CN112553235B

CN112553235B - 一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用

Info

Publication number: CN112553235B
Application number: CN202011449022.8A
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 韩来闯; 陈巧青; 崔文璟; 程中一; 刘中美; 周丽; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-09
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-12-09
Also published as: CN112553235A

Abstract

本发明公开了一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明通过将P_glpD与抗终止子GlpP共同构建至枯草芽孢杆菌高拷贝质粒上，使菌体的生长和蛋白的表达分开。在发酵初期，使菌体充分利用葡萄糖等优先利用的碳源完成生长和高效积累生物量的过程；直至葡萄糖耗尽，甘油自动诱导开始之后，蛋白得到高效表达。本发明用绿色荧光蛋白和纳豆激酶验证该表达系统的调控性能，该表达系统可广泛应用于对宿主菌压力较大的蛋白和代谢产物的生产上。

Description

一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

由于枯草芽孢杆菌生长速度快、蛋白分泌表达能力强、发酵工艺简单，已经被广泛应用于各种酶的高效生产。另外，枯草芽孢杆菌一般被认为是安全菌株，因此也是食品和药用蛋白生产的理想宿主。枯草芽孢杆菌表达蛋白产量的关键是高效表达系统的构建及相应发酵工艺的开发，而前者最为基础。目前，得到广泛应用的枯草芽孢杆菌表达系统主要有三类：①基于P43等启动子开发的强组成型表达系统；②基于P_xylA、P_grac等启动子开发的诱导型表达系统；③基于P_srfA等启动子开发的细胞密度依赖型表达系统。

目前这些表达系统皆存在较大缺陷，亟需解决。在强组成型表达系统中，无法调节蛋白的表达时间和强度，蛋白表达与菌体生长同步进行，使得表达一些对宿主压力较大的外源蛋白时，影响菌体的正常生长，大大限制产量。在使用木糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等作为诱导剂的诱导型表达系统中，虽然蛋白表达时间和强度可调，但是昂贵的诱导剂添加会大大增加生产成本，限制期在工业规模的放大使用。而利用群体感应系统开发的细胞密度依赖型表达系统，由于摇瓶、小体系发酵罐、大体系发酵罐之间培养条件的差异，导致其放大生产稳定性较差。

葡萄糖是发酵培养常用的速效碳源，虽然细菌利用葡萄糖效率高、生长速度快，但是葡萄糖代谢常常伴随乙酸积累，大幅降低培养液的pH，对生长造成巨大压力。因此在发酵过程中往往需要大量的碱(如氨水)来调节培养液的pH。与之相对，甘油代谢中产酸较少，利用率高，被认为是发酵后期的理想碳源，复配在多种蛋白高产培养基中(如TB培养基)。随着甘油价格的逐步降低，可作为大规模发酵的主要碳源使用。

枯草芽孢杆菌能高效利用甘油作为碳源为菌体的生长提供能量，glp操纵子包含了甘油代谢的各个基因。该操纵子中的基因表达受抗终止子GlpP调控，GlpP结合3-磷酸甘油后能够靶向目标mRNA，破坏其终止子结构，从而使得mRNA顺利转录。如，glp操纵子中负责glpD基因表达的启动子P_glpD，紧邻其转录起始位点下游的是一个终止子结构，使得RNA聚合酶不能对glpD基因进行转录，导致glpD基因不能表达。

纳豆激酶(NK)最初发现于日本传统的发酵食品纳豆中，由于其具有极强的纤维蛋白溶解活性，被认为在心脑血管的保健甚至血栓治疗中具有很大的应用潜力。但是目前纳豆激酶主要从纳豆食品中提取，成本高，产量低。由于枯草芽孢杆菌极佳的安全性，人们通过基因工程手段在枯草芽孢杆菌中构建纳豆激酶高产工程菌，提高了纳豆激酶的产量，降低了生产成本。但是，纳豆激酶作为一种丝氨酸蛋白酶，其高效表达会对宿主菌造成极大的压力，使得发酵过程中的生物量难以积累，严重限制了纳豆激酶的进一步高产。

发明内容

本发明的提供了一种受甘油诱导的高效蛋白表达系统，可通过葡萄糖与甘油的复配实现蛋白自诱导，最终通过自诱导表达的方式实现纳豆激酶的高产。鉴于启动子及其对应的调控蛋白是构建表达载体的核心元件，本发明将枯草芽孢杆菌负责甘油代谢的glp操纵子中的强启动子P_glpD单独或者与抗终止子蛋白基因glpP共同克隆到枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体上，最终构建以甘油作为诱导剂的高效蛋白表达系统。该系统的构建不仅提供了一种高效的诱导型蛋白表达系统，可以使用甘油作为诱导剂及发酵中后期的碳源。同时，通过在培养基中复配葡萄糖和甘油，提供了一种蛋白自诱导的发酵方式。利用该高效表达系统和自诱导的发酵工艺，最终实现了纳豆激酶的高产。

本发明的第一个目的是提供一种受甘油诱导的蛋白表达系统，该系统包含了响应甘油的强启动子P_glpD、启动子P_glpD的终止子、启动子P_cm和抗终止子蛋白；所述启动子P_glpD和启动子P_cm的转录方向相反；所述抗终止子蛋白可以与三磷酸甘油结合，且二者的结合物可与位于P_glpD的终止子结合；所述强启动子P_glpD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗终止子蛋白的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述启动子P_cm的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述强启动子P_glpD、启动子P_glpD的终止子、启动子P_cm和抗终止子蛋白的编码基因均位于pBSG04质粒骨架上。

在一种实施方式中，所述受甘油诱导的蛋白表达系统还含有编码目的蛋白的基因；所述编码目的蛋白的基因位于P_glpD的终止子的下游。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白。

在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为纳豆激酶。

本发明的第二个目的是提供含有所述受甘油诱导的蛋白表达系统的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的第三个目的是提供所述受甘油诱导的蛋白表达系统在诱导表达目的蛋白中的应用。

在一种实施方式中，所述目的蛋白为纳豆激酶。

在一种实施方式中，编码所述纳豆激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四个目的是提供一种应用甘油诱导的蛋白表达系统调控目的蛋白表达的方法，是将编码目的蛋白的基因连接至启动子P_glpD的终止子的下游，并将所述蛋白表达系统转化至枯草芽孢杆菌细胞中，再将获得的重组枯草芽孢杆菌细胞在含甘油的环境下培养。

在一种实施方式中，所述方法是将编码纳豆激酶的基因连接至P_glpD的终止子的下游，并将表达纳豆激酶的重组枯草芽孢杆菌接种至含葡萄糖和甘油的培养基中培养。

在一种实施方式中，所述葡萄糖和甘油的比例为1:1。

在一种实施方式中，所述葡萄糖的浓度为10g/L，甘油的浓度为10g/L。

在一种实施方式中，所述方法是将表达纳豆激酶的重组枯草芽孢杆菌接种于发酵培养基中，于35～37℃下培养。

在一种实施方式中，所述方法在发酵12h后，补料甘油或含甘油的培养基。

有益效果：本发明首先利用枯草芽孢杆菌glp操纵子中的强启动子P_glpD，构建甘油诱导型高效蛋白表达系统。使枯草芽孢杆菌利用培养基中的甘油生成3-磷酸甘油，使抗终止子GlpP结合3-磷酸甘油后，定位在P_glpD下游，并破坏其固有的终止子，使RNA聚合酶可以继续转录，从而开启glpD基因的表达。

本发明利用构建的自诱导表达系统及相应的发酵方法，使菌体的生长和蛋白的表达分开，在发酵初期，使菌体充分利用葡萄糖等优先利用的碳源完成生长和高效积累生物量的过程；直至葡萄糖耗尽，甘油自动诱导开始之后，蛋白得到高效表达。该表达系统可广泛应用于对宿主菌压力较大的蛋白和代谢产物的生产上。

本发明使用绿色荧光蛋白sfGFP验证系统性能，发现该系统可受甘油诱导，蛋白表达强度随甘油浓度增加而加强，且表达强度高于基于P₄₃启动子的强组成型系统。在质粒上过表达抗终止子基因glpP后，蛋白表达强度进一步提升。

本发明以纳豆激酶为例，应用该表达系统调控纳豆激酶的表达，通过在培养基中复配葡萄糖和甘油，使重组枯草芽孢杆菌在生长前期利用葡萄糖生长，并在葡萄糖耗尽，转换为利用甘油后开始诱导表达蛋白。该甘油诱导表达系统可以高效表达纳豆激酶。使用自诱导培养方法在5L发酵罐中补料发酵纳豆激酶，生物量(OD₆₀₀)达到80.4，纳豆激酶酶活达到9.6U/mL。

附图说明

图1为甘油诱导蛋白表达系统的构建；a：甘油诱导表达系统构建示意图；b：甘油诱导表达系统功能验证。

图2为葡萄糖-甘油复配实现蛋白自诱导表达；a：1％甘油复配不同浓度葡萄糖时，sfGFP表达检测；b：1％甘油复配不同浓度葡萄糖时，培养基残余葡萄糖检测。c：0.2％葡萄糖复配不同浓度甘油时，sfGFP表达检测；d：0.2％葡萄糖复配不同浓度甘油时，培养基残余葡萄糖检测。

图3为过表达glpP提升甘油诱导系统的效果。

图4为自诱导表达纳豆激酶的效果。a：生物量(OD600)测定；b：纳豆激酶酶活测定。

图5为5L发酵罐补料发酵纳豆激酶的效果。

具体实施方式

培养基：

LB培养基(L^-1)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。

无甘油TB培养基(L^-1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH₂PO₄ 2.31g，K₂HPO₄12.54g。

发酵初始培养基(L^-1)：无水葡萄糖5g，甘油20g，胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH₂PO₄ 2.31g，K₂HPO₄ 12.54g，CaCl₂ 0.2g。

发酵补料培养基(L^-1)：甘油500g，胰蛋白胨12g，酵母提取物24g。

sfGFP荧光强度的检测方法：取200μL细菌培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入SynergyTM H4荧光酶标仪检测OD₆₀₀和荧光。检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。

纳豆激酶酶活检测方法：使用四肽底物(Suc-AAPF-pNA)法测定纳豆激酶酶活。四肽底物(Suc-AAPF-pNA)溶液：25mg溶解在2ml DMSO中配制成母液保存，使用时稀释10倍。反应缓冲液：100mM Tris-HCl pH 8.0(含0.1mM CaCl₂)。将80μL底物,80μL反应缓冲液和40μL经适当稀释的酶液在96孔酶标板中混合均匀。放置于酶标仪中，在25℃下反应，每分钟读取一次OD₄₀₅，持续5min。根军OD₄₀₅随时间变化计算酶液的酶活。酶活定义(U)：25℃，pH＝8.0,底物浓度为0.8mmol/L时，1min内催化四肽底物生成1umol pNA所需的酶量为1U。

实施例1：甘油诱导表达系统的构建和功能验证

以PglpD-sfGFP-i1/PglpD-sfGFP-i2为引物，以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，扩增SEQ ID NO.1所示的P_glpD启动子序列。以PglpD-sfGFP-v1/PglpD-sfGFP-v1为引物，以pBPrpoB-sfGFP质粒(公开于Han L,Chen Q,Lin Q,et al.Realization of Robust andPrecise Regulation of Gene Expression by Multiple Sigma RecognizableArtificial Promoters[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2020,8.)为模板，扩增载体骨架。然后通过Gibson Assembly方法将P_glpD启动子片段载体骨架进行无缝克隆，使P_glpD克隆至绿色荧光蛋白sfGFP上游，转化至大肠杆菌JM109，提取质粒并验证，构建获得甘油诱导型蛋白表达系统质粒pBPglpD-sfGFP。该系统原理示意图见图1。

表1构建甘油诱导型表达系统引物

引物	序列(5’-3’)
		PglpD-sfGFP-i1	GAGGGCAGGTCGAAATGAGCTGTATAAAGGC
PglpD-sfGFP-i2	CTCCTTTGCTCATTACGTTTCCTCCTTGTTGTCAC
		PglpD-sfGFP-v1	GGAGGAAACGTAATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTC
PglpD-sfGFP-v2	ATACAGCTCATTTCGACCTGCCCTCTGCCACC

提取质粒pBPglpD-sfGFP，并将其转化至枯草芽孢杆菌168中，获得含有sfGFP表达质粒的枯草芽孢杆菌重组菌168pBPglpD-sfGFP。接取单菌落在含有5mL LB培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有5mL LB培养基的试管或者含有50mLLB培养基的250mL摇瓶中，使接种后的细胞的初始OD₆₀₀约为0.05-0.1，加入不同浓度的诱导剂甘油后，37℃200rpm继续培养。

以采用P₄₃表达的重组枯草芽孢杆菌为对照，结果如表2和图2所示，随着甘油浓度的增加，sfGFP表达荧光随之增加，添加1％浓度可以使sfGFP完全诱导表达。并且，该系统完全诱导后的sfGFP表达水平明显高于强组成型启动子P₄₃，说明该系统具有较高活性。

表2甘油诱导型蛋白表达系统功能验证

甘油浓度(％，W/V)	<![CDATA[荧光强度(a.u./OD<sub>600</sub>)]]>
		0	16012
0.01	27793
		0.05	88495
0.1	175760
		0.2	302988
0.4	330381
		0.6	363470
0.8	396814
		1	490140
1.5	487148
		2	467665
P43启动子对照	333463

实施例2：利用葡萄糖-甘油复配碳源实现蛋白自诱导表达

生物利用不同的碳源有先后顺序，更倾向于利用速效碳源(如葡萄糖)进行生长代谢活动，该现象被称作碳代谢阻遏效应。本发明中构建的系统为甘油诱导型表达系统，枯草芽孢杆菌对甘油的利用同样遵循碳代谢阻遏效应。因此，当培养基中同时存在葡萄糖和甘油时，枯草芽孢杆菌优先利用葡萄糖，当葡萄糖耗尽后，才开始利用甘油，外源蛋白开始诱导表达。

为了通过葡萄糖-甘油复配实现蛋白自诱导表达，接取实施例1构建的含有sfGFP诱导表达质粒的重组菌在含有5mL LB培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中，使细胞的初始OD₆₀₀约为0.05-0.1，再向培养基中添加不同比例的葡萄糖和甘油，37℃200rpm继续培养。监测不同时间的葡萄糖含量、sfGFP荧光强度。

sfGFP荧光强度和葡萄糖残留变化见图2。当固定甘油浓度为1％复配不同浓度葡萄糖时，随着葡萄糖浓度增加，sfGFP的表达时间也随之延后，最终的表达强度也随之降低。与sfGFP表达时间相对应的是葡萄糖耗尽的时间。这表明，sfGFP的表达受到葡萄糖抑制，甘油诱导，且这种调控十分严谨。当固定葡萄糖浓度为0.2％复配不同浓度的甘油时，所有条件下的sfGFP的表达时间和葡萄糖耗尽时间一致。但是随着甘油浓度的提升，最终sfGFP表达水平也提高，不加甘油时，荧光强度为1.5×10⁵a.u.当甘油添加量达到1％时，培养36h后的荧光强度最高，达到3.7×10⁶a.u.，荧光提升约25倍。从该结果得知，通过葡萄糖和甘油的复配，可以实现外源蛋白的自诱导表达。由以上结果可知，sfGFP的表达时间随葡萄糖浓度的提高而推后，另一方面，sfGFP的表达强度随甘油浓度的提升而增强。需要延迟蛋白表达时，可适当提高葡萄糖浓度，当需要较高蛋白表达水平时，提高甘油浓度。因此，在本发明构建的表达系统中，可通过葡萄糖浓度调节蛋白表达时间，甘油浓度调节蛋白表达水平。

实施例3：过表达glpP进一步提高甘油诱导表达系统的蛋白表达水平

该系统中起关键调控作用的是抗终止子GlpP，而基因组中本底表达的GlpP不一定能满足高拷贝质粒中P_glpD的激活需求，导致蛋白表达水平受限。使用引物PglpD-glpP-P1/PglpD-glpP-P2扩增pHT01质粒上的P_cm启动子(SEQ ID NO.3所示)，使用引物PglpD-glpP-i1/PglpD-glpP-i2扩增枯草芽孢杆菌基因组中的glpP基因(SEQ ID NO.2所示)。将P_cm启动子和glpP基因的片段分别连接至实施例1构建的重组质粒连接在pBPglpD-sfGFP这个质粒上，并使P_cm启动子和P_glpD启动子的转录方向相反。接取重组菌在含有5mL LB培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。之后按2％接种量转入含有50mL LB培养基的250mL摇瓶中(此时细胞的初始OD₆₀₀约为0.05-0.1)，培养基中添加1％甘油，37℃200rpm继续培养。结果显示，过表达glpP后，sfGFP的表达水平明显进一步提升(图3和表4)。

表3构建过表达glpP系统引物

引物	序列(5’-3’)
		PglpD-glpP-P1	AACTCATCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAG
PglpD-glpP-P2	TAGCTTACCGAAACGGAATGGACGATCGGCAATAG
		PglpD-glpP-i1	TAACGGAATATCAATCACTTTCCGTCAAAAAG
PglpD-glpP-i2	TAGGAGGCATATCAAATGATGAGTTTTCACAACCAGCC
		PglpD-glpP-v1	TCGTCCATTCCGTTTCGGTAAGCTAGACAAAACG
PglpD-glpP-v2	ACGGAAAGTGATTGATATTCCGTTAATGCGCCATG

表4过表达glpP对sfGFP表达的影响

实验组	<![CDATA[荧光强度(a.u./OD<sub>600</sub>)]]>
		不引入glpP基因(GlpP-)	490140
引入glpP基因(GlpP+)	862751

实施例4：纳豆激酶高效表达系统的构建及摇瓶表达

以PglpD-NK-i1/PglpD-NK-i2(表5)为引物，以pBSG04质粒(公开于Cui W,Suo F,Cheng J,Han L,Hao W,Guo J,Zhou Z.Stepwise modifications of genetic partsreinforce the secretory production of nattokinase in Bacillus subtilis.MicrobBiotechnol.2018Sep；11(5):930-942.)为模板，扩增SEQ ID NO.4所示的纳豆激酶基因。以PglpD-NK-v1/PglpD-NK-v2为引物，以质粒pBPglpD-sfGFP-glpP为模板，扩增质粒骨架。通过Gibson Assembly将两个片段进行组装，构建纳豆激酶表达质粒pBPglpD-NK-glpP。转化至枯草芽孢杆菌WB800中，获得重组枯草芽孢杆菌WB800 pBPglpD-NK-glpP。

接取重组菌WB800 pBPglpD-NK-glpP在含有5mL LB培养基的试管中200r·min^-1，37℃过夜培养。按2％接种量转接种子液至含有50mLTB培养基的250mL三角瓶，培养基中复配不同浓度的甘油和葡萄糖，在200r·min^-1，37℃培养36h。检测NK的表达水平。结果显示，碳源总量较多的培养基，最终的OD₆₀₀较高。但是，含有1％甘油和1％葡萄糖的TB培养基最终酶活较高。可见纳豆激酶可以通过自诱导的形式在合适的时间表达，可以一定程度避免纳豆激酶对宿主的压力，提高纳豆激酶的表达水平。

表5纳豆激酶表达质粒构建引物

引物	序列(5’-3’)
		PglpD-NK-i1	AGGAAACGTAATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAAC
PglpD-NK-i2	GAGGGATACCGCATCAGGCGAATTCTTATTGTGCAGCTGCTTGTACG
		PglpD-NK-v1	GAATTCGCCTGATGCGGTATC
PglpD-NK-v2	CTTTCTTTTTTTCATTACGTTTCCTCCTTGTTGTCAC

实施例5：5-L发酵罐补料发酵纳豆激酶

5L发酵罐发酵：

一级种子培养：将实施例4构建的重组枯草芽孢杆菌WB800 pBPglpD-NK-glpP单菌落至不含甘油的TB培养基中，37℃200rpm培养12h，获得OD₆₀₀达2.0的一级种子液。

二级种子培养：转接800μL一级种子液至40mL不含甘油TB培养基的三角瓶中，37℃200rpm培养12h，获得OD₆₀₀达3.0的二级种子液。

上罐接种：转接40mL二级种子液至2L初始培养基中。

溶氧(DO)控制：以初始培养基中通气量7L/min、转速400rpm时的溶氧，定为100％。发酵过程中转速偶联DO，通过转速维持DO在30％。初始转速400rpm，转速范围在200-950rpm之间自动调整，调整时间间隔1min，调整梯度5rpm，补料培养基每L含有甘油500g，胰蛋白胨12g，酵母提取物24g。

补料速度：发酵12h后开始以0.3mL/min恒速补料。

在5L发酵罐中对纳豆激酶进行高密度发酵，初始培养基含有葡萄糖和甘油。结果显示(表6和图5)，经过补料发酵，生物量最高在32h达到OD₆₀₀＝85.0，酶活在28h达到12.1U/mL。

表6 5L发酵罐细胞生长和纳豆激酶活性

时间(h)	<![CDATA[细胞密度(OD<sub>600</sub>)]]>	酶活(U/mL)
			2	0.6	未测
4	4.1	0.01
			6	15.2	未测
8	25.8	0.49
			10	32.6	未测
12	34.1	4.86
			14	35.0	未测
16	41.6	7.02
			20	49.1	10.30
24	78.2	10.40
			28	79.0	12.10
32	85.0	11.18

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种甘油诱导表达系统及在纳豆激酶生产中的应用

<130> BAA201311A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaaatgagc tgtataaagg ctggcaaaaa gccgtgaaag cagctatggc ttttaaataa 60

agtaatacta tggtataatg gttacaagtt aataagaacg gtcctgagat gaggagagac 120

cacagcacca aagtgtaagc atgcactttg gctgttgtgg tctctttttc tatttaccgt 180

gacaacaagg aggaaacgta 200

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatgagtt ttcacaacca gccgatctta ccggctattc gcaatatgaa gcaatttgat 60

gagtttttga acagttcatt ctcttacggt gttattcttg atattcatct cggccagctg 120

aagggcgtga tcaaagaagc gcaaaagcac ggaaagaaca tgatggtgca cgtcgatctc 180

attcaaggga ttaagcatga cgaatacggt gcggaattta tatgtcagga tatcaagccc 240

gctgggatta tttccacaag atcgaatgtg attgccaaag cgaagcagaa gaaaatttat 300

gccattcagc gcctgttttt gcttgataca agcgcgatgg agaaaagcat ggagtttatc 360

ggcaagcata agcctgactt catcgaagtg cttcccggca tcgttccgtc actcattcag 420

gaaataaaag agaaaacagg gattcccatc tttgccgggg gtttcatccg tacggaagag 480

gatgtagagc aggcattgaa agcgggggct gtagctgtca caacatctaa taccaaattg 540

tggaaaaaat atgaaaactt tttgacggaa agtgattga 579

<210> 3

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggaatggac gatcggcaat agttaccctt attatcaaga taagaaagaa aaggattttt 60

cgctacgctc aaatccttta aaaaaacaca aaagaccaca ttttttaatg tggtctttta 120

ttcttcaact aaagcaccca ttagttcaac aaacgaaaat tggataaagt gggatatttt 180

taaaatatat atttatgtta cagtaatatt gacttttaaa aaaggattga ttctaatgaa 240

gaaagcagac aagtaagcct cctaaattca ctttagataa aaatttagga ggcatatcaa 300

<210> 4

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaaaaaa gaaagaggcg aaactttaaa aggttcattg cagcattttt agtgttggct 60

ttaatgattt cattagtgcc agccgatgta ctagcagccg gaaaaagcag tacagaaaag 120

aaatacattg tcggatttaa gcagacaatg agtgccatga gttccgccaa gaaaaaggat 180

gttatttctg aaaaaggcgg aaaggttcaa aagcaattta agtatgttaa cgcggccgca 240

gcaacattgg atgaaaaagc tgtaaaagaa ttgaaaaaag atccgagcgt tgcatatgtg 300

gaagaagatc atattgcaca tgaatatgcg caatctgttc cttatggcat ttctcaaatt 360

aaagcgccgg ctcttcactc tcaaggctac acaggctcta acgtaaaagt agctgttatc 420

gacagcggaa ttgactcttc tcatcctgac ttaaacgtca gaggcggagc aagcttcgtt 480

ccttctgaaa caaacccata ccaggacggc agttctcacg gtacgcatgt cgccggtacg 540

attgccgctc ttaataactc aatcggtgtt ctgggcgtag cgccaagcgc atcattatat 600

gcagtaaaag tgcttgattc aacaggaagc ggccaatata gctggattat taacggcatt 660

gagtgggcca tttccaacaa tatggatgtt atcaacatga gccttggcgg acctactggt 720

tctacagcgc tgaaaacagt agttgataaa gcggtttcca gcggtatcgt cgttgctgcc 780

gcagccggaa acgaaggttc atccggaagc acaagcacag tcggctaccc tgcaaaatat 840

ccttctacta ttgcagtagg tgcggtaaac agcagcaacc aaagagcttc attctccagc 900

gtaggttctg agcttgatgt aatggctcct ggcgtgtcca tccaaagcac acttcctgga 960

ggcacttacg gcgcttataa cggaacgtcc atggcgactc ctcacgttgc cggagcagca 1020

gcgctaattc tttctaagca cccgacttgg acaaacgcgc aagtccgtga tcgtttagaa 1080

agcactgcaa catatcttgg aaactctttc tactatggaa aagggttaat caacgtacaa 1140

gcagctgcac aataa 1155

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtccgt ggagagggtg aaggtgatgc tacaaacgga 120

aaactcaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccgtg gccaacactt 180

gtcactactc tgacctatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300

aaagatgacg ggacctacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatcgtatcg agttaaaggg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ctcgagtaca actttaactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac gttgaagatg gttccgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtcgacac aatctgtcct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa 717

Claims

1.一种受甘油诱导的蛋白表达系统，其特征在于，包含了响应甘油的强启动子P_glpD、启动子P_glpD的终止子、启动子P_cm、抗终止子蛋白和编码目的蛋白的基因；所述启动子P_glpD和启动子P_cm的转录方向相反；所述启动子P_cm强化所述抗终止子蛋白的表达；所述抗终止子蛋白可以与三磷酸甘油结合，且二者的结合物可与位于P_glpD的终止子结合；所述强启动子P_glpD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗终止子蛋白的编码基因如SEQ ID NO.2所示；所述启动子P_cm的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述强启动子P_glpD、启动子P_glpD的终止子、启动子P_cm和抗终止子蛋白的编码基因均位于pBSG04质粒骨架上；所述编码目的蛋白的基因位于P_glpD的终止子的下游。

2.含有权利要求1所述受甘油诱导的蛋白表达系统的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞具备将甘油转化为三磷酸甘油的能力。

3.含有权利要求1所述受甘油诱导的蛋白表达系统的枯草芽孢杆菌。

4.权利要求1所述受甘油诱导的蛋白表达系统在诱导表达纳豆激酶中的应用。

5.一种生产纳豆激酶的方法，其特征在于，将编码所述纳豆激酶的基因连接至权利要求1所述蛋白表达系统的启动子P_glpD的终止子的下游，获得重组枯草芽孢杆菌；将所述重组枯草芽孢杆菌在含甘油的发酵培养基中培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中葡萄糖和甘油的比例为1:1。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，发酵12h后，补料甘油或含甘油的培养基。