CN116064636A - 基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用 - Google Patents
基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体提供一种基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。具体的，本发明提出通过利用CRISPR/Cas9技术敲除木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1的同时，定点过表达转录激活因子Xyr1‑A824V以同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，本发明提供方法能提高木聚糖酶和纤维素酶分泌量，生产成本低，并且该酶系可以高效应用于秸秆以及其他木质纤维素材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体提供一种基于CRISPR/Cas9技术同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
植物生物质是转化为生物燃料和生物炼制产品的最丰富的可再生资源。它由木质纤维素组成，木质纤维素的成分主要包括半纤维素、纤维素和木质素。其中，纤维素和半纤维素是在木质纤维素的降解转化的主要有效成分。β-1,4-木聚糖是半纤维素的主要成分，占每年形成的可再生植物生物量中第二丰富的材料。木聚糖是一种杂多糖，其主链由β-1,4-吡喃木糖基残基组成，其上附有D-葡萄糖醛酸、L-阿拉伯糖、对香豆酸和阿魏酸等侧基。纤维素是可再生植物生物量最丰富的材料，也是植物生物量中最难降解的物质，并且只能产生D-葡萄糖。
木聚糖酶在纸浆、造纸、食品和饲料以及纺织工业中的广泛应用。里氏木霉具有典型的木聚糖水解酶系统，主要分泌β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，可以完全降解木聚糖成更小的可溶性寡聚糖和单糖，如木二糖和D-木糖。其中里氏木霉分泌的两种主要内切β-1,4-木聚糖酶XYNI和XYNII占总木聚糖酶的90％。XYN3，显示内切-β-1,4-木聚糖酶活性，但也可以显示内切β-1,3-木聚糖酶或木葡聚糖/木葡糖聚糖转移酶活性。XYN4不仅具有明显的外活性，而且具有一定的内活性，主要从各种线性低聚木糖和木糖释放D-木糖。BXLI具有β-木糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和β-木糖苷酶活性，还能水解木二糖，从聚合木聚糖中缓慢释放木糖。同时，里氏木霉能产生一种高效的纤维素水解酶混合物，主要纤维素酶及作用过程：内切葡聚糖酶(EG)通过切割聚合物链内无定形区域的纤维素链来发挥作用，用于工业纤维素酶生产，而纤维二糖水解酶(CBH)则在纤维素链末端水解纤维素链，生成纤维二糖。这种二糖然后被β-葡萄糖苷酶(BGL)水解成葡萄糖。
提升木聚糖酶活或纤维素酶活的方法主要有：基因突变、DNA重组、发酵工艺优化等；通过过表达木聚糖酶或纤维素酶来构建工程菌株是目前提高木聚糖酶活或纤维素酶活的常用方法。然而，单一过表达酶组分只能提高相应一种酶活。因此，需要一种同步提升里氏木霉木聚糖酶和纤维素酶表达水平的方法。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及应用。具体的，本发明提出通过利用CRISPR/Cas9技术敲除木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1的同时，定点过表达转录激活因子Xyr1-A824V以同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，所述方法包括利用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1，同时定点过表达转录激活因子Xyr1。
其中，所述转录激活因子Xyr1包括野生型转录激活因子Xyr1及其突变体，所述突变体具体为Xyr1-A824V，经研究证明，其对木聚糖酶和纤维素酶基因表达的转录激活作用更强，因此，本发明的一个具体实施方式中，所述转录激活因子Xyr1为Xyr1-A824V。
具体的，所述方法包括：利用定位敲除ace1的CRISPR/Cas9载体中里氏木霉甘氨酸tRNA间隔两个靶向ace1基因sgRNA的方式，利用内源tRNA的加工方式转录时释放两个sgRNA，继而引导Cas9敲除ace1；同时，在该位点通过构建的分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA进行同源重组；分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA与靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体共转里氏木霉原生质体，获得转化子后用于发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
本发明的第二个方面，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：
(a)制备高活性木聚糖酶和纤维素酶；
(b)高效降解木质纤维素材料。
其中，所述木质纤维素材料包括秸秆和林木残留物；其中，所述秸秆包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆和稻草秸秆等。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
上述技术方案提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，利用本发明所述方法生产的木聚糖酶和纤维素酶，显著高于出发菌株Q53G；此外，上述技术方案所述方法获得菌株可以在经济的葡萄糖为碳源的条件下生产木聚糖酶和纤维素酶；进一步在致密化预处理秸秆实际处理中的应用，菌株所产的纤维素酶系和木聚糖酶系能够高效降解致密化预处理秸秆底物，其葡萄糖得率相比出发菌株分别提高提高了2.1和0.9倍，木糖得率相比出发菌株分别提高了2.4和0.9倍。本发明提供方法能提高木聚糖酶和纤维素酶分泌量，生产成本低，并且该酶系可以高效应用于秸秆以及其他木质纤维素材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明质粒pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)图谱。
图2为本发明利用CRISPR/Cas9技术对里氏木霉ace1基因编辑提升木聚糖酶活和纤维素酶活的方法及结果。
其中：A是CRISPR/Cas9技术对里氏木霉ace1基因编辑的示意图和菌株上下游锚定验证示意图；B是转化子PCR验证结果。
图3为本发明利用CRISPR/Cas9技术获得菌株在纤维素及葡萄糖条件的木聚糖酶活和β-木糖苷酶酶活分析。
其中：A是菌株在纤维素及葡萄糖条件的的木聚糖酶活分析；B是菌株的在纤维素及葡萄糖条件的β-木糖苷酶酶活分析。
图4为本发明利用CRISPR/Cas9技术获得菌株在纤维素及葡萄糖条件的纤维素酶活和分析。
其中：A是菌株在纤维素及葡萄糖条件的纤维素总酶活和分析；B是菌株在纤维素及葡萄糖条件的纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BGL)组分分析。
图5为本发明利用CRISPR/Cas9技术获得菌株对致密化预处理秸秆糖化应用。
其中：A是木糖得率的测定结果；B是葡萄糖得率的测定结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达受到不同转录调控因子的严格调控。转录激活因子Xyr1是木聚糖酶基因表达的主要激活因子，其突变体Xyr1-A824V对木聚糖酶和纤维素酶基因表达的转录激活作用更强。Ace1是木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子。有鉴于此，本发明提出通过利用CRISPR/Cas9技术敲除Ace1的同时定点过表达Xyr1-A824V以同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活。
具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，所述方法包括利用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1，同时定点过表达转录激活因子Xyr1。
其中，所述转录激活因子Xyr1包括野生型转录激活因子Xyr1及其突变体，所述突变体具体为Xyr1-A824V，经研究证明，其对木聚糖酶和纤维素酶基因表达的转录激活作用更强，因此，本发明的一个具体实施方式中，所述转录激活因子Xyr1为Xyr1-A824V。
更具体的，所述方法包括：利用定位敲除ace1的CRISPR/Cas9载体中里氏木霉甘氨酸tRNA间隔两个靶向ace1基因sgRNA的方式，利用内源tRNA的加工方式转录时释放两个sgRNA，继而引导Cas9敲除ace1；同时，在该位点通过构建的分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA进行同源重组；分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA与靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体共转里氏木霉原生质体，获得转化子后用于发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：
S1、设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒；
S2、构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体；
S3、构建定点过表达xyr1-A824V的供体DNA；
S4、将步骤S2制得的靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体与定点过表达xyr1-A824V的供体DNA共转里氏木霉中获得里氏木霉工程菌；
S5、对步骤S4获得的里氏木霉工程菌进行发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
其中，所述步骤S1中，设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒的具体方法包括：基因合成以5S rRNA为启动子、包含两个靶向ace1的sgRNA、以里氏木霉编码甘氨酸的tRNA间隔每个sgRNA并以T6为终止子的sgRNA表达盒，同时在所述sgRNA表达盒两端添加酶切位点；每个sgRNA包含原间隔基序和支架序列(来自化脓性链球菌的sgRNA序列)；以ace1U和ace1D代表靶向相应基因的20bp原间隔基序(protospacer)，其序列分别为：5’-TCACCGGTGTCCTTCTGCGG-3’和5’-GCATATCGGTAAACAATGAC-3’；所述酶切位点为Bgl II和PacI。
所述sgRNA表达盒命名为5stsgRNA(ace1*2)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
所述步骤S2中，构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体，具体方法包括：将步骤S1获得的sgRNA表达盒5stsgRNA(ace1*2)与携带Cas9和筛选标记ptrA的自主复制质粒pFC33ptrA酶切后连接在一起，从而构建含有sgRNA(靶向ace1)的CRISPR/Cas9载体，命名为pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)；其中，所述酶切采用Bgl II和Pac I，并使用T4 DNA连接酶进行连接。
所述步骤S3中，所述构建定点过表达xyr1-A824V的供体DNA具体方法包括：以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1上游同源臂；从质粒pAB7-1扩增得到PgpdA序列；以融合得到xyr1-A824V为模板扩增5’末端带有PgpdA同源序列的xyr1-A824V；以pAB7-1为模板扩增TtrpC；以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂。然后将所扩增的5个片段利用Double-joint PCR融合得到敲除ace1同时PgpdA驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dgXYR1-ace1)；或者，
以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1上游同源臂及Pcdna1序列；以融合得到xyr1-A824V为模板扩增xyr1-A824V；以pAB7-1为模板扩增TtrpC；以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂。再将所扩增的5个片段利用Double-joint PCR融合得到敲除ace1同时Pcdna1驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dcXYR1-ace1)。
所述步骤S4中，具体方法包括：以里氏木霉Q53G为出发菌株；制备里氏木霉Q53G原生质体，然后将pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)分别和dgXYR1-ace1及dcXYR1-ace1共转里氏木霉Q53G的原生质体中，经筛选、验证，验证正确的菌株即为里氏木霉工程菌，分别命名为QA1Xg和QA1Xc。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述里氏木霉Q53G系由里氏木霉QM53菌株经敲除基因pyr4获得；里氏木霉QM53购自美国菌种保藏中心。
所述步骤S5中，所述发酵生产具体方法包括：将里氏木霉工程菌接种到发酵培养基中，在温度29-35℃、转速220-230r/min条件下发酵1-7天，即得到含木聚糖酶活和纤维素酶活提高的发酵液，分离提取即得。
其中，所述发酵培养基具体配方包括：CaCl2 0.8g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、KH2PO46g/L、(NH4)2SO4 6g/L、玉米浆30g/L、CaCO3 1g/L、酵母膏12g/L、FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L和CoCl·6H2O 2g/L，诱导条件加入纤维素25g/L(葡萄糖条件换为葡萄糖23g/L)，115℃，灭菌30min。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：
(a)制备高活性木聚糖酶和纤维素酶；
(b)高效降解木质纤维素材料。
其中，所述木质纤维素材料包括秸秆和林木残留物；其中，所述秸秆包括但不限于玉米秸秆、小麦秸秆和稻草秸秆等。
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例中，Q53G菌株为本实验室保存(QM53菌株经敲除pyr4得到)，使用的材料、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1.靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)的构建
构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)：将带有Bgl II、Pac I酶切酶切位点的5stsgRNA(ace1*2)片段(SEQ ID NO.1)，与携带Cas9和筛选标记ptrA的自主复制质粒pFC33ptrA用Bgl II、Pac I酶切，用T4 DNA连接酶连接在一起，转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单菌落测序证明序列正确，证明pFC33ptrA-5stsgRNA(cbh1*2-cbh2*2)构建成功，其图谱如图2所示。
其中，携带Cas9和筛选标记ptrA的自主复制质粒pFC33ptrA的构建方法如下：首先从pFC330用引物对Ttef1-DF(Pml I)/Ttef1-DR(ptrA)扩增Ttef1部分序列。然后用引物对PtrA-F/PtrA-R(Nhe I)从T-ptrA质粒上扩增ptrA表达盒。最后利用将这两个片段融合得到Ttef1-ptrA。将Ttef1-ptrA与pFC330(包含非整合型Cas9的载体、筛选标记为pyrG)都用PmlI、Nhe I双酶切，用T4DNA连接酶连接在一起，转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单菌落用引物对Y-ptrA-F/Y-Nhe I-R(1.6kb)PCR验证，成功构建质粒pFC33ptrA。
其中：涉及引物序列是：
Y-ptrA-F：GACCATTTCGGTGGCAAGT；
Y-Nhe I-R：GGTTTTTTTATGGGGGGA。
实施例2.利用CRISPR/Cas9技术对里氏木霉ace1基因编辑提升木聚糖水解酶酶系
表达供体DNA的构建：使用引物对ace1-1591-UF/ace1-31UR(gpdA)以里氏木霉Q53G染色体为模板ace1上游同源臂(U-ace1)；使用引物对PgpdA-F/PgpdA-R从质粒pAN7-1(Punt,P.J.,Kramer,C.,Kuyvenhoven,A.,Pouwels,P.H.,and van den Hondel,C.433A.:(1992)An upstream activating sequence from the Aspergillus nidulans gpdAgene,Gene,434 435 120,67–73.)扩增得到PgpdA序列；使用引物xyr1-F(PgpdA)/Xyr1-R以融合得到xyr1-A824V为模板扩增得到xyr1-A824V；使用引物对TtrpC-F(xyr1)/TtrpC-R以pAB7-1为模板扩增TtrpC；使用引物对ace1-2372DF(TtrpC)/ace1-3912DR以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂(D-ace1)。将上述5个片段融合得到定位敲除ace1同时PgpdA驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dgXYR1-ace1)，构建示意图见图2A所示。
其中：涉及引物序列是：
ace1-1591-UF：TAGTTGAGCGGCTTTGTT
ace1-31UR(gpdA)：TTGTAGGGGCTGTATTAGGTCTTGGGTGGGGAAGATGTATG
PgpdA-F：AGACCTAATACAGCCCCTACAA
PgpdA-A：TGTCTGCTCAAGCGGGGTA
xyr1-F(PgpdA)：AACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACAATGTTGTCCAATCCTCTCCGT
XYR1-R：TTAGAGGGCCAGACCGGTT
ace1-2372DF(TtrpC)：GCGCCCACTCCACATCTCCACTCGACAAACGCTTATCCACTCG
ace1-3912DR：CCTTTTGAGCAGTGGACG
使用引物对ace1-1591-UF/ace1-31UR(cdna1)以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增5’末端带有Pcdna1同源序列的ace1上游同源臂(U-ace1)；使用引物对Pcdna1-F/Pcdna1-R从里氏木霉Q53G染色体扩增得到Pcdna1序列；使用引物xyr1-F(Pcdna1)/Xyr1-R以融合得到xyr1-A824V为模板扩增xyr1-A824V；使用引物对TtrpC-F(xyr1)/TtrpC-R以pAB7-1为模板扩增TtrpC(0.7kb)；使用引物对ace1-2372DF(TtrpC)/ace1-3912DR以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂(D-ace1)。然后将所扩增的5个片段融合得到定位敲除ace1同时Pcdna1驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dcXYR1-ace1)构建示意图见图2A所示。
其中：新涉及引物序列是：
ace1-31UR(cdna1)：CGTCCTTCAGACCGAATTCTGGGTGGGGAAGATGTATG
Pcdna1-F：GAATTCGGTCTGAAGGACG
Pcdna1-R：GTTGAGAGAAGTTGTTGGATTG
xyr1-F(Pcdna1)：GATCAATCCAACAACTTCTCTCAACATGTTGTCCAATCCTCTCCGT
里氏木霉Q53G的遗传转化是利用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法，吡啶硫胺素抗性基因ptrA为选择标记。
将纯化的供体DNA融合片段(dgXYR1-ace1和dcXYR1-ace1)分别和靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)共同转化里氏木霉Q53G原生质体后，通过所设计2个sgRNA中的protospacer与基因组上的目标基因的DNA链配对来识别靶标位点分别为ace1基因的不同位置，进而引导Cas9在PAM位置前三到四个碱基进行切割，随后同源供体DNA片段与ace1靶标位点两侧序列发生同源重组，该过程示意图如图2A所示。通过在平板中加入添加6‰吡啶硫胺氢溴酸盐筛选转化子。以转化子提取的基因组DNA为模版，用引物对转化子进行基因PCR验证。验证正确即分别构建得到里氏木霉QA1Xg和QA1Xc。
Y-ace1-1768UF/Y-xyr1-593R进行扩增上游锚定片段(3.5kb)；用引物对Y-ace1-4078DR/Y-xyr1-213F进行扩增下游锚定片段(5.2kb)，结果如图2B所示，筛选到的目的转化株能扩增出相应片段，而出发菌株Q53G无法扩增出条带。上下游锚定验证示意图如图2B所示。
其中：涉及引物序列是：
Y-ace1-1768UF：GGGCATTTTTTTTGGGGAT
Y-xyr1-593R：GAAGATTCGCTTTGCTGGC
Y-xyr1-213F：CGCCAGGGCTCTCTTATTG
Y-ace1-4078DR：CTTCACGAAATCCTTACCGA
实施例3.敲除ace1同时过表达xyr1-A824V菌株在纤维素及葡萄糖条件的木聚糖酶活和纤维素酶活分析
将活化后的QA1Xg和QA1Xc菌株以108个/ml的数量分别接种到纤维素和葡萄糖发酵培养基中，在温度29-35℃、转速220-230r/min条件下发酵7天。取第7d的发酵液测定木聚糖酶活，结果如图3A所示，QA1Xg和QA1Xc菌株较出发菌株的木聚糖酶活显著提高，纤维素条件下QA1Xg和QA1Xc菌株的木聚糖酶活较出发菌株Q53G分别提高16.24和7.98倍；葡萄糖条件QA1Xg和QA1Xc菌株的木聚糖酶活较出发菌株Q53G分别提高22.86和42.63倍。同时测定β-木糖苷酶酶活，结果如图3B所示，纤维素条件下QA1Xg和QA1Xc菌株的β-木糖苷酶酶活较出发菌株Q53G分别提高26.84和2.95倍；葡萄糖条件QA1Xg和QA1Xc菌株β-木糖苷酶酶活的较出发菌株Q53G分别提高200.91和208.05倍。
同时取第7d的发酵液测定纤维素酶活，结果如图4A所示，QA1Xg和QA1Xc菌株较出发菌株的纤维素酶活显著提高，纤维素条件下QA1Xg和QA1Xc菌株的纤维素酶活较出发菌株Q53G分别提高2.31和2.14倍；葡萄糖条件QA1Xg和QA1Xc菌株的纤维素酶活较出发菌株Q53G分别提高1.61和18.84倍。同时进一步检测纤维素酶组分的酶活力，结果如图4B所示，纤维素条件下QA1Xg的CBH、BGL和EG活力组分别提高7.0倍、5.4倍和0.07倍，而QA1Xc的CBH、BGL和EG活力分别提高3.90倍、4.30倍和0.04倍。葡萄糖条件下，QA1Xg的CBH、BGL和EG组分比出发菌株Q53G分别提高3.6倍、1.8倍和0.39倍。QA1Xc的CBH、BGL和EG组分比出发菌株Q53G分别提高91倍、10倍和4倍。
由以上结果表明，在纤维素条件下QA1Xg的木聚糖酶活和纤维素酶活更高，葡萄糖条件下QA1Xc木聚糖酶活和纤维素酶活更高，可根据需要选取不同的方法提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活。
发酵培养基配方是：CaCl2 0.8g/L、MgSO4·7H2O 0.75g/L、KH2PO4 6g/L、(NH4)2SO46g/L、玉米浆30g/L、CaCO3 1g/L、酵母膏12g/L、FeSO4·7H2O 5g/L、MnSO4·H2O 1.6g/L、ZnSO4·7H2O 1.4g/L和CoCl·6H2O 2g/L，诱导条件加入纤维素25g/L(葡萄糖条件换为葡萄糖23g/L)，115℃，灭菌30min。
滤纸酶活力和内切纤维素酶活力个根据中华人民共和国轻工业标准QB 2583-2003测定。
木聚糖酶和EG(内切葡聚糖酶)活力测定：2mL的1％的木聚糖溶液与稀释后的酶液0.5mL放入试管底混匀50℃水浴30min，再加入3mL DNS终止反应煮沸10min，最后静置冷却后加蒸馏水定容至25mL摇匀，于540nm测定对照组及实验组OD值，对照标准曲线可计算出木聚糖酶活力。底物改为2mL的1％的CMC-Na，其他步骤同木聚糖酶活力的测定即可测EG(内切葡聚糖酶)的活力。酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmol木聚糖/葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。
纤维素酶活酶活测定：将Whatman No 1(50mg)滤纸条、1.5mL柠檬酸缓冲液(pH＝4.8)和0.5mL稀释一定倍数的粗酶液放入试管底混匀50℃水浴60min，再加入3mL DNS终止反应煮沸10min，最后静置冷却后加蒸馏水定容至25mL摇匀，于540nm测定对照组及实验组OD值，对照标准曲线可计算出FPA活力。
CBH(外切葡聚糖酶)、BGL(β-葡萄糖苷酶)活力和β-木糖苷酶测定：50μL的1mg/mL的pNPC与100μL使用柠檬酸缓冲液稀释适当的上清液在50℃反应30min，再加入150μL 10％的Na2CO3终止反应，于420nm测吸光度值，对照标准曲线可计算得到CBH活力。只底物改为10mM的pNPG，其他步骤同CBH活力的测定，即可测BGL活力。只底物改为1mg/mL的pNPX，其他步骤同CBH活力的测定，即可测β-木糖苷酶活力。酶活的定义：在50℃、pH4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。
实施例4.敲除ace1同时过表达xyr1-A824V菌株菌株产生的纤维素和木聚糖酶系在水解致密化预处理秸秆中的应用
将实施例3获得的QA1Xg和QA1Xc菌株和出发菌株Q53G所制备的纤维素条件的酶液应用于致密化预处理秸秆的糖化实验中。反应体系为30ml，糖化底物为5％的致密化预处理秸秆，木聚糖酶添加量为1000FPU g/L底物，为了防止染菌加入0.1％NaN3，用去离子水补齐至30ml，调pH为4.8，50℃、200r min-1进行糖化，糖化结束后、取糖化液，进行木糖的测定，结果如图5A所示，菌株QA1Xg和QA1Xc的酶液能够显著提高木糖得率，20.2mg/mL和19.0mg/mL与出发菌株Q53G的酶液(8.1mg/mL)相比，提高了2.4和0.9倍。纤维素酶添加量为15FPUg/L底物，进行葡萄糖的测定。结果如图5B所示，菌株QA1Xg和QA1Xc的酶液能够显著提高葡萄糖得率，葡萄糖得率分别为25.5mg/mL和24.3mg/mL，与出发菌株Q53G的酶液(12.0mg/mL)相比，提高了2.1和0.9倍。本研究成功实现了里氏木霉Q53G遗传操作体系的改进，并以此为基础改良木聚糖酶和纤维素酶组分，获得了糖化效率显著提高的工程菌，为下一步实际工业应用打下基础。
葡萄糖和木糖测定按照索莱宝葡萄糖和木糖含量测定试剂盒进行测定。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/Cas9技术提升里氏木霉同步提升里氏木霉木聚糖酶活和纤维素酶活的方法，其特征在于，所述方法包括利用CRISPR/Cas9技术敲除里氏木霉的木聚糖酶和纤维素酶基因表达的通用抑制因子Ace1，同时定点过表达转录激活因子Xyr1；
其中，所述转录激活因子Xyr1包括野生型转录激活因子Xyr1及其突变体，所述突变体为Xyr1-A824V。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：利用定位敲除ace1的CRISPR/Cas9载体中里氏木霉甘氨酸tRNA间隔两个靶向ace1基因sgRNA的方式，利用内源tRNA的加工方式转录时释放两个sgRNA，继而引导Cas9敲除ace1；同时，在该位点通过构建的分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA进行同源重组；分别以gpdA和cdna1为启动子过表达xyr1-A824V的供体DNA与靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体共转里氏木霉原生质体，获得转化子后用于发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
3.如权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒；
S2、构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体；
S3、构建定点过表达xyr1-A824V的供体DNA；
S4、将步骤S2制得的靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体与定点过表达xyr1-A824V的供体DNA共转里氏木霉中获得里氏木霉工程菌；
S5、对步骤S4获得的里氏木霉工程菌进行发酵生产木聚糖酶和纤维素酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，设计并合成包含两个靶向ace1的sgRNA表达盒的具体方法包括：基因合成以5S rRNA为启动子、包含两个靶向ace1的sgRNA、以里氏木霉编码甘氨酸的tRNA间隔每个sgRNA并以T6为终止子的sgRNA表达盒，同时在所述sgRNA表达盒两端添加酶切位点；每个sgRNA包含原间隔基序和支架序列；所述酶切位点为Bgl II和Pac I；
所述sgRNA表达盒命名为5stsgRNA(ace1*2)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，构建靶向ace1定位敲除的CRISPR/Cas9载体，具体方法包括：将步骤S1获得的sgRNA表达盒5stsgRNA(ace1*2)与携带Cas9和筛选标记ptrA的自主复制质粒pFC33ptrA酶切后连接在一起，从而构建含有sgRNA(靶向ace1)的CRISPR/Cas9载体，命名为pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)；其中，所述酶切采用Bgl II和Pac I，并使用T4 DNA连接酶进行连接。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述构建定点过表达xyr1-A824V的供体DNA具体方法包括：以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1上游同源臂；从质粒pAB7-1扩增得到PgpdA序列；以融合得到xyr1-A824V为模板扩增5’末端带有PgpdA同源序列的xyr1-A824V；以pAB7-1为模板扩增TtrpC；以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂；然后将所扩增的5个片段利用Double-joint PCR融合得到敲除ace1同时PgpdA驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dgXYR1-ace1)；或者，
以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1上游同源臂及Pcdna1序列；以融合得到xyr1-A824V为模板扩增xyr1-A824V；以pAB7-1为模板扩增TtrpC；以里氏木霉Q53G染色体为模板扩增ace1下游同源臂；再将所扩增的5个片段利用Double-joint PCR融合得到敲除ace1同时Pcdna1驱动过表达xyr1-A824V供体DNA融合片段(dcXYR1-ace1)。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，具体方法包括：以里氏木霉Q53G为出发菌株；制备里氏木霉Q53G原生质体，然后将pFC33ptrA-5stsgRNA(ace1*2)分别和dgXYR1-ace1及dcXYR1-ace1共转里氏木霉Q53G的原生质体中，经筛选、验证，验证正确的菌株即为里氏木霉工程菌，分别命名为QA1Xg和QA1Xc；
所述里氏木霉Q53G系由里氏木霉QM53菌株经敲除基因pyr4获得。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述发酵生产具体方法包括：将里氏木霉工程菌接种到发酵培养基中，在温度29-35℃、转速220-230r/min条件下发酵1-7天，即得到含木聚糖酶活和纤维素酶活提高的发酵液，分离提取即得。
9.权利要求1-8任一项所述方法在如下任意一种或多种中的应用：
(a)制备高活性木聚糖酶和纤维素酶；
(b)高效降解木质纤维素材料。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述木质纤维素材料包括秸秆和林木残留物。
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