CN104845954B - 一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶生产的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，属于基因工程领域。该方法是利用敲除或突变转录因子部分碱基或减弱转录因子的表达的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶，所述微生物为脉孢菌、曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或侧孢霉，所述转录因子基因包括NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186和NCU08744，敲除其中的任意一个，或突变其中的部分碱基，或减弱任意一个表达。本发明通过敲除或是部分碱基突变或是减弱微生物转录因子基因表达得到一类出发菌，并应用其降解木质纤维素或是提高纤维素酶、半纤维素酶表达或其它蛋白的表达量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，涉及5个基因(五个转录因子基因分别为NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186、NCU08744)。
背景技术
纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。随着地球资源的快速消耗、环境污染和能源危机的日益加剧，纤维素作为潜力巨大、环境友好的可再生能源成为研究的重点。作为地球上数量最大的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食料和化学原料等，势必将会对人类社会的健康发展起到关键作用。要利用这些储量巨大的生物质资源，需要糖化和发酵两个基本步骤。其中，如何将生物质高效地水解为单体化合物(葡萄糖、木糖等)已成为其利用过程中的一个迫切需要解决的问题。
多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，特别是子囊菌和担子菌等丝状真菌可以分泌多种木质纤维素水解酶，与其它微生物相比，其具有完整的纤维素酶系，这种特性使其成为研究纤维素利用和纤维素酶生产过程中的热点。在提高生物质降解效率的研究中，传统诱变技术已经取得了重大进步，提升空间有限。
因此，本领域迫切需要开发能够提高纤维素酶生产从而提供菌株对纤维素利用的技术和方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶表达的方法及其应用。
本发明第一方面，提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：
抑制丝状真菌的纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。
在另一优选例中，所述的丝状真菌包括：脉孢菌(Neurospora)、或侧孢霉(Sporotrichum)。
在另一优选例中，所述的丝状真菌还包括曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝霉(Myceliophthora)。
在另一优选例中，所述纤维素降解相关锌指转录因子包括：
(a)SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。
在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子还包括：
(b)与SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列同源性为50％以上，较佳地为60％以上，更佳地为65％以上的纤维素降解相关锌指转录因子。
在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的纤维素降解相关锌指转录因子的表达和/或活性。
在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子至少包括SEQ ID NO.:1所示的序列。
在另一优选例中，所述的丝状真菌为脉胞菌，较佳地，为粗糙脉孢菌。
本发明第二方面，提供了一种纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的抑制剂的用途，(a)用于提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达；和/或(b)用于提高丝状真菌的纤维素降解活性。
在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子包括选自(a)SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种；或(b)与SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列同源性为50％以上，较佳地为60％以上，更佳地为65％以上的纤维素降解相关锌指转录因子。
在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子的NCBI参考序列号包括：XP_662607.1、XP_659104.1、CBF84793.1(曲霉)；EPS30056.1、EPS31562.1、EPS26047.1(青霉)；XP_006965567.1、XP_006967595.、ETS00557.1(木霉)；EWZ01503.1、ENH63019.1、EXA00009.1(镰刀霉)；XP_003665650.1、XP_003662015.1、XP_003658871.1、XP_003662960.1(毁丝霉)。
在另一优选例中，所述的抑制剂包括所述纤维素降解相关锌指转录因子的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及锌指转录因子的活性抑制剂。
本发明第三方面，提供了一种用于降解纤维素的工程菌，所述工程菌中纤维素降解相关锌指转录因子被敲除或被下调。
在另一优选例中，所述的工程菌不表达或基本不表达纤维素降解相关锌指转录因子。
在另一优选例中，所述的“基本不表达”指的是与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素降解相关锌指转录因子的表达量至少降低了50％，较佳地，至少降低了60％、70％、80％、或90％。
在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了50-80％，更佳地，至少提高了100-500％。
在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子包括选自SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。
在另一优选例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脉孢菌(Neurospora)、或侧孢霉(Sporotrichum)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝霉(Myceliophthora)。
本发明第四方面，提供了一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，在纤维素原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。
在另一优选例中，所述的诱导物即纤维素原料包括木质纤维素、结晶纤维素、木聚糖、木质纤维素水解物、木寡糖、纤维寡糖、木糖、或阿拉伯糖。
本发明第五方面，提供了一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，在木质素原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。
本发明第六方面，提供了本发明第三方面所述工程菌的用途，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。
该方法是利用敲除或突变锌指转录因子基因的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，所述微生物为脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)或侧孢霉(Sporotrichum)。
所述锌指转录因子基因包括NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186，敲除其中的任意转录因子，或突变任意一个转录因子的部分碱基，或是减弱任意一个转录因子的表达。
所述锌指家族转录因子基因NCU05064的核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列1所示蛋白；所述锌指家族转录因子基因NCU03699的核苷酸序列如序列表中序列4所示，编码序列表中序列3所示蛋白；所述锌指家族转录因子基因NCU02576的核苷酸序列如序列表中序列6所示，编码序列表中序列5所示蛋白。所述锌指家族转录因子基因NCU06186的核苷酸序列如序列表中序列8所示，编码序列表中序列7所示蛋白。所述锌指家族转录因子基因NCU08744的核苷酸序列如序列表中序列10所示，编码序列表中序列9所示蛋白。
具体的，该方法利用以下任一菌株：以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU05064基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU03699基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU02576基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU06186基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU08744基因的菌株。
本发明提供的提高木质纤维素降解和纤维素酶、半纤维素酶表达的方法，是以微生物为出发菌株，敲除其中锌指家族转录因子基因而得到，或将任意锌指家族转录因子基因部分碱基突变而得到，或是减弱任意锌指家族转录因子基因的表达而得到。所述微生物为脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)或侧孢霉(Sporotrichum)。所述敲除或部分碱基突变或减弱基因表达是针对锌指家族转录因子基因NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186和NCU08744。
本发明方法的应用是广泛的，其为高效表达生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白质。其中：
生产纤维素酶的方法，是以木质纤维素、结晶纤维素、经过预处理的木质纤维素、纤维寡糖为诱导物，发酵所述的方法得到纤维素酶。
生产半纤维素酶的方法，是以木质纤维素、木聚糖、经过预处理的木质纤维素、阿拉伯糖、木寡糖、木糖为诱导物，发酵所述方法得到半纤维素酶。
生产其它蛋白的方法，包括将编码蛋白功能片段的基因导入所述受体菌中形成工程菌，再发酵该工程菌生产蛋白的过程。
因此，本发明还涉及这些转录因子基因在构建功能性工程菌中的应用。该应用是将编码蛋白功能片段的基因导入所述的出发菌株中形成的工程菌。
由此形成的高效表达蛋白的工程菌也属于本发明的技术内容。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：WT和NCU05064在2％微晶纤维素(A)和2％木聚糖(B)培养基上培养7天，取发酵液上清液，测量蛋白浓度、木聚糖酶活和纤维素内切酶酶活。
图2：WT和NCU05064在2％微晶纤维素和2％木聚糖培养基上培养7天，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析(1、4为野生型菌株；2、5为NCU08807；3、6为NCU05064)。
图3：WT和NCU03699在2％微晶纤维素(Avicel)培养基上培养7天后，纤维素内切酶酶活分析。
图4：WT和NCU02576在2％微晶纤维素培养基上培养7天后，取发酵液上清液，测量蛋白浓度、木聚糖酶活和纤维素内切酶酶活。
图5：WT和NCU02576在2％微晶纤维素(Avicel)培养基上培养7天后，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。
图6：WT、NCU06186在2％微晶纤维素培养基上培养7天后，取发酵液上清液，测量蛋白浓度和纤维素内切酶酶活。
图7：NCU05064突变体的PCR验证，其中S1为NCU05064突变体，WT为野生型菌株，所用引物为NCU05064DC和hphDC。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，丝状真菌中存在一系列与纤维素降解调控相关的锌指转录因子。实验证明，当这些锌指转录因子的表达降低或不表达时，丝状真菌中的纤维素酶或半纤维素酶的表达量会上升，从而能够提高菌株对木质纤维素的利用，并增强木质纤维素的降解。在此基础上，完成了本发明。
纤维素降解相关锌指转录因子
如本文所用，术语“纤维素降解相关锌指转录因子”、“本发明转录因子”、“本发明锌指蛋白”均指在丝状真菌中属于锌指家族且具有调控(半)纤维素酶表达或活性从而与纤维素降解相关的蛋白或其编码基因。
实验证明，当敲除或下调了本发明转录因子后，能够有效地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达，并进一步提高丝状真菌对木质纤维素的利用从而加强其降解。
优选地，本发明转录因子指的是在脉孢菌中的锌指转录因子，例如，如SEQ IDNO.:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。编码这些转录因子的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.:2、4、6、8、或10所示。
此外，本发明转录因子还包括来自多种丝状真菌的锌指家族的转录因子。例如，所述的丝状真菌包括曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或毁丝霉。在这些丝状真菌的转录因子中，可以找到与本发明SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列具有一定同源性的转录因子。本发明人通过筛选发现，在这些丝状真菌中，具有以下NCBI参考序列号的转录因子与纤维素的降解相关：XP_662607.1、XP_659104.1、CBF84793.1(曲霉)；EPS30056.1、EPS31562.1、EPS26047.1(青霉)；XP_006965567.1、XP_006967595.、ETS00557.1(木霉)；EWZ01503.1、ENH63019.1、EXA00009.1(镰刀霉)；XP_003665650.1、XP_003662015.1、XP_003658871.1、XP_003662960.1(毁丝霉)。优选地，这些转录因子中与本发明SEQ ID NO.:1、3、5、7、或9所示序列同源性大于50％，较佳地大于60％，更佳地大于65％的转录因子与纤维素降解有密切的相关性。
同时，本领域技术人员可以根据本发明教导在其他丝状真菌中找到同源性较高且与纤维素降解相关的锌指家族转录因子。
此外，本发明人还通过实验发现，当单个敲除或多个敲除所述的锌指家族转录因子后，均能够有效地使(半)纤维素酶活性增加，而不影响菌株的正常生长。
纤维素、纤维素酶、半纤维素酶
纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，其可以分泌多种纤维素水解酶。
纤维素酶是一种多酶体系，由多种组份组成。按底物特异性可将纤维素酶分为以下组分：(1)外切β-1,4-葡萄糖酶(exo-beta-1,4-glucanase，EC.3.2.1.91)简称为外切酶，又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)。纤维二糖水解酶可以水解纤维素结晶区，从纤维素链的非还原端/还原端开始水解并释放纤维二糖。(2)内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-beta-1,4-glucanase，EC3.2.1.74)简称内切酶。纤维素内切酶能够在纤维素多糖链上无定形部分随机切断糖苷键，产生新的糖链末端和长度不一的纤维寡糖。(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(beta-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)简称纤维二糖酶。纤维二糖水解酶水解可溶性的纤维糊精和纤维二糖生成葡萄糖。(4)其它组分，除了以上三大组分外还有纤维二糖脱氢酶、纤维二糖醌氧化还原酶、磷酸化酶、纤维素酶小体等都会参与纤维素降解过程。
半纤维素具有与纤维素一样的负责结构，其降解需要多种半纤维素酶的共同作用。其中主要有两种：β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者从半纤维素主链内部作用于木糖苷键，分解成低聚木糖，后者作用于低聚木糖的末端，释放出单糖。除此之外，降解半纤维素还需要多种侧链裂解酶的共同作用，主要有乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶等。
工程菌
本发明“工程菌”、“突变体”可互换使用，均是指将出发菌株中纤维素降解相关锌指转录因子敲除或下调后获得的具有(增强的)降解纤维素活性的工程菌株。其中，本发明工程菌在改造后，不表达或基本不较大纤维素降解相关锌指转录因子。
本领域技术人员应理解，当获得了锌指转录因子的序列后，可以通过多种常规技术使某出发菌株中的锌指转录因子的表达下调或沉默。通常，可采用同源重组的方法，采用某标记(或抗性)基因置换出发菌株的原始编码列。
当然，还可以采用能够抑制纤维素降解相关锌指转录因子表达和/或活性的其他基因工程手段或物质对该蛋白进行敲除或下调，从而获得新的转基因工程菌。这一类物质被称为“纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的抑制剂”或“本发明抑制剂”。例如，所述的抑制剂包括纤维素降解相关锌指转录因子的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及锌指转录因子的活性抑制剂。
同样，在获得了本发明锌指转录因子的序列或其编码核苷酸后，本领域技术人员可以根据常规技术手段设计、合成、鉴定并验证这些抑制剂及其效果。应理解，这些抑制剂可以是完全抑制本发明锌指转录因子的表达和/或活性，也可以是部分抑制，从而获得(半)纤维素酶活性增强的本发明工程菌。
应用
通过抑制本发明锌指蛋白，可以人为地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达量和/或活性，从而增加菌株对纤维素(尤其是木质纤维素)的利用。
例如，当获得了本发明的工程菌后，可以通过加入纤维素原料的诱导，对所述的工程菌进行培养。此时，所述的菌株会分泌纤维素酶和半纤维素酶，对其进行分离并提纯后，就可以获得较纯的纤维素酶和半纤维素酶。
由于产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中，纤维素原料受其降解，形成降解产物。因此当进一步对培养物进行分离时，就可以获得纤维素的多种降解产物，例如多种单体化合物：葡萄糖、木糖等。
本发明有益效果
本发明通过改造丝状真菌在纤维素降解的调控因子及调控网络，增强了丝状真菌对纤维素的利用，提高了生物质降解，从而成为能量利用中的新途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明所采用的原始出发菌株商购于美国真菌菌种保存库(FGSC)，其余所用材料均为商购。
实施例1工程菌的获得
可采用常规技术对出发菌株中的转录因子进行敲除。
以粗糙脉孢菌出发菌株(FGSC2489)(购自FGSC)为例，根据同源重组的原理，利用hph基因(潮霉素B抗性基因)置换待NCU05064的整个开放阅读框(open reading frame,ORF)。
1)设计同源臂特异性引物
上游同源臂特异性引物:
NCU05064-5f:GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGGACTTGACTTGAGTGACAGG(SEQ IDNO.:11)；
NCU05064-5r:ATCCACTTAACGTTACTGAAATCTCCAACGTTAGAAGCAGGAAGGAAGG(SEQ IDNO.:12)
下游同源臂特异性引物:
NCU05064-3f:CTCCTTCAATATCATCTTCTGTCTCCGACTACTGCGAGGAAGATCAAGG(SEQ IDNO.:13)；
NCU05064-3r:GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCCCTACCTACCTATCCAGACG(SEQ IDNO.:14)
扩增目标基因上下游同源臂；然后利用引物从质粒pCSN44中扩增hph抗性元件。将上述扩增所得3个片段利用酵母组装的方法连接至pRS426中。引物如下所示
hph-F：GTCGGAGACAGAAGATGATATTGAAGGAGC(SEQ ID NO.:15)
hph-R：GTTGGAGATTTCAGTAACGTTAAGTGGAT(SEQ ID NO.:16)
2)将上述所获得质粒作为模板，用SEQ ID NO.:11-12所示的引物扩增NCU05064敲除元件，凝胶纯化PCR产物。
3)将上述PCR产物10μg电击转化至野生型菌株(FGSC2489，A)，通过含有潮霉素的平板筛选阳性转化子。
4)提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物扩增，其中hphDC是验证基因敲除的通用引物，如果可以扩增得到目的片段，则说明这些转化子发生了预期的同源重组。引物如下所示：
NCU05064DC：GCGACTTGGACCTGACCACT(SEQ ID NO.:17)
hphDC：GCTCCGGGCGTATATGCT(SEQ ID NO.:18)
5)将所获得的转化子与野生型菌株杂交(FGSC4200，a)，将杂交得到的子囊孢子热激(60℃,45min)后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利用PCR进行鉴定。
其余工程菌株均根据类似方法获得，所需的引物如表1所示：
表1
实施例2工程菌的验证
提基因组DNA：采用酚氯仿法从孢子中提取提基因组DNA
1)RCR采用25μl体系，包括12.5μlDreamTaq PCR Master Mix 12.5μl，9.5μl水(nuclease-free)，上下游引物各1μl，基因组DNA1μl。
2)按如下条件进行PCR扩增95度预变性5分钟，94度变性30秒，52度退火45秒，72度延伸2分钟，按同样条件进行34个循环，最后72度退火10分钟。
3)110V电压，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，凝胶成像系统下看基因扩增条带(见图7)。
4)保菌：30％甘油保菌后放于-80℃冰箱保种。
实施例3突变体产纤维素酶、半纤维素酶实验
转录因子工程菌和野生型粗糙脉孢菌分别在2％结晶纤维素或2％木聚糖培养基上培养7天，取培养基上清，离心后进行一系列验证试验。
3.1方法：
3.1.1酶活测定
(1)内切-1,4-β-葡聚糖酶活力的测定方法：将粗酶液用0.1M醋酸钠缓冲液稀释适宜的倍数，终体积为0.5mL，放入40℃水浴锅内预热，取出，加入0.5mL Megazyme AZO-CM-CELLULOSE底物溶液，混匀，40℃温育10min，用2.5mL沉淀溶液终止反应，室温静置10min，混匀，1000g离心10min，590nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。
(2)β-葡萄糖苷酶酶活的测定方法：取50μL酶液，加入200μL pH 4.8的0.05M的乙酸钠缓冲液，再加入250μL 1mg/mLp-NPG底物溶液后，50℃反应10min，加入500μL 1M碳酸钠溶液终止反应，420nm波长下测OD。空白组使用灭活的酶液作对照。
(3)活性定义：1mL酶液于50℃pH 4.8条件下，每min水解底物产生1μmol产物的酶量定义为1个酶活力单位。
3.1.2蛋白质SDS-PAGE实验
在2％结晶纤维素或是2％木聚糖培养7天后，离心得到培养基上清液，上样，做蛋白质电泳。
3.2结果：
转录因子对纤维素酶、半纤维素酶表达水平的影响
在2％木聚糖条件下培养7天，突变株NCU05064培养基上清液中的蛋白表达水平和木聚糖酶酶活显著提高，分别提高了30％和80％。在2％结晶纤维素条件下培养7天，突变株NCU05064培养基上清液中的蛋白表达水平和木聚糖酶酶活显著提高，分别提高了40％和30％，其纤维素内切酶酶活无显著性变化。具体蛋白表达水平、酶活水平及蛋白胶图见说明书附图1和图2。
在2％结晶纤维素条件下培养7天，突变株NCU03699培养基上清液中的蛋白表达水平、纤维素内切酶活力及木聚糖酶活显著提高，分别提高了100％、40％和80％。具体蛋白表达水平、纤维素内切酶酶活水平及木聚糖酶活见说明书附图3。
在2％结晶纤维素条件下培养7天，突变株NCU02576培养基上清液中的蛋白表达水平、纤维素内切酶活力显著提高，分别提高了120％和300％，其木聚糖酶活无显著性变化。具体蛋白表达水平、纤维素内切酶酶活水平及木聚糖酶活见说明书附图4和图5。
在2％结晶纤维素条件下培养7天，突变株NCU06186培养基上清液中的蛋白表达水平和纤维素内切酶酶活水平分别提高了40％和20％。具体蛋白表达水平、纤维素内切酶酶活水平见说明书附图6。同样条件下，突变株NCU08744培养基上清液中的纤维素内切酶活力提高了40％。
实施例4多基因敲除的突变体生长活性研究以及酶活性测定
利用实施例1的方法、实施例2的鉴定、以及实施例3酶活测定方法，构建了如下菌株并对其进行酶活测定：
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU05064和NCU03699的菌株为B1(NCU05064×NCU03699)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU05064和NCU02576的菌株为B2(NCU05064×NCU02576)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU05064和NCU06186的菌株为B3(NCU05064×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU05064和NCU08744的菌株为B4(NCU05064×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU03699和NCU02576的菌株为B5(NCU03699×NCU02576)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU03699和NCU06186的菌株为B6(NCU03699×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU03699和NCU08744的菌株为B7(NCU03699×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU02576和NCU06186的菌株为B8(NCU02576×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU02576和NCU08744的菌株为B9(NCU02576×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子基因NCU06186和NCU08744的菌株为B10(NCU06186×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699和NCU02576的菌株为T1(NCU05064×NCU03699×NCU02576)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699和NCU06186的菌株为T2(NCU05064×NCU03699×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699和NCU08744的菌株为T3(NCU05064×NCU03699×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU02576和NCU06186的菌株为T4(NCU05064×NCU02576×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU02576和NCU08744的菌株为T5(NCU05064×NCU02576×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU06186和NCU08744的菌株为T6(NCU05064×NCU06186×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU03699、NCU02576和NCU06186的菌株为T7(NCU03699×NCU02576×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU03699、NCU02576和NCU08744的菌株为T8(NCU03699×NCU02576×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU03699、NCU06186和NCU08744的菌株为T9(NCU03699×NCU06186×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU02576、NCU06186和NCU08744的菌株为T10(NCU02576×NCU06186×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699、NCU02576和NCU06186的菌株为F1(NCU05064×NCU03699×NCU02576×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699、NCU02576和NCU08744的菌株为F2(NCU05064×NCU03699×NCU02576×NCU08744)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699、NCU08744和NCU06186的菌株为F3(NCU05064×NCU03699×NCU08744×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU02576、NCU08744和NCU06186的菌株为F4(NCU05064×NCU02576×NCU08744×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU02576、NCU03699、NCU08744和NCU06186的菌株为F5(NCU02576×NCU03699×NCU08744×NCU06186)；
以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱表达转录因子基因NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU08744和NCU06186的菌株为M1(NCU05064×NCU03699×NCU02576×NCU08744×NCU06186)。
培养结果显示，在敲除了多个基因后的突变工程菌株的生长情况与野生菌株相似，并没有出现明显的株系生长障碍。此外，对这些突变工程菌株进行酶活测试显示，经敲除基因后的突变体纤维素酶、半纤维素酶均高于野生菌株，增长范围至少为30％，部分多基因敲除后的菌株酶活可增长200％。可见，多基因敲除更能够有效地提高纤维素酶和半纤维素酶的活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (23)
1.一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：
抑制丝状真菌的纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性，其中，所述纤维素降解相关锌指转录因子为至少一种序列，其中所述的至少一种的序列如SEQ IDNO.: 3所示；
所述的丝状真菌为脉孢 菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素降解相关锌指转录因子还有：SEQ ID NO.: 1、5或7所示序列的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制包括敲除和/或下调所述的纤维素降解相关锌指转录因子的表达和/或活性。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纤维素降解相关锌指转录因子至少包括SEQ ID NO.: 1所示的序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的丝状真菌为粗糙脉孢菌。
6.一种纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的抑制剂的用途，其特征在于，(a)用于提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达；和/或(b)用于提高丝状真菌的纤维素降解活性；其中，所述纤维素降解相关锌指转录因子为至少一种序列，其中所述一种序列如SEQ IDNO.: 3所示；
所述的丝状真菌为脉孢 菌。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的纤维素降解相关锌指转录因子还有SEQ ID NO.: 1、5或7所示序列的一种或多种。
8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的纤维素降解相关锌指转录因子的NCBI参考序列号包括： XP_003665650.1、XP_003662015.1、XP_003658871.1、XP_003662960.1。
9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括所述纤维素降解相关锌指转录因子的抗体、抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA 以及锌指转录因子的活性抑制剂。
10.一种用于降解纤维素的工程菌，其特征在于，所述工程菌中纤维素降解相关锌指转录因子被敲除或被下调，其中所述纤维素降解相关锌指转录因子的序列如SEQ ID NO.: 3所示；且所述的工程菌为脉孢菌。
11.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述的脉孢菌包括粗糙脉孢菌。
12.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌不表达纤维素降解相关锌指转录因子。
13.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性至少提高了20%。
14.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述的纤维素降解相关锌指转录因子还有选自SEQ ID NO.: 1、5或7所示序列的一种或多种。
15.一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，其特征在于，在纤维素原料的存在下，培养权利要求10所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的纤维素原料包括木质纤维素、木聚糖、木质纤维素水解物、木寡糖。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素包括结晶纤维素。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素水解物包括木糖、纤维寡糖。
19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述木聚糖包括：木糖、阿拉伯糖。
20.权利要求10所述工程菌的用途，其特征在于，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，用途是利用敲除或突变锌指转录因子基因的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶。
22.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性提高了50-80%。
23.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性提高了100-300%。
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| "Identification of the CRE-1 Cellulolytic Regulon in Neurospora crassa";Jianping Sun 等;《PLOS One》;20110929;第6卷(第9期);摘要，"Result" * |
| "The CRE1 carbon catabolite repressor of the fungus Trichoderma reesei: a master regulator of carbon assimilation";Thomas Portnoy 等;《BMC Genomics》;20110327;第12卷(第269期);摘要 * |
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