WO2014192647A1 - 培養細胞および糖液の製造方法 - Google Patents

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WO2014192647A1
WO2014192647A1 PCT/JP2014/063656 JP2014063656W WO2014192647A1 WO 2014192647 A1 WO2014192647 A1 WO 2014192647A1 JP 2014063656 W JP2014063656 W JP 2014063656W WO 2014192647 A1 WO2014192647 A1 WO 2014192647A1
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WO
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codon
modification
glucosidase
pyrococcus furiosus
derived
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PCT/JP2014/063656
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English (en)
French (fr)
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石川　一彦
渉 小笠原
洋介 志田
紳吾 平松
栗原　宏征
山田　勝成
Original Assignee
独立行政法人産業技術総合研究所
国立大学法人長岡技術科学大学
東レ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Definitions

  • the present invention relates to a Trichoderma fungus cultured cell expressing ⁇ -glucosidase that forms a tetramer derived from a hyperthermophilic bacterium, and a method for producing a cellulose-derived sugar solution using the cultured cell.
  • Cellulase which is a cellulose-degrading enzyme, can be roughly classified into cellobiohydrase that acts on the crystalline region of cellulose and endoglucanase that acts from the inside of the cellulose molecular chain to reduce the molecular weight. These cellulases are known to be inhibited by cellobiose, which is one of the products.
  • ⁇ -glucosidase is an enzyme that acts on water-soluble oligosaccharides or cellobiose to catalyze a reaction of hydrolyzing the ⁇ -glycoside bond.
  • ⁇ -glucosidase is an essential enzyme for sufficiently obtaining glucose useful as a fermentation raw material.
  • cellobiohydrase or endoglucanase is known to cause reaction inhibition due to accumulation of cellobiose produced by cellulose degradation. That is, ⁇ -glucosidase can greatly reduce the accumulation of cellobiose produced by cellulose degradation, and thus has the effect of greatly improving cellulose degradation efficiency.
  • Thermostable ⁇ -glucosidase has also been identified from several types of thermophilic or hyperthermophilic bacteria. Specifically, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Thermotoga maritima (Thermocella maritima), Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Clostridium thermocellum (Clostridial thermocellum) and other glucosids such as Clostridium thermocellum.
  • Non-patent Document 1 ⁇ -glucosidase derived from Clostridium thermocellum is a monomer (Non-patent Document 1), and the amount of glucosidase derived from Sulfolobus solphataris and Pyrococcus furiosus is 4 glucosidase.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 3
  • Patent Document 3 a method for producing a sugar solution from a cellulose pretreated product in which ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is reacted with cellulase derived from a filamentous fungus has been reported (Patent Document 1).
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus which originally forms a tetramer, is artificially added with a mutation that destabilizes the tetramer, resulting in the presence of lignin.
  • Patent Document 2 A mutant ⁇ -glucosidase with improved cellobiose degradation activity has been reported (Patent Document 2).
  • Trichoderma fungi are known to have high protein expression levels and excellent protein secreting ability.
  • Non-patent Document 4 Examples are known in which ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus fungi is expressed using Trichoderma fungi and ⁇ -glucosidase is expressed in the culture supernatant (Patent Document 3, Non-Patent Document 4), and more than 90% of the activity is It was present in the culture supernatant (Non-patent Document 4).
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus secreted and expressed in the culture supernatant gradually decreases in enzyme activity when celloose is used as a substrate, and the amount of glucose released per unit time is reduced. There was a problem of gradually decreasing.
  • the present inventors have modified the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus to a codon that is frequently used in Trichoderma fungi, thereby converting the ⁇ -glucosidase to Trichoderma. It was found that it can be expressed in the genus fungus. Furthermore, Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase expressed in Trichoderma fungal cells can be accumulated in the expressing cells without being secreted immediately, and ⁇ -glucosidase can be stably retained.
  • ⁇ -glucosidase can be stably supplied even in a long-term saccharification reaction, and the activity of ⁇ -glucosidase in the reaction system can be stably maintained. And found that saccharification efficiency can be maintained.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention comprises [1] Trichoderma fungus cells into which a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus, which has been modified to a frequently used codon in Trichoderma fungi, is introduced.
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is (I) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (Ii) an amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions, additions or insertions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the tetramer structure to be formed is not destabilized; A polypeptide exhibiting cellobiose-degrading activity; or (iii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the tetramer structure formed does not become unstable, And a polypeptide exhibiting cellobiose-degrading activity, The cell of [1] or [2], comprising
  • a method for producing a sugar solution from the biomass comprising the step of hydrolyzing the cellulose-containing biomass by causing the cells and cellulases of any of [1] to [6] to act.
  • a ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is (I) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; (Ii) an amino acid sequence having one or several amino acid substitutions, deletions, additions or insertions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the tetramer structure to be formed is not destabilized; A polypeptide exhibiting cellobiose-degrading activity; or (iii) an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the tetramer structure formed does not become unstable, And a polypeptide exhibiting cellobiose-degrading activity, A gene according to [10] or [11].
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus can be stably expressed in Trichoderma fungi.
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus expressed in Trichoderma fungal cells is not secreted immediately but is accumulated and retained in the expressing cells.
  • ⁇ -glucosidase can be stably supplied even in a long-term saccharification reaction, and the activity of ⁇ -glucosidase in the reaction system can be stably maintained. And saccharification efficiency can be maintained.
  • ⁇ -glucosidase means an enzyme that catalyzes a reaction that hydrolyzes the ⁇ -glucoside bond of a sugar.
  • ⁇ -glucosidase is characterized by high cellobiose degrading activity, and the enzyme activity (U: unit) is based on the enzyme activity measurement method standardized by the Bioindustry Association, “New Energy Technology R & D / High-efficiency conversion of biomass energy, etc.
  • Technology Development Leading Technology Development
  • the reaction was performed using 100 ⁇ L of enzyme dilution solution in 500 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 20 mM cellobiose, and 10 minutes later, 50 ⁇ L of 0.5 M sodium hydroxide was added to stop the reaction, and glucose released from cellobiose was quantified. By doing so, ⁇ -glucosidase activity can be measured.
  • the calculation of the enzyme activity is defined as 1 U that hydrolyzes 1 ⁇ mol of cellobiose per minute.
  • pNPG degrading activity which is another index of ⁇ -glucosidase activity, is defined as 1 U, an activity that hydrolyzes 1 ⁇ mol of substrate at 50 ° C. for 1 minute using p-nitrophenyl ⁇ -glucopyranoside (pNPG) as a substrate.
  • pNPG degrading activity which is another index of ⁇ -glucosidase activity
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is a ⁇ -glucosidase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and exhibits cellobiose-degrading activity. It is the first enzyme isolated and purified by Kengen et al. (Eur. J. Biochem. 213, 305-312, 1993).
  • ⁇ -glucosidase from Pyrococcus furiosus exists in the form of a homotetramer (molecular weight of about 230 kDa) in an aqueous solution not containing a surfactant such as SDS (Kengen et al., Supra; Bauer MW. Et al., Supra). J. Biol. Chem., Vol. 271, 39, 23749-23755 (1996)).
  • this tetramer can be destroyed by a surfactant such as SDS, and it has been confirmed that each monomer is about 58 kDa (Kengen et al., Supra).
  • the amino acid sequence of “Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase” represented by SEQ ID NO: 2 is based on the amino acid sequence identified by Voorhorst et al. (J. Bacteriol. 177, 24, 7105-7111, 1995).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is obtained by removing the first methionine.
  • the molecular weight based on this identified amino acid sequence has been confirmed to be about 54 kDa (54.58 kDa) (Vorhorst et al., Supra).
  • proteins having an amino acid sequence containing amino acid mutations such as single amino acid substitutions, deletions, additions or insertions.
  • “1 or several” means, for example, 1 to 40, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, particularly preferably Means about 1 to 3 pieces.
  • the amino acid mutation may be any of substitution, deletion, addition and insertion, and may contain two or more mutation modes at the same time.
  • proteins consisting of amino acid sequences that have an identity of 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more when calculated using (eg, default or default parameters).
  • Codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus refers to the above-mentioned “Pyrococcus furiosus-derived gene”.
  • the gene encoding “Friosus-derived ⁇ -glucosidase” it means a gene in which one or more codons have a base sequence modified to another codon without changing the encoded amino acid.
  • a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus there can be mentioned a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (Vorhorst et al., Supra). Further, in the present invention, the “gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus” has the SEQ ID NO: 3 as long as the formed tetramer structure does not destabilize and encodes a protein exhibiting cellobiose-degrading activity. Or a base sequence in which 1 to 100 bases, preferably 1 to 50 bases, more preferably 1 to 10 bases are deleted, substituted, added or inserted. included.
  • the “gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus” has the SEQ ID NO: 3 as long as the formed tetramer structure does not destabilize and encodes a protein exhibiting cellobiose-degrading activity. And those comprising a nucleotide sequence having a sequence identity of 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more.
  • the comparison of base sequences can be performed by a known method, and for example, BLAST can be performed using default settings, for example.
  • the “gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus” has the SEQ ID NO: as long as the tetramer structure formed does not destabilize and encodes a protein exhibiting cellobiose-degrading activity.
  • Those comprising a base sequence that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a sequence complementary to all or part of the base sequence represented by 3 are also included.
  • stringent conditions refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Codon modification in the present invention means that the codon of the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is modified according to the codon usage of Trichoderma fungi. That is, in the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus, some or all of the codons corresponding to the less frequently used codons (minor codons) in Trichoderma fungi are used frequently (major codons). More preferably, it means changing to the most frequently used codon.
  • this codon modification ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus that cannot be expressed in Trichoderma fungi when a wild-type gene is used can be expressed in Trichoderma fungi.
  • phenylalanine is UUC
  • leucine is CUC
  • isoleucine is AUC
  • valine is GUC
  • serine is AGC
  • proline is CCC
  • threonine is ACC
  • alanine is GCC
  • tyrosine is UAC
  • histidine is CAC
  • glutamine is CAG
  • asparagine is AAC
  • lysine is modified to AAG
  • aspartic acid is modified to GAC
  • glutamic acid is modified to GAG
  • cysteine is modified to UGC
  • arginine is modified to CGC
  • glycine is modified to GGC.
  • the codons to be modified may be all codons corresponding to minor codons or some codons.
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is efficiently expressed in Trichoderma fungi, it is more preferable to change one or more codons corresponding to minor codons, more preferably all to the major codons. preferable.
  • codon modification can be performed by changing adenine (A) and uracil (U) to guanine (G) and cytosine (C) as long as the corresponding amino acids do not change. It is preferable to modify it. In particular, it is preferable to use a silent mutation that modifies adenine or uracil at the third position of each codon encoding each amino acid into guanine or cytosine as long as the corresponding amino acid does not change.
  • ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus that cannot be expressed in Trichoderma fungi can be expressed. It is preferable to be modified.
  • the codon is further modified to the corresponding major codon in the Trichoderma fungus, respectively.
  • threonine corresponding codon ACA In order to further increase the intracellular expression level of ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus, threonine corresponding codon ACA, proline corresponding codon CCA, alanine corresponding codon AGC, tyrosine corresponding codon AUA, histidine corresponding codon CAU, glutamine corresponding codon CAA, It is preferable that at least one of codons for aspartic acid corresponding codon AAU, glutamic acid corresponding codon GAA, and arginine corresponding codon AGG is further modified to a corresponding major codon in the Trichoderma fungus.
  • a codon modification method in the present invention a method such as a mutation introduction method using a PCR method or a gene synthesis method is used.
  • a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes a stop codon with respect to the ⁇ -glucosidase wild-type gene derived from Pyrococcus furiosus shown in SEQ ID NO: 3 (total of 472 codons including the stop codon except the first methionine) 302 It is an example of a codon-modified gene in which individual codons are modified, and all codons corresponding to amino acids are modified to the most frequent major codon in Trichoderma fungi.
  • proline corresponding codon CCU, CCA, or CCG
  • valine corresponding codon GUA, or GUG
  • asparagine corresponding codon AAU is AAC
  • lysine corresponding codon AAA is AAG.
  • the histidine codon CAU is CAC
  • the isoleucine codon (AUU or AUA) is AUC
  • the alanine codon GCU, GCA, or GCG
  • the glycine codon GGU, GGA, or GGG
  • a leucine corresponding codon (UUA, UUG, CUU, CUA, or CUG) is CUC
  • a phenylalanine corresponding codon UUU is UUC
  • a serine corresponding codon (UCU, UUC, UCA, or AGU) is AGC
  • a threonine corresponding codon ( ACU or ACA) is ACC
  • tyrosine The codon UAU is UAC
  • the glutamine codon CAA is CAG
  • the aspartate codon GAU is GAC
  • the glutamate codon GAA is GAG
  • the cysteine codon UGU is UGC
  • the arginine codon (AGA, AGG, or CGU).
  • Trichoderma fungus used as a host in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Trichoderma and has the ability to produce cellulase. Trichoderma reesei is preferred. Alternatively, a mutant strain derived from the genus Trichoderma and subjected to mutation treatment with a mutation agent or ultraviolet irradiation to improve cellulase productivity may be used. Preferred are QM9414 strain, PC-3-7 strain, QM9123 strain, RutC-30 strain, CL-847 strain, MCG77 strain, MCG80 strain and their derivatives, which are known mutants derived from Trichoderma reesei.
  • Trichoderma fungal cells (6) Introduction of a codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus into Trichoderma fungal cells.
  • Gene introduction into Trichoderma fungal cells is carried out using homologous or non-homologous recombination techniques. be able to.
  • homologous recombination the gene to be recombined is not particularly limited as long as it is a gene that is expressed when cellulase is induced. Homologous recombination is preferred.
  • homologous recombination By introducing a codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus into these gene sites by homologous recombination, high expression of the gene can be obtained. Also preferred is homologous recombination into the endoglucanase gene site of Trichoderma fungi. Homologous recombination to the endoglucanase gene site does not reduce cellobiohydrase activity derived from Trichoderma fungi, resulting in less degradation of biomass degradation compared to homologous recombination to the cellobiohydrase gene site This is preferable.
  • homologous recombination using the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus is performed.
  • non-homologous recombination there is no particular restriction on the gene as a recombination target.
  • cellulase gene deficiency hardly occurs, and as a result, the decrease in biomass decomposing activity may be small.
  • a gene linked with a promoter or terminator is used in order to express a “ ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus”.
  • Trichoderma fungal cell into which the codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been introduced is obtained by using ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus. Expressed and expressed ⁇ -glucosidase is not immediately secreted but once accumulated and retained in the cell and then gradually secreted. The expressed ⁇ -glucosidase accumulated and retained in the cell maintains its stability even in the saccharification reaction system.
  • ⁇ -glucosidase can be stably supplied, and for a long time (a time longer than 30 minutes, for example, 60 minutes or more, 120 minutes or more
  • the saccharification rate can be remarkably improved without reducing the activity of ⁇ -glucosidase in the reaction system.
  • Trichoderma fungal cells into which the codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been introduced are preferably 50% or more, more preferably 80% of the expressed ⁇ -glucosidase at the activity level. % Or more, more preferably 90% or more of ⁇ -glucosidase is accumulated and retained in the cell without immediately secreting it. In order to increase the proportion of ⁇ -glucosidase accumulated in the cells, it is preferable to express ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus under the control of a strong promoter so that the expression level exceeds the secretion level.
  • a cellobiohydrase 1, 2 gene promoter or an endoglucanase gene promoter that functions as a strong promoter in the presence of a cellulase inducer such as cellulose is preferably used.
  • a relatively weak promoter other than these the proportion of ⁇ -glucosidase accumulated in the cell decreases.
  • the ratio of ⁇ -glucosidase in the cells can be kept high by controlling the pH during culture to 8 or less, more preferably 6 or less. When the culture is carried out at a pH higher than 8, the ratio of intracellular ⁇ -glucosidase decreases and the ratio of extracellular ⁇ -glucosidase increases.
  • the ⁇ -glucosidase activity accumulated and retained in the cells is 6 U / mL or more, preferably 10 U / mL or more in terms of the concentration in the culture state.
  • the specific activity is 5 U / mg or more, preferably 10 U / mg or more.
  • Quantification of ⁇ -glucosidase accumulated and retained in the cells is obtained by washing and suspending the cultured cells from which the culture supernatant has been removed with a buffer solution, and maintaining the temperature at 70 ° C. for 60 minutes to disrupt the cells and extract the ⁇ -glucosidase extracted into the supernatant. It can be quantified by measuring the activity.
  • the activity (U: unit) of ⁇ -glucosidase can be measured and defined in accordance with the enzyme activity measurement method standardized by the aforementioned Bioindustry Association.
  • the protein can be quantified by a conventional method such as BCA method or Bradford method.
  • Quantification of ⁇ -glucosidase secreted extracellularly can be determined by measuring ⁇ -glucosidase activity in the culture supernatant.
  • the ⁇ -glucosidase produced in the culture solution can be quantified by measuring the ⁇ -glucosidase activity of the culture solution.
  • the codon-modified Trichoderma fungal cell into which the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been introduced can be used in a saccharification reaction for obtaining water-soluble sugar from cellulose-containing biomass.
  • the resulting glucose concentration is improved by 20% or more.
  • the saccharification reaction (saccharification step) using a Trichoderma fungus cell into which a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been modified expresses ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus Compared with the case where Trichoderma fungus cultured cells are not used, the resulting glucose concentration is improved, so that the time is longer than 30 minutes, preferably 60 minutes or more, more preferably 120 minutes or more.
  • limiting in particular in the upper limit of saccharification reaction time Preferably it is 48 hours, More preferably, it is within 24 hours.
  • the cellobiose hydrolysis reaction using the Trichoderma fungal cell into which the codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention is introduced is a Trichoderma genus expressing ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus.
  • the resulting glucose concentration is further improved, so that the temperature is 50 ° C or higher, preferably higher than 50 ° C, more preferably 60 ° C or higher, more preferably 70 ° C or higher, More preferably, it is preferably carried out at 80 ° C. or higher.
  • the upper limit of the saccharification temperature is not particularly limited as long as ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is not inactivated, and is preferably 110 ° C. or less, more preferably 105 ° C. or less.
  • the cellobiose hydrolysis reaction using the Trichoderma fungal cell into which the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus forming a tetramer of the present invention is modified is a pyro which does not form a tetramer.
  • the obtained glucose concentration is further improved, so that the temperature is 50 ° C. or higher, preferably higher than 50 ° C., more preferably Is preferably carried out at 60 ° C. or higher, more preferably 70 ° C. or higher, and even more preferably 80 ° C. or higher.
  • the upper limit of the saccharification temperature is not particularly limited as long as ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus forming a tetramer is not inactivated, and is preferably 110 ° C. or less, more preferably 105 ° C. or less.
  • the Trichoderma fungal cell into which the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been modified is mixed with cellulase to hydrolyze cellulose-containing biomass as an enzyme composition for degrading biomass. It can be used for (saccharification process).
  • Cellulase as used herein is not particularly limited as long as it has an activity of decomposing cellulose, and may be one or more kinds of mixtures. Examples of such enzymes include cellulase, hemicellulase, cellobiohydrase, endoglucanase, exoglucanase, xylanase, and mannanase.
  • Trichoderma fungal cells into which the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been modified can also be used for simultaneous saccharification parallel fermentation in which fermentation is performed in parallel with the saccharification step. .
  • the cellulose-containing biomass is not limited as long as it contains at least cellulose. Specifically, bagasse, corn stover, corn cob, switch glass, rice straw, wheat straw, tree, wood, waste building materials, newspaper, waste paper, pulp, and the like. These cellulose-containing biomass contains impurities such as polymer aromatic compounds lignin and hemicellulose, but as a pretreatment, lignin and hemicellulose were partially decomposed using acid, alkali, pressurized hot water, etc. Cellulose-containing biomass may be used as cellulose.
  • the codon-modified ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus is homologous recombination at a cellulase locus such as cellobiohydrase, or under the control of a cellulase gene promoter, cellulose, xylan, lactose, Substances that induce cellulases, including sorbose and sophorose, are used for culturing.
  • homologous recombination is performed at a locus encoding cellulase important in the degradation of solid cellulose, such as cellobiohydrase 1 (cbh1) and cellobiohydrase 2 (cbh2), the degradation efficiency of solid cellulose decreases.
  • soluble inducers such as sorbose, sophorose, lactose, cellobiose are generally used.
  • the nitrogen source for example, polypeptone, gravy, CSL, soybean meal, etc. are used.
  • components required for producing the target cellulase can be added to the medium.
  • various culture methods such as shake culture, agitation culture, agitation shake culture, stationary culture, and continuous culture can be adopted, and shake culture or agitation culture is preferred.
  • the culture temperature is usually 20 ° C. to 35 ° C., preferably 25 ° C. to 31 ° C.
  • the culture time is usually 3 to 10 days, preferably 4 to 9 days.
  • Trichoderma fungus cell into which the gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus of the present invention has been modified, in addition to recombinantly expressed ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus
  • Cellulase groups such as Trichoderma fungal endogenous ⁇ -glucosidase, cellobiohydrase, endoglucanase, xylanase and the like are included.
  • the culture supernatant may be used as a saccharification enzyme and used for saccharification of cellulose-containing biomass together with the Trichoderma fungal cells into which the gene of the present invention is introduced.
  • ⁇ -glucosidase activity is 0.1 U / mL or more (preferably 0.3 U / mL or more, preferably) in the culture supernatant of the Trichoderma fungal cell into which the gene of the present invention has been introduced. More preferably, it has 0.9 U / mL or more) and an Avicel degradation activity of 2 U / mL or more (preferably 4 U / mL or more).
  • the gene-introduced Trichoderma fungus cell of the present invention preferably has ⁇ -glucosidase activity of 6 U / mL or more (preferably 10 U / mL or more).
  • Example 1 Preparation of codon-modified Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase gene DNA for homologous recombination, shown in SEQ ID NO: 1, modified to a frequently used codon in Trichoderma fungus A Juliosus-derived ⁇ -glucosidase gene was prepared as a synthetic gene.
  • DNA for homologous recombination for introducing a codon-modified ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus into the cbh1 (cellobiohydrase 1) locus of Trichoderma fungus (expressed by SEQ ID NO: 4) ) was produced.
  • the 1st to 2165th bases are the upstream region containing the promoter of cellobiohydrase 1 gene derived from Trichoderma filamentous fungi, and the 2166th to 2219th bases are cellobiohydrase 1 Secretion signal region of gene, bases 2220 to 3635 are codon-modified ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus, and bases 3636 to 4730 are terminator region 1 of cellobiohydrase 1 gene
  • the 4731-5737 bases are upstream of the amdS (acetamidase) gene
  • 5738-7737 bases are acetamidase genes
  • 7638-7817 bases are downstream of the acetamidase gene
  • 7818-9951 bases are Cellobioha It is shown Doraze 1 gene terminator region 2, respectively.
  • a restriction enzyme recognition site is provided at the junction of each region.
  • a codon-modified DNA for homologous recombination for introducing the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus into the egl1 (endoglucanase 1) locus of Trichoderma fungi by homologous recombination (represented by SEQ ID NO: 5) ) was produced.
  • the 1st to 2330th bases are the upstream region and N-terminal region containing the promoter of the endoglucanase 1 gene derived from Trichoderma filamentous fungi
  • the 2331st to 3746th bases are SEQ ID NO: 1.
  • the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus the bases 3747 to 4055 are terminator regions 1 of the endoglucanase 1 gene, the bases 4056 to 5062 are upstream regions of the amdS (acetamidase) gene,
  • the bases 5063 to 6962 represent the acetamidase gene, the bases 6963 to 7142 represent the downstream region of the acetamidase gene, and the bases 7143 to 9591 represent the terminator region 2 of the endoglucanase 1 gene.
  • a restriction enzyme recognition site is provided at the junction of each region.
  • the 1st to 1714th base is the upstream region of the endoglucanase 3 gene derived from Trichoderma filamentous fungi
  • the 1715 to 1894th base is the downstream region of the amdS (acetamidase) gene ( Reverse)
  • bases 1895 to 3794 are the acetamidase gene (reverse direction)
  • bases 3795 to 4801 are the upstream region of the acetamidase gene (reverse direction)
  • bases 4802 to 6695 are the promoter of the endoglucanase 3 gene
  • the 6696th to 8111st bases are the codon-modified ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus
  • the 8112th to 10315th bases are terminator regions of the endoglucanase 3 gene.
  • EachA restriction enzyme recognition site is provided at the junction of each region.
  • Example 2 Production of Trichoderma fungal cells expressing ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus
  • the DNA for homologous recombination constructed in Example 1 was introduced into Trichoderma reesei PC-3-7 strain and QM9414 strain, respectively. .
  • the introduction was performed by the protoplast PEG method.
  • the transformant was selected with a selective medium for acetamide utilization ability.
  • the composition of the medium is as follows.
  • composition of the trace element is as follows. 6 mg H 3 BO 3 , 26 mg (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 ⁇ 4H 2 O, 100 mg FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 40 mg CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 8 mg MnCl 2 ⁇ 4H 2 O, 200 mg ZnCl 2 in distilled water And made up to 100 ml.
  • one strain is a cbh1 gene non-homologous recombination strain (B-12 strain having QM9414 strain as a parent strain), The remaining 7 strains were all homologous recombination strains to the cbh1 gene.
  • a transformant (E1-10) having the PC-3-7 strain as the parent strain was obtained by transformation using the DNA for homologous recombination shown in SEQ ID NO: 5 (endoglucanase 1).
  • Trichoderma reesei liquid medium The composition of Trichoderma reesei liquid medium is as follows.
  • Each culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to separate into culture supernatant and cells.
  • the cells were washed with a sodium acetate buffer and then incubated at 70 ° C. for 1 hour, and intracellular ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus was extracted into the supernatant.
  • Example 3 Measurement of molecular weight Transformation obtained using cbh1 (cellobiohydrase 1) DNA for homologous recombination shown in SEQ ID NO: 4 with the PC-3-7 strain produced in Example 2 as the parent strain Using the B-20 strain, the molecular weight of ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus was measured by gel filtration, and it was confirmed that a tetramer was formed.
  • Superdex 200 was used for the gel filtration column, and the molecular weight was estimated from the elution time of the protein having a known molecular weight.
  • the molecular weight of ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus was about 264 kDa, and it was confirmed that a tetramer was formed.
  • Example 4 Measurement of Protein Concentration, ⁇ -Glucosidase Activity, pNPG Degrading Activity, and Avicel Degrading Activity
  • a non-transformant and each transformant prepared in Example 2 were cultured, and the amount of protein in the culture supernatant over time ⁇ -glucosidase activity, pNPG-degrading activity, Avicel-degrading activity, intracellular ⁇ -glucosidase activity, and protein concentration of the cell extract were measured.
  • the protein concentration, ⁇ -glucosidase activity, pNPG degradation activity, and Avicel degradation activity were measured by the following methods.
  • the BCA method was used for protein concentration measurement, and the protein concentration was quantified using BSA as a standard product.
  • ⁇ -glucosidase activity was measured and defined according to the enzyme activity measurement method standardized by the Bioindustry Association. Specifically, the reaction was performed at 50 ° C. using 100 ⁇ L of enzyme dilution in 500 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 20 mM cellobiose, and after 10 minutes, 50 ⁇ L of 0.5 M sodium hydroxide was added to stop the reaction and release from cellobiose. ⁇ -glucosidase activity was measured by quantifying the glucose. Glucose was quantified using Glucose Test Wako, and the activity of hydrolyzing 1 ⁇ mol of cellobiose per minute was defined as 1 U.
  • PNPG degradation activity was measured and defined according to the enzyme activity measurement method standardized by the Bioindustry Association. Specifically, the reaction was carried out at 50 ° C. using 100 ⁇ L of enzyme dilution solution in 500 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM pNPG, and after 10 minutes, 500 ⁇ L of 1M sodium carbonate was added to stop the reaction, and pNP released from pNPG was quantified. PNPG degradation activity was measured. The activity to hydrolyze 1 ⁇ mol of pNPG per minute was defined as 1U.
  • Avicel degradation activity is 5 ⁇ L of enzyme dilution solution in 500 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1% Avicel, and 5 ⁇ L of enzyme dilution solution is used for reaction at 50 ° C. After 1 hour, the reaction is stopped by filter filtration. Avicel degradation activity was measured by quantifying the glucose released from the sucrose. The activity to release 1 ⁇ mol of glucose per minute was defined as 1U.
  • the ⁇ -glucosidase activity and specific activity of the culture supernatant are more than 5 times that of the wild strain, and the intracellular ⁇ -glucosidase activity is 300 times that of the wild strain.
  • the specific activity was 200 times or more.
  • the total amount of ⁇ -glucosidase activity was 25 to 200 times that of the wild type.
  • Most of the ⁇ -glucosidase contained in the culture solution was estimated to be ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus.
  • the intracellular ⁇ -glucosidase activity is higher than the extracellular (culture supernatant) ⁇ -glucosidase activity, ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus is mainly accumulated in the cell, and the ⁇ -glucosidase activity of 80 % To 98% were present in the cells.
  • the transformant having homologous recombination at the cbh1 locus has a reduced degradation efficiency of solid cellulose in the medium and the free concentration of cellobiose having a high inducibility greatly decreases, resulting from Pyrococcus furiosus. It was also predicted that ⁇ -glucosidase was not induced, but a sufficient amount of Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase could be produced even in the culture using pulp which is solid cellulose.
  • a DNA for homologous recombination (represented by SEQ ID NO: 7) for introducing the ⁇ -glucosidase gene derived from the wild type Pyrococcus furiosus through the cbh1 (cellobiohydrase 1) locus was prepared. It is the same as the DNA for homologous recombination represented by SEQ ID NO: 4 except that the codon of the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus is not modified (wild type).
  • transformants (B-41, B-45) were obtained by the same method as in Example 2 using the QM9414 strain as a parent strain.
  • the obtained transformant is cultured by the same method as in Example 2, and the same method as in Example 4 is used for the ⁇ -glucosidase activity, Avicel degradation activity, intracellular ⁇ -glucosidase activity, and protein concentration of the cell extract at the end of the culture. It was measured by.
  • Table 4 summarized in Table 4 below.
  • a ⁇ -glucosidase activity at the same level as that of the non-transformant shown in Table 1 is detected in the culture solution and cultured cells of the transformant into which the ⁇ -glucosidase gene derived from wild-type Pyrococcus furiosus without codon modification has been introduced. That is, no activity derived from ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus was detected.
  • Example 5 Enzymatic reaction using a codon-modified Trichoderma fungal cell into which a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus was introduced B3 using PC3-7 strain prepared in Example 4 as a parent strain Enzymatic reaction was carried out using the culture supernatant of the -15 strain or a culture solution containing the transformant.
  • the culture supernatant and the culture solution were each diluted with an acetate buffer, and a cellobiose degradation reaction was performed using ⁇ -glucosidase having almost the same activity.
  • the concentration of glucose produced in the reaction solution after 10 minutes, 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes was quantified. The results are shown in Table 5 below.
  • Example 6 Enzymatic reaction using a Trichoderma fungal cell into which a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus having a modified codon was used at a high temperature. The glucosidase activity and reaction temperature were changed, and the reaction was performed at 50 ° C. and higher than 50 ° C. The results are shown in Table 6.
  • the concentration of glucose obtained at a temperature higher than 50 ° C. Had improved.
  • the codon-modified enzyme solution containing a transformant introduced with a gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus has a longer saccharification time longer than 30 minutes, particularly longer than 60 minutes.
  • the yield of glucose is further improved at higher temperatures such as 60 ° C, 70 ° C, 80 ° C, 90 ° C.
  • a DNA for homologous recombination for introducing the ⁇ -glucosidase gene derived from Pyrococcus furiosus with the tetramer structure destabilized through the cbh1 (cellobiohydrase 1) locus was prepared in the same manner as in Example 1. .
  • the resulting DNA for homologous recombination of the ⁇ -glucosidase gene derived from the destabilized Pyrococcus furiosus has four amino acids (R170A / R220A / Y227F / R448G) of ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus. Except that the corresponding nucleotide sequence is mutated, it is the same as the DNA for homologous recombination represented by SEQ ID NO: 4.
  • a transformant (M4-2) expressing ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus having a tetramer structure destabilized by the same method as in Example 2 using the QM9414 strain as a parent strain. , M4-4).
  • M4-2 strain, M4-4 strain, and the parent strain QM9414 strain, B-9 strain expressing tetramer-forming Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase were respectively cultured.
  • pNPG degradation activity, Avicel degradation activity, intracellular ⁇ -glucosidase activity, and protein concentration of the cell extract were measured. The results are summarized in Table 7 below.
  • the amount accumulated in the cell is less than that when ⁇ -glucosidase derived from tetramer-forming Pyrococcus furiosus is expressed. It decreased to 4 or less.
  • Example 7 Comparison of Enzymatic Activity at High Temperature Using Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase-expressing cells in which the tetramer structure is destabilized and tetramer-forming Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase-expressing cells Using the B-9 strain, M4-2 strain, M4-4 strain, and the parental strain QM9414 prepared in Example 2 and Comparative Example 2, the culture supernatant and cell extract were 50 ° C, 60 ° C, 70 ° C. PNPG degradation activity at 80 ° C. and 90 ° C. was measured. The results are shown in Table 8.
  • a Trichoderma fungal cell into which a codon-modified gene encoding ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus in the present invention has been introduced expresses and accumulates and retains ⁇ -glucosidase derived from Pyrococcus furiosus Can do.
  • Such Trichoderma fungal cells can stably and long-term supply ⁇ -glucosidase accumulated and retained in cells during biomass hydrolysis and saccharification reactions, and stably retain ⁇ -glucosidase activity in the reaction system.
  • the saccharification rate of biomass can be remarkably improved without reducing ⁇ -glucosidase activity even in a long-time reaction.
  • the Trichoderma fungal cell according to the present invention can be suitably used for producing a sugar solution by hydrolysis of cellulose-containing biomass.

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Abstract

　長時間の糖化反応において糖化率が低下しにくい酵素液を提供する。　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌培養細胞を糖化反応に使用する。また、コドンを改変したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を、トリコデルマ属真菌培養細胞にて発現させることにより、発現されたβグルコシダーゼをすぐに分泌されることなく細胞内に蓄積・保持させる。

Description

培養細胞および糖液の製造方法
　本発明は、超好熱菌由来の４量体を形成するβ－グルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌培養細胞、および、当該培養細胞を使用したセルロース由来糖液の製造方法に関する。
　セルロースの糖化には様々な手法があるが、エネルギー使用量が少なく、かつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。セルロース分解酵素であるセルラーゼを大別すると、セルロースの結晶領域に作用するセロビオハイドラーゼ、セルロース分子鎖内部から作用して分子量を低減させるエンドグルカナーゼに分けられる。これらセルラーゼは、生成物の一つであるセロビオースによって阻害を受けることが知られている。またβグルコシダーゼは、水溶性オリゴ糖あるいはセロビオースに作用し、そのβ－グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素である。特にβグルコシダーゼは、発酵原料として有用なグルコースを十分に得るためには必須の酵素である。また、セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解で生成したセロビオースの蓄積により反応阻害が引き起こされることが知られている。すなわち、βグルコシダーゼは、セルロース分解により生成するセロビオースの蓄積を大幅に低減することができるため、セルロース分解効率を大幅に向上させるといった効果を有する。
　耐熱性のβグルコシダーゼに関しても、数種の好熱性菌あるいは超好熱性菌より同定されており、具体的にはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、サーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ）、スルフォロバス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｈｉｂａｔａｅ）、スルフォロバス・ソルファタリスク（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）などの微生物より耐熱性のβグルコシダーゼが同定されている。クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）由来のβグルコシダーゼは単量体であり（非特許文献１）、スルフォロバス・ソルファタリスク（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）およびパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のβグルコシダーゼは４量体を形成する（非特許文献２、非特許文献３）ことが確認されている。また、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを糸状菌由来セルラーゼとともに反応させる、セルロース前処理物からの糖液の製造方法も報告されている（特許文献１）。
　さらに、本来は４量体を形成するパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼに、４量体を不安定化させる変異を人為的に加え、２量体、又は単量体とすることで、リグニン存在下でセロビオース分解活性が向上した変異型βグルコシダーゼが報告されている（特許文献２）。
　βグルコシダーゼを組み換えにより大量に発現させる検討が種々行われており、大腸菌等の細菌、トリコデルマなどの糸状菌を用いて発現させた例が知られている。なかでも、トリコデルマ属真菌はタンパク質の発現量が高く、また、タンパク質を分泌する能力に優れることが知られている。
　トリコデルマ属真菌を用いてアスペルギルス属真菌由来βグルコシダーゼを発現させ、培養上清にβグルコシダーゼを発現させた例が知られており（特許文献３、非特許文献４）、その活性の９０％以上は培養上清に存在していた（非特許文献４）。
特開２０１１－２４５０１号公報 特開２０１２－３４６９０号公報 特開２０１２－１６３２９号公報
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　Ｐ．ら，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｎｄ　Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ：Ｂａｓｉｃ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔａｘｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，ｖｏｌ．１，１２１－１３８（１９９８） Ｏｈｂａ　Ｈ．ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１５８１－１５８３（１９９５） Ｂａｕｅｒ　ＭＷ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，３９，２３７４９－２３７５５（１９９６） Ｈｉｋａｒｕ　Ｎａｋａｚａｗａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１０９，Ｎｏ．１，９２－９８（２０１２）
　パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼは、これまでトリコデルマ属真菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）において発現させることができなかった。
　さらに、培養上清に分泌発現させたパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは、セロビオースを基質として糖化反応させた際に、酵素活性が徐々に低下し、単位時間当たりに遊離してくるグルコース量が徐々に低下するという課題があった。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子のコドンをトリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変することで、当該βグルコシダーゼをトリコデルマ属真菌において発現可能とすることを見出した。さらに、トリコデルマ属真菌細胞にて発現されたパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼはすぐに分泌されることなく、発現する細胞内に蓄積することができβグルコシダーゼを安定的に保持することができる。これにより、当該細胞をセルロース含有バイオマスの糖化反応に用いることによって、長時間の糖化反応においてもβグルコシダーゼを安定的に供給することができ、反応系におけるβグルコシダーゼの活性を安定的に保持することができ、糖化効率を維持できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。
　すなわち、本発明は以下の構成からなる
［１］　トリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されている、トリコデルマ属真菌細胞であって、発現された該パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは４量体を形成する、上記トリコデルマ属真菌細胞。
［２］　以下の１以上のコドン改変を含むパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されている、［１］の細胞：
（１）ロイシン対応コドンのＣＵＣへの改変；
（２）バリン対応コドンのＧＵＣへの改変；
（３）リジン対応コドンのＡＡＧへの改変；
（４）イソロイシン対応コドンのＡＵＣへの改変；
（５）セリン対応コドンのＡＧＣへの改変；
（６）アルギニン対応コドンのＣＧＣへの改変；
（７）トレオニン対応コドンのＡＣＣへの改変；
（８）プロリン対応コドンのＣＣＣへの改変；
（９）アラニン対応コドンのＧＣＣへの改変；
（１０）チロシン対応コドンのＵＡＣへの改変；
（１１）ヒスチジン対応コドンのＣＡＣへの改変；
（１２）グルタミン対応コドンのＣＡＧへの改変；
（１３）アスパラギン酸対応コドンのＧＡＣへの改変；
（１４）グルタミン酸対応コドンのＧＡＧへの改変；
（１５）フェニルアラニン対応コドンのＵＵＣへの改変；
（１６）アスパラギン対応コドンのＡＡＣへの改変；
（１７）システイン対応コドンのＵＧＣへの改変；及び
（１８）グリシン対応コドンのＧＧＣへの改変。
［３］　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド；あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド、
を含む、［１］又は［２］の細胞。
［４］　コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を含む、［１］又は［２］の細胞。
［５］　発現したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、細胞内に蓄積されている、［１］～［４］のいずれかの細胞。
［６］　発現したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼのうち、βグルコシダーゼ活性として５０％以上が細胞内に蓄積されている、［５］の細胞。
［７］　［１］～［６］のいずれかの細胞及びセルラーゼを作用させて、セルロース含有バイオマスを加水分解する工程を含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
［８］　セルロース含有バイオマスを加水分解する工程が、３０分よりも長く行われることを特徴とする、［７］の方法。
［９］　セルロース含有バイオマスを加水分解する工程が、５０℃以上で行われることを特徴とする［８］に記載の方法。
［１０］　トリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子。
［１１］　以下の１以上のコドン改変を含む、［１０］の遺伝子：
（１）ロイシン対応コドンのＣＵＣへの改変；
（２）バリン対応コドンのＧＵＣへの改変；
（３）リジン対応コドンのＡＡＧへの改変；
（４）イソロイシン対応コドンのＡＵＣへの改変；
（５）セリン対応コドンのＡＧＣへの改変；
（６）アルギニン対応コドンのＣＧＣへの改変；
（７）トレオニン対応コドンのＡＣＣへの改変；
（８）プロリン対応コドンのＣＣＣへの改変；
（９）アラニン対応コドンのＧＣＣへの改変；
（１０）チロシン対応コドンのＵＡＣへの改変；
（１１）ヒスチジン対応コドンのＣＡＣへの改変；
（１２）グルタミン対応コドンのＣＡＧへの改変；
（１３）アスパラギン酸対応コドンのＧＡＣへの改変；
（１４）グルタミン酸対応コドンのＧＡＧへの改変；
（１５）フェニルアラニン対応コドンのＵＵＣへの改変；
（１６）アスパラギン対応コドンのＡＡＣへの改変；
（１７）システイン対応コドンのＵＧＣへの改変；及び
（１８）グリシン対応コドンのＧＧＣへの改変。
［１２］　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、
（ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド；あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド、
を含む、［１０］又は［１１］の遺伝子。
［１３］　配列番号１に示される塩基配列を含む、［１０］又は［１１］の遺伝子。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-111169号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、トリコデルマ属真菌においてパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを安定に発現させることができる。
　また、トリコデルマ属真菌細胞にて発現されたパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼはすぐに分泌されず、発現する細胞内に蓄積・保持される。これにより、当該細胞をセルロース含有バイオマスの糖化反応に用いることによって、長時間の糖化反応においてもβグルコシダーゼを安定的に供給することができ、反応系におけるβグルコシダーゼの活性を安定的に保持することができ、糖化効率を維持できる。
　以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
（１）βグルコシダーゼ
　「βグルコシダーゼ」とは、糖のβ－グルコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素を意味する。βグルコシダーゼはセロビオースの分解活性が高いことを特徴とし、係る酵素の活性（Ｕ：ユニット）は、財団法人バイオインダストリー協会が標準化した酵素活性測定法「新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発（先導技術開発）／酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究平成２０年度～平成２３年度のうち平成２２年度分中間年報」に従って測定、定義することができる。具体的には、２０ｍＭセロビオースを含む５０ｍＭ酢酸バッファー５００μＬ中で酵素希釈液１００μＬ用いて反応を行い、１０分後に０．５Ｍ水酸化ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、セロビオースから遊離したグルコースを定量することでβグルコシダーゼ活性を測定することができる。酵素活性の算出は、１分間あたり１μｍｏｌのセロビオースを加水分解する活性が１Ｕと定義される。また、βグルコシダーゼ活性のもう一つの指標となるｐＮＰＧ分解活性として、ｐ－ニトロフェニルβグルコピラノシド（ｐＮＰＧ）を基質とし、５０℃、１分間において１μモルの基質を加水分解する活性が１Ｕとして定義される。
（２）パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ
　本発明における「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ」は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するβグルコシダーゼであり、セロビオース分解活性を示すものである。Ｋｅｎｇｅｎら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３，３０５－３１２，１９９３年）によって初めて単離精製された酵素である。パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは、ＳＤＳなどの界面活性剤を含まない水溶液中でホモ４量体（分子量は約２３０ｋＤａ）を形成して存在する（Ｋｅｎｇｅｎら、上掲；Ｂａｕｅｒ　ＭＷ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，３９，２３７４９－２３７５５（１９９６））。また、ＳＤＳなどの界面活性剤によって、この４量体を破壊することができ、各単量体は約５８ｋＤａであることが確認されている（Ｋｅｎｇｅｎら、上掲）。さらに、当該βグルコシダーゼの至適ｐＨは５．０、等電点は４．４、反応最適温度は１０２－１０５℃と確認されている（Ｋｅｎｇｅｎら、上掲）。配列番号２で示される「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ」のアミノ酸配列は、Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２４，７１０５－７１１１，１９９５年）に同定されたアミノ酸配列に基づくものであり、配列番号２に示されるアミノ酸配列はその最初のメチオニンを除去したものである。この同定されたアミノ酸配列に基づく分子量は、約５４ｋＤａ（５４．５８ｋＤａ）と確認されている（Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔら、上掲）。
　本発明における「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ」には、形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示す限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入などのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。ここで「１又は数個」とは例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。また、アミノ酸変異は、置換、欠失、付加及び挿入のいずれであってもよく、２種類以上の変異態様を同時に含んでいてもよい。
　さらに、本発明における「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ」には、形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示す限り、配列番号２で示されるアミノ酸配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も含まれる。
（３）コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子
　本発明における「コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子」とは、上記「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ」をコードする遺伝子において、一又は複数のコドンが、そのコードするアミノ酸が変化することなく別のコドンに改変された塩基配列を有する遺伝子を意味する。
　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子としては、配列番号３に示される塩基配列からなるものが挙げられる（Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔら、上掲）。また、本発明において「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子」には、形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すタンパク質をコードする限り、配列番号３に表される塩基配列において、１～１００個の塩基、好ましくは１～５０個の塩基、より好ましくは１～１０個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列からなるものも含まれる。さらに、本発明において「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子」には、形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すタンパク質をコードする限り、配列番号３に表わされる塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるものも含まれる。塩基配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。またさらに、本発明において「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子」には、形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すタンパク質をコードする限り、配列番号３で表される塩基配列の全部又は一部と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるものも含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２～６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）及び０．１～０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２～５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１～０．２×ＳＳＣ及び０．１～０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５～６５℃にて洗浄を行う条件をいう。
（４）コドン改変
　本発明における「コドン改変」とは、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子のコドンをトリコデルマ属真菌のコドン利用頻度に従って改変することを意味する。すなわち、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子において、トリコデルマ属真菌にて利用頻度の低いコドン（マイナーコドン）に該当するコドンの一部又は全てを、利用頻度の高いコドン（メジャーコドン）、より好ましくは最も利用頻度の高いコドンに改変することを意味する。このコドン改変により、野生型遺伝子を用いた場合にはトリコデルマ属真菌で発現させることができないパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを、トリコデルマ属真菌にて発現させることができる。
　グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）の略号を用いて標記される、以下のメジャーコドンへの改変が、トリコデルマ属真菌での発現量を高めることができるためより好ましく用いられる。すなわち、フェニルアラニンはＵＵＣ、ロイシンはＣＵＣ、イソロイシンはＡＵＣ、バリンはＧＵＣ、セリンはＡＧＣ、プロリンはＣＣＣ、トレオニンはＡＣＣ、アラニンはＧＣＣ、チロシンはＵＡＣ、ヒスチジンはＣＡＣ、グルタミンはＣＡＧ、アスパラギンはＡＡＣ、リジンはＡＡＧ、アスパラギン酸はＧＡＣ、グルタミン酸はＧＡＧ、システインはＵＧＣ、アルギニンはＣＧＣ、グリシンはＧＧＣにそれぞれ改変されることが好ましい。改変されるコドンはマイナーコドンに該当する全てのコドンであってもよいし、一部のコドンであってもよい。パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをトリコデルマ属真菌にて効率的に発現させることから、より好ましくは、マイナーコドンに該当する１以上のコドンを、更に好ましくは全てを上記メジャーコドンに改変することが好ましい。
　また、トリコデルマ属真菌での発現量をより高めることができるため、コドンの改変は、アデニン（Ａ）やウラシル（Ｕ）を、対応するアミノ酸が変化しない範囲においてグアニン（Ｇ）やシトシン（Ｃ）に改変することが好ましい。特に各アミノ酸をコードする各コドンの第３番目にあるアデニンやウラシルを、対応するアミノ酸が変化しない範囲においてグアニンやシトシンに改変するサイレント変異が用いられることが好ましい。
　なかでも、野生型遺伝子を用いた場合にはトリコデルマ属真菌で発現させることができないパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現可能とするため、ロイシン対応コドンＵＵＡが上記トリコデルマ属真菌におけるロイシン対応メジャーコドンに改変されることが好ましい。また、ロイシン対応コドンＵＵＡの改変に加え、更に、バリン対応コドンＧＵＡ、リジン対応コドンＡＡＡ、イソロイシン対応コドンＡＵＡ、ロイシン対応コドンＣＵＡ、セリン対応コドンＡＧＵ、アルギニン対応コドンＡＧＡのうち、少なくとも一つ以上のコドンがさらに、それぞれ上記トリコデルマ属真菌における対応メジャーコドンに改変されることが好ましい。パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼの細胞内での発現量をより高めるため、トレオニン対応コドンＡＣＡ、プロリン対応コドンＣＣＡ、アラニン対応コドンＡＧＣ、チロシン対応コドンＡＵＡ、ヒスチジン対応コドンＣＡＵ、グルタミン対応コドンＣＡＡ、アスパラギン酸対応コドンＡＡＵ、グルタミン酸対応コドンＧＡＡ、アルギニン対応コドンＡＧＧのうち、少なくとも一つ以上のコドンが更に、それぞれ上記トリコデルマ属真菌における対応メジャーコドンに改変されることが好ましい。
　本発明におけるコドンの改変方法としては、ＰＣＲ法を用いた変異導入法や、遺伝子合成などの手法が用いられる。
　本発明における「コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子」としては、配列番号１に示す塩基配列からなるものが挙げられる。配列番号１に示す塩基配列は、配列番号３に示すパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ野生型遺伝子（最初のメチオニンを除き、終止コドンを含む全４７２個のコドン）に対し、終止コドンを含む３０２個のコドンを改変した、コドン改変型遺伝子の一例であり、すべてのアミノ酸対応コドンをトリコデルマ属真菌における最頻出のメジャーコドンに改変したものである。具体的には、プロリン対応コドン（ＣＣＵ、ＣＣＡ、又はＣＣＧ）はＣＣＣに、バリン対応コドン（ＧＵＵ、ＧＵＡ、又はＧＵＧ）はＧＵＣに、アスパラギン対応コドンＡＡＵはＡＡＣに、リジン対応コドンＡＡＡはＡＡＧに、ヒスチジン対応コドンＣＡＵはＣＡＣに、イソロイシン対応コドン（ＡＵＵ、又はＡＵＡ）はＡＵＣに、アラニン対応コドン（ＧＣＵ、ＧＣＡ、又はＧＣＧ）はＧＣＣに、グリシン対応コドン（ＧＧＵ、ＧＧＡ、又はＧＧＧ）はＧＧＣに、ロイシン対応コドン（ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ、又はＣＵＧ）はＣＵＣに、フェニルアラニン対応コドンＵＵＵはＵＵＣに、セリン対応コドン（ＵＣＵ、ＵＵＣ、ＵＣＡ、又はＡＧＵ）はＡＧＣに、トレオニン対応コドン（ＡＣＵ、又はＡＣＡ）はＡＣＣに、チロシン対応コドンＵＡＵはＵＡＣに、グルタミン対応コドンＣＡＡはＣＡＧに、アスパラギン酸対応コドンＧＡＵはＧＡＣに、グルタミン酸対応コドンＧＡＡはＧＡＧに、システイン対応コドンＵＧＵはＵＧＣに、アルギニン対応コドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ、又はＣＧＵ）はＣＧＣに改変されている。
（５）トリコデルマ属真菌
　本発明において宿主として用いるトリコデルマ属真菌は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属し、セルラーゼを生産する能力を有していれば特に制限はない。好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）である。また、トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株を利用してもよい。好ましくはトリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ９４１４株、ＰＣ－３－７株、ＱＭ９１２３株、ＲｕｔＣ－３０株、ＣＬ－８４７株、ＭＣＧ７７株、ＭＣＧ８０株及びこれらの派生株である。
（６）トリコデルマ属真菌細胞へのコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子の導入
　トリコデルマ属真菌細胞への遺伝子導入は、相同組み換え又は非相同組み換えの手法を用いて行うことができる。相同組み換えの場合、組み換えターゲットとなる遺伝子はセルラーゼ誘導時に発現する遺伝子であれば特に制限はないが、トリコデルマ属真菌のセルラーゼ遺伝子やキシラナーゼ遺伝子部位への相同組み換え、特にセロビオハイドラーゼ遺伝子部位への相同組み換えが好ましい。これら遺伝子部位へ、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子を相同組み換えにより導入することによって、当該遺伝子の高い発現を得ることができる。また、トリコデルマ属真菌のエンドグルカナーゼ遺伝子部位への相同組み換えも好ましい。エンドグルカナーゼ遺伝子部位への相同組み換えは、セロビオハイドラーゼ遺伝子部位への相同組み換えと比較して、トリコデルマ属真菌に由来するセロビオハイドラーゼ活性が低下せず、結果としてバイオマス分解活性の低下が少ないことから好ましい。いずれもトリコデルマ属真菌の内因性のキシラナーゼ遺伝子、セロビオハイドラーゼ遺伝子、又はエンドグルカナーゼ遺伝子のプロモーターやターミネーターがそのまま利用できるよう、ターゲットとなる遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、ターミネーターなどと連結した、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を用いた相同組み換えが行われることが好ましい。
　非相同組み換えの場合、組み換えターゲットとなる遺伝子に特に制限はない。非相同組み換えでは、セルラーゼ遺伝子の欠損がほぼ起きないことから、結果としてバイオマス分解活性の低下が少ない場合がある。非相同組み換えを行う場合、「パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子」を発現させるため、プロモーターやターミネーターを連結した遺伝子が用いられる。
（７）遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現し、発現されたβグルコシダーゼはすぐに分泌されず細胞内に一旦蓄積・保持され、その後徐々に分泌することができる。細胞内に蓄積・保持された発現されたβグルコシダーゼは糖化反応系内においてもその安定性が維持される。これによって当該遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞を糖化反応に用いることによって、βグルコシダーゼを安定的に供給することができ、長時間（３０分よりも長い時間、例えば、６０分以上、１２０分以上）の糖化反応においても、反応系におけるβグルコシダーゼの活性を低下させることなく、糖化率を顕著に向上させることができる。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、発現したβグルコシダーゼのうち活性レベルで、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上のβグルコシダーゼをすぐに分泌することなく細胞内に蓄積・保持する。細胞内に蓄積されるβ－グルコシダーゼの割合を増やすため、強力なプロモーター制御下でパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現させ、発現量が分泌量を上回ることが好ましい。セルロースなどセルラーゼ誘導物質存在下で強力なプロモーターとして機能する、セロビオハイドラーゼ１，２遺伝子プロモーターやエンドグルカナーゼ遺伝子プロモーターが好適に用いられる。これら以外の、比較的弱いプロモーター制御下で発現させた場合、細胞内に蓄積されるβ－グルコシダーゼの割合は低下する。また、培養時のｐＨを８以下、より好ましくは６以下に制御することによって、細胞内のβ－グルコシダーゼの割合を高く維持することもできる。培養時のｐＨが８より高い状態で培養が行われると、細胞内のβ－グルコシダーゼの割合が低下し、細胞外のβ－グルコシダーゼの割合が高まる。
　細胞内に蓄積・保持されたβグルコシダーゼ活性は、培養状態の濃度に換算して６Ｕ／ｍＬ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以上である。比活性は５Ｕ／ｍｇ以上、好ましくは１０Ｕ／ｍｇ以上である。
　細胞内に蓄積・保持したβグルコシダーゼの定量は、培養上清を除去した培養細胞を緩衝液で洗浄、懸濁し、７０℃で６０分保温することで細胞を破砕、上清に抽出したβグルコシダーゼ活性を測定することで定量できる。βグルコシダーゼの活性（Ｕ：ユニット）は、先に示した財団法人バイオインダストリー協会が標準化した酵素活性測定法に従って測定、活性を定義することができる。タンパク質の定量はＢＣＡ法やＢｒａｄｆｏｒｄ法など定法により定量することができる。
　細胞外に分泌されたβグルコシダーゼの定量は、培養上清のβグルコシダーゼ活性を測定することで定量できる。
　培養液に生産されたβグルコシダーゼの定量は、培養液のβグルコシダーゼ活性を測定することで定量できる。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、セルロース含有バイオマスから水溶性の糖を得る糖化反応に用いることができる。当該遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いることで細胞内に蓄積・保持されたβグルコシダーゼが安定的かつ長期的に供給されるために、細胞外に分泌された（培養上清中の）パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼのみを用いた糖化反応時と比較して、長時間（３０分よりも長い時間、例えば、６０分以上、１２０分以上）の糖化反応時において反応系におけるβグルコシダーゼ活性の低下が起こりにくく、結果として得られるグルコースの量が向上する。細胞外に分泌された（培養上清中の）パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼのみを用いた糖化反応時と比較して、得られるグルコース濃度は２０％以上向上する。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いた糖化反応（糖化工程）は、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌培養細胞を用いない場合と比較して、得られるグルコース濃度が向上することから、３０分よりも長い時間、好ましくは６０分以上、より好ましくは１２０分以上行われることが好ましい。糖化反応時間の上限に特に制限はなく、好ましくは４８時間、より好ましくは２４時間以内である。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いたセロビオース加水分解反応は、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌培養細胞を用いない場合と比較して、得られるグルコース濃度がより向上することから、５０℃以上、好ましくは５０℃よりも高い温度、さらに好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上、よりさらに好ましくは８０℃以上で行われることが好ましい。糖化温度の上限はパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが失活しない範囲において特に制限はなく、好ましくは１１０℃以下、より好ましくは１０５℃以下である。
　本発明のコドン改変された、４量体を形成するパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いたセロビオース加水分解反応は、４量体を形成しないパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌培養細胞を用いない場合と比較して、得られるグルコース濃度がより向上することから、５０℃以上、好ましくは５０℃よりも高い温度、さらに好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上、よりさらに好ましくは８０℃以上で行われることが好ましい。糖化温度の上限は４量体を形成するパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが失活しない範囲において特に制限はなく、好ましくは１１０℃以下、より好ましくは１０５℃以下である。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、セルラーゼと混合することで、バイオマス分解用酵素組成物としてセルロース含有バイオマスの加水分解（糖化工程）に使用することができる。ここでいうセルラーゼとは、セルロースを分解する活性を有する酵素であれば特に限定されず、一種類以上の混合物であってもよい。このような酵素としては、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼなどが挙げられる。また、本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、糖化工程と並行して発酵を行う同時糖化並行発酵に用いることもできる。
　セルロース含有バイオマスとは、少なくともセルロースを含むものであれば限定されない。具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。これらセルロース含有バイオマスは、高分子芳香族化合物リグニンやヘミセルロースなどの不純物が含まれているが、前処理として、酸、アルカリ、加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを部分的に分解したセルロース含有バイオマスを、セルロースとして利用してもよい。
（８）培養
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞の培養方法に特に制限はなく、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが発現可能であればよい。コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子が、セロビオハイドラーゼなどセルラーゼ遺伝子座に相同組み換えがされている場合や、セルラーゼ遺伝子プロモーターの制御下にある場合、セルロース、キシラン、ラクトース、ソルボースやソホロースなどを含むセルラーゼを誘導する物質が培養に用いられる。セロビオハイドラーゼ１（ｃｂｈ１）やセロビオハイドラーゼ２（ｃｂｈ２）など、固体セルロースの分解において重要なセルラーゼをコードする遺伝子座で相同組換えが行われている場合、固体セルロースの分解効率が低下し、培養中に誘導物質となる可溶性のセロオリゴ糖の遊離濃度は大幅に低下する。そのため、満足な誘導がなされない場合もある。そのため、効率的な誘導を行うためには、可溶性の誘導物質であるソルボース、ソホロースやラクトース、セロビオースなどが一般的に用いられる。
　窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、CSL、大豆かすなどが用いられる。その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３１℃であり、培養時間は、通常、３～１０日、好ましくは４～９日である。
　本発明のコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞の培養上清中には、組み換え発現されたパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼに加え、トリコデルマ属真菌内因性βグルコシダーゼ、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼなどのセルラーゼ群が含まれている。この培養上清を糖化酵素として利用し、本発明の遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞と共にセルロース含有バイオマスの糖化に用いてもよい。セルロース含有バイオマスの糖化率を向上させるため、本発明の遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞の培養上清中には、βグルコシダーゼ活性を０．１Ｕ／ｍＬ以上（好ましくは０．３Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは０．９Ｕ／ｍＬ以上）、アビセル分解活性を２Ｕ／ｍＬ以上（好ましくは４Ｕ／ｍＬ以上）有していることが好ましい。一方、本発明の遺伝子導入されたトリコデルマ属真菌細胞内には、βグルコシダーゼ活性を６Ｕ／ｍＬ以上（好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以上）有していることが好ましい。
　以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子の相同組み換え用ＤＮＡの調製
　配列番号１に示す、トリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を、合成遺伝子として調製した。
　コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子をトリコデルマ属真菌のｃｂｈ１（セロビオハイドラーゼ１）遺伝子座に相同組み換えにより導入するための相同組換え用ＤＮＡ（配列番号４で表される）を作製した。ここで配列番号４に示される塩基配列において、１～２１６５番目の塩基はトリコデルマ属糸状菌由来のセロビオハイドラーゼ１遺伝子のプロモーターを含む上流領域、２１６６～２２１９番目の塩基はセロビオハイドラーゼ１遺伝子の分泌シグナル領域、２２２０～３６３５番目の塩基は配列番号１に示すコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子、３６３６～４７３０番目の塩基はセロビオハイドラーゼ１遺伝子のターミネーター領域１、４７３１～５７３７番目の塩基はａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子の上流領域、５７３８～７６３７番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子、７６３８～７８１７番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子の下流領域、７８１８～９９５１番目の塩基はセロビオハイドラーゼ１遺伝子のターミネーター領域２をそれぞれ示す。各領域の連結部には、制限酵素認識サイトが設けられている。
　また、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子をトリコデルマ属真菌のｅｇｌ１（エンドグルカナーゼ１）遺伝子座に相同組み換えにより導入するための相同組換え用ＤＮＡ（配列番号５で表される）を作製した。ここで配列番号５に示される塩基配列において、１～２３３０番目の塩基はトリコデルマ属糸状菌由来のエンドグルカナーゼ１遺伝子のプロモーターを含む上流領域とＮ末端領域、２３３１～３７４６番目の塩基は配列番号１に示すコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子、３７４７～４０５５番目の塩基はエンドグルカナーゼ１遺伝子のターミネーター領域１、４０５６～５０６２番目の塩基はａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子の上流領域、５０６３～６９６２番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子、６９６３～７１４２番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子の下流領域、７１４３～９５９１番目の塩基はエンドグルカナーゼ１遺伝子のターミネーター領域２をそれぞれ示す。各領域の連結部には、制限酵素認識サイトが設けられている。
　さらに、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子をトリコデルマ属真菌のｅｇｌ３（エンドグルカナーゼ３）遺伝子座に相同組み換えにより導入するための相同組換え用ＤＮＡ（配列番号６で表される）を作製した。ここで配列番号６に示される塩基配列において、１～１７１４番目の塩基はトリコデルマ属糸状菌由来のエンドグルカナーゼ３遺伝子の上流領域、１７１５～１８９４番目の塩基はａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子の下流領域（逆向き）、１８９５～３７９４番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子（逆向き）、３７９５～４８０１番目の塩基はアセトアミダーゼ遺伝子の上流領域（逆向き）、４８０２～６６９５番目の塩基はエンドグルカナーゼ３遺伝子のプロモーターを含む上流領域とＮ末端領域、６６９６～８１１１番目の塩基は配列番号１に示すコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子、８１１２～１０３１５番目の塩基はエンドグルカナーゼ３遺伝子のターミネーター領域をそれぞれ示す。各領域の連結部には、制限酵素認識サイトが設けられている。
（実施例２）パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現するトリコデルマ属真菌細胞の作製
　実施例１で構築した相同組み換え用ＤＮＡを、それぞれトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株およびＱＭ９４１４株に導入した。導入は、プロトプラストＰＥＧ法で行った。形質転換体をアセトアミド資化能選択培地で選抜した。培地の組成は次の通りである。
　２％グルコース、１．１Ｍソルビトール、２％ａｇａｒ、０．２％ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ５．５）、０．０６％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０６％ＣｓＣｌ２、０．０６％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０６％アセトアミド溶液、０．１％トレースエレメント。
　なお、トレースエレメントの組成は次の通りである。６ｍｇ　Ｈ３ＢＯ３、２６ｍｇ　（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、８ｍｇ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ　ＺｎＣｌ２を蒸留水で１００ｍｌにメスアップしたもの。
　得られた形質転換体について、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子のゲノム上への挿入を、ＰＣＲ法を用いて確認した。その結果、配列番号４に示すｃｂｈ１（セロビオハイドラーゼ１）相同組み換え用ＤＮＡを用いた形質転換において、ＰＣ－３－７株を親株として４株の形質転換体（Ｂ－１２，Ｂ－１５，Ｂ－１８，Ｂ－２０）を、ＱＭ９４１４株を親株として４株の形質転換体（Ｂ－３，Ｂ－９，Ｂ－１０，Ｂ－１２）を得た。各形質転換体のｃｂｈ１遺伝子をＰＣＲにより増幅し、相同組み換えと非相同組み換えの判定を行った結果、１株がｃｂｈ１遺伝子非相同組み換え株（ＱＭ９４１４株を親株とするＢ－１２株）であり、残りの７株は全てｃｂｈ１遺伝子への相同組み換え株であった。
　また、配列番号５に示すｅｇｌ１（エンドグルカナーゼ１）相同組み換え用ＤＮＡを用いた形質転換において、ＰＣ－３－７株を親株とした形質転換体（Ｅ１－１０）を得た。
　さらに、配列番号６に示すｅｇｌ３（エンドグルカナーゼ３）相同組み換え用ＤＮＡを用いた形質転換において、ＰＣ－３－７株を親株とした形質転換体（Ｅ３－１１）を得た。
　得られた各形質転換体、ならびにＰＣ－３－７株およびＱＭ９４１４株の各胞子約１０５個を、トリコデルマ・リーセイ用液体培地６ｍＬを含む５０ｍＬ三角フラスコに植菌し、２００ｒｐｍで５日間、２８℃にて培養し、各トリコデルマ属真菌細胞を含む培養液を得た。トリコデルマ・リーセイ用液体培地組成は以下の通りである。５％パルプ、０．１４％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．０３％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０３％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１％Ｂａｃｔｏ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ、０．０５％Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１％Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ、ｐＨ４．０　終濃度で５０ｍＭ　Ｔａｒｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ。
　各培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培養上清と細胞とに分離した。細胞は酢酸ナトリウムバッファーで洗浄した後、７０℃で１時間保温し、細胞内のパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを上清に抽出した。
（実施例３）分子量の測定
　実施例２で作製した、ＰＣ－３－７株を親株として、配列番号４に示すｃｂｈ１（セロビオハイドラーゼ１）相同組み換え用ＤＮＡを用いて得られた形質転換体Ｂ－２０株を用いて、ゲル濾過により、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼの分子量を測定し、４量体を形成していることを確認した。
　ゲル濾過カラムにはｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００を用い、分子量既知のタンパク質の溶出時間から分子量を推定した。パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼの分子量は約２６４ｋＤａであり、４量体を形成していることが確認された。
（実施例４）タンパク質濃度、βグルコシダーゼ活性、ｐＮＰＧ分解活性、アビセル分解活性の測定
　非形質転換体、ならびに実施例２で作製した各形質転換体について培養し、経時的に培養上清のタンパク質量、βグルコシダーゼ活性、ｐＮＰＧ分解活性、アビセル分解活性、細胞内βグルコシダーゼ活性、及び細胞抽出液のタンパク質濃度を測定した。
　タンパク質濃度、βグルコシダーゼ活性、ｐＮＰＧ分解活性、アビセル分解活性の測定は、以下の手法により行った。
　タンパク質濃度測定にはＢＣＡ法を用い、ＢＳＡを標準品としてタンパク質濃度を定量した。
　βグルコシダーゼ活性は、上記財団法人バイオインダストリー協会が標準化した酵素活性測定法に従って測定・定義した。具体的には、２０ｍＭセロビオースを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー５００μＬ中で酵素希釈液１００μＬ用いて５０℃で反応を行い、１０分後に０．５Ｍ水酸化ナトリウム５０μＬを加えて反応を停止させ、セロビオースから遊離したグルコースを定量することでβグルコシダーゼ活性を測定した。グルコースの定量にはグルコーステストワコーを用い、１分間あたり１μｍｏｌのセロビオースを加水分解する活性を１Ｕと定義した。
　ｐＮＰＧ分解活性は、上記財団法人バイオインダストリー協会が標準化した酵素活性測定法に従って測定・定義した。具体的には、１ｍＭｐＮＰＧを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー５００μＬ中で酵素希釈液１００μＬ用いて５０℃で反応を行い、１０分後に１Ｍ炭酸ナトリウム５００μＬを加えて反応を停止させ、ｐＮＰＧから遊離したｐＮＰを定量することでｐＮＰＧ分解活性を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐＮＰＧを加水分解する活性を１Ｕと定義した。
　アビセル分解活性は、１％アビセルを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー５００μＬ中に酵素希釈液を５μＬ加え、酵素希釈液５μＬ用いて５０℃で反応を行い、１時間後にフィルター濾過して反応を停止させ、アビセルから遊離したグルコースを定量することでアビセル分解活性を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのグルコースを遊離する活性を１Ｕと定義した。
　ＱＭ９４１４株（非形質転換体）とその形質転換体（Ｂ－３，Ｂ－９，Ｂ－１０，Ｂ－１２）について、培養終了時のβグルコシダーゼ活性、アビセル分解活性、細胞内βグルコシダーゼ活性、及び細胞抽出液のタンパク質濃度を以下の表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　続いて、ＰＣ－３－７株（非形質転換体）とその形質転換体（Ｂ－１２，Ｂ－１５，Ｂ－１８，Ｂ－２０）について、培養終了時のβグルコシダーゼ活性、アビセル分解活性、細胞内βグルコシダーゼ活性、及び細胞抽出液のタンパク質濃度を以下の表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を導入することで、培養上清のβグルコシダーゼ活性と比活性は野生株の５倍以上となり、細胞内βグルコシダーゼ活性は野生株の３００倍以上（比活性は２００倍以上）になった。βグルコシダーゼ活性の総量は、野生株の２５～２００倍になった。培養液中に含まれるβグルコシダーゼのほとんどは、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼであると推定された。また、細胞内のβグルコシダーゼ活性は、細胞外（培養上清）のβグルコシダーゼ活性と比べて高く、主に細胞内にパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは蓄積しており、βグルコシダーゼ活性の８０％～９８％が細胞内に存在していた。
　また、ｃｂｈ１遺伝子座での相同組み換えを有する形質転換体は、培地中の固体セルロースの分解効率の低下や、誘導能の高いセロビオースの遊離濃度が大幅に低下してしまい、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが誘導されないことも予想されたが、固体セルロースであるパルプを用いた培養においても充分な量のパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが生産できた。
　ＰＣ－３－７株（非形質転換体）とｅｇｌ１遺伝子座およびｅｇｌ３遺伝子座における形質転換体（Ｅ１－１０、Ｅ３－１１）について、培養終了時の細胞上清および細胞内のｐＮＰＧ分解活性とタンパク質濃度を以下の表３にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　エンドグルカナーゼ１およびエンドグルカナーゼ３（ｅｇｌ１，ｅｇｌ３）遺伝子座への４量体形成パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼ遺伝子の組換えにおいても、その活性の大半は細胞内に蓄積していた。
（比較例１）コドン改変していない（野生型）、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子の相同組み換え用ＤＮＡの調製と形質転換トリコデルマ属真菌の作製
　配列番号３に示す野生型パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を合成遺伝子として調製した。
　また、この野生型パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子をｃｂｈ１（セロビオハイドラーゼ１）遺伝子座により導入するための相同組み換え用ＤＮＡ（配列番号７で表される）を調製した。パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子のコドンが改変されていない（野生型）ことを除き、配列番号４で表される相同組み換え用ＤＮＡと同一である。
　得られた相同組み換え用ＤＮＡを用いて、ＱＭ９４１４株を親株とし実施例２と同じ手法により形質転換体（Ｂ－４１，Ｂ－４５）を得た。得られた形質転換体を、実施例２と同じ手法により培養し、培養終了時のβグルコシダーゼ活性、アビセル分解活性、細胞内βグルコシダーゼ活性、及び細胞抽出液のタンパク質濃度を実施例４と同じ手法により測定した。結果を以下の表４にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　コドン改変していない野生型パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を導入した形質転換体の培養液および培養細胞では、上記表１に示す非形質転換体と同等レベルのβグルコシダーゼ活性が検出されるのみであり、すなわちパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ由来の活性は全く検出されなかった。
（実施例５）コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いた酵素反応
　実施例４で作製したＰＣ３－７株を親株とするＢ－１５株の培養上清又は、当該形質転換体を含む培養液を用いて酵素反応を行った。
　培養上清と培養液とをそれぞれ酢酸バッファーで希釈し、ほぼ同じ活性のβグルコシダーゼを用いてセロビオース分解反応を行った。経時的にサンプリングし、１０分後、３０分後、６０分後、１２０分後の反応液中に生成したグルコース濃度を定量した。結果を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　形質転換体を含まない培養上清と比較して、同じ酵素活性（Ｕ）の形質転換体を含む培養液を用いて反応を行った場合、３０分経過時は１１～１４％、６０分経過時は２７～２８％、１２０分経過時は２２～２３％、得られるグルコースの濃度が向上していた。このことから、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を含む酵素液は、３０分よりも長い時間、特に６０分以上の長時間の糖化反応において、反応系における酵素活性が安定しており、結果として得られるグルコース量を向上できることがわかった。
（実施例６）高温における、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞を用いた酵素反応
　実施例５と同様の実験を、投入するβグルコシダーゼ活性と反応温度を変え、５０℃および５０℃より高温にて行った。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　形質転換体を含まない培養上清と比較して、同じ酵素活性（Ｕ）の形質転換体を含む培養液を用いて反応を行った場合、５０℃よりも高温において、より得られるグルコースの濃度が向上していた。このことから、コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を含む酵素液は、３０分よりも長い時間、特に６０分以上の長時間の糖化反応において高いグルコース収量を示すだけでなく、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃といったより高温において、さらにグルコースの収量を向上させることがわかった。
（比較例２）４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子の相同組み換え用ＤＮＡの調製と形質転換トリコデルマ属真菌の作製
　配列番号８に示す４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子を合成遺伝子として調製した。この４量体構造不安定化パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは、特許文献２（特開２０１２－３４６９０号公報）におけるＲ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ変異体と同じである。
　また、この４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子をｃｂｈ１（セロビオハイドラーゼ１）遺伝子座により導入するための相同組み換え用ＤＮＡを実施例１と同様に調製した。得られた４量体構造不安定化パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼ遺伝子の相同組換え用ＤＮＡは、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼの４カ所のアミノ酸（Ｒ１７０Ａ／Ｒ２２０Ａ／Ｙ２２７Ｆ／Ｒ４４８Ｇ）に相当する塩基配列が変異していることを除き、配列番号４で表される相同組み換え用ＤＮＡと同一である。
　得られた相同組み換え用ＤＮＡを用いて、ＱＭ９４１４株を親株とし実施例２と同じ手法により、４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現する形質転換体（Ｍ４－２，Ｍ４－４）を得た。実施例２と同じ手法により、これらのＭ４－２株、Ｍ４－４株、及びその親株であるＱＭ９４１４株、４量体形成パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現するＢ－９株をそれぞれ培養し、培養終了時のｐＮＰＧ分解活性、アビセル分解活性、細胞内βグルコシダーゼ活性、及び細胞抽出液のタンパク質濃度を測定した。結果を以下の表７にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現させると、細胞内への蓄積量が４量体形成パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現させた場合と比較し、１／４以下に低下した。
（実施例７）４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼ発現細胞と、４量体形成パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼ発現細胞とを用いた、高温での酵素活性の比較
　実施例２および比較例２で調製したＢ－９株、Ｍ４－２株、Ｍ４－４株、親株であるＱＭ９４１４株を用いて、培養上清および細胞抽出液の５０℃、６０℃、７０℃、８０℃および９０℃でのｐＮＰＧ分解活性を測定した。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　４量体構造が不安定化したパイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現させた細胞は、４量体形成パイロコッカス・フリオサス由来βグルコシダーゼを発現させた細胞と比較し、より高温でのｐＮＰＧ分解活性が低下しており、熱安定性が低下したことが示された。
　本発明におけるコドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されたトリコデルマ属真菌細胞は、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼを発現し、細胞内に蓄積・保持することができる。係るトリコデルマ属真菌細胞はバイオマスの加水分解および糖化反応において、細胞内に蓄積・保持されたβグルコシダーゼを安定的かつ長期的に供給することができ、反応系におけるβグルコシダーゼ活性を安定的に保持することができ、長時間の反応においてもβグルコシダーゼ活性が低下せずバイオマスの糖化率を顕著に向上させることができる。本発明に係るトリコデルマ属真菌細胞はセルロース含有バイオマスの加水分解による糖液の製造に好適に使用することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. 　トリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されている、トリコデルマ属真菌細胞であって、発現された該パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼは４量体を形成する、上記トリコデルマ属真菌細胞。
  2. 　以下の１以上のコドン改変を含むパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が導入されている、請求項１に記載の細胞：
    （１）ロイシン対応コドンのＣＵＣへの改変；
    （２）バリン対応コドンのＧＵＣへの改変；
    （３）リジン対応コドンのＡＡＧへの改変；
    （４）イソロイシン対応コドンのＡＵＣへの改変；
    （５）セリン対応コドンのＡＧＣへの改変；
    （６）アルギニン対応コドンのＣＧＣへの改変；
    （７）トレオニン対応コドンのＡＣＣへの改変；
    （８）プロリン対応コドンのＣＣＣへの改変；
    （９）アラニン対応コドンのＧＣＣへの改変；
    （１０）チロシン対応コドンのＵＡＣへの改変；
    （１１）ヒスチジン対応コドンのＣＡＣへの改変；
    （１２）グルタミン対応コドンのＣＡＧへの改変；
    （１３）アスパラギン酸対応コドンのＧＡＣへの改変；
    （１４）グルタミン酸対応コドンのＧＡＧへの改変；
    （１５）フェニルアラニン対応コドンのＵＵＣへの改変；
    （１６）アスパラギン対応コドンのＡＡＣへの改変；
    （１７）システイン対応コドンのＵＧＣへの改変；及び
    （１８）グリシン対応コドンのＧＧＣへの改変。
  3. 　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、
    （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
    （ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド；あるいは
    （ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド、
    を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞。
  4. 　コドン改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を含む、請求項１又は２に記載の細胞。
  5. 　発現したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、細胞内に蓄積されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞。
  6. 　発現したパイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼのうち、βグルコシダーゼ活性として５０％以上が細胞内に蓄積されている、請求項５に記載の細胞。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞及びセルラーゼを作用させて、セルロース含有バイオマスを加水分解する工程を含む、該バイオマスより糖液を製造する方法。
  8. 　セルロース含有バイオマスを加水分解する工程が、３０分よりも長く行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 　セルロース含有バイオマスを加水分解する工程が、５０℃以上で行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 　トリコデルマ属真菌にて利用頻度の高いコドンに改変された、パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼをコードする遺伝子。
  11. 　以下の１以上のコドン改変を含む、請求項１０に記載の遺伝子：
    （１）ロイシン対応コドンのＣＵＣへの改変；
    （２）バリン対応コドンのＧＵＣへの改変；
    （３）リジン対応コドンのＡＡＧへの改変；
    （４）イソロイシン対応コドンのＡＵＣへの改変；
    （５）セリン対応コドンのＡＧＣへの改変；
    （６）アルギニン対応コドンのＣＧＣへの改変；
    （７）トレオニン対応コドンのＡＣＣへの改変；
    （８）プロリン対応コドンのＣＣＣへの改変；
    （９）アラニン対応コドンのＧＣＣへの改変；
    （１０）チロシン対応コドンのＵＡＣへの改変；
    （１１）ヒスチジン対応コドンのＣＡＣへの改変；
    （１２）グルタミン対応コドンのＣＡＧへの改変；
    （１３）アスパラギン酸対応コドンのＧＡＣへの改変；
    （１４）グルタミン酸対応コドンのＧＡＧへの改変；
    （１５）フェニルアラニン対応コドンのＵＵＣへの改変；
    （１６）アスパラギン対応コドンのＡＡＣへの改変；
    （１７）システイン対応コドンのＵＧＣへの改変；及び
    （１８）グリシン対応コドンのＧＧＣへの改変。
  12. 　パイロコッカス・フリオサス由来のβグルコシダーゼが、
    （ｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；
    （ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド；あるいは
    （ｉｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ形成する４量体構造が不安定化せず、かつセロビオース分解活性を示すポリペプチド、
    を含む、請求項１０又は１１に記載の遺伝子。
  13. 　配列番号１に示される塩基配列を含む、請求項１０又は１１に記載の遺伝子。
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