CN114250155A - 一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用。本发明首先通过启动子Pcdna1过表达xyr1基因实现了里氏木霉在葡萄糖条件下纤维素酶的表达，然后在过表达xyr1基因的基础之上又过表达tup1基因，进一步提高了在葡萄糖条件下纤维素酶的表达水平。本发明所获得的里氏木霉基因工程菌遗传稳定性较好，并能够不依赖纤维素等诱导条件生产纤维素酶，对工业中纤维素酶的生产具有重要的应用价值。

Description

一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌 及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
木质纤维素类生物质资源是地球上最为丰富的可再生资源，在大宗生物基产品的生产中有广阔的应用前景。有效利用生物质资源不仅可以解决人类社会面临的日益严重的能源危机，还可以变废为宝解决由于焚烧秸秆带来的环境污染问题。里氏木霉是降解木质纤维素类生物质的模式真菌，也是纤维素酶的主要工业生产菌株，其生产的纤维素酶广泛应用于能源、纺织和纸浆造纸等领域。
在葡萄糖条件下，里氏木霉纤维素酶的表达被严格地抑制。在纤维素条件下，里氏木霉可以迅速响应诱导信号启动纤维素酶基因的表达，从而实现对纤维素的高效降解。利用分子生物学和遗传学生物技术进一步改造里氏木霉基因组，实现纤维素酶基因的高水平表达是降低纤维素酶生产成本的重要手段。里氏木霉纤维素酶基因的转录表达受到转录激活因子Xyr1的调控，而xyr1基因的表达受纤维素等碳源的诱导。但是，在纤维素等不可溶碳源条件下生产纤维素酶存在发酵周期长、纯化工艺复杂等缺点。本发明旨在构建在可溶性碳源葡萄糖条件下的高产纤维素酶工程菌株，实现纤维素酶的高效生产。
发明内容
本发明提供了一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用，首先通过启动子Pcdna1过表达xyr1基因实现了里氏木霉在葡萄糖条件下纤维素酶的表达，然后在过表达xyr1基因的基础之上又过表达tup1基因，进一步提高了在葡萄糖条件下纤维素酶的表达水平。
本发明的技术方案如下：
一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌，是以里氏木霉QM9414为出发菌株，该里氏木霉工程菌中含有以启动子Pcdna1表达的转录激活因子编码基因xyr1，同时其tup1基因自身的启动子替换为启动子Ptcu1。
本发明中的里氏木霉工程菌通过xyr1基因和tup1基因的协同增效作用，可以在葡萄糖为碳源条件下高水平表达纤维素酶，而出发菌株里氏木霉QM9414在葡萄糖为碳源的条件下，纤维素酶基本不表达。
上述里氏木霉工程菌的构建方法，包括步骤：以里氏木霉QM9414为出发菌株，转化含有启动子Pcdna1和转录激活因子编码基因xyr1的xyr1基因过表达载体，再转化含有tup1基因上下游同源臂序列和启动子Ptcu1的启动子替换载体，经同源重组后，筛选、验证获得。
根据本发明优选的，所述里氏木霉工程菌的构建方法，具体包括步骤如下：
(1)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，PCR扩增得到启动子Pcdna1、xyr1基因编码区、终止子TtrpC，依次将终止子TtrpC、启动子Pcdna1、xyr1基因编码区依次连接到质粒载体上，并接入hph基因，构建得到xyr1基因过表达载体；
(2)将步骤(1)构建的xyr1基因过表达载体转入里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体中，经再生、筛选及验证，得里氏木霉OExyr1工程菌；
(3)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，PCR扩增得到tup1基因上下游同源臂序列，连接到pyr4-Ptcu1载体，构建得到tup1启动子替换载体；
(4)将tup1启动子替换载体线性化，转入步骤(2)里氏木霉OExyr1工程菌原生质体中，经再生、筛选及验证，得到里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌。
优选的，步骤(1)中启动子Pcdna1的长度为925bp，PCR扩增引物序列如下：
Pcdna1-F：5′-AGCTTTGTTTAAACCAGACAATGATGGTAGCAGC-3′，
Pcdna1-R：5′-TTGGCGCGCCGAGAGAAGTTGTTGGATTGATC-3′；
xyr1基因编码区的长度为2823bp，PCR扩增引物序列如下：
xyr1-F：5′-TTGGCGCGCCATGTTGTCCAATCCTCTCCG-3′，
xyr1-R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGAGGGCCAGACCGGTTC-3′；
终止子TtrpC的长度为695bp，PCR扩增引物序列如下：
TtrpC-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATTCGAAGATGAGAGGAAAGCCCT-3′，
TtrpC-R：5′-GGACTAGTCTACTACTTCTGGGAAGCTTCTG-3′。
优选的，步骤(1)中的质粒载体为pMD19-T质粒载体。
优选的，步骤(2)中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术验证阳性转化子，所述验证引物序列如下：
Pcdna1-F1：5′-AACTCCCTAAGATTCTTTCAGTG-3′，
TtrpC-R1：5′-ATTCGCAATCAAGAAATCTACCCA-3′
优选的，步骤(3)中上游同源臂序列的长度为1761bp，PCR扩增引物序列如下：
tup1-up-F：5′-CCCAAGCTTTGGTAGCTTATTAGCTGGATTTGG-3′，
tup1-up-R：5′-AGGCGCGCCCGTGGCTCTATCGAGGCCGTAA-3′，
下游同源臂序列的长度为1857bp，PCR扩增引物序列如下：
tup1-down-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCATGTATTCCCATCGCGGCA-3′，
tup1-down-R：5′-GACTAGTCCCAGACACGAACGCTCTTATCCAA-3′。
优选的，步骤(3)中所述pyr4-Ptcu1载体是将里氏木霉铜离子透性酶基因启动子Ptcu1序列和pyr4基因表达盒接入质粒载体中构建得到的；进一步优选的，所述质粒载体为pMD19-T质粒载体。
优选的，步骤(3)中所述上下游同源臂序列分别位于pyr4-Ptcu1载体中pyr4-Ptcu1片段的两侧。
优选的，步骤(4)中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证及内部基因验证；
其中，用于验证上游同源臂序列锚定的引物序列如下：
Vtup1-up-F:5′-TGGGTGCCCCACTTACTGCAGCCC-3′，
pyr4100-R:5′-GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，
用于验证下游同源臂序列锚定的引物序列如下：
Ptcu1-F：5′-CCACAAGAGCCTACTGCCAAATC-3′，
Vtup1-down-R：5′-CCTTGCCGTTGGGCGAGAACGCCAC-3′，
用于验证内部基因的引物序列如下：
Vtup1-in-F：5′-TCGGAATCTCGATCCCCCGGCTAAA-3′，
Vtup1-in-R：5′-TTATGGTCCTCCAAGACGCACA-3′。
优选的，步骤(2)中所述再生和筛选是在含有尿苷和潮霉素B的条件下进行；步骤(4)中所述再生和筛选是在不含有尿苷但含有潮霉素B的条件下进行。
上述里氏木霉工程菌在以葡萄糖为碳源生产纤维素酶中的应用。
根据本发明优选的，所述应用的步骤如下：
将里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30±2℃，180-220rpm培养40-50h，收集菌丝，转入以1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源的发酵培养基，30±2℃，180-220rpm继续培养生产纤维素酶。
优选的，所述MA培养基组分如下：17.907g/L Na2HPO4·12H2O,2g/L KH2PO4,1.4g/L(NH4)2SO4,0.3g/L尿素,0.5ml/L吐温-80，用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1％(v/v)甘油为碳源，并添加2g/L的蛋白胨；
所述发酵培养基为MA培养基，并在发酵时添加1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/L CaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/L ZnSO4·7H2O。
上述未详细说明的实验步骤均按照本领域常规操作进行。
本发明的技术特点及有益效果：
1、本发明中的xyr1基因编码主要的里氏木霉纤维素酶基因的转录激活因子，该转录激活因子在葡萄糖条件下表达水平极低，受到葡萄糖的严重抑制，在纤维素等诱导碳源条件下高水平表达。启动子Pcdna1是里氏木霉中组成型高水平表达的启动子的代表，可在葡萄糖条件下高水平表达，本发明利用启动子Pcdna1过表达转录激活因子编码基因xyr1，构建的里氏木霉OExyr1工程菌株实现了纤维素酶在葡萄糖为碳源条件下的高水平表达。
2、Cyc8-Tup1是真核生物中功能保守的转录调控复合物，尽管该复合物主要的功能是参与真核生物基因的转录抑制，但近些年的研究表明，该复合物也具备激活基因转录的功能。本发明中的tup1基因是转录调控复合物Cyc8-Tup1的组成成分之一，本发明中采用启动子替换技术在染色质原位将里氏木霉OExyr1工程菌中tup1基因自身的启动子替换为高水平表达启动子Ptcu1，构建了里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌，实现了xyr1和tup1的同时过表达。在葡萄糖为碳源的条件下，与里氏木霉OExyr1工程菌相比，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌纤维素酶的表达量进一步提高；将里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌应用于纤维素酶的生产，可以降低生产成本。
3、里氏木霉在葡萄糖条件下几乎不生产纤维素酶，里氏木霉OEtup1工程菌在葡萄糖条件下也不产生纤维素酶。然而，在里氏木霉OExyr1工程菌的基础之上构建的里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌在葡萄糖条件下使得过表达tup1提升纤维素酶表达的效果得以显现，摆脱了对诱导性碳源的依赖，进一步提升了产酶水平，对工业中纤维素酶的生产具有重要的应用价值。里氏木霉tup1基因和xyr1基因在调控纤维素酶表达过程种存在协同增效机制，同时过表达后可实现1+1＞2的产酶效果。
附图说明
图1为xyr1基因过表达载体Pcdna1-xyr1-hph的构建流程图；
图2为里氏木霉OExyr1工程菌阳性转化子基因组PCR验证电泳图；图中，泳道1、2、3均为阳性转化子，NC泳道为出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4；
图3为里氏木霉OExyr1工程菌和里氏木霉QM9414-Δpyr4中xyr1基因的相对转录水平和胞外发酵液的纤维素酶活分析图；图中，A为xyr1基因的相对转录水平分析柱状图，B为胞外发酵液的纤维素酶活分析柱状图；
图4为tup1基因启动子替换原理图；
图5为里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌阳性转化子基因组PCR验证电泳图；图中，A为上游同源臂序列验证电泳图，NC为阴性对照(里氏木霉OExyr1工程菌)；B为下游同源臂序列验证电泳图，NC为阴性对照(里氏木霉OExyr1工程菌)；C为内部基因验证电泳图，PC为阳性对照(里氏木霉OExyr1工程菌)；三张图中的1、2、3泳道均为阳性转化子；
图6为里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌和里氏木霉OExyr1工程菌中tup1转录和胞外发酵液中纤维素酶活分析图；图中，A为tup1基因的相对转录水平分析柱状图，B为胞外发酵液的纤维素酶活分析柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂、药品、材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例中的里氏木霉QM9414为现有菌种，可购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)，菌种保藏号：26921。
里氏木霉QM9414-Δpyr4是将里氏木霉QM9414中的pyr4基因敲除后得到的，构建方法可参考文献：A novel transcriptional regulator RXE1 modulates the essentialtransactivator XYR1 and cellulase gene expression in Trichoderma reesei；
pyr4-Ptcu1质粒载体是将里氏木霉铜离子透性酶基因启动子Ptcu1序列和筛选标记基因pyr4接入pMD19-T质粒载体中构建得到，构建方法可参考文献：Acopper-responsivepromoter replacement system to investigate gene functionsin Trichodermareesei:a case study in characterizing SAGA genes.
实施例1：xyr1基因过表达载体构建
1)参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit，OMEGA)说明书提取里氏木霉QM9414基因组DNA；
2)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，以Pcdna1-F和Pcdna1-R为上下游引物，经PCR扩增得到cdna1基因启动子Pcdna1(SEQ ID NO.1)，大小925bp；
上下游引物Pcdna1-F和Pcdna1-R的序列如下：
Pcdna1-F：5′-AGCTTTGTTTAAACCAGACAATGATGGTAGCAGC-3′，
Pcdna1-R：5′-TTGGCGCGCCGAGAGAAGTTGTTGGATTGATC-3′；
以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，以xyr1-F和xyr1-R为上下游引物，经PCR扩增得到xyr1基因编码区(SEQ ID NO.2)，大小2823bp；
上下游引物xyr1-F和xyr1-R的序列如下：
xyr1-F：5′-TTGGCGCGCCATGTTGTCCAATCCTCTCCG-3′，
xyr1-R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGAGGGCCAGACCGGTTC-3′；
以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，以TtrpC-F和TtrpC-R为上下游引物，经PCR扩增得到trpC基因终止子TtrpC(SEQ ID NO.3)，大小695bp；
上下游引物TtrpC-F和TtrpC-R的序列如下：
TtrpC-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATTCGAAGATGAGAGGAAAGCCCT-3′，
TtrpC-R：5′-GGACTAGTCTACTACTTCTGGGAAGCTTCTG-3′；
其中，上述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA10ng，2.5mM dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足至50μL；
上述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并回收DNA片段；
3)将hph基因连入pMD19-T载体中得到pMD19-hph载体，hph基因是常用的潮霉素抗性筛选标签；然后依次将trpC基因终止子TtrpC、cdna1基因启动子Pcdna1和xyr1基因编码区通过酶切连接的方式连入pMD19-hph载体NotI/XhoI、PmeI/AscI和AscI/NotI酶切位点，得到xyr1基因过表达载体Pcdna1-xyr1-hph。
里氏木霉xyr1基因过表达载体Pcdna1-xyr1-hph的构建流程如图1所示，含有cdna1基因启动子Pcdna1，xyr1基因编码区，trpC基因终止子TtrpC，以及筛选标记基因hph。
实施例2：里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体制备
1)取500μL里氏木霉QM9414-Δpyr4孢子接种于100mL基本培养基中，30℃、200rpm培养16～20h；
其中，所述基本培养基的组分如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 15g/L、蛋白胨10g/L，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/L CaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/L ZnSO4·7H2O，10mM尿苷；
2)收集菌丝培养物使用G1漏斗过滤，用无菌的双蒸水洗涤两次；加入8mL SK细胞壁裂解缓冲液，同时加入0.8g溶壁酶和0.8g蜗牛酶，30℃、200rpm酶解2.5～3h；
其中，所述SK细胞壁裂解缓冲液组分如下：1M山梨糖醇；10mM K3PO4；
3)使用G2漏斗过滤细胞裂解液，收集滤液，4℃，4000rpm离心10min收集原生质体，收集到的原生质体用4mL预冷的STC溶液洗涤两次，然后加入预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度约为5×108个/mL，置于冰上备用；
其中，所述STC溶液的组分如下：1MD-山梨糖醇，0.05M CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5。
实施例3：里氏木霉OExyr1工程菌构建
1)取约10μg实施例1制备的xyr1基因过表达载体Pcdna1-xyr1-hph、100μL实施例2制备的里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体和25μL PTC溶液加入到10mL离心管底部，混匀后冰浴20min，加入1mL PTC溶液，室温放置5min，再加入2mL STC溶液混匀，得转化液；将所得的转化液涂布于再生培养基平板上，30℃培养5～7d；
其中，所述PTC溶液的组分如下：60％(w/v，g/mL)聚乙二醇4000，10mM Tris-HCl，50mM CaCl2，pH 7.5；
所述再生培养基的组分如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 15g/L、1M D-山梨糖醇、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/L CaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/LZnSO4·7H2O，140μg/mL潮霉素B，10mM尿苷；
2)待长出菌落后，将再生培养基平板上长出的菌落转接到的筛选培养基平板上，30℃培养2d；然后挑选生产较好的菌落于MEA培养基上生孢，30℃培养5～7d；
其中，所述筛选培养基组分如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 15g/L、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A，用NaOH调pH至5.5，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/LCaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/L ZnSO4·7H2O，140μg/mL潮霉素B，10mM尿苷；
所述MEA培养基组分如下：麦芽提取物30g/L，蛋白胨5g/L、1.5％(w/v，g/mL)琼脂A；
3)收集孢子后用无菌水稀释涂布于筛选培养基分选单孢；分单孢时需加入0.1％(v/v)Triton X-100；
4)提取分单孢获得的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术验证阳性转化子；后采用单孢分离的方法对阳性转化子进行纯化，得里氏木霉OExyr1工程菌；
其中，所述阳性转化子验证引物为Pcdna1-F1和TtrpC-R1，序列如下：
Pcdna1-F1：5′-AACTCCCTAAGATTCTTTCAGTG-3′，
TtrpC-R1：5′-ATTCGCAATCAAGAAATCTACCCA-3′；
验证结果如图2所示，出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4(NC)无目的条带，3个阳性转化子均有一条明亮的目的条带，条带大小约为3kb，说明xyr1基因过表达载体Pcdna1-xyr1-hph成功转化入里氏木霉QM9414-Δpyr4中。
实施例4：里氏木霉OExyr1工程菌中xyr1转录和胞外纤维素酶分泌水平分析
1)将出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4和构建的里氏木霉OExyr1工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30℃，200rpm培养48h；收集菌丝，然后转入以1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源的发酵培养基，30℃，200rpm发酵培养；
其中，所述MA培养基组分如下：17.907g/L Na2HPO4·12H2O,2g/L KH2PO4,1.4g/L(NH4)2SO4,0.3g/L尿素,0.5mL/L吐温-80,用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1％(v/v)甘油为碳源，并添加2g/L的蛋白胨；发酵培养基为MA培养基，并在发酵时添加1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/L CaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/L ZnSO4·7H2O，10mM尿苷；
2)每隔12h收集发酵液，测定胞外纤维素酶的分泌水平；同时在培养24h时收集菌丝，用于提取RNA分析xyr1基因转录水平；
①使用TRizol试剂(invitrogen公司)提取菌丝的总RNA；使用TaKaRa的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒对RNA进行反转录，方法参照说明书；使用获得的反转录产物进行qRT-PCR扩增，按照TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行qRT-PCR分析，actin基因作为内参基因，实验程序参照说明书；
其中，内参基因actin的qRT-PCR引物如下：
actin-F：5′-TGAGAGCGGTGGTATCCACG-3′，
actin-R：5′-GGTACCACCAGACATGACAATGTTG-3′，
其中，xyr1基因的qRT-PCR引物如下：
xyr1-qF：5′-CCATCAACCTTCTAGACGAC-3′，
xyr1-qR：5′-AACCCTGCAGGAGATAGAC-3′，
结果如图3A所示，培养24h以后，里氏木霉OExyr1工程菌的xyr1基因的转录水平显著高于出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4，出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4在以葡萄糖为碳源的条件下xyr1基因几乎不进行转录，说明使用cdna1基因启动子成功地实现了xyr1基因在葡萄糖条件下的过表达。
②以pNPC为底物测定里氏木霉OExyr1工程菌胞外发酵液中纤维素酶酶活，测定步骤为：用50mM pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液配制2mM的pNPC作为反应底物，并加入0.1％(w/v，g/mL)葡萄糖内酯抑制β-葡萄糖苷酶的活性；配制200μL反应体系，包括pH 4.8的HAc-NaAc缓冲液100μL，pNPC反应底物50μL，发酵液50μL；反应体系混匀后置于45℃水浴中温育30min；反应结束后，向反应体系中加入50μL 10％(w/v，g/mL)的Na2CO3溶液终止反应；取200μL反应液测定420nm处的光吸收值，并按照标准曲线计算酶活力单位；
酶活力单位定义：每分钟产生1μmol pNP所需要的酶量为1个酶活单位(U)；
结果如图3B所示，里氏木霉OExyr1工程菌发酵液中纤维素酶的pNPC活性显著高于出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4，里氏木霉OExyr1工程菌发酵培养12h时，发酵液中的纤维素酶活性不明显，24h以后纤维素酶活性具有明显的提升，而出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4在葡萄糖为碳源的条件下，整个发酵过程几乎都不会产生纤维素酶，说明使用cdna1基因启动子过表达xyr1基因，导致了里氏木霉OExyr1工程菌在葡萄糖为碳源的条件下纤维素酶的高水平分泌。
实施例5：里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌构建
1)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，以tup1-up-F和tup1-up-R为上下游引物，经PCR扩增得到tup1基因上游同源臂片段(SEQ ID NO.4)，大小1761bp，
上下游引物tup1-up-F和tup1-up-R的序列如下：
tup1-up-F：5′-CCCAAGCTTTGGTAGCTTATTAGCTGGATTTGG-3′，
tup1-up-R：5′-AGGCGCGCCCGTGGCTCTATCGAGGCCGTAA-3′，
以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，以tup1-down-F和tup1-down-R为上下游引物，经PCR扩增得到tup1基因下游同源臂片段(SEQ ID NO.5)，大小约1857bp，
上下游引物tup1-down-F和tup1-down-R的序列如下：
tup1-down-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCATGTATTCCCATCGCGGCA-3′，
tup1-down-R：5′-GACTAGTCCCAGACACGAACGCTCTTATCCAA-3′，
其中，上述PCR扩增体系为：10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，基因组DNA10ng，2.5mM dNTP混合物5μL，5×TransStart FastPfu缓冲液10μL，TransStartFastPfuDNA聚合酶1μL，ddH2O补足至50μL；
上述PCR扩增程序如下：98℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，并回收DNA片段；
将上述得到的tup1基因上下游同源臂片段分别采用酶切连接的方式连入pyr4-Ptcu1载体的两侧，上游同源臂片段位于pyr4-Ptcu1载体中pyr4基因表达盒的左侧，下游同源臂片段位于pyr4-Ptcu1载体中Ptcu1启动子序列(SEQ ID NO.6)的右侧，构建tup1启动子替换载体Ptcu1-tup1-pyr4。
2)将构建好的tup1启动子替换载体Ptcu1-tup1-pyr4，使用SpeI限制性内切酶线性化，纯化后转化入里氏木霉OExyr1工程菌的原生质体中，按照实施例3中1)～3)所述的步骤进行培养，不同之处在于，所述再生培养基和筛选培养基均不含尿苷，其余成分与实施例3相同；
其中，里氏木霉OExyr1工程菌原生质体的制备与实施例2相同；
里氏木霉tup1基因启动子替换原理如图4所示，将tup1启动子替换载体Ptcu1-tup1-pyr4转入里氏木霉原生质体，采用同源重组技术在染色质原位将tup1基因自身的启动子替换为tcu1启动子Ptcu1；
3)提取分单孢获得的转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证，验证阳性转化子；后采用单孢分离的方法对阳性转化子进行纯化，采用PCR技术通过扩增内部基因进行阳性纯合子验证，构建得到里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌；
其中，上述PCR的具体反应体系和反应条件参见GenStar2×Taq PCR StarMix说明书。
用于验证上游同源臂序列锚定的引物为Vtup1-up-F和pyr4100-R，用于验证下游同源臂序列锚定的引物为Ptcu1-F和Vtup1-down-R，引物序列如下：
Vtup1-up-F:5′-TGGGTGCCCCACTTACTGCAGCCC-3′，
pyr4100-R:5′-GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，
Ptcu1-F：5′-CCACAAGAGCCTACTGCCAAATC-3′，
Vtup1-down-R：5′-CCTTGCCGTTGGGCGAGAACGCCAC-3′，
用于验证内部基因的引物序列如下：
Vtup1-in-F：5′-TCGGAATCTCGATCCCCCGGCTAAA-3′，
Vtup1-in-R：5′-TTATGGTCCTCCAAGACGCACA-3′。
验证结果如图5所示，在上下游同源臂序列锚定验证中，里氏木霉OExyr1工程菌无目的条带，阳性转化子在上下游同源臂序列验证中均有一条明亮的目的条带，条带大小约为2.5kb；在内部基因的验证中，里氏木霉OExyr1工程菌有一条明亮的目的条带，条带大小约为1.5kb，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌无目的条带，说明启动子Ptcu1替换成功。
对比例1：里氏木霉OEtup1工程菌的构建
里氏木霉OEtup1工程菌的构建方法与实施例5相同，不同之处在于：将构建好的tup1启动子替换载体Ptcu1-tup1-pyr4，使用SpeI限制性内切酶线性化，纯化后转化入里氏木霉QM9414-Δpyr4的原生质体中，在不含尿苷和不含潮霉素B的条件下进行再生和筛选，其他均与实施例5相同。
实施例6：里氏木霉OExyr1和OExyr1&OEtup1工程菌tup1转录和胞外发酵液中纤维素酶活分析
1)将出发菌株里氏木霉QM9414-Δpyr4和构建的里氏木霉OExyr1工程菌、里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌、里氏木霉OEtup1工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30℃，200rpm培养48h；收集菌丝，然后转入以1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源的发酵培养基，30℃，200rpm发酵培养；
其中，所述MA培养基组分同实施例4步骤1)，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌和里氏木霉OEtup1工程菌预培养和发酵时不需要添加尿苷。
2)每隔12h收集发酵液，测定胞外纤维素酶分泌水平；同时在培养24h时收集菌丝，用于提取RNA分析tup1基因转录水平；
初步分析发现，里氏木霉QM9414-Δpyr4和里氏木霉OEtup1工程菌在以葡萄糖为碳源的条件下，在整个发酵过程中也几乎检测不到纤维素酶的酶活。
①提取里氏木霉OExyr1工程菌和里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌菌丝的总RNA，反转录获得cDNA，使用qRT-PCR方法分析tup1转录水平，actin基因作为内参基因；
其中，内参基因actin的qRT-PCR引物如下：
actin-F：5′-TGAGAGCGGTGGTATCCACG-3′，
actin-R：5′-GGTACCACCAGACATGACAATGTTG-3′，
其中，tup1基因的qRT-PCR引物如下：
tup1-F：5′-CGAACTATCCGCAACCACTT-3′，
tup1-R：5′-GACACGAACGCTCTTATCCAA-3′，
结果如图6A所示，培养24h以后，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌的tup1基因的转录水平显著高于里氏木霉OExyr1工程菌，说明使用cdna1基因启动子过表达xyr1基因同时使用启动子替换系统成功地实现了tup1基因葡萄糖条件下在里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌中的过表达；
②以pNPC为底物测定里氏木霉OExyr1工程菌、里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌在葡萄糖条件下胞外发酵液中纤维素酶酶活，测定步骤与实施例4中的测定方法相同。
结果如图6B所示，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌发酵液中纤维素酶的pNPC活性显著高于里氏木霉OExyr1工程菌，说明使用启动子替换系统在里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌中过表达tup1基因，在葡萄糖条件下，与里氏木霉OExyr1工程菌相比，里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌纤维素酶的表达进一步提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌及其构建方法与
应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 925
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 1
cagacaatga tggtagcagc gcatggaaga acccggttgt tcggaatgtc cttgtgctaa 60
cagtggcatg attttacgtt gcggctcatc tcgccttggc accggacctc agcaaatctt 120
gtcacaacag caatctcaaa cagcctcatg gttcccagat tccctgattc agaactctag 180
agcggcagat gtcaaacgat tctgacctag taccttgagc atccctttcg gatccggccc 240
atgttctgcc tgcccttctg agcacagcaa acagcccaaa aggcgccggc cgattccttt 300
cccgggatgc tccggagtgg caccacctcc caaaacaagc aaccttgaac ccccccccca 360
aatcaactga agcgctcttc gcctaaccag cataagcccc ccccaggatc gttaggccaa 420
gtggtagggc cagccaatta gcgagcggcc atttggaggt catgggcgca gaatgtcctg 480
acagtggtat gatattgact gcccggtgtg tgtggcatct ggccataatc gcaggctgag 540
gcgaggaagt ctcgtgagga tgtcccgact ttgacatcat gagggagtga gaaactgaag 600
agaaggaaag cttcgaaggt tcgataaggg atgatttgca tggcgggcga caggatgcga 660
tggctcgttg ggatacataa tgcttgggtt ggaagcgatt ccaggtcgtc tttttttggt 720
tcatcatcac agcatcaaca agcaacgata caagcaatcc actgaggatt acctctcaac 780
tcaaccactt tccaaaccat ctcaactccc taagattctt tcagtgtatt atcactagga 840
tttttcccaa gccggcttca aaacacacag ataaaccacc aactctacaa ccaaagactt 900
tttgatcaat ccaacaactt ctctc 925
<210> 2
<211> 2823
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 2
atgttgtcca atcctctccg tcgctattct gcctaccccg acatctcctc ggcgtcattt 60
gacccgaact accatggctc acagtcgcat ctccactcga tcaacgtcaa cacattcggc 120
aacagccacc cctatcccat gcagcacctc gcacagcatg cggagctttc gagttcacgc 180
atgataaggg ccagtccggt gcagccaaag cagcgccagg gctctcttat tgctgccagg 240
aagaattcaa cgggtactgc tgggcccatt cggcggagga tcagtcgcgc ttgtgaccag 300
tgcaaccagc ttcgtaccaa gtgcgatggc ttacacccat gtgcccattg tatagaattc 360
ggccttggat gcgaatatgt ccgagagaga aagaagcgtg gcaaagcttc gcgcaaggat 420
attgctgccc agcaagccgc ggcggctgca gcacaacact ccggccaggt ccaggatggt 480
ccagaggatc aacatcgcaa actctcacgc cagcaaagcg aatcttcgcg tggcagcgct 540
gagcttgccc agcctgccca cgacccgcct catggccaca ttgagggctc tgtcagctcc 600
ttcagcgaca atggcctttc ccagcatgct gccatgggcg gcatggatgg cctggaagat 660
caccatggcc acgtcggagt tgatcctgcc ctgggccgaa ctcagctgga agcgtcatca 720
gcaatgggcc tgggcgcata cggtgaagtc caccccggct atgagagccc cggcatgaat 780
ggccatgtga tggtgccccc gtcgtatggc gcgcagacca ccatggccgg gtattccggt 840
atctcgtatg ctgcgcaagc cccgagtccg gctacgtata gcagcgacgg taactttcga 900
ctcaccggtc acatccatga ttacccgctg gcaaatggga gctcgccctc atggggagtc 960
tcgctggcct cgccttcgaa ccagttccag cttcagctct cgcagcccat cttcaagcaa 1020
agcgatttgc gatatcctgt gcttgagcct ctgctgcctc acctgggaaa catcctcccc 1080
gtgtctttgg cgtgcgatct gattgacctg tacttctcct cgtcttcatc agcacagatg 1140
cacccaatgt ccccatacgt tctgggcttc gtcttccgga agcgctcctt cttgcacccc 1200
acgaacccac gaaggtgcca gcccgcgctg cttgcgagca tgctgtgggt ggcggcacag 1260
actagcgaag cgtccttctt gacgagcctg ccgtcggcga ggagcaaggt ctgccagaag 1320
ctgctcgagc tgaccgttgg gcttcttcag cccctgatcc acaccggcac caacagcccg 1380
tctcccaaga ctagccccgt cgtcggtgct gctgccctgg gagttcttgg ggtggccatg 1440
ccgggctcgc tgaacatgga ttcactggcc ggcgaaacgg gtgcttttgg ggccataggg 1500
agccttgacg acgtcatcac ctatgtgcac ctcgccacgg tcgtctcggc cagcgagtac 1560
aagggcgcca gcctgcggtg gtggggtgcg gcatggtctc tcgccagaga gctcaagctt 1620
ggccgtgagc tgccgcctgg caatccacct gccaaccagg aggacggcga gggccttagc 1680
gaagacgtgg atgagcacga cttgaacaga aacaacactc gcttcgtgac ggaagaggag 1740
cgcgaagagc gacggcgagc atggtggctc gtttacatcg tcgacaggca cctggcgctc 1800
tgctacaacc gccccttgtt tcttctggac agcgagtgca gcgacttgta ccacccgatg 1860
gacgacatca agtggcaggc aggcaaattt cgcagccacg atgcagggaa ctccagcatc 1920
aacatcgata gctccatgac ggacgagttt ggcgatagtc cccgggcggc tcgcggcgca 1980
cactacgagt gccgcggtcg tagcattttt ggctacttct tgtccttgat gacaatcctg 2040
ggcgagattg tcgatgtcca ccatgctaaa agccaccccc ggttcggcgt tggattccgc 2100
tccgcgcggg attgggacga gcaggttgct gaaatcaccc gacacctgga catgtatgag 2160
gagagcctca agaggttcgt ggccaagcat ctgccattgt cctcaaagga caaggagcag 2220
catgagatgc acgacagtgg agcggtaaca gacatgcaat ctccactctc ggtgcggacc 2280
aacgcgtcca gccgcatgac ggagagcgag atccaggcca gcatcgtggt ggcttacagc 2340
acccatgtga tgcatgtcct ccacatcctc cttgcggata agtgggatcc catcaacctt 2400
ctagacgacg acgacttgtg gatctcgtcg gaaggattcg tgacggcgac gagccacgcg 2460
gtatcggctg ccgaagctat tagccagatt ctcgagtttg accctggcct ggagtttatg 2520
ccattcttct acggcgtcta tctcctgcag ggttccttcc tcctcctgct catcgccgac 2580
aagctgcagg ccgaagcgtc tccaagcgtc atcaaggctt gcgagaccat tgttagggca 2640
cacgaagctt gcgttgtgac gctgagcaca gagtatcagc gcaactttag caaggttatg 2700
cgaagcgcgc tggctctgat tcggggccgt gtgccggaag atttagctga gcagcagcag 2760
cgacgacgcg agcttcttgc actataccga tggactggta acggaaccgg tctggccctc 2820
taa 2823
<210> 3
<211> 695
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 3
attcgaagat gagaggaaag cccttttgcg gaaatagatc aaaactttgg gtagatttct 60
tgattgcgaa tcgatacatg ctcctgccgc ctgccactgt ttgttctaca tgatcatgct 120
gtgtctatct tgactacctc ttcgctccag tatcatatat caagtcgcga gatctttgtc 180
cacatcgcag ctgaccttgg tagcatctgt cctcccacca ccaaacatct ccgacttgac 240
gtgtaagtcc gtcctgggct caagaacaac cacaccgcca gcgcaccacc gcttcgtgcc 300
acatctttac aagtcctcaa cagcttaaat ctgccatctt cattcaaaga cgaacacacc 360
tctccaagac ctaatcttct caagagccca ccacatcatc ccgcctcaca gccttatgat 420
cccacatctc cgcttccttc tccaatccaa accaccctct catcgattcg tcaaccttat 480
caaacatata cacactttgg agaaatgcct cgcaaaatct tcaagaacct cgtcatcgcc 540
acagcaggcc ctctcccagg ccaactcacc gccgaaaacc tccgccaatg gaccgccctc 600
cgcaaaggcg tcttcacaga agactacgac gaccaagtca cccacctgct gtgcacgcgt 660
gagcagtttg accagaagct tcccagaagt agtag 695
<210> 4
<211> 1761
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 4
tggtagctta ttagctggat ttgggtactg catcttagtg catgtagtag ttttatggtg 60
gaggctgcca tcttgaggga cttgtaaaat gattagagaa acttcaacgt ctagatgccc 120
caccgtgccg ggctgggcct ctgcacctcc cctgctactg gggaacgggc gggtttggag 180
ccagggtgga cggcgaggaa ggaagacgag aaggggggtc gcgcttgaag ggggggctga 240
gaggcgctta caggtacatg caggttgcgg agcattgatt aggtacggaa ggacggatta 300
cagggagata cctacttgac atgcaaatgc atagaacgac gatgacgcga cagacggctg 360
ttgaatcgga ctcggtttct ggaggaagga atcaaggcga gtaataactc tttccacgta 420
cgtaagtgga cagaaagagg gcaactacaa gcacctaggc atgccattaa tcattgcatc 480
gtggcttact tcagtagggc gttactcgtc ttactcgtaa tacctaccta ccttatgtag 540
agtactagag gtgttaggta taggtagttg acaagagtct cgtgcgcgtg cgtctgcata 600
catgtgcgtc tgcctctact acatcccttt acatgccctc tttgcctgtg ctacctacct 660
accttaccta ctgtacgagc acccgcacgt acgtacagaa gacggtgtca caacttctct 720
tctgtccgtg tgtaacccca ggtgaagagg cgtgccaccc cggtgtcccg tctgcagcgc 780
ggccaacccg tgctacctcg ctgtctgccc ggacgtgtcg tagcaaccgc aggtatcttg 840
ggtactctgc ggcgagcaga cgacagtacc tactccgcgc cccgagcacc aagaggccat 900
ggctggagta tcgatttgct gtcggcccgc gctaccgcgc accccccccc cccccctcag 960
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acccgctcag agagaagaaa aagggcccga gcttctgtgc aactccacct gcccacgccc 1080
ctgtccggct gtgccagaac acactcgcgc acttgacgct ggggccaggc tagccgggag 1140
aacctgacgc ccctgtcgcc tgtactgcgc ggtacatgtg ggtggtgccg cagcaccaca 1200
agaggagcct ccagtccgct gtggcgcgtg cggtggagcg ccgtcaccaa agtaccgcca 1260
ggtatatgcg gctgttgtct ggacttgggc tgcatgtaca acgaggcgcc ccccccttga 1320
gccagcgcct ttctcccccc cagctgctct gctctgctct gcgctgcttg tgtggtcagg 1380
ctacgagccc cgagacgaga cgcctgctcg cttctagcgc tccaccgaag ttaccttatt 1440
cccccagccg cgacgctgta cctccaaggt tccttttctc acctttttct ctctctctct 1500
cttcttctct gcctcctcct ttgacacaaa acctccacgc atcgcatcga aatcacgtcc 1560
gccgttgccc gcagatacgc gattccgctc ccaagctgcg agtcgctctc ccatccgccg 1620
cccggatacc atttaccgcc tccatcgtca gcctcggccg gtcgagctgg aatttcgtca 1680
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<212> DNA
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gagctgctgg agcagatcag ggccgagttc gacagccagc agcgccagac tgagaacttt 120
gagcatcaga gtacgccttc cccccccccc cccccccggc aaatgccgtc tgagcaaggt 180
caatggtttg tgccatggct atccgaaatg ttgaagcaaa cgcacgcata cgcgtgtcaa 240
gaggcggacg tcaagacaat aggacagaag cgaaggagga gaaggaggag gaacacggat 300
ggagatggaa aatcaaatga caagaaatca aatgacaagc agcaaataca tcgcgggcta 360
gaatcgctgg ctaactgctc aactatatag tctcagcgca ggtcagcgaa atgcagctgg 420
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caagggagct ccgcaggcag gcctccaggg ccctcctcag cacgccggac cctcccagca 660
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gccgcagcag caacaacagc cgccgccgca gcagcagcct ccgtaccagc agcaggccta 900
tcagggcccc aacggcatgg gccctcaggc gccgccaagc acggcctcgc ctggcccggg 960
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cgctcgcatg gggggccccc gagcgccccc gcctcccatc agcaacgccc tcggcgatct 1140
cgaggtcgac gccgtcgcgc ctcacaacaa gaagacgggc aatgactggt acgccatctt 1200
caacccgcag gtccagcgcg tcctggacgt cgacctggtc cattccctga cccacgagag 1260
cgtcgtctgc tgtgtccgct ttagccacga cggcaagtat gtcgccacgg gctgtaacaa 1320
gtcggcccag atctttgacg tccagacggg cgaaaaggtg tgcgtcttgg aggaccataa 1380
tgccaccgac atggctgccg acctctacat ccgcagcgtc tgcttcagcc ccgacggccg 1440
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gagggggaaa gtgggcaggg cagaggccgt gccttgctca cgtttcaccc ccttgcagat 1560
tccagacgaa tatttgctaa cttctttatt ttccttccta ggtgtgggat attgccactc 1620
gaactatccg caaccacttc tcgggccacg agcaagacat ttactcgctc gactttgcgc 1680
gcgacggccg caccatcgct tcgggcagtg gtgacaggac tgtccgtctg tgggacattg 1740
agcagggcac caacaccctg acgctgacga ttgaggatgg cgtcaccacc gttgccattt 1800
ctcccgacac gcagtttgtt gccgccggct cgttggataa gagcgttcgt gtctggg 1857
<210> 6
<211> 744
<212> DNA
<213> Trichoderma reesei
<400> 6
ctgtgtggca tcactcatgt tctggatgtg ccgagcacgc actatagagt gagcgccagc 60
catggcgttg cgcatttggt ctcttgatag aaaaggcagg acgggtgact ctgtgccaga 120
tggttgcggc gccgagtgtt ggtgattggc agcgttatgt tgcaaaggag ctttatcggg 180
cagcacagag aacttaatat aagcatgacg agcagccaga taagttcaat acccaagaaa 240
ttctagggct ctagttatgt tgtccacttg ggaggcttgg agggatggtc cccccccccc 300
cccttaaagt aattcgcggc tgttgtatcg gtgcgcttta tccgccaacg gttttgatag 360
ttgcacttgt atctgctgga atgcttccac aatgctgtag tcagtgatac aaggttaatg 420
atgtcgcttg atgcggattc ttgaaggtgg ggaactactg caggtgagga catatgagca 480
agtttgcggg agattatgaa gatcgcaggt tggctgactt gaccaccctt atcaggcaca 540
tttgattcgg cctatatatg tgtgagattt atctcagcaa tgctcagaca actcctctga 600
atggtttggc gattttgctt tggcttgatc atcgcttgtc tttgcagtca ccctacttca 660
caggactccc aaggagtgca tcaatccaca agagcctact gccaaatcca ggagttcaat 720
ctatacgacc tggttgatac gaca 744

Claims (10)

1.一种在葡萄糖为碳源条件下高产纤维素酶的里氏木霉工程菌，其特征在于，是以里氏木霉QM9414为出发菌株，该里氏木霉工程菌中含有以启动子Pcdna1表达的转录激活因子编码基因xyr1，同时其tup1基因自身的启动子替换为启动子Ptcu1。
2.权利要求1所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括步骤：以里氏木霉QM9414为出发菌株，转化含有启动子Pcdna1和转录激活因子编码基因xyr1的xyr1基因过表达载体，再转化含有tup1基因上下游同源臂序列和启动子Ptcu1的启动子替换载体，经同源重组后，筛选、验证获得。
3.如权利要求2所述的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括步骤如下：
(1)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，PCR扩增得到启动子Pcdna1、xyr1基因编码区、终止子TtrpC，依次将终止子TtrpC、启动子Pcdna1、xyr1基因编码区依次连接到质粒载体上，并接入hph基因，构建得到xyr1基因过表达载体；
(2)将步骤(1)构建的xyr1基因过表达载体转入里氏木霉QM9414-Δpyr4原生质体中，经再生、筛选及验证，得里氏木霉OExyr1工程菌；
(3)以里氏木霉QM9414基因组DNA为模板，PCR扩增得到tup1基因上下游同源臂序列，连接到pyr4-Ptcu1载体，构建得到tup1启动子替换载体；
(4)将tup1启动子替换载体线性化，转入步骤(2)里氏木霉OExyr1工程菌原生质体中，经再生、筛选及验证，得到里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中启动子Pcdna1的长度为925bp，PCR扩增引物序列如下：
Pcdna1-F：5′-AGCTTTGTTTAAACCAGACAATGATGGTAGCAGC-3′，
Pcdna1-R：5′-TTGGCGCGCCGAGAGAAGTTGTTGGATTGATC-3′；
xyr1基因编码区的长度为2823bp，PCR扩增引物序列如下：
xyr1-F：5′-TTGGCGCGCCATGTTGTCCAATCCTCTCCG-3′，
xyr1-R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGAGGGCCAGACCGGTTC-3′；
终止子TtrpC的长度为695bp，PCR扩增引物序列如下：
TtrpC-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATTCGAAGATGAGAGGAAAGCCCT-3′，
TtrpC-R：5′-GGACTAGTCTACTACTTCTGGGAAGCTTCTG-3′；
优选的，步骤(1)中的质粒载体为pMD19-T质粒载体。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术验证阳性转化子，所述验证引物序列如下：
Pcdna1-F1：5′-AACTCCCTAAGATTCTTTCAGTG-3′，
TtrpC-R1：5′-ATTCGCAATCAAGAAATCTACCCA-3′。
6.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中上游同源臂序列的长度为1761bp，PCR扩增引物序列如下：
tup1-up-F：5′-CCCAAGCTTTGGTAGCTTATTAGCTGGATTTGG-3′，
tup1-up-R：5′-AGGCGCGCCCGTGGCTCTATCGAGGCCGTAA-3′，
下游同源臂序列的长度为1857bp，PCR扩增引物序列如下：
tup1-down-F：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCATGTATTCCCATCGCGGCA-3′，
tup1-down-R：5′-GACTAGTCCCAGACACGAACGCTCTTATCCAA-3′；
优选的，步骤(3)中所述pyr4-Ptcu1载体是将里氏木霉铜离子透性酶基因启动子Ptcu1序列和pyr4基因表达盒接入质粒载体中构建得到的；进一步优选的，所述质粒载体为pMD19-T质粒载体；
优选的，步骤(3)中所述上下游同源臂序列分别位于pyr4-Ptcu1载体中pyr4-Ptcu1片段的两侧。
7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述验证是以筛选的转化子基因组DNA为模板，采用PCR技术进行上下游同源臂序列锚定验证及内部基因验证；
其中，用于验证上游同源臂序列锚定的引物序列如下：
Vtup1-up-F:5′-TGGGTGCCCCACTTACTGCAGCCC-3′，
pyr4100-R:5′-GGTAGGGAAGTGGTTAGGAAAGG-3′，
用于验证下游同源臂序列锚定的引物序列如下：
Ptcu1-F：5′-CCACAAGAGCCTACTGCCAAATC-3′，
Vtup1-down-R：5′-CCTTGCCGTTGGGCGAGAACGCCAC-3′，
用于验证内部基因的引物序列如下：
Vtup1-in-F：5′-TCGGAATCTCGATCCCCCGGCTAAA-3′，
Vtup1-in-R：5′-TTATGGTCCTCCAAGACGCACA-3′。
8.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述再生和筛选是在含有尿苷和潮霉素B的条件下进行；步骤(4)中所述再生和筛选是在不含有尿苷但含有潮霉素B的条件下进行。
9.权利要求1所述的里氏木霉工程菌在以葡萄糖为碳源生产纤维素酶中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤如下：
将里氏木霉OExyr1&OEtup1工程菌接种于以1％(v/v)甘油为碳源的MA培养基进行预培养，在30±2℃，180-220rpm培养40-50h，收集菌丝，转入以1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源的发酵培养基，30±2℃，180-220rpm继续培养生产纤维素酶；
优选的，所述MA培养基组分如下：17.907g/L Na2HPO4·12H2O,2g/L KH2PO4,1.4g/L(NH4)2SO4,0.3g/L尿素,0.5ml/L吐温-80，用无水柠檬酸调pH至5.0；预培养时添加1％(v/v)甘油为碳源，并添加2g/L的蛋白胨；
所述发酵培养基为MA培养基，并在发酵时添加1％(w/v，g/mL)葡萄糖为碳源，使用前加入终浓度为0.6g/L MgSO4,0.4g/L CaCl2,5.0mg/L FeSO4·7H2O,2.0mg/L CoCl2·2H2O,1.6mg/L MnSO4·H2O,1.4mg/L ZnSO4·7H2O。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Title
王磊: "Cyc8-Tup1转录调控复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究" *

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