周知である。クロマトグラフィー手法は、多くの異なる製造者（たとえばＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）からの装置を使用していかなる規模でも実施できることは当業者に明白である。
再生およびリフォールディング

不溶性ペプチドは、二次および三次ペプチド構造立体配座を形成するために再生またはリフォールディングされ得る。ペプチドのリフォールディング工程は、必要に応じて、組換え産物の立体配置を完成させるときに使用できる。リフォールディングおよび再生は、ペプチドの解離／会合を促進する当分野で公知の作用物質を用いて達成できる。たとえばペプチドは、ジチオトレイトールと共にインキュベートし、次に酸化グルタチオン二ナトリウム塩と共にインキュベートして、その後尿素などのリフォールディング剤を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。

組換えペプチドはまた、たとえばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭＮａＣｌに対して透析することによって再生できる。あるいはペプチドは、プロテアーゼ阻害剤を含む、５００ｍＭＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭトリス／ＨＣｌｐＨ７．４中の直線６Ｍ〜１Ｍ尿素勾配を使用することにより、Ｎｉ−ＮＴＡカラムなどのカラムに固定化されてリフォールディングすることができる。再生は、１．５時間またはそれ以上の期間にわたって実施できる。再生後、２５０ｍＭイミダゾールの添加によってペプチドを溶出できる。イミダゾールは、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６緩衝液プラス２００ｍＭＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去できる。精製ペプチドは、４℃でまたは−８０℃に凍結して保存することができる。

他の方法は、たとえばMH Lee et al., Peptide Expr. Purif, 25(1): p. 166-73 (2002), W.K. Cho et al., J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 and periodic supplements), Deutscher (1990) 「Guide to Peptide Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182, and other volumes in this series, Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Peptide Science Wiley/Greene, NY, S. Roe, Peptide Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001); D. Bollag, et al., Peptide Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996)において述べられているものを含む。
Ｖ．組換えポリペプチド

本発明は、細菌宿主細胞発現系における対象組換えペプチドの生産を提供する。本発明において使用できる組換えポリペプチドの例は、原核および真核生物に由来するポリペプチドを含む。そのような生物は、原生生物、真菌、植物および動物界からの生物を含む、古細菌、細菌、真核生物ドメインからの生物を含む。

本発明において利用できるペプチドの種類は、上述したタンパク質およびペプチドに加えて、生細胞の数千もの化学反応を触媒する役割を担う酵素；重要な種類の構造または支持ペプチドである、ケラチン、エラスチンおよびコラーゲン；ヘモグロビンおよび他のガス輸送ペプチド；オボアルブミン、カゼインおよび他の栄養分子；免疫系の分子である抗体；代謝を調節するペプチドホルモン；および機械的作業を実行するペプチド、たとえば収縮性筋ペプチドであるアクチンおよびミオシンなどの非限定的な例を含む。

他の特定の非限定的ポリペプチドは、たとえばレニン、ヒト成長ホルモンを含む、成長ホルモン；ウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；上皮小体ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポペプチド；α₁−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、たとえば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブラント因子；抗凝固因子、たとえばペプチドＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、たとえばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血細胞増殖因子；腫瘍壊死因子αおよびβ；エンケファリナーゼ；血清アルブミン、たとえばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物ペプチド、たとえばβ−ラクタマーゼ；デオキシリボヌクレアーゼ；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは増殖因子についての受容体；インテグリン；ペプチドＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、たとえば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、たとえばＮＧＦ−β；カルジオトロフィン（心肥大因子）、たとえばカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子、たとえばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、たとえばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−β；インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合ペプチド；ＣＤペプチド、たとえばＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８およびＣＤ−１９；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成ペプチド（ＢＭＰ）；インターフェロン、たとえばインターフェロンα、βおよびγ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、たとえばＩＬ−１からＩＬ−１０；抗ＨＥＲ２抗体；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；膜表面ペプチド；崩壊促進因子；ウイルス抗原、たとえばＡＩＤＳエンベロープの部分；輸送ペプチド；ホーミング受容体；アドレシン；調節ペプチド；抗体；および上記に列挙したポリペプチドのいずれかのフラグメントなどの分子を含む。

本発明に従って発現される組み換えペプチドは、標的ポリペプチドコード配列が、宿主細胞がペプチドを発現し得る機能的遺伝子を形成するために転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている、ポリヌクレオチドから発現され得る。コード配列は、標的ポリペプチドについての天然コード配列であり得るが、入手可能である場合には、より好ましくは、たとえばシュードモナス・フルオレセンスなどのシュードモナス種のコドン使用の偏りを反映するように遺伝子を合成することによって、選択発現宿主細胞における使用のために選択、改善または最適化されたコード配列である。生じる遺伝子は、１またはそれ以上のベクター内で構築されるかまたはベクターに挿入され、次に発現宿主細胞に形質転換される。「発現可能形態（expressible form）」で提供されると言われる核酸またはポリヌクレオチドは、選択細菌発現宿主細胞によって発現され得る少なくとも１個の遺伝子を含む核酸またはポリヌクレオチドを意味する。

分子遺伝学および遺伝子工学手法のために必要な広範囲の配列情報は、広く公的に入手可能である。哺乳動物ならびにヒトの完全なヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムへのアクセスは、ＧｅｎＢａｎｋより HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＥｎｔｒｅｚのＵＲＬアドレスで入手できる。付加的な情報はまた、ＷｅｉｚｍａｎｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅＧｅｎｏｍｅａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃａｒｄｓ／）からの遺伝子およびそれらの産物および生物医学適用についての電子百科事典統合情報、ＧｅｎｅＣａｒｄｓから入手でき、ヌクレオチド配列情報はまた、ＥＭＢＬＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）またはｔｈｅＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｒＪａｐａｎ（ＤＤＢＪ,ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）からも入手できる。アミノ酸配列に関する情報についての付加的なサイトは、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ’ｓｐｅｐｔｉｄｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅｗｅｂｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｎｂｒｆ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｐｉｒ／）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／ｓｐｒｏｔ−ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）を含む。

本発明を以下の実施例においてより詳細に説明する。これらの実施例は本発明の例示を意図するものであり、その限定と解釈されるべきではない。
（実施例）
実験材料および方法

異なる指示がない限り、分子生物学の分野において公知の標準手法、ベクター、制御配列エレメントおよび他の発現系エレメントを核酸操作、形質転換および発現のために使用する。そのような標準手法、ベクターおよびエレメントは、たとえばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); and Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)に認められる。

異なる指示がない限り、ＰＣＲ反応は、表６のプロトコールに従ってＰＴＣ２２５サーモサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
菌株およびプラスミド

本実施例で使用する菌株を表７に示す。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔを用いてプラスミドを作製し、以下のように新鮮プレートした細胞の電気穿孔によってシュードモナス・フルオレセンスＤＣ２８３またはＤＣ３８８に形質転換した。たとえばEnderle et al. (1998) 「Electroporation of freshly plated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa cells,」 Biotechniques 25: 954-958参照。細胞を、摂取ループを用いてＬＢ寒天プレートから削り取り、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５００μｌ中で３回洗浄して、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水４０μｌに再懸濁した。プラスミドＤＮＡ１μｌを細胞４０μｌと混合し、氷冷電気穿孔キュベットに移した。電気穿孔を、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて２．２５ｋＶ／ｃｍの電界強度で実施した。細胞を直ちにＳＯＣ培地１ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に移し、３０℃で１〜１．５時間インキュベートして、その後選択寒天プレート（Ｍ９グルコースプラスウラシル）に塗布した。寒天プレートを３０℃でインキュベートした。
増殖実験

グリセロールについてのすべてのパーセンテージ濃度はｖ／ｖで表わしており、グルコースおよびマンニトールについてはｗ／ｖで表わしている。増殖実験は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および微量元素と共に無機塩培地２００ｍを含む１Ｌ底部バッフル付き振とうフラスコにおいて実施した。標準培地は、１．３Ｍの濃度に相当する、９．５％グリセロールを含んだ。一部の実験については、グリセロール濃度を２％（＝２７４ｍＭ）または５％（＝６８５ｍＭ）に低下させた。グルコースを炭素源として使用したときは、グリセロールを含まない振とうフラスコ培地中２５％グルコースの溶液をろ過滅菌し、加圧滅菌した培地に添加して、５％（＝２７８ｍＭ）または１２．５％（＝６９４ｍＭ）グルコースの最終濃度にした。必要な場合は、ウラシル（７５０μｇ／ｍｌ）を振とうフラスコ培地に添加した。Ｍ９グルコース（必要に応じてプラスウラシル２５０μｇ／ｍｌ）中で増殖させた菌株の一晩培養物４ｍＬを振とうフラスコのための接種材料として使用した。ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＡＧ；Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１ｃｍプラスチックキュベット中、定められた時間間隔で、６００ｎｍでの培養物の光学密度を測定することによって増殖を観測した。マンニトールプロモーターの誘導は、典型的には２４時間の発酵が経過した時点で２０％保存溶液から１％（＝５５ｍＭ）マンニトールを添加して実施した。
２０リットル発酵槽におけるＤＣ３９０の培養

ＤＣ３９０菌株を、標準通気２０Ｌ研究用発酵容器において、Risenberg et al. (1991) 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate,」 J. Biotech. 20(1): 17-27によって述べられている無機塩培地中、わずかに修正を加えて増殖させた。培養物を３２℃で７２時間増殖させた；アンモニア水の添加を通してｐＨを６．５に維持した。攪拌およびスパージ気流速度は、最初は溶解酸素を正のレベルに制御するために上昇させたが、これらが達成されたとき最大レベルに固定した。グルコースまたはグリセロールは、わずかに過剰の状態を維持するために発酵工程全体を通じて供給した。流加高密度発酵工程を、約２４時間の初期増殖期と、５７５ｎｍで１７０ＯＤ単位の標的細胞密度で組換え遺伝子発現を開始させるために１％（ｗ／ｖ）濃度のマンニトールを添加した遺伝子発現（誘導）期に分けた。光学密度および細胞蛍光を経時的に観測した。最終細胞密度は炭素源に依存して異なった。
蛍光分析

培養物の蛍光を、以下の設定を用いてＳｐｅｃｔｒａｍａｘＧｅｍｉｎｉマイクロプレート蛍光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した：励起４８５ｎｍ、発光５３８ｎｍ、バンドパスフィルター５３０ｎｍ。分析の前に、試料の光学密度（ＯＤ₆₀₀）を上述したように１ｃｍキュベット中で測定した。試料を、エッペンドルフ管中、振とうフラスコ培地でＯＤ₆₀₀＝５に希釈し、次に９６穴マイクロプレートにおいて水で直接ＯＤ₆₀₀＝１に希釈した。希釈振とうフラスコ（１：５）をブランクとして使用した。９６穴プレート中の試料の６００ｎｍでの光学密度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘＰｌｕｓマイクロプレート分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定し、蛍光値をＲＦＵ−相対蛍光単位として報告した。

フローサイトメトリーのために、培養試料を以下のようにホルムアルデヒドによって固定した：細胞１ｍＬをペレット化し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に再懸濁した。換気フードにおいて、３７％ホルムアルデヒド（保存濃度）を２％の濃度に添加した。細胞を室温で５分間インキュベートし、その後合計３回、遠心分離してＰＢＳに再懸濁した。ＯＤ₆₀₀を０．０１に調整し、分析まで細胞を４℃で保存した。すべての洗浄液を危険廃棄物として収集した。フローサイトメトリー分析をＣｙｔｏｍｅｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡによって実施した。ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ２ソフトウエア（ＤｅＮｏｖｏＳｏｆｔｗａｒｅ；Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いてデータをプロットした。
マンニトール、グリセロールおよびグルコース濃度の分析

培養ブロス中のマンニトール、グリセロールおよびグルコースの濃度を、ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１０分析カラムとＥＤ５０パルストアンペロメトリック検出器（ＰＡＤ）（ＤｉｏｎｅｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を備えたＤｉｏｎｅｘイオンクロマトグラフで測定した。細胞と培養ブロスを遠心分離によって分離し、上清試料を使用時まで−２０℃で保存した。試料を約１０μｇ／ｍｌの推定濃度まで水で数千倍に希釈し、自動サンプル注入器でカラムに注入した（注入容量２５μｌ）。カラムを水中１８ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡させた。１ｍｌ／分の流速で、実施条件は以下のとおりであった：１８ｍＭＮａＯＨ１０分間；１分以内に１００ｍＭＮａＯＨに上昇させる；１００ｍＭＮａＯＨ１分間；カラムを順化させるために１８ｍＭＮａＯＨ８分間。おおよその保持時間は以下のとおりであった：グリセロール２．２分間；マンニトール３．４分間；グルコース１２．８分間。濃度を公知濃度の標準に基づいて算定した。

様々なシュードモナス属におけるｍｔｌオペロンの同定

Brunker et al. (1998) 「Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106,」 Gene 206(l):l 17-126によって述べられているＤＳＭ５０１０６ｍｔｌＥ配列を使用した、ＥＲＧＯデータベースにおけるＰ．フルオレセンスＭＢ１０１ゲノムのＢＬＡＳＴ検索は、
ＭＢ１０１が、ＲＸＦ０１１９５から始まる、ＤＳＭ５０１０６に述べられているものに類似したｍｔｌオペロンを有することを示した（ｍｔｌＥ）。４個の異なるシュードモナス菌株、Ｐ．エルギノーサＰＡ０−１、Ｐ．フルオレセンスＤＳＭ５０１０６、Ｐ．フルオレセンスＰｆ０−１およびＰ．フルオレセンスＭＢ１０１におけるｍｔｌオペロンの遺伝子アラインメントを図３に示す。２種類の遺伝子配置が存在し、１つは転写アクチベーター遺伝子、ｍｔｌＲがｍｔｌオペロンのすぐ上流に位置し、１つはｍｔｌＲがｍｔｌオペロンのすぐ上流に存在しないものであって、これはＭＢ１０１およびＤＳＭ５０１０６の場合である。

ＭＢ１０１、ＤＳＭ５０１０６、Ｐ．フルオレセンスＰｆ０−１およびシュードモナス・エルギノーサＰＡ０−１におけるｍｔｌＥＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の領域の間の配列アラインメントを図４に示す。−３５および−１０プロモーター領域のコンセンサス配列にマッチする完全に保存された配列が４つの菌株において認められ、これは、この領域がｍｔｌオペロンについてのプロモーターとして働くという結論を裏付ける。加えて、２つの完全に保存された領域が認められ、−３５領域の上流の１５ｂｐの領域と−１０領域の下流の１４ｂｐの領域であった。

ｍｔｌオペロンについてのプロモーター領域のクローニング

ＭＢ１０１ｍｔｌＥ遺伝子の上流の２９９ｂｐ領域（配列番号９、表３）を、プライマーｍｔｌＥ３（５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＴＧＴ−３’−配列番号１４）およびｍｔｌＥ４（５’−ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＴＡＣ−３’−配列番号１５）（表８参照）を用いてＰＣＲによって増幅し、ＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子の前でクローニングして、ｐＤＯＷ１３６５−１を作製した（図５）。クローニングした領域は、ＤＳＭ５０１０６とＭＢ１０１の間で保存されているすべての配列ならびにさらに上流の配列を含む。２つのｐＤＯＷ１３６５−１クローンを配列決定した；１つ（ｐＤＯＷ１３６５−１）はゲノム標準配列（ＴｈｅＤｏｗＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙによって配列決定された）と同じ配列を有し、他方はクローンと標準配列の間で１４の相違を有していた。この大きな数の変化は、単に誤りを生じやすいＰＣＲ増幅工程から生じるとは考えられないので、本発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼが、明らかに、ＰＣＲ増幅反応におけるサイクルの間に上流領域内の４個半の直接反復配列（the four and a half direct repeats）の中で鋳型を切り換えたと推測する。反復配列はわずかに異なっており、ＰＣＲ産物の配列多様性を導く。

同じ領域からの１２６ｂｐのプロモーター領域（配列番号１１、表３）を、プライマーｍｔｌＥ５（５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＡＧＣＧＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＣＡ−３’−配列番号１６）およびｍｔｌＥ４を用いてＰＣＲによって増幅し、ＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子の前でクローニングして、ｐＤＯＷ１３６９を作製した（マップは示していない）。

Ｐ．フルオレセンスＰｆ０−１におけるｍｔｌＲとｍｔｌＥの間の２０３ｂｐ領域（配列番号１０）を、プライマーｍｔｌＥ６（配列番号１７）およびｍｔｌＥ７（配列番号１８）（表８）を用いてＰＣＲ増幅によってクローニングし、ＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子の上流に挿入して、ｐＤＯＷ１３７０−７を作製した（マップは示していない）。クローニングしたプロモーター領域の配列は、ＥＲＧＯデータベースから得た標準配列と同じであった。

同じ領域からの１４７ｂｐのプロモーター領域（配列番号１２、表３）を、プライマーｍｔｌＥ９（５’−ＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＧＴＡＡＧ３’−配列番号１９）およびｍｔｌＥ４（表８）を用いてＰＣＲによって増幅し、ＣｏｐＧＦＰ遺伝子の前でクローニングして、ｐＤＯＷ１３７７を作製した（マップは示していない）。

同じ領域からの７７ｂｐのプロモーター領域（配列番号１３、表３）を、プライマーｍｔｌＥ９およびｍｔｌＥ１１（５’−ＡＴＡＴＣＣＧＣＧＧＧＴＧＣＧＴＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＣＴＴＣＡＡＡ３’−配列番号２０）（表８）を用いてＰＣＲによって増幅し、ＣｏｐＧＦＰ遺伝子の前でクローニングして、ｐＤＯＷ１３７８を作製した（マップは示していない）。

寒天プレートでの相対プロモーター活性を測定するため、Ｐ．フルオレセンスＭＢ１０１のウラシルおよびプロリン栄養要求性突然変異株であるＤＣ２８３をプラスミドで形質転換し、２５０μｇ／ｍＬウラシル、１００μＭＦｅＣｌ₃（鉄制限されたとき細胞によって産生される蛍光ピオベルジンの生産を抑制するため）および様々な炭素源を含むＭ９プレートに線条接種して、３０℃でインキュベートした。コロニーを青色光トランスイルミネーター（ＤａｒｋＲｅａｄｅｒ，ＣｌａｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）によって検査した。ｐＤＯＷ１３６５−１またはｐＤＯＷ１３６５−２における２９９ｂｐのＭＢ１０１フラグメントおよびｐＤＯＷ１３７７における１４７ｂｐフラグメントだけが、マンニトールの存在下でＣｏｐＧＦＰ遺伝子を誘導した（表９および図６参照）−その他のフラグメントは試験したいずれの条件下でもＣｏｐＧＦＰを発現しなかった。すべてのフラグメントが−３５および−１０プロモーター領域を含んだ。マンニトールに１％グリセロールまたはグルコースを添加したとき、ｐＤＯＷ１３６５−１構築物はまだＣｏｐＧＦＰを生産し、プロモーターがいずれの炭素源によっても異化代謝産物抑制されないことを指示した。ｐＤＯＷ１３６５−１プロモーターは、１％グリセロールまたは１％グルコースが唯一の炭素源であるとき活性を有さなかった。しかし、グリセロールを５％および９．５％のレベルで使用したときプロモーターは活性であり（表９）、グリセロールがｍｔｌプロモーターの偶発的な誘導物質として働き得ることを示唆した。

マンニトール誘導

マンニトール誘導を調べるための実験を、Ｐ．フルオレセンスＭＢ１０１のウラシルおよびプロリン栄養要求性突然変異株である、シュードモナス・フルオレセンスＤＣ２８３菌株において実施した。たとえばJC Schneider et al. (2005) 「Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high cell density Pseudomonas fluorescens fermentation,」 Biotech Prog 21:343参照。菌株ＤＣ２８３／ｐＤＯＷ１３６５−１に関する増殖実験を、最初に９．５％グリセロールを含む標準振とうフラスコ培地で実施した。約２４時間の細胞培養後、ＣｏｐＧＦＰの発現を誘導するために１％マンニトール（５５ｍＭ）を添加し、培養物の蛍光を測定することによって経時的に追跡した。興味深いことに、細胞はマンニトールによる誘導の前に高い度合いの蛍光を示し、細胞蛍光は誘導後に上昇しなかった（図７）。さらなる実験は、誘導前の蛍光レベルとマンニトールプロモーターの誘導能が培地中のグリセロールの量と相関することを明らかにした。振とうフラスコ培地中のグリセロール濃度を２％から５％、さらには９．５％に上昇させると、非誘導蛍光のレベル上昇と誘導蛍光のレベル低下を生じさせた（図８）。ＣｏｐＧＦＰ発現は、２％グリセロール濃度を含む培地中のマンニトールによって直後にのみ誘導可能であった。これらの低レベルのグリセロールを使用することは、すべての炭素源が２４時間で消費されるので、振とうフラスコ分析のためには十分でない。

Ｐ．フルオレセンスにおけるｍｔｌＤＹＺマンニトール分解遺伝子の欠失

ＤＣ２８３菌株によるマンニトール分解を防ぐため、本発明者らは、染色体上のマンニトールオペロンから３個の遺伝子（ｍｔｌＤＹＺ）を欠失させた。対立遺伝子交換突然変異誘発によってｍｔｌＤＹＺ遺伝子を欠失させるために自殺ベクターｐＤＯＷ１３７３−３（図９）を設計した。ｍｔｌＤＹＺ隣接領域を、ＭＢ２１４ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅し、上流領域についてはプライマーｍａｎ１（５’−ＧＣＣＧＡＣＡＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＣＡ−３’）（配列番号２１）およびｍａｎ２（５’−ＴＧＣＣＣＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＧＧＧＡＡＡＴＡＣＴＣ−３’）（配列番号２２）を使用し、下流領域についてはｍａｎ３（ＧＡＧＴＡＴＴＴＣＣＣＧＡＴＧＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＧＣＡ−３’）（配列番号２３）およびｍａｎ４（５’−ＡＣＣＧＡＴＡＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＡＧ−３’）（配列番号２４）を使用して、オーバーラップ伸長手法によるスプライシングを用いて連結した。プライマーｍａｎ２およびｍａｎ３は相補的オーバーラップを含む。連結産物をｐＤＯＷ１２６１／ＳｒｆＩにクローニングして、ｐＤＯＷ１３７３−３を作製した（図９）。コロニーをプライマーＨ３ｓｅｑ（５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡ−３’）（配列番号２５）およびｍａｎ４でスクリーニングした；ＰＣＲによって生じた突然変異が組み込まれなかったことを確認するため、予想された１１７０ｂｐ産物を有するものを配列決定した。

プラスミドｐＤＯＷ１３７３−３を、その中で独立して複製することができないＤＣ２８３菌株に形質転換し、ゲノム内への組込み体をテトラサイクリン耐性によって選択した。ｍｔｌＤＹＺ遺伝子クラスターの上流または下流の染色体へのプラスミドの組み込みに成功した形質転換体を、ＰＣＲ増幅を実施することによって同定した。その後、二次交差によって染色体からプラスミド（ｍｔｌＤＹＺ遺伝子を有するまたは有さない）を成功裏にループアウトしたクローンを富化するため、数個の上流および下流組込み体をテトラサイクリンの不在下で培養した。プラスミドの喪失はクローンを、所望遺伝子型を有するクローンに関して選択するために寒天培地において使用した５’−フルオロオロチン酸に対して耐性にした。プラスミド（およびｍｔｌＤＹＺ遺伝子）が染色体に組み込まれなかったクローンは、それらのウラシル栄養要求性を回復していた。対立遺伝子交換のために増幅した領域の外側に位置する、プライマーｍａｎ５（５’−ＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＡＣＣＧＣＴＧＴＣＣＡ−３’）（配列番号２６）およびｍａｎ６（５’−ＴＴＣＡＡＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣＧＧＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡ−３’）（配列番号２７）を使用したＰＣＲ増幅は、いくつかの単離クローンにおいて予想された大きさ（１３０８ｂｐ）のＰＣＲ産物を生じ、プラスミドプラスｍｔｌＤＹＺ遺伝子がＤＣ２８３染色体から成功裏に欠失されたことを指示した。対象染色体領域のＰＣＲ配列決定は、ｍｔｌＤＹＺ遺伝子が菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ（＝ＤＣ３８８）に存在しないことを確認した。

ＤＣ３８８菌株を、ウラシルとプロリン（各々２５０μｇ／ｍｌ）および１％（ｗ／ｖ）グルコースまたは１％（ｗ／ｖ）マンニトールを唯一の炭素およびエネルギー源として添加したＭ９無機塩培地において増殖および炭素代謝に関して分析した。突然変異株は、グルコースを含む培地で２４時間以内に約２．２のＯＤ₆₀₀に増殖し、グルコースは付随して枯渇した。これに対し、マンニトールを唯一の炭素源として含む培地では光学密度のわずかな上昇しか認められず、マンニトール濃度は経時的に減少しなかった（図１０）。これらの結果は、ｍｔｌＤＹＺ欠失突然変異株が予想された表現型を有し、マンニトールを分解できないことを明らかにした。

様々な増殖条件下でのｍｔｌＤＹＺ欠失突然変異株におけるマンニトール誘導のＣｏｐＧＦＰ発現

プラスミドｐＤＯＷ１３６５−１（２９９ｂｐのｍｔｌプロモーターによって制御されるＣｏｐＧＦＰ遺伝子を担持する）をＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ菌株に形質転換した。生じた構築物、ＤＣ３８９菌株を、様々な濃度のグリセロール（２％、５％、９．５％）を含む振とうフラスコ培地で試験した。マンニトール分解欠損菌株において、マンニトールはすべてのグリセロール濃度でＣｏｐＧＦＰを誘導した（図１１）が、野生型菌株では、２％初期グリセロールで増殖させた培養物だけが即時誘導を示した（図７）。プロモーター活性の量は炭素源濃度と正に相関した；最高誘導レベルは９．５％グリセロールを使用して達成された。欠失はマンニトール同化における最初の工程を除去し、それ故マンニトールによるＰｍｔｌの誘導は、分解産物ではなくマンニトールがＰｍｔｌの誘導物質であることを指示する。

欠失突然変異株と野生型株の並列比較において、突然変異株は９．５％グリセロールを含む培地でマンニトールによって誘導可能であったが、野生型株は誘導されなかった（図１２ａ）。マンニトール濃度は、突然変異株では一定のままであったが、野生型株ではゼロに低下した（データは示していない）。突然変異株はより低いＯＤ₆₀₀へと増殖し、これは、マンニトールを炭素源として利用することができないこと、および細胞増殖に負担を与え得る、突然変異におけるＣｏｐＧＦＰ遺伝子のより高い発現に起因すると考えられる。突然変異株は野生型株よりも高い誘導前発現レベルを示し、これは、突然変異株が酵母抽出物中に存在する微量の誘導物質を分解できないことから生じると考えられる。

マンニトールプロモーターはまた、１０％グルコースを炭素源として突然変異株を増殖させたときより高い誘導レベルを達成した（図１２ｂ）。グルコース増殖培養物は４８時間後にＣｏｐＧＦＰ活性の急速な喪失を経験し、これは、培地の酸性化および付随する死滅とタンパク質変性に帰せられる。

様々なマンニトール濃度による誘導後のｍｔｌプロモーター活性

ｍｔｌプロモーターからＣｏｐＧＦＰ発現を誘導するため、先の実験では１％（５５ｍＭ）濃度のマンニトールを培地に添加した。この実験では、発現を誘導するためにより低い誘導物質濃度が使用できるかどうかを調べるため、２４時間目にグルコース増殖またはグリセロール増殖培地に添加するマンニトール濃度を０．０１％〜１％の間で変化させた。誘導後の蛍光はマンニトールの濃度の上昇と共に増加した（図１３）。０．０１％のマンニトールは、グリセロール増殖およびグルコース増殖細胞の両方においてプロモーター活性を上昇させるのに十分であったが、１％マンニトールではより高いレベルが達成された。

ｍｔｌプロモーターのグリセロール誘導

振とうフラスコ実験において、野生型と突然変異型菌株の両方が、グリセロール含有培地では誘導前にバックグラウンド蛍光を示したが、グルコース含有培地ではバックグラウンド蛍光を示さなかった。グリセロールはマンニトールと構造的類似性を共有し、グリセロールの濃度が十分に高い場合、グリセロールがｍｔｌプロモーターの偶発的誘導物質として働き得ることが考えられる。この仮説を、１２．５％グルコースを含む培地で、誘導の時点でマンニトールの代わりに様々な濃度のグリセロールを添加して、菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３３９ｐＤＯＷ１３６５−１に関する振とうフラスコ実験を実施することによって試験した。フラスコを制御するための誘導物質としてマンニトールを添加した。グルコース増殖培地において後の時点で起こり得るｐＨシフトからの干渉を防ぐため、ＥＦＴ２４時間目ではなくＥＦＴ１２時間目に誘導を実施した。

グリセロール誘導物質濃度が２％またはそれ以下であるとき、プロモーター活性は添加なしの場合と検出可能に異ならなかった。より高いグリセロール濃度（５％および９．５％）では、蛍光は誘導後１７時間目までにバックグラウンドレベルの２〜３倍に上昇した（図１４）。この結果は、グリセロールが、ＣｏＰＧＦＰ発現を生じさせるｍｔｌプロモーター活性を誘導できること（マンニトールよりは低レベルであるが）を明らかに示しており、高グリセロール濃度を含む培地で認められたバックグラウンド蛍光を説明する。

飽和未満の誘導物質濃度でのｍｔｌプロモーターの均一誘導

飽和未満レベルの誘導物質が二相性の「全か無か」スタイルの誘導を生じさせたのかどうか、または誘導がすべての細胞の間で均一であったのかどうかを調べるため、実施例６および７からの振とうフラスコ培養物の一部をフローサイトメトリーによって分析した。０〜１％マンニトールを誘導物質としてまたは０〜９．５％グリセロールを誘導物質として、グルコースを炭素源として使用した、試験培養物において、蛍光の分布は単一の正常な形状の分布を創造し（図１５）、培養物内ですべての細胞が同様のレベルに誘導されたことを指示した。

２０Ｌ発酵槽におけるｍｔｌプロモーター活性

ＤＣ３９０菌株（＝ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１ｐＤＯＷ１３３９）を、２０Ｌ発酵槽においてグリセロールまたはコーンシロップ（グルコース）のいずれかを唯一の炭素源として含む無機塩培地中で培養した。グリセロールおよびグルコースを、細胞の酸素取り込み速度に依存する標準化供給レジメンに従って様々な時点で培地に頻繁にスパイクした。グリセロールまたはグルコースの濃度はそれぞれ１％および０．１％を一度も超えず、培地のｐＨは６．５の一定に保持した。グリセロールを含む培地では、培養物は約２５０の光学密度ＯＤ₅₇₅に達した。細胞をコーンシロップで増殖させたとき（図１６ａ）、最大光学密度はわずかに低かった（約２３０のＯＤ₅₇₅）。

経過発酵時間（ＥＦＴ）２０．５時間目に約１７０の光学密度で、発酵槽培養物を１％（ｗ／ｖ）マンニトールで誘導した。（図１６ｂ）に示すように、細胞蛍光は、コーンシロップを含む培地では約３０００ＲＦＵに、およびグリセロールを含む培地では約１５００ＲＦＵに上昇した。バックグラウンド蛍光、経時的な蛍光の上昇および最大ＲＦＵは、１２．５％グルコース（最大３５００ＲＦＵ）または２％グリセロール（最大１０００ＲＦＵ）に関する振とうフラスコ実験で得た結果と同等であった（データは示していない）、すなわち抑制レベルは低かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペプチド分析は、マンニトールによる誘導後のＣｏｐＧＦＰの出現（２５ｋＤａの予想された分子サイズを有する）を明らかにした（データは示していない）。両方の発酵槽において、培養物中の細胞の間でのＣｏｐＧＦＰの発現は、フローサイトメトリーによって評価したとき、均一に誘導された（図１７）。

ヒト成長ホルモンの溶解度を上昇させる折りたたみ調節因子ＧｒｐＥ、ＤｎａＫおよびＤｎａＪを共発現するためのｍｔｌプロモーターの使用

ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、Ｐ．フルオレセンスにおいて発現されるとき、ほぼ全面的に不溶性封入体として蓄積する。転写プロファイリングデータに基づき、Ｐ．フルオレセンス折りたたみ調節因子（ＦＭ）ＤｎａＫおよびＤｎａＪの発現は、標的タンパク質を発現しなかった菌株と比較して、組換えｈＧＨの発現およびＰ．フルオレセンスの細胞質における封入体としての蓄積後の菌株において上昇した（たとえば米国特許仮出願第６０／５９１，４８９号参照）。本発明者らはそれ故、ｈＧＨとＦＭを共発現するためにプラスミド上でｍｔｌプロモーターの制御下にＧｒｐＥ、ＤｎａＫおよびＤｎａＪをコードする推定上のオペロンを有する菌株を操作した。

ＭＢ２１４（ＤＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から単離した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＲＣ１９９（配列番号２８）およびＲＣ２００（配列番号２９）を用いて、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を製造者の推奨に従って使用してｇｒｐＥｄｎａＫＪを増幅した。生じたＰＣＲ産物（４ｋｂ）をＳｐｅＩおよびＸｂａＩ（上記プライマー内の下線を付した制限部位）で消化し、ｐＤＯＷ２２３６（ｐＤＯＷ１３０６−６の誘導体）(Schneider, J. C., A. F. Jenings, D. M. Mun, P. M. McGovern and L. C. Chew (2005). 「Auxotrophic markers pyrF and proC can replace antibiotic markers on protein production plasmids in high-cell-density Pseudomonas fluorescens fermentation.」 Biotech Prog 21: 343-348)に連結して、ｔａｃプロモーターの制御下にｇｒｐＥｄｎａＫＪオペロンを含むｐＤＯＷ２２４０を作製した。ｐＤＯＷ２２４０をＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生じたｇｒｐＥｄｎａＫＪ含有の４．０ｋｂフラグメントを、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてゲル精製して、同じくＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＤＯＷ２２４７（ｐＤＯＷ１３６５−１の誘導体）に連結した。マンニトールプロモーターの制御下にｇｒｐＥｄｎａＫＪを含む、生じたプラスミドｐＤＯＷ３５０１を、２５０μｇ／ｍｌウラシルを添加したＭ９グルコースプレートで選択することによってＤＣ３８８に形質転換した。最後に、ｐＤＯＷ１４２６［標準品？］を上記菌株（ＤＣ４６２）に電気穿孔し、Ｍ９グルコースプレートで選択して、２個の誘導性プラスミド：１）Ｐ_tacｈＧＨを担持するｐＤＯＷ１４２６および２）Ｐ_mtlｇｒｐＥｄｎａＫＪを担持するｐＤＯＷ３５０１を有する菌株ＤＣ４６３を生成した。

ＤＣ４６３の２つの培養物を無機塩培地で増殖させ、各々の培養物について様々な時点でＯＤ₆₀₀を記録した。接種後様々な時点で、ｈＧＨについては０．１ｍＭＩＰＴＧおよびＧｒｐＥＤｎａＫＪについては０．５％マンニトールを添加することによって誘導を実施した。誘導後０、４、８、２４および４８時間後に試料を収集した。各々の時点で、１ｍＬに基準化した２０ＯＤ₆₀₀を採集し、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて溶解して、１４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって可溶性分画と不溶性分画に分けた。等容量の試料をＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）２×レムリ緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱して、３０μＬを、１×トリスグリシンＳＤＳランニング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＢｉｏＲａｄ１５％トリス−ＨＣｌ判定基準ゲルに負荷した。タンパク質をＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＳａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で視覚化し、同じゲルに負荷したＰｒｅｄｉｌｕｔｅｄＢＳＡ標準品（ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてｈＧＨ産生を定量した。生じたクマシー染色ゲルを、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＰｅｒｓｏｎａｌＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して走査し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔおよびエクセルを用いて分析を実施した。表１１に示すように、ＧｒｐＥＤｎａＫＪの共発現はｈＧＨの溶解度を有意に上昇させ、標的タンパク質のほぼ１００％を可溶性分画に変換した。ＩＰＴＧとマンニトールの同時添加を用いてＤＣ４６３の増殖と誘導を反復する付加的な実験は、ここで示した結果を厳密に模倣し、さもなければ１００％不溶性分画であったのと比較して、ＧｒｐＥＤｎａＫＪと共過剰発現されたときｈＧＨの５０〜１００％が可溶性分画として認められた（データは示していない）。これらの結果は、ＩＰＴＧとマンニトールの同時添加または時間をずらした添加のいずれについても認められたが、ＧｒｐＥＤｎａＫＪを早期誘導した培養物についての細胞密度も上昇せず、これらのＦＭの高レベルの発現が細胞の健康に有害であることを示唆した。より低いレベルの発現が細胞代謝への最小有害作用および可溶性ｈＧＨの最も高い収率のために最適であると考えられるので、標的タンパク質とは独立して調節されるプロモーターからのこれらのＦＭ遺伝子の制御は、独立した発現の最適化を可能にする。

Brunker et al. (1998)「Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106,」 Gene 206(1): 117-126によって述べられた、マンニトール、グルシトールおよびアラビトール分解の経路を示す。 Brunker et al. (1998) 「Structure and function of the genes involved in mannitol, arabitol, and glucitol utilization from Pseudomonas fluorescens DSM50106,」 Gene 206(1): 117-126によって述べられた、ＤＳＭ５０１０６におけるＰ．フルオレセンスマンニトール（ｍｔｌ）オペロンの構造を示し、プロモーター内の推定上の−１０および−３５部位（太字）および逆方向相同性の領域（矢印）を特定する。ｍｔｌＲアクチベーターはｍｔｌオペロンから離れた部位に存在する。ＭＢ１０１および他のシュードモナス属におけるマンニトールオペロンの比較を示す。図は、４つの異なるシュードモナス菌株、Ｐ．フルオレセンスＭＢ１０１、Ｐ．フルオレセンスＤＳＭ５０６０１、Ｐ．フルオレセンスＰｆ０−１およびＰ．エルギノーサＰＡ０−１におけるｍｔｌオペロンのアラインメントを示す。ｍｔｌオペロンの転写アクチベーターをコードするｍｔｌＲ遺伝子は、ＭＢ１０１とＤＳＭ５０６０１を除くすべての場合にｍｔｌオペロンのすぐ上流に位置し、ＭＢ１０１では数ｋＢ上流で生じ、ＤＳＭ５０６０１ではゲノム内の未知の位置で生じる。様々なシュードモナス属におけるｍｔｌＥの上流のゲノム領域の比較を示す。ＭＢ１０１、ＤＳＭ１０５０６、Ｐ．フルオレセンスＰｆ０−１、およびＰ．エルギノーサＰＡ０−１におけるｍｔｌＥ遺伝子の上流領域を整列した。４つの菌株の間での完全な相同領域を小文字で示している。−３５および−１０領域、推定上のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）および開始コドンに下線を付している。点線の箱は、マンニトール誘導のために必要な最小配列を示す。ＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子の直前のｍｔｌプロモーターフラグメントのクローニングを示す。ＭＢ１０１ｍｔｌＥ遺伝子の上流の２９９ｂｐ領域（配列番号９）を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＭＢ２１４（ＭＢ１０１に由来する菌株）ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーｍｔｌＥ３（配列番号１４）およびｍｔｌＥ４（配列番号１５）（表８参照）でのＰＣＲ増幅によってクローニングし、ｐＤＯＷ１３６５−１を作製した。ｍｔｌＥの上流領域からの様々なフラグメントの活性の比較を示す。ｐＤＯＷ１３６５−１、ｐＤＯＷ１３７７、ｐＤＯＷ１３６９、ｐＤＯＷ１３７８またはｐＤＯＷ２２１２（ＣｏｐＧＦＰ遺伝子なし）のいずれかを担持する菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺを、ウラシルを添加した１％マンニトールを含むＭ９寒天プレートにパッチした。蛍光タンパク質の誘導を青色光への暴露によって測定した。４つの菌株の間での２つの１５ｂｐ相同領域（図４参照）を、斜線で影をつけた箱で示している。−３５および−１０領域を示し、各々の配列をクローニングするために使用したプライマーを、ＣｏｐＧＦＰレポーター遺伝子の上流のクローン化した領域を指示する、白い箱の先端に示している。標準生産培地で増殖させた野生型菌株バックグラウンドにおける、ＰｍｔｌからのＣｏｐＧＦＰの発現へのマンニトールの作用を示す。菌株ＤＣ２８３ｐＤＯＷ１３６５−１を、９．５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよびウラシル補充を含む振とうフラスコ培地で培養した。マンニトール１％（ｗ／ｖ）をＥＦＴ（経過発酵時間）２４時間目に１つのセットに添加した（黒い四角）または添加しなかった（白い三角）。誘導後の蛍光を経時的に観測した。ＯＤ₆₀₀＝１に基準化した試料に関して蛍光を測定した。様々なグリセロール濃度を有する培地での野生型菌株バックグラウンドにおける、ＰｍｔｌからのＣｏｐＧＦＰの発現へのマンニトールの作用を示す。菌株ＤＣ２８３ｐＤＯＷ１３６５−１を、２％（四角）、５％（三角）または９．５％（丸）グリセロールを含む振とうフラスコ培地で培養した。培養物を、ＥＦＴ２０時間目に１％マンニトールで誘導しなかった（白い記号）か、または誘導した（黒い記号）。誘導後の蛍光を経時的に観測した。ＯＤ₆₀₀＝１に基準化した試料に関して蛍光を測定した。ｍｔｌＤＹＺ欠失ベクターｐＤＯＷ１３７３−３のベクターマップを示す。ベクターｐＤＯＷ１３７３−３は、対立遺伝子交換突然変異誘発によってｍｔｌＤＹＺ遺伝子を欠失させるために設計した。ｍｔｌＤＹＺ隣接領域を、ＭＢ２１４ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅し、上流領域についてはプライマーｍａｎ１（配列番号１８）およびｍａｎ２（配列番号１９）、下流領域についてはｍａｎ３（配列番号２０）およびｍａｎ４（配列番号２１）を使用して、オーバーラップ伸長法によるスプライシングを用いて連結した。プライマーｍａｎ２およびｍａｎ３は相補的オーバーラップを含む。連結した産物をｐＤＯＷ１２６１／ＳｒｆＩにクローニングして、ｐＤＯＷ１３７３−３を作製した。コロニーをプライマーＨ３ｓｅｑ（配列番号２２）およびｍａｎ４でスクリーニングした；ＰＣＲ由来の突然変異が組み込まれていないことを確実にするために予想された１１７０ｂｐ産物を有するものを配列決定した。菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺの増殖と炭素源（マンニトールまたはグルコース）利用を示す。培養物を、ウラシル（２５０μｇ／ｍｌ）およびプロリン（２５０μｇ／ｍｌ）を添加した、１％炭素源を含むＭ９培地で増殖させた。誘導後のグルコース（白い丸）およびマンニトール（白い三角）濃度および６００ｎｍでの光学密度（マンニトールについての黒い三角、グルコースについては黒い丸）を経時的に観測した。１％マンニトールによる誘導後のマンニトール分解能欠損株におけるＰｍｔｌからのＣｏｐＧＦＰの発現へのグリセロール濃度の影響を示す。菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１を、ウラシルを添加した、２％（四角）、５％（三角）または９．５％（丸）の初期濃度のグリセロールを含む振とうフラスコ培地で培養した。培養物を、ＥＦＴ２２時間目に１％マンニトールで誘導した（黒い記号）かまたは誘導しないままにした（白い記号）。誘導後の蛍光を経時的に観測した。ＯＤ₆₀₀＝１に基準化した試料に関して蛍光を測定した。様々な炭素源におけるｍｔｌＤＹＺ欠失突然変異型および野生型のＰｍｔｌ活性の比較を示す。Ｐｍｔｌ活性を、５％（四角）または９．５％グリセロール（三角）（ａ）、または１０％グルコース（丸）（ｂ）の初期濃度を含む振とうフラスコ培地でマンニトール分解能欠損株（Ｄ２８３ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１）（黒い記号）および野生型（ＤＣ２８３／ｐＤＯＷ１３６５−ｌ）（白い記号）において比較した。培養物をＥＦＴ２４時間目に１％マンニトールで誘導し、誘導後の蛍光を経時的に観測した。ＯＤ₆₀₀＝１に基準化した試料に関して蛍光を測定した。様々な濃度のマンニトールによる誘導後のＰｍｔｌ活性を示す。様々な濃度のマンニトール（０、０．０１％、０．１％、０．５％、１％）を、ＥＦＴ２５時間目に、９．５％グリセロールおよび補充ウラシルで増殖させたＤ２８３ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１（三角）または１２．５％グルコースで増殖させたＤ２８３ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１ｐＤＯＷ１３３９（四角）に誘導物質として添加した。誘導後の蛍光を、ＯＤ₆₀₀＝１に基準化した試料に関して経時的に観測した。グリセロールによる誘導後のグルコース増殖培養物におけるＰｍｔｌ活性を示す。菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１ｐＤＯＷ１３３９を、１２．５％グルコースを含む振とうフラスコ培地で培養した。様々な濃度のグリセロール（０、０．１％、０．５％、１％、２％、５％、９．５％）をＥＦＴ１２時間目に添加し、基準化した試料（上記）に関して蛍光を経時的に測定した。１７時間目（四角）または３５時間目（三角）の蛍光レベルをプロットした。様々な濃度の誘導物質を用いたフローサイトメトリー分析を示す。様々なレベルのマンニトール（図１３参照）（ａ）またはグリセロール（図１４参照）（ｂ）で誘導したグルコース増殖培養物からの細胞の蛍光をフローサイトメトリーによって分析し、結果をヒストグラムに重ね合わせた。ｘ軸は蛍光であり、ｙ軸は各々の蛍光値での細胞数である。比較のため、２％マンニトールによる誘導後の蛍光を（ｂ）に含めている。２０Ｌのコーンシロップ（グルコース）またはグリセロール発酵槽培養物におけるＣｏｐＧＦＰＰｍｔｌのマンニトールによる誘導を示す。コーンシロップ（グルコース）（菱形）またはグリセロール（四角）を含む２０Ｌ発酵槽で増殖させた菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１ｐＤＯＷ１３３９（＝ＤＣ３９０）の光学密度（Ａ）および蛍光（Ｂ）分析を示す。培養物をＥＦＴ２０．５時間目に１％マンニトールで誘導し、５７５ｎｍでの光学密度および蛍光を、基準化した試料に関して経時的に測定した。２０Ｌのコーンシロップ（グルコース）またはグリセロール発酵槽培養物におけるＰｍｔｌからのＣｏｐＧＦＰ発現のマンニトールによる誘導のフローサイトメトリー分析を示す。コーンシロップ（グルコース）（上）またはグリセロール（下）を含む２０Ｌ発酵槽で増殖させた菌株ＤＣ２８３ ΔｍｔｌＤＹＺ／ｐＤＯＷ１３６５−１ｐＤＯＷ１３３９（＝ＤＣ３９０）のフローサイトメトリー分析。培養物をＥＦＴ２０．５時間目に１％マンニトールで誘導した。誘導後０時間目と４８時間目にフローサイトメトリー分析のために試料を取り出した。ヒストグラムのｘ軸は蛍光であり、ｙ軸は各々の蛍光値での細胞数である。

Claims

（ａ）配列番号９または配列番号１２；および
（ｂ）配列番号９または配列番号１２に示すヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から成る群より選択される核酸配列を含むマンニトール誘導性プロモーターに作動可能に連結された、組換えポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸構築物を含む、シュードモナス・フルオレセンス細胞であって、
前記シュードモナス・フルオレセンス細胞が、マンニトールの代謝または分解を阻害するように遺伝的に変化している、前記シュードモナス・フルオレセンス細胞。
前記核酸構築物が、ｍｔｌアクチベータータンパク質結合領域として働く核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
遺伝的変化が、マンニトールまたはその誘導体もしくは類似体の代謝において必要な遺伝子の突然変異または欠失である、請求項１に記載の細胞。
前記遺伝子がｍｔｌオペロンから選択される、請求項３に記載の細胞。
前記遺伝子が、ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺ、またはそれらの組合せから成る群より選択される、請求項４に記載の細胞。
ａ）組換えポリペプチドを発現することができるシュードモナス・フルオレセンス宿主細胞を提供すること；
ｂ）ｉ）配列番号９または配列番号１２；および
ii）配列番号９または配列番号１２に示すヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
から成る群より選択される核酸配列を含むマンニトール誘導性プロモーターに作動可能に連結された組換えポリペプチドをコードする少なくとも１個の核酸構築物で前記宿主細胞を形質転換すること；
ｃ）前記宿主細胞を増殖培地で増殖させること；
ｄ）前記マンニトール誘導性プロモーターから対象ペプチドの発現を誘導することができる量で炭素源を増殖培地に添加すること；および
ｅ）前記マンニトール誘導性プロモーターを誘導することによって対象組換えポリペプチドを発現すること；および
ｆ）発現された組換えポリペプチドを単離すること
を含み、前記宿主細胞が、前記マンニトール誘導性プロモーターを誘導することができるマンニトールの代謝または分解を阻害するように遺伝的に変化している、シュードモナス・フルオレセンス宿主細胞において組換えポリペプチドを発現するための方法。
前記プロモーターが、ｍｔｌアクチベータータンパク質結合領域として働く核酸配列をさらに含む、請求項６に記載の方法。
前記遺伝的変化が、マンニトールまたはその誘導体もしくは類似体の代謝において必要な遺伝子の突然変異または欠失である、請求項６に記載の方法。
前記遺伝子がｍｔｌオペロンから選択される、請求項７に記載の方法。
前記遺伝子が、ｍｔｌＤ、ｍｔｌＹおよびｍｔｌＺ、またはそれらの組合せから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
前記シュードモナス・フルオレセンス宿主細胞が、マンニトールの代謝または分解を阻害するように遺伝的に変化している、請求項６に記載の方法。