CN103958677A - 新的纤维二糖水解酶 - Google Patents

新的纤维二糖水解酶 Download PDF

Info

Publication number
CN103958677A
CN103958677A CN201280052603.5A CN201280052603A CN103958677A CN 103958677 A CN103958677 A CN 103958677A CN 201280052603 A CN201280052603 A CN 201280052603A CN 103958677 A CN103958677 A CN 103958677A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellobiohydrolase
family
separation
seq
catalyst structure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280052603.5A
Other languages
English (en)
Inventor
J·蒙塔利特
L·古达内特-塞维奇
C·希尔
C·D·欣德利
J·A·拉维尼
N·玛斯里
F·塔罕
J·J·托马舍克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iogen Energy Corp
Original Assignee
Iogen Energy Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iogen Energy Corp filed Critical Iogen Energy Corp
Publication of CN103958677A publication Critical patent/CN103958677A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了分离的纤维二糖水解酶，其包含修饰的糖苷水解酶（GH）家族7催化结构域、GH家族7催化结构域和修饰的家族1碳水化合物结合模块（CBM）、或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM。这类分离的纤维二糖水解酶展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸45%-约99.9%的氨基酸序列同一性，并且对处理底物活性提高。还提供了用于表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体和遗传修饰的微生物，产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，包含所述分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物以及用这类纤维素酶的酶混合物水解纤维质底物的方法。

Description

新的纤维二糖水解酶
技术领域
本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的糖基水解酶家族7的纤维二糖水解酶。本发明还涉及包含编码分离的纤维二糖水解酶的核苷酸序列的遗传构建体，用于从宿主菌株产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，以及所述分离的纤维二糖水解酶在纤维素水解中的用途。
背景技术
木质纤维素原料有希望替代玉米淀粉用于生产燃料乙醇。这些原材料可广泛获得、廉价，并且一些研究已经得出结论：纤维素乙醇产生接近于零的温室气体排放。
然而，这些原料不能被轻易降解成其复合糖分子。可以通过物理和/化学预处理来部分克服木质纤维素的难降解的问题。化学预处理的实例是在稀硫酸的存在下进行蒸汽爆破（美国专利No.4,461,648）。该方法去除了大部分半纤维素，但是几乎没有纤维素转化成葡萄糖。然后，预处理的材料可以被纤维素酶水解。
术语纤维素酶广义上是指催化纤维素聚合物中连接个体葡萄糖单元的β-1,4糖苷键的水解的酶。纤维素酶属于更大的糖基水解酶（GH）组，所述糖基水解酶组由基于结构同源性的家族（family）或部族（clan）组织而成（Davies and Henrissat,1995,Structure15:853;CarbohydrateActive Enzymes database,Cantarel et al.,2009,Nucleic Acids Res.,37:D233）。超过100个GH酶家族的成员的更新数据库可见于URL:www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases/html。GH包括催化其他寡糖和多糖的水解的酶（例如葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖苷酶等）。
纤维素转化成葡萄糖涉及内切葡聚糖酶（E.C.3.2.1.4）、纤维二糖水解酶（E.C.3.2.1.91）和β-葡糖苷酶（E.C.3.2.1.21）的协同作用（Henrissat et al,1994;Knowles et al.,1987;Lynd et al.,2002;Teeri,1997;Wood and Garcia-Campayo,1990;Zhang and Lynd,2004）。内切葡聚糖酶水解纤维素链中部的易接近的糖苷键，而纤维二糖水解酶从这些链的末端持续地释放纤维二糖。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，从而使纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的产物抑制降到最低。
虽然纤维素酶驱使纤维素水解成葡萄糖，但是已经发现了能够提高纤维素酶系统的效率的另外的酶。这些酶可包括降解木聚糖和生物质中的其他半纤维素材料的半纤维素酶（Maheshwari et al.,2000,MicrobiolMol Biol Rev.64:461）；使纤维素结构重排的膨胀因子（swollenin）和扩展因子（expansin）（Saloheimo et al,2002,Eur.J.Biochem.269:4202;Sampedro and Cosgrove,2005,Genome Biol.6:242）；以及部分表征或未表征的活性例如GH家族61酶（Harris et al.,2010,Biochemistry49:3305）和纤维素诱导的蛋白（CIP—Foreman et al.,2003,J.Biol.Chem.278:31988）。用于转化木质纤维素底物的高效纤维素酶系统将根据生物质的组成和处理条件纳入这些酶的全部或任何一种（Henrissat et al.,1985,Bio/technology3:722；Baker et al.,1998,Appl.Biochem.Biotechnol.70-72:395；Boisset et al.,2001,Biotechnol.Bioeng.72:339;Berlin et al.,2007,Biotechnol.Bioeng.97:287；Gusakov et al.,2007,Biotechnol.Bioeng.97:1028;WO2008/025165；WO2009/026722；Meyeret al.,2009,J.Cereal Sci.50:337）。
纤维素酶——以及其他GH酶——具有共同的总体结构和催化机制（Teeri et al.,1992,Biotechnology21:417）。所有GH酶具有催化结构域（CD），并且该结构域的具体结构决定其GH家族命名，有超过100个GH家族命名。已经鉴定了GH的两种常见的催化机制，并且来自给定的家族的所有酶将具有共同的机制（McCarter and Withers,1994,Curr.Opin.Struct.Biol.4:885；Zechel and Withers,2000,Acc.Chem.Res.33:11）。能够保留还原端的异头构型的保留型酶（retaining enzyme）通过双重置换反应进行水解，其中靶键的还原侧首先被置换，并被共价结合到活性位点中的酸性残基，接着进行第二次置换，通常通过水（但可能通过其他含有羟基的化合物（包括糖））来完成所述置换（White andRose,1997,Curr.Op.Struct.Biol.7:645）。可转换异头碳的构型的转换型酶（inverting enzyme）具有活化水，靶键的还原端被直接置换到所述活化水上。
纤维素酶以及许多半纤维素酶和辅助纤维素水解的酶，常常具有碳水化合物结合模块（CBM），在纤维素酶的情形中碳水化合物结合模块也被称为纤维素结合结构域（CBD）。CBM的一个功能是帮助CD与底物接触。一些研究表明，某些CBM还可破坏纤维素结构，从而有利于CD的催化活性（Din et al.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:11383；Teeri et al.,1992,Biotechnology21:417）。在超过40个不同的家族中有三种常见的CBM类型。其中，Ⅰ型CBM与结晶纤维素酶的表面结合；家族1的CBM属于Ⅰ型，是来自丝状真菌的糖基水解酶中发现的唯一类型。在结构上，CBM/CBD可以几乎与CD相连，但通常这些结构域通过长度一般为10-50个残基的非结构化的（unstructured）（常常为糖基化的）连接肽连接，所述连接肽参与纤维素相互作用（Srisodsuk et al.,1993,J.Biol.Chem.268:20756）。
纤维二糖水解酶是纤维素水解的主要驱动者。这些酶与纤维素链的游离端结合，并常常持续地催化从所述链末端切割纤维二糖单元。因此，纤维二糖水解酶催化大多数从固体纤维素底物释放可溶性寡糖的反应，并且使得它们可用于进一步水解为葡萄糖。有两种主要类型的CBH（Barr et al.,1996,Biochemistry35:586）。纤维二糖水解酶2（CBH2或CBHⅡ）是从纤维素链的非还原端进行水解的转换型酶；多数CBH2酶见于GH家族6。纤维二糖水解酶1（CBH1或CBH Ⅰ）酶是从纤维素链的还原端进行水解的保留型酶；大多数CBH1见于GH家族7。CBH样酶活性存在于其他GH家族（例如家族9和48）中。CBH1和CBH2的活性及两者的协同作用占了大多数真菌系统的总纤维素酶活性的大部分。
包含家族7CD的糖苷水解酶见于真核生物（主要是真菌），包含外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶。虽然也已经报道了脱乙酰几丁质酶和木聚糖酶活性，但是GH家族7酶大多是纤维素酶。所述家族通过β-果冻卷（beta-jelly roll）核心结构来区分，许多随机螺旋形式的蛋白质通过二硫键连接在一起。与内切葡聚糖酶相比，该家族的外切葡聚糖酶具有覆盖活性位点裂缝（cleft）的肽环（peptide loop），将活性位点裂缝转变成闭合的通道，所述通道引导纤维素链通过所述活性位点残基并使得能够具有高连续性（Kleywegt et al.,1997,J Mol Biol.272:383）。所述活性位点通道或裂缝由一系列单体（在纤维素的情形中为葡萄糖）结合位点组成，所述结合位点通过糖残基和裂缝中芳香族侧链之间的环堆积相互作用来与多糖链相连。在纤维素酶的情形中，被结合的纤维素从而与活性位点处的两个酸性残基恰当地排列，所述活性位点催化所述双重置换水解。从所述催化点开始对单体结合位点进行编号，正数向纤维素链的还原端的方向进行，负数向非还末端的方向进行。因此，所述催化位点位于+1和-1位点之间，对于Cel7纤维二糖水解酶，产物结合位点为+1和+2位点，所述+1和+2位点在初始置换后被纤维二糖占据（Divne et al.,1998,J.Mol.Biol.275:309）。
纤维素酶和其他GH由许多生物产生，用于多种天然的目的。纤维素酶主要是由微生物——细菌和真菌——分泌的酶，用于从环境中获得营养素。细菌常常分泌在扩展的非共价连接的结构（称为纤维素酶小体（cellulosome））中连接在一起的酶（Fontes and Gilbert,2010,Annu RevBiochem.79:655）。真菌通常表达单独的酶，但是一些真菌例如生活在反刍动物（例如绵羊和牛）瘤胃中的那些，也可形成扩展的纤维素酶小体样的结构（Ljungdahl,2008,Ann.N.Y.Acad.Sci.1125:308）。生物体表达的确切的酶和酶比值可由其已经利用的底物和目前其正在利用的底物来确定。多数纤维素酶和半纤维素酶的表达是由与靶底物相关的小分子诱导的（Schmoll and Kubicek,2003,Acta Microbiol Immunol Hung.50:125;Mach and Zeilinger,2003,Appl Microbiol Biotechnol.60:515）。
嗜温真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）（红褐肉座菌（无性型的Hypocrea jecorina））和嗜热真菌嗜热毁丝菌（Myceliophthorathermophila）（无性型的Thielavia heterothallica）是工业使用的糖苷水解酶的主要来源。两者均分泌大量的主要包含水解酶的蛋白质，因此对工业酶而言，两者是有用的生产宿主。
里氏木霉（T.ressi）分泌两种GH家族7酶，CBH1（Cel7A）和EG1（Cel7B），其中Cel7A是主要的分泌蛋白产物。正如已经解开某些其他家族7酶的结构一样，已经解开了Cel7A和Cel7B二者的催化结构域的三维结构（Divne,et al.,1998,J.Mol.Biol.275:309-325;Kleywegt et al,1997,J.Biol.Chem.272:383-397）。嗜热毁丝菌（M.thermophila）分泌至少三种GH家族7酶。其他工业相关的纤维素酶来自真菌，包括但不限于曲霉属（Aspergillus）、毛壳霉属（Chaetomium）、金孢子菌属（Chrysosporium）、鬼伞属（Coprinus）、棒囊壳属（Corynascus）、拟层孔菌（Fomitopsis）、镰孢菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、稻温病菌属（Magnaporthe）、Melanocarpus、毁丝霉属（Myceliophthora）、链孢霉属（Neurospora）、平革菌属（Phanerochaete）、柄孢壳菌属（Podospora）、根毛霉属（Rhizomucor）、侧孢霉属（Sporotrichum）、踝节菌属（Talaromyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热真菌属（Thermomyces）和梭孢壳属（Thielavia）的种。
GH，特别是纤维素酶和半纤维素酶，在工业中具有许多有用的应用。纤维素酶在纺织工业中使用，用于生物抛光（biopolishing）、丹宁布（denim）磨损、洗涤剂应用（例如Anish et al,2007,Biotechnol Bioeng.96:48；Montazer et al,2010,Appl Biochem Biotechnol.160:2114；Shimonaka et al,2006,Biosci Biotechnol Biochem.70:1013）。葡聚糖酶和木聚糖酶在酿造和烘焙工业中用于降低粘度和改善产品质地（例如Bai et al,2010,Appl Microbiol Biotechnol.87:251）。半纤维素酶，特别是木聚糖酶，在纸浆造纸工业中用以改善漂率、改善处理效率以及改变纸张质量和属性（例如Suurnakki et al,1997,Adv Biochem EngBiotechnol.57:261）。最后，纤维素酶一直用于将纤维素水解为糖，用于发酵为有附加值的产品，特别是生物燃料和燃料级乙醇（Dashtban etal,2009,Int J Biol Sci.5:578）。因为GH家族7纤维二糖水解酶被公认为是纤维素酶系统中纤维素水解的主要驱动者，因此作出了极大的努力以使用现代分子生物学的方法来改进这些酶。
酶改进的目标取决于处理条件和酶应用的最终目的。通常的改进目标是热稳定性和亲热性，以使得酶能够在高处理温度下工作。更高的处理温度有利于提高反应速率以及降低微生物污染的可能性。另一常见的目标是可能需要在酶与处理之间保持一致的最适pH和pH范围。使由处理中特有的因素所引起的酶抑制和失活（包括产物抑制）下降，可能对于某些处理配置是重要的。最后，始终需要提高在处理条件下酶的比活性。酶修饰的目标范围广，并且对处理和最终目标高度特异。一个总体目标可以是增宽、缩小或改变底物特异性。另一总体目标可以是限制反应的立体化学。
已经开发了许多改进和/或修饰酶的属性的方法。这些方法范围很广，从合理设计到定向进化都有。对于合理设计，仔细考虑蛋白质的结构/功能关系，然后基于对蛋白质生物化学的理解进行有意的设计改变（例如Wohlfahrt et al.,2003,Biochemistry42:10095）。对于定向进化，生成在氨基酸序列上包含随机改变的酶变体文库，并且通过测定对文库进行筛选以鉴定改进/改变的变体（Arnold and Moore,1997,AdvBiochem Eng Biotechnol.58:1；Kim et al.,2000,Appl Environ Microbiol.66:788）。还存在许多杂合方法，有时被称为“半-合理”设计。例如，长期以来已知蛋白家族的共有序列常常比单个成员的序列更稳定（Lehmann et al.,2000,Biochim Biophys Acta.1543:408；Lehmann andWyss,2001,Curr Opin Biotechnol.12:371）。因此，一种产生更稳定的酶的方法是将非共有残基突变为共有序列。另一实例是SCHEMA方法，其包括随机互换来自共同蛋白家族的若干成员的用结构定义的结构域，然后通过测定来筛选改进/改变的变体（Silberg et al.,2004,MethodsEnzymol.388:35；Heinzelman et al.,2009,Proc Natl Acad Sci USA.106:5610）。第三个实例是ProSar算法，其使用来自最初随机筛选的信息，来设计第二和第三重组体用于筛选（Fox et al.,2003,Protein Eng.16:589）。
GH家族7酶已经是对商业应用的研究和开发都很深入的领域。例如，已经通过合理设计使木霉属（Trichoderma）Cel7A发生突变，以改变所述酶的最佳pH和热稳定性（Becker et al.,2001,Biochem J.356:19；Boer and Koivula,2003,Eur J Biochem.270:841）。Cel7A共有序列已经被构建并表达，并且显示出比木霉属Cel7A酶的热稳定性更高（美国公开No.2005/0054039）。SCHEMA方法已经被应用于生成热稳定性增加的杂合Cel7A酶（Heinzelman et al.,2010,Protein Eng Des Sel.23:871）。随机诱变也已经被应用于鉴定改进的木霉属Cel7A变体。合理设计和定向进化已经被应用于改进来自Melanocarpus的Cel7B的热稳定性（Voutilainen et al.,2007,Enz Microb Technol.41:234；Voutilainen et al.,2009,Appl Microbiol Biotechnol.83:261）。类似的合理设计方法用于使来自踝节菌属的Cel7A稳定，并在一个实例中偶然地提高比活性（Voutilainen et al.,2010,Protein Eng Des Sel.23:69）。木霉属Cel7A的CBM已经被设计成使得与纤维素的结合具有pH敏感性，从而在处理条件下使所述结合可逆，使得酶能够重复利用（Reinikainen etal.,1992,Proteins14:475；Reinikainen et al.,1995,Proteins22:392;Under et al.,1999,FEES Lett.447:13）。通过可产生另外的糖单体结合位点的合理设计突变使腐质霉属Cel7内切葡聚糖酶的KM降低（Davieset al.,1997,J Biotechnol.57:91）。
精心设计的测定法是成功鉴定改进的酶的关键，尤其是在随机方法（例如定向进化）的情形中。虽然已经开发了可溶的显色底物和荧光底物用于检测GH酶的活性并将它们用于某些筛选测定，但是GH酶在这些人造底物上的性能常常与在天然的或技术性的底物例如纤维素或木聚糖上的活性不相关。已经有文献记录了在一种底物上的改进与在另一种底物上的改进不相关的实例（Teeri et al.,1998,Biochem Soc Trans.26:173；Voutilainen et al.,2010,Protein Eng Des Sel.23:69;Kurasin andValjamae,2011,J Biol Chem.286:169）。因此，当筛选改进的酶时，关键是使用与处理相关的底物和条件。
包含很多氨基酸置换的里氏木霉（红褐肉座菌（H.jecorina））Cel7A的变体在美国专利No.7,951,570、美国公开No.2011/0229956和美国公开No.2009/0075336中公开。包含很多氨基酸置换的嗜热毁丝菌（M.thermophila）CBHla的变体在美国公开No.2012/0003703中公开。然而，通过使用可溶性底物而非纤维素底物筛选改进的热稳定性和亲热性来分离这些变体。在一些情形中，随后对热稳定的变体进行纤维素水解活性的表征。
本文中发明人提供了里氏木霉Cel7A的变体，所述变体是通过在处理过程相关的条件下使用处理过程相关的底物来筛选提高的活性而分离的。将赋予提高的具体突变在来自其他生物体的Cel7A纤维二糖水解酶上作图，以证实所述提高可以推广到GH家族7酶。
发明内容
本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的糖基水解酶家族7的纤维二糖水解酶，所述酶的活性增加、产物抑制减弱或稳定性改善。本发明的纤维二糖水解酶在需要将纤维二糖有效地转化成葡萄糖（特别是在高底物浓度的条件下，或者用于水解木质纤维素生物质）的工业过程中应用。
在第一方面，本发明涉及一种包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶，所述催化结构域在以下位置具有一个或多个氨基酸置换：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，
或其任意组合。所述位置根据亲本家族7纤维素酶与SEQ ID NO：1的比对来确定。所述修饰的家族7催化结构域包含的氨基酸序列展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约45％-约99.9％的序列同一性。
如上所述的包含修饰的家族7催化结构域的这类分离的纤维二糖水解酶，相对于包含亲本家族7催化结构域(所述修饰的家族7催化结构域衍生自该结构域)的纤维二糖水解酶，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
在一个实施方案中，所述修饰的家族7催化结构域包含在以下位置上具有一个或多个氨基酸置换：
26，39，45，46，52，53，54，87，95，102，129，130，139，143，144，183，184，197，237，241，253，264，271，282，314，316，324，326，339，343，364，368，379，382，385，390，398，406，423，
或其任意组合。
在另一实施方案中，所述修饰的家族7催化结构域包含选自以下的一个或多个氨基酸置换：
X26A，X45D，X46A，X46L，X46T，X51I，X52R，X52W，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X54I，X54D，X75S，X87T，X93V，X95L，X95Y，X102R，X111T，X129S，X130N，X130E，X138S，X139E，X139M，X139Q，X139S，X139R，X143L，X143G，X144A，X144V，X150N，X181L，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X219S，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X260D，X264C，X264Y，X271I，X326F，X343L，X351R，X353M，X364V，X368A，X373Y，X374V，X375A，X378E，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385I，X385L，X390A，X390G，X390K，X390W，X390C，X390L，X390V，X400G，X406P，X419F，和X436D，
并且展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约65％-约99.9％的同一性。
例如，所述修饰的家族7催化结构域可包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
X45D，X46A，X46L，X46T，X52R，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X54I，X54D，X87T，X95L，X95Y，X102R，X129S，X130N，X139M，X139S，X139R，X143L，X143G，X144V，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X264C，X271I，X282I，X314A，X326F，X343L，X364V，X368A，X368G，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385G，X385I，X385L，X390A，X390G，X390K，X390W，X390C，X390L，X390V，X398P，X406P，和X423Y，
并且展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约80％-约99.9％的同一性。
在又一实施方案中，所述分离的纤维二糖水解酶还包含碳水化合物结合模块和位于所述修饰的家族7催化结构域与所述碳水化合物结合模块之间的连接肽。例如，所述碳水化合物结合模块可为家族1碳水化合物结合模块，其展示出与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸或与氨基酸约50％-约99％的同一性，并且在位置466包含丝氨酸，在位置467包含天冬氨酸，在位置471包含丝氨酸，在位置483包含缬氨酸或丝氨酸，在位置486包含精氨酸，在位置489包含苏氨酸或谷氨酰胺，或其任意组合。所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸的比对来确定。
在另一方面，本发明涉及一种分离的纤维二糖水解酶，其包含家族7催化结构域、修饰的家族1碳水化合物结合模块和在所述家族7催化结构域和所述修饰的家族1碳水化合物结合模块之间的连接肽。所述修饰的家族1碳水化合物结合模块包含选自以下的一个或多个氨基酸置换：X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T和X489Q，并且展示出与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO：2的474-509位氨基酸约50％-约99％的同一性。所述一个或多个氨基酸置换的位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸的比对来确定。这类分离的纤维二糖水解酶，相对于包含亲本家族1碳水化合物结合结构域(所述修饰的家族1碳水化合物结合结构域衍生自该结构域)的纤维二糖水解酶，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
在另一方面，本发明涉及一种分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其包含选自以下的一个或多个氨基酸置换：
T26X，R39L，N45D，S46X，Y51I，D52X，G53X，N54X，G75X，S87X，I93X，F95X，A100X，K102X，L108X，M111X，D114X，F129X，D130X，V131X，P137X，C138X，G139X，A143X，L144X，D150X，V155X，S156X，K181X，I183X，N184X，P194X，N197X，N200X，C209X，S211X，N219X，I237X，D241X，G253X，G260X，N264X，P265X，T271X，L282X，P314X，A316X，N324X，L326X，G339X，F343X，Q351X，K353X，G358X，M364X，D368X，Y370X，A372X，N373X，M374X，L375X，D378X，S379X，S379X，P382X，T383X，E385X，P390X，V393X，S398X，S400X，Q406X，S419X，N420X，F423X，N431X，G435X，N436X，P437X，N441X，G444X，T446X，T447X，R450X，T453X，T454X，T455X，P459X，Q463X，Y466X，G467X，G471X，S475X，G476X，S482X，G483X，C486X，V488X，和L489X。
这类分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约75％-约99.9％的同一性。
在一个实施方案中，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
T26A，T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46I，S46L，S46T，Y51I，D52R，D52T，D52W，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，G75S，S87T，I93V，F95L，F95Y，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102S，K102R，L108I，M111T，D114E，F129S，D130N，D130E，V131A，P137S，C138S，G139E，G139M，G139Q，G139S，G139R，A143L，A143G，L144A，L144V，D150N，V155M，S156G，K181L，I183N，N184S，P194Q，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，C209S，S211T，N219S，I237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，G260D，N264Y，T271I，L282I，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，Q351R，K353M，G358S，M364V，D368A，D368G，D378E，Y370H，A372T，N373Y，M374V，L375A，D378E，S379C，S379E，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，S398P，S400G，Q406P，S419F，N420D，F423Y，N431R，G435S，N436D，P437T，N441D，G444D，T446A，T447S，R450S，T453I，T453S，T454I，T455A，P459L，Q463L，Q463S，Q463K，Y466S，G467D，G471S，S475N，G476D，S482N，G483V，G483S，C486R，V488D，L489P，和L489Q.
这类分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约80％-约99.9％的同一性。
例如，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46L，S46T，D52R，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，S87T，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102R，F129S，D130N，G139M，G139S，G139R，A143L，A143G，L144V，I183N，N184S，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，1237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，N264C，N264Y，T271I，L282I，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，G358S，M364V，D368A，D368G，A372T，S379C，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，S398P，Q406P，F423Y，N431R，P437T，T446A，T447S，T454I，G467D，S475N，和G483V，
并且展示出与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约90％-约99.9％的同一性。
如上所述的分离的里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶，相对于亲本里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶(所述分离的里氏木霉Trcel7A纤维二糖水解酶衍生自该酶)，展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加、或其任意组合。
在另一方面，本发明涉及编码如上所述的分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。
在另一方面，本发明还涉及一种遗传修饰的微生物，其包含编码如上所述的分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。所述遗传修饰的微生物可为酵母或丝状真菌。例如，所述遗传修饰的微生物可为酵母茵属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、木霉属、肉座茵属(Hypocrea)、曲霉属、镰刀茵属、腐质霉属、金孢子菌属、毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属或链孢霉属或者其分类学上等价的属的种。
在另一方面，本发明还涉及一种用于产生如上所述的分离的纤维二糖水解酶的方法，所述方法包括用编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体转化宿主微生物，选择表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物，以及在能够从所述遗传构建体表达所述分离的纤维二糖水解酶的条件下培养所述遗传修饰的微生物。
在另一方面，本发明涉及包含如上所述的分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物。
在另一方面，本发明涉及一种用包含如上所述的分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物水解纤维素底物的方法。在一个实施方案中，所述纤维素底物是预处理的木质纤维素原料例如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑（fine）和次品、甘蔗渣、硬木材、软木材、锯屑、柳枝稷、芒草、米草（cord grass）和草芦（reed canary grass）。
附图说明
图1示出了用于指导分离的纤维二糖水解酶在木霉属宿主菌中表达和分泌的质粒载体pTr7Ap-NheI-KpnI-7aT-DRmUra3的图谱。
图2示出了用于指导分离的纤维二糖水解酶在木霉属宿主菌中表达和分泌的质粒载体pTr7Ap’-Nhe Ⅰ-Kpn Ⅰ-7aT-DRmUra3的图谱。
图3提供了（a）真菌家族7催化结构域的氨基酸序列的比对和（b）共有序列家族7催化结构域中每个氨基酸的相对发生频率的示意图。
图4提供了TrCel7A（SEQ ID NO:1）和MtCel7A（SEQ ID NO:2）纤维二糖水解酶的比对。
图5提供了真菌家族1碳水化合物结合模块的氨基酸序列的比对。
具体实施方式
本发明涉及分离的纤维二糖水解酶。更具体地，本发明涉及分离的纤维二糖水解酶，其包含属于糖苷水解酶家族7的改良催化结构域，并且展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物的时的活性增加，或其组合。本发明还涉及编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体，从宿主菌株产生所述分离的纤维二糖水解酶的方法，和用所述分离的纤维二糖水解酶水解纤维质底物（例如预处理的木质纤维素原料）的方法。
以下描述是仅作为示例、而不是对实现本发明所必需的特征的组合构成限制的优选实施方案。提供的标题不意欲限制本发明的各个实施方案。术语例如“包括”和“包含”不意欲是限制性的。此外，除非另有说明，否则单数形式的使用包括复数形式，并且“或”是指“和/或”。除非本文另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
家族7纤维二糖水解酶
本文使用的家族7纤维二糖水解酶（Cel7纤维二糖水解酶、Cel7CBH酶或Cel7CBH）是包含属于糖苷水解酶（GH）家族7的催化结构域的纤维素酶，其能够从纤维素链的还原端释放纤维二糖。例如，Cel7CBH可以从纤维素链的还原端持续地释放纤维二糖。来自不同生物来源的包含家族7催化结构域的纤维素酶通过两个字母的命名来标识，所述两个字母的命名由所述Cel7CBH衍生自的属和种的第一个字母组成，后面跟着指示具体的Cel7从该生物中的鉴定出来的顺序的大写字母。例如，来自里氏木霉的Cel7CBH酶（CBH1）和来自嗜热毁丝菌的Cel7CBH酶（CBH1a）可被分别称为TrCel7A和MtCel7A。
如果催化结构域展示出与其他的家族7纤维素酶相似的一级、二级和三级蛋白质结构，那么该催化结构域被分类至GH家族7中。例如，所有的家族7纤维素酶包含两个可作为催化残基的谷氨酸（E）残基。这些天冬氨酸残基存在于里氏木霉CBH1的212和217位（Divne,et al.,1998,J.Mol.Biol.275:309-325）。嗜热毁丝菌CBHla中的同源谷氨酸存在于213和218位（图5）。
家族7催化结构域通过β-果冻卷核心结构来区分，许多随机螺旋形式的蛋白质通过二硫键连接在一起。已知一些家族7纤维素酶的三维结构：里氏木霉Cel7A（Divne et al.,1994,Science265(6171):524-528）；里氏木霉Cel7B（Kleywegt et al.,1997,J.Biol.Chem.272:383-397），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）Cel7B（Sulzenbacher,et al.,1996,Biochemistry35(48):15280-15287），特异腐质霉（Humicola insolens）Cel7B（Davies,et al.,1997,J.Biotechnol.57:91-100），热白丝菌（Melanocarpus albomyces）Cel7B（Parkkinen et al.,2008,ProteinScience17:1383-94），黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）Cel7D（Munoz et al.,2001,J.Mol.Biol.314:1097-1111），和埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）Cel7A（Grassick et al.,2004,Eur.J.Biochem.271:495-4506）。
家族7催化结构域主要见于真菌纤维素酶中。表1中提供了包含家族7催化结构域的纤维素酶的非限制性实例。
表1：真菌家族7催化结构域
以默认设置使用BioEdit软件版本7.0.9.0(6/27/07)中的ClustalW多重比对工具将来自表中保藏编号的每种酶的全长序列（如果存在的话，包括CBM和信号肽）与参考序列（SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸和SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸）进行比对。仅使用与参考序列比对上的并且去除了参考序列前面和后面的所有氨基酸后的序列，来计算与参考序列的同一性百分比。
如表1和图3所示，在家族7纤维二糖水解酶中存在高度保守的一级氨基酸序列。38个目前已知的真菌纤维二糖水解酶的家族7催化结构域的多重氨基酸序列比对显示出，大多数天然存在的家族7CBH催化结构域展示出与包含TrCel7A的催化结构域的1-436位氨基酸约45%-约100%的氨基酸序列同一性（表1），以及与包含MtCel7A的催化结构域的1-438位氨基酸约45%-100%的氨基酸序列同一性。具体地，在真菌纤维二糖水解酶的家族7催化结构域中有一些氨基酸序列保守性非常高的区域，包括例如165-188位、360-383位和含有212和217位催化氨基酸的207-222位氨基酸。
“TrCel7A纤维二糖水解酶”或“TrCel7A”意指由SEQ ID NO:1的氨基酸序列限定的里氏木霉产生的家族7纤维二糖水解酶。TrCel7A纤维二糖水解酶也被称为里氏木霉外切葡聚糖酶Ⅰ、纤维二糖水解酶Ⅰ或CBH1。“天然的”或“野生型的”TrCel7A（也注释为TrCel7Awt），意指没有任何氨基酸置换的SEQ ID NO:1的TrCel7A。
“MtCel7A纤维二糖水解酶”或“MtCel7A”意指由SEQ ID NO:2的氨基酸序列限定的嗜热毁丝菌产生的家族7纤维二糖水解酶。MtCel7A纤维二糖水解酶也被称为嗜热毁丝菌纤维二糖水解酶Ⅰa或CBH1a。“天然的”或“野生型的”MtCel7A(也注释为MtCel7Awt)意指没有任何氨基酸置换的SEQ ID NO：2的MtCel7A。
分离的纤维二糖水解酶
“分离的纤维二糖水解酶”或“分离的CBH”意指包含CBH酶和不多于10％的与其天然相关的多肽的酶制剂。例如，所述酶制剂可包含CBH酶和不多于8％、6％、4％、2％、1％、0％或其之间的任意量的与所述CBH酶天然相关的多肽。如下文所述，本发明的分离的纤维二糖水解酶可通过重组方式由遗传修饰的微生物产生。
在本发明的一个方面，分离的纤维二糖水解酶包含修饰的家族7催化结构域，所述结构域(a)在以下位置上具有一个或多个氨基酸置换：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，193，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，
或其任意组合，这类氨基酸置换的一个或多个位置可通过与亲本家族7催化结构域的氨基酸序列进行比对来确定，所述亲本家族7催化结构域衍生出所述修饰的家族7催化结构域，并且具有SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸，(b)展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约47％-约99.9％的氨基酸序列同一性。例如，所述分离的纤维二糖水解酶可包含在以下位置上具有一个或多个氨基酸置换的修饰家族7催化结构域：
26，39，45，46，52，53，54，87，95，102，129，130，139，143，144，183，184，197，237，241，253，264，271，282，314，316，324，326，339，343，358，364，368，379，382，385，390，398，406，423，
或其任意组合。
“氨基酸序列比对”意指一个或多个氨基酸序列与参考序列进行比对，目的是优化所比对的序列之间的序列相似性。比对两个或多个氨基酸序列的方法包括但不限于BLAST(BLAST和BLAST 2.0；Altschul eta1.，1997和1990)、Smith&Waterman(1981)的比对算法、Needleman&Wunsch(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman(1988)的相似性搜索的方法、这些算法的计算机化的工具(GAP、BESTFIT、FASTA和Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis的威斯康辛遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的TFASTA)，或通过手动比对和目测。图1和2分别提供了38个家族7催化结构域的氨基酸序列与38个家族1碳水化合物结合模块序列的比对。
一旦完成比对，本领域技术人员可确定(a)给定的亲本家族7催化结构域中与SEQ ID NO：1的TrCel7A纤维二糖水解酶的位置
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435
和436对应的氨基酸的位置和(b)给定的家族7催化结构域序列与SEQID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸的氨基酸序列同一性。
“亲本家族7催化结构域”意指在以下位置或其任意组合上不合有原始氨基酸的置换的家族7催化结构域：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，
应理解，亲本家族7催化结构域可为野生型的或天然的家族7催化结构域，或在除了以下位置之外的位置上含有氨基酸置换的家族7催化结构域：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435和/或436.
亲本家族7催化结构域可衍生自一种或多种来自任意源生物的纤维素酶，所述源生物包括但不限于曲霉属、毛壳霉属、金孢子菌属、鬼伞属、棒囊壳属、栉霉属(Ctenomyces)、拟层孔菌、镰刀菌属、腐质霉属、稻温病菌、Melanocarpus、毁丝霉属、链孢霉属、平革菌属、柄孢壳菌属、根毛霉属、侧孢霉属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、嗜热真菌属和梭孢壳属的种。例如，亲本家族7催化结构域可衍生自里氏木霉Cel7A(SEQ ID NO：1)、嗜热毁丝菌Cel7A  (SEQ ID NO：2)，或衍生自包含表1中所列的家族7催化结构域的任何纤维素酶。
为了帮助本领域技术人员了解可对亲本家族7催化结构域进行氨基酸置换的那些氨基酸位置(而不是在相应的修饰的家族7催化结构域中存在的那些)并产生有活性的纤维二糖水解酶，图1中提供了将38个衍生自真菌来源的家族7催化结构域与共有序列家族7催化结构域(由在每个位置以最高频率天然存在的氨基酸组成)的比对，以及示出共有序列在每个位置上的每种氨基酸的发生频率的图。使用该信息，本领域技术人员将识别出具有低序列保守性的区域，并选择这类区域用于引入可能不显著消弱所述酶的功能的氨基酸置换。这类区域的非限制性实例包括例如位置232-247、309-322和327-359之间的区域。
在本发明的另一实施方案中，所述分离的纤维二糖水解酶包含修饰的家族7催化结构域，所述结构域(a)具有选自以下的一个或多个氨基酸置换：
X26A，X45D，X46A，X46L，X46T，X51I，X52R，X52W，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X541，X54D，X75S，X87T，X93V，X95L，X95Y，X102R，X111T，X129S，X130N，X130E，X138S，X139E，X139M，X139Q，X139S，X139R，X143L，X143G，X144A，X144V，X150N，X181L，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X219S，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X260D，X264C，X264Y，X271I，X326F，X343L，X351R，X353M，X356I，X356A，X364V，X368A，X373Y，X374V，X375A，X378E，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385I，X385L，X390A，X390G，X390K，X390W，X390C，X390L，X390V，X400G，X406P，X419F，和X436D，
(b)展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约65％-约99.9％的氨基酸序列同一性。例如，修饰的家族7催化结构域可具有选自以下的一个或多个氨基酸置换：
X45D，X46A，X46L，X46T，X52R，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X54I，X54D，X87T，X95L，X95Y，X102R，X129S，X130N，X139M，X139S，X139R，X143L，X143G，X144V，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X264C，X271I，X282I，X314A，X326F，X343L，X356I，X364V，X368A，X368G，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385G，X385I，X385L，X390A，X390G，X390K，X390W，X390C，X390L，X390V，X398P，X406P，和X423Y，
在另一实施方案中，包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶还可包含碳水化合物结合模块(CBM)和位于所述修饰的家族7催化结构域与碳水化合物结合模块之间的连接肽。例如，所述CBM可以是家族1CBM。“家族1CBM”或“家族1碳水化合物结合模块”意指展示出与微晶纤维素的结合并包含依据CAZy系统（见URL:cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html）被分类为家族1碳水化合物结合模块（或家族1CBM）的氨基酸序列的任何多肽。图2提供了38个家族1CBM氨基酸序列的比对，示出了形成两个二硫键的四个高度保守的半胱氨酸的位置。三个芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）也是保守的，形成平面并经范德华（van der Waals’）相互作用来直接与纤维素聚合物的葡萄糖单元相互作用。表2中提供了所述38个CBM序列与TrCel7A和MtCel7a的CBM的同一性。
术语“连接肽”意欲理解为位于两个功能性结构域之间并包含约6-约60个氨基酸的氨基酸片段（stretch）。连接肽可使用模型由氨基酸序列信息来鉴定（Bae,et al.(2008)Journal of the American StatisticalAssociation,103(483):1085-99；Suyama,and Ohara,(2003)Bioinformatics,19(5):673-4)。Gilkes et al.,(1991Microbiology Reviews,55(2):303-315）提供了被该定义所涵盖的来自多种纤维素酶以及其他细菌和真菌蛋白质的接头的序列。与非接头序列相比，连接肽通常为碱性肽，尤其富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸。如在Gilkes et al(1991)的表Ⅰ中所呈现的，在所有的来自细菌和真菌糖苷水解酶（木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶）的连接肽序列中脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸占了氨基酸的50%或更多。对于本文所限定的目的，连接肽可能被定义为约6-约60个氨基酸的其中至少50%为脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸的片段，其位于催化结构域和CBM之间、两个催化结构域之间、两个CBM之间、另一功能性的结构域与催化结构域之间、或另一功能性的结构域与CBM之间。脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸可占所述连接肽中氨基酸的50%、60%、70%、80%、90%或100%（（#脯氨酸+苏氨酸+丝氨酸）/#接头中的氨基酸×100%）。本领域技术人员应认识到，给定的接头的氨基酸序列可通过加入、删除或置换一个或多个氨基酸来修饰，并仍认为是连接肽。
在另一方面，所述分离的纤维二糖水解酶包含亲本的或修饰的家族7催化结构域、修饰的家族1CBM和位于它们之间的连接肽，所述修饰的家族1碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO:1的463-497位氨基酸或SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸约50%-约99%的同一性，并且具有选自X466S、X467D、X471S、X483V、X486R、X489T、X489Q或其任意组合的一个或多个氨基酸置换，所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQ ID NO:1的463-497位氨基酸或与SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸的比对来确定。如上所述，有很多方法可用于将亲本家族1CBM的氨基酸序列与参考家族1CBM例如SEQ ID NO:1的463-497位氨基酸或SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸进行比对，以确定（a）给定的亲本家族1CBM中对应SEQ ID NO:1的位置466、467、471、483、486和489的氨基酸的位置和（b）给定的亲本家族1CBM序列与SEQ ID NO:1的463-497位氨基酸或与SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸的氨基酸序列同一性。
与包含亲本家族1碳水化合物结合模块的纤维二糖水解酶相比，包含亲本或修饰的家族7催化结构域和衍生自所述亲本家族1碳水化合物结合模块的修饰的家族1CBM的分离的纤维二糖水解酶展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起的失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或其任意组合。
“亲本家族1碳水化合物结合模块”意指在在位置466、467、471、483、486、489或其任意组合上不含有原始氨基酸置换的家族1碳水化合物结合模块。应理解，亲本家族1碳水化合物结合模块可以为野生型或天然的家族1碳水化合物结合模块或在除了466、467、471、483、486和/或489之外的位置上含有氨基酸置换的家族1碳水化合物结合模块。亲本家族1碳水化合物结合模块可以衍生自一种或多种来自任何源生物的纤维素酶，所述源生物包括但不限于曲霉属、毛壳霉属、金孢子菌属、鬼伞属、棒囊壳属、栉霉属、拟层孔菌、镰刀菌属、腐质霉属、稻温病菌、Melanocarpus、毁丝霉属、链孢霉属、平革菌属、柄孢壳菌属、根毛霉属、侧孢霉属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、嗜热真菌属和梭孢壳属的种。例如，亲本家族1CBM可衍生自里氏木霉Cel7A（SEQ IDNO:1）、嗜热毁丝菌Cel7A（SEQ ID NO:2）或包含表2中所列的家族1碳水化合物结合模块的任何纤维素酶。
家族1碳水化合物结合模块主要见于真菌纤维素酶。表2中提供了包含家族1碳水化合物结合模块的纤维素酶的非限制性实例。
表2：真菌家族1碳水化合物结合模块
以默认设置使用BioEdit软件版本7.0.9.0(6/27/07)中的ClustalW多重比对工具将来自表中所述的登录号的每种酶的全长序列（如果存在的话，包括CBM和信号肽）与参考序列(SEQ ID NO：1的463-497位氨基酸和SEQ ID NO：2的474-509位氨基酸)进行比对。仅使用与参考序列比对上的并且去除了参考序列前面和后面的所有氨基酸后的序列，来计算与参考序列的同一性百分比。
用于本文时，对于修饰的家族7催化结构域或修饰的家族1CBM，“衍生自”是指使用相应的亲本家族7催化结构域或亲本家族1CBM所特有的遗传材料或者核酸或氨基酸序列信息，分离编码所需的修饰的家族7催化结构域或家族1CBM的靶核酸序列元件。如本领域技术人员所知，可使用一种或多种分子生物学技术(包括但不限于克隆、亚克隆、PCR扩增、体外合成等)使用这类材料或序列信息来生成编码所需的修饰的家族7催化结构域或修饰的家族1CBM的核酸序列。
在另一方面，所述分离的纤维二糖水解酶可为包含一个或多个选自以下的氨基酸置换并且展示出与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约75％-约99.9％的氨基酸序列同一性的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶：
T26X，R39L，N45D，S46X，Y51I，D52X，G53X，N54X，G75X，S87X，I93X，F95X，A100X，K102X，L108X，M111X，D114X，F129X，D130X，V131X，P137X，C138X，G139X，A143X，L144X，D150X，V155X，S156X，K181X，I183X，N184X，P194X，N197X，N200X，C209X，S211X，N219X，I237X，D241X，G253X，G260X，N264X，T271X，L282X，P314X，A316X，N324X，L326X，G339X，F343X，Q351X，K353X，T356X，G358X，M364X，D368X，Y370X，A372X，N373X，M374X，L375X，D378X，S379X，S379X，P382X，T383X，E385X，P390X，V393X，S398X，S400X，Q406X，S419X，N420X，F423X，N431X，G435X，N436X，P437X，N441X，G444X，T446X，T447X，R450X，T453X，T454X，T455X，P459X，Q463X，Y466X，G467X，G471X，S475X，G476X，S482X，G483X，G483X，C486X，V488X，和L489X，。
例如，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含选自以下的一个或多个氨基酸置换，并且展示出与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约80％-约99.9％的氨基酸序列同一性：
126A，T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46I，S46L，S46T，Y51I，D52R，D52T，D52W，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，G75S，S87T，I93V，F95L，F95Y，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102S，K102R，L108I，M111T，D114E，F129S，D130N，D130E，V131A，P137S，C138S，G139E，G139M，G139Q，G139S，G139R，A143L，A143G，L144A，L144V，D150N，V155M，S156G，K181L，I183N，N184S，P194Q，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，C209S，S211T，N219S，I237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，G260D，N264Y，T271I，L282I，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，Q351R，K353M，G358S，M364V，D368A，D368G，D378E，Y370H，A372T，N373Y，M374V，L375A，D378E，S379C，S379E，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，V393A，S398P，S400G，Q406P，S419F，N420D，F423Y，N431R，G435S，N436D，P437T，N441D，G444D，T446A，T447S，R450S，T453I，T453S，T454I，T455A，P459L，Q463L，Q463S，Q463K，Y466S，G467D，G471S，S475N，G476D，S482N，G483V，G483S，C486R，V488D，L489P，和L489Q。
在一个实施方案中，所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶可包含选自以下的一个或多个氨基酸置换，并且展示出与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸约90％-约99.9％的氨基酸序列同一性：
T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46L，S46T，D52R，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，S87T，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102R，F129S，D130N，G139M，G139S，G139R，A143L，A143G，L144V，I183N，N184S，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，I237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，N264C，N264Y，T271I，T281A，L282I，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，T356I，G358S，M364V，D368A，D368G，A372T，S379C，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，V393A，S398P，Q406P，F423Y，N431R，P437T，T446A，T447S，T454I，G467D，S475N，和G483V，。
所述分离的TrCel7A纤维二糖水解酶可衍生自序列为SEQ ID NO：1的野生型或天然的TrCel7A纤维二糖水解酶或衍生自包含氨基酸缺失或插入或者除了以下置换之外的氨基酸置换的亲本TrCel7A纤维二糖水解酶：
T26X，R39L，N45D，S46X，Y51I，D52X，G53X，N54X，G75X，S87X，I93X，F95X，A100X，K102X，L108X，M111X，D114X，F129X，D130X，V131X，P137X，C138X，G139X，A143X，L144X，D150X，V155X，S156X，K181X，I183X，N184X，P194X，N197X，N200X，C209X，S211X，N219X，I237X，D241X，D249X，G253X，G260X，N264X，T271X，L282X，P314X，A316X，N324X，L326X，G339X，F343X，Q351X，K353X，G358X，M364X，D368X，Y370X，A372X，N373X，M374X，L375X，D378X，S379X，S379X，P382X，T383X，E385X，P390X，V393X，S398X，S400X，Q406X，S419X，N420X，F423X，N431X，G435X，N436X，P437X，N441X，G444X，T446X，T447X，R450X，T453X，T454X，T455X，P459X，Q463X，Y466X，G467X，G471X，S475X，G476X，S482X，G483X，G483X，C486X，V488X，和L489X.。
表3中提供了依据本发明的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的列表，其不被认为以任何方式进行限制。
表3：分离的衍生自TrCel7A的纤维二糖水解酶
可通过将亲本真菌纤维二糖水解酶的氨基酸序列与里氏木霉Cel7A的氨基酸序列进行比对，鉴定所述亲本真菌纤维二糖水解酶中与以下位置等价的氨基酸：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，437，441，444，446，447，450，453，454，455，459，463，466，G467，471，475，476，482，483，486，488，和/或489，
然后进行等价氨基酸的置换，来形成本发明的分离的纤维二糖水解酶，所述纤维二糖水解酶包含衍生自表1或表2中的任何真菌纤维二糖水解酶的修饰的家族7催化结构域和/或修饰的家族1CBM。例如，可通过将SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1进行比对，如图4所示，以鉴定在SEQ ID NO：2中与SEQ ID NO：1的以下位置
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，437，441，444，446，447，450，453，454，455，459，463，466，467，471，475，476，482，483，486，488，和489
等价的位置，而从嗜热毁丝茵MtCel7A纤维二糖水解酶衍生出分离的纤维二糖水解酶。所得到的分离的嗜热毁丝茵MtCel7A纤维二糖水解酶包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
T26X，R39X，S46X，Y51X，E52X，G53X，N54X，G75X，S87X，L93X，F95X，Y101X，T103X，M112X，D115X，F130X，D131X，V132X，C139X，G140X，A144X，L145X，D151X，S157X，K182X，I184X，N185X，Q194X，N198X，C210X，S212X，N220X，R238X，D242X，A254X，G261X，N265X，K272X，V281X，S318X，S320X，N328X，S329X，I330X，G343X，F348X，Q356X，G358X，G363X，M369X，D373X，N378X，M379X，L380X，D383X，S384X，P387X，I388X，D389X，P394X，T404X，E410X，S423X，N424X，F427X，V434X，G441X，S442X，G443X，N446X，V449X，S451X，V455X，S459X，Y478X，E479X，G483X，T487X，G488X，S494X，C498X，K500X，和L501X，
并且展示出与SEQ ID NO：2的1-509位氨基酸约75％-约99.9％的氨基酸序列同一性。
表4中提供了依据本发明的分离的MtCel7A纤维二糖水解酶的列表，其不被认为以任何方法进行限制。
表4：衍生自MtCel7A的分离的纤维二糖水解酶
SEQ ID N0： 分离的CBH SEQ ID NO： 分离的CBH
218 MtCel7A-S13H 301 MtCel7A-N265C
219 MtCel7A-S13T 302 MtCel7A-N265Y
220 MtCel7A-G22D 303 MtCel7A-S266T
221 MtCel7A-T26A 304 MtCel7A-K272I
222 MtCel7A-T26S 305 MtCel7A-T280A
223 MtCel7A-S27L 306 MtCel7A-T280I
224 MtCel7A-R39L 307 MtCel7A-K285E
225 MtCel7A-S46A 308 MtCel7A-A298T
226 MtCel7A-S46G 309 MtCel7A-I315L
227 MtCel7A-S46L 310 MtCel7A-S318A
228 MtCel7A-S46T 311 MtCel7A-S320V
229 MtCel7A-Y51I 312 MtCel7A-N328D
230 MtCel7A-E52R 313 MtCel7A-S329K
231 MtCel7A-E52T 314 MtCel7A-I330F
232 MtCel7A-E52W 315 MtCel7A-T331Y
233 MtCel7A-G53A 316 MtCel7A-D336I
234 MtCel7A-G53M 317 MtCel7A-G343D
235 MtCel7A-G53R 318 MtCel7A-F348L
236 MtCel7A-G53W 319 MtCel7A-Q356R
237 MtCel7A-N54D 320 MtCel7A-G358M
238 MtCel7A-N54I 321 MtCel7A-L361A
239 MtCel7A-N54S 322 MtCel7A-L361I
240 MtCel7A-S59A 323 MtCel7A-G363S
241 MtCel7A-G75S 324 MtCel7A-M369V
242 MtCel7A-S87T 325 MtCel7A-D373A
243 MtCel7A-G88V 326 MtCel7A-D373G
244 MtCel7A-L93V 327 MtCel7A-V377T
245 MtCel7A-F95L 328 MtCel7A-N378Y
246 MtCel7A-F95Y 329 MtCel7A-M379V
247 MtCel7A-Y101G 330 MtCel7A-L380A
248 MtCel7A-Y101L 331 MtCel7A-D383E
249 MtCel7A-Y101T 332 MtCel7A-S384C
250 MtCel7A-Y101V 333 MtCel7A-S384E
251 MtCel7A-Y101W 334 MtCel7A-P387I
252 MtCel7A-T103R 335 MtCel7A-P387L
253 MtCel7A-T103S 336 MtCel7A-P387Q
254 MtCel7A-T109I 337 MtCel7A-I388A
255 MtCel7A-M112T 338 MtCel7A-I388S
256 MtCel7A-D115E 339 MtCel7A-G390I
257 MtCel7A-F130S 340 MtCel7A-G390L
258 MtCel7A-D131E 341 MtCel7A-P394A
259 MtCel7A-D131N 342 MtCel7A-P394C
260 MtCel7A-V132A 343 MtCel7A-P394G
261 MtCel7A-G138S 344 MtCel7A-P394K
262 MtCel7A-C139S 345 MtCel7A-P394L
263 MtCel7A-G140E 346 MtCel7A-P394V
264 MtCel7A-G140M 347 MtCel7A-P394W
265 MtCel7A-G140Q 348 MtCel7A-E397A
266 MtCel7A-G140R 349 MtCel7A-T404G
267 MtCel7A-G140S 350 MtCel7A-E410P
268 MtCel7A-A144G 351 MtCel7A-V411I
269 MtCel7A-A144L 352 MtCel7A-S423F
270 MtCel7A-L145A 353 MtCel7A-N424D
271 MtCel7A-L145V 354 MtCel7A-F427Y
272 MtCel7A-D151N 355 MtCel7A-V434D
273 MtCel7A-S157G 356 MtCel7A-S435R
274 MtCel7A-K182L 357 MtCel7A-G441S
275 MtCel7A-I184N 358 MtCel7A-S442D
276 MtCel7A-N185S 359 MtCel7A-G443T
277 MtCel7A-E187K 360 MtCel7A-N446D
278 MtCel7A-Q194G 361 MtCel7A-V449D
279 MtCel7A-S195Q 362 MtCel7A-S450I
280 MtCel7A-N198A 363 MtCel7A-S451A
281 MtCel7A-N198L 364 MtCel7A-V455S
282 MtCel7A-N198Q 365 MtCel7A-S458I
283 MtCel7A-N198V 366 MtCel7A-S459I
284 MtCel7A-N198W 367 MtCel7A-T460Q
285 MtCel7A-N201C 368 MtCel7A-S466L
286 MtCel7A-N201F 369 MtCel7A-A475K
287 MtCel7A-C210S 370 MtCel7A-A475L
288 MtCel7A-S212T 371 MtCel7A-A475S
289 MtCel7A-M214I 372 MtCel7A-Y478S
290 MtCel7A-N220S 373 MtCel7A-E479D
291 MtCel7A-R238T 374 MtCel7A-G483S
292 MtCel7A-D242L 375 MtCel7A-T487N
293 MtCel7A-D242R 376 MtCel7A-G488D
294 MtCel7A-D242V 377 MtCel7A-S494N
295 MtCel7A-T247S 378 MtCel7A-P495S
296 MtCel7A-T250C 379 MtCel7A-P495V
297 MtCel7A-T250N 380 MtCel7A-C498R
298 MtCel7A-A254D 381 MtCel7A-K500D
299 MtCel7A-A254R 382 MtCel7A-L501P
300 MtCel7A-G261D 383 MtCel7A-L501Q
分离的具有对抗处理底物的改善的活性的纤维二糖水解酶
如上所述，相对于包含亲本家族7催化结构域(其衍生出修饰的家族7催化结构域)的纤维二糖水解酶，本发明的分离的纤维二糖水解酶可展示出比活性增加、由葡萄糖引起的抑制下降、由木质素引起失活下降、存在木质素时的活性增加、存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或其任意组合。
比活性增加意指在基本相当的反应条件下，给定量的分离的纤维二糖水解酶(包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM)对纤维质底物作用给定的一段时间后，转化成产物的纤维素底物比由相应的纤维二糖水解酶(包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM)转化的更多。可以用单位体积水解反应的蛋白质的质量或摩尔数、单位重量的水解反应含有的蛋白质的质量或摩尔数、单位质量的纤维素或纤维质底物含有的蛋白质的质量或摩尔数以及其他本领域技术人员已知的测量方法来测量作用在纤维素底物上的纤维二糖水解酶的量。
对于本文的目的，纤维质底物包括但不限于结晶的或不可溶的纤维素、无定形纤维素（例如磷酸膨胀纤维素）、含有纤维素的生物质（包括但不限于木质纤维素底物例如小麦秸秆、草、木材、木浆）、纸和纸制品、棉花和含有纤维素的纺织品、可溶性纤维素衍生物（例如羧甲基纤维素或羟乙基纤维素，也称为CMC和HEC）、着色的纤维素（例如azo-CMC），以及低分子量的纤维素衍生物例如纤维寡糖、荧光底物例如甲基伞形酮-β-D-纤维素二糖苷（MUC）或甲基伞形酮-β-D-乳糖苷（MUL）、或比色底物例如对硝基苯β-D-纤维二糖苷（pNP-G2）或对硝基苯β-D-乳糖苷（pNP-lac）。
纤维质底物至产物的转化率可以通过本领域技术人员已知的任何数量的方法确定。例如，可通过测量还原糖的酶依赖性释放来监测纤维素或纤维素衍生物的水解，所述还原糖在随后本领域技术人员已知的化学或化学酶学检测中定量，包括与二硝基水杨酸（dinitrosalisylic acid,DNS）反应。也可以通过色谱法监测多糖的水解，所述色谱法分离并定量由酶活性释放的可溶性单糖、二糖和寡糖。此外，可将可溶性比色且低分子量的纤维素衍生物纳入琼脂培养基中，在其上培养表达和分泌分离的纤维二糖水解酶的宿主微生物。在这类琼脂平板测定中，纤维二糖水解酶的活性以表达和分泌有活性的纤维素酶的单个微生物菌落周围的有色或无色的环来检测。本发明的实施不受用来评估分离的纤维二糖水解酶的活性的方法的限制。
由葡萄糖引起的抑制作用的下降意指，在存在抑制水平的葡萄糖的情况下，给定量的分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）对纤维质底物上作用给定的一段时间后，转化成产物的纤维质底物比在基本相同的反应条件下由相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM两者）转化的更多。纤维素酶的葡萄糖抑制还可通过确定抑制常数KG来测量，KG定义为使纤维素酶的活性下降50%的葡萄糖浓度。KG的值不取决于产物抑制的性质——即竞争性、非竞争性或混合类型。受葡萄糖抑制较少的分离的纤维二糖水解酶具有更高的KG值——即，使所述酶的活性下降50%需要更高的葡萄糖浓度。
由木质素引起的失活下降意指，在先前暴露于木质素或用木质素预处理后，给定量的分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）对纤维质底物作用给定的一段时间后，转化成产物的底物比在基本相同的条件下由相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM）转化的更多。例如，由木质素引起的纤维二糖水解酶的失活可通过如上所述的在等价的水解反应中测量纤维素转化的程度来确定，其中一个反应含有足量的木质素以降低纤维素酶的活性。或者，可以通过用非特异性蛋白例如BSA、表面活性剂或其他化学物质包被纯化的木质素，来处理纯化的木质素以使其失活能力减弱，然后将其加入到具有纤维质底物的纤维二糖水解酶的反应中，其中纤维质底物的量与未处理的木质素相同。
存在木质素时活性增加意指，在木质素的存在下，分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）比在基本相等的反应条件下相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM）从纤维质底物生成更多的产物。可以通过在存在和不存在木质素的情况下测量纤维质底物的转化率，然后得到存在木质素的情况下与不存在木质素的情况下的纤维质底物的转化程度的比率，来确定存在木质素时分离的纤维二糖水解酶的活性增加。活性增加可能是由木质素引起的所述分离的纤维二糖水解酶的抑制、失活或结合降低中的任何一种或多种原因导致的。本发明的实施不受所述分离的纤维二糖水解酶在存在木质素时的活性增加的一种或多种机制的限制。
存在于这类纤维素水解反应中的木质素可以为不可溶的底物的一部分例如在预处理的木质纤维素中，或者以可溶的或不可溶的形式进行纯化。如果木质素不是纤维质底物的一部分，那么可以通过用非特异性蛋白例如BSA、表面活性剂或其他化学物质包被这类木质素来对其进行处理以使得失活能力下降，然后将其加入到具有纤维质底物的纤维二糖水解酶的反应中，其中纤维素底物的量与未处理的木质素相同。如果木质素是不可溶的底物的一部分，那么还可以测量未漂白的、含有木质素的纤维素质底物与漂白的底物（其中已经除去了木质素，例如通过氧化剂例如二氧化氯）的转化程度的比率。存在木质素时的活性增加的分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）将会显示出未漂白的含有木质素的纤维质量底物与漂白的底物的转化程度的比率比相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM两者）更高。
本领域技术人员应认识到，由木质素引起的失活降低或存在木质素时的活性增加的分离的纤维二糖水解酶可以展示出与木质素的结合减少。与木质素的结合可通过确定如美国公开No.2010/0041100所述的木质素结合常数来评估。展示出与木质素的结合减少的分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）的KL相对于相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM）的KL将会增加。
存在木质纤维素水解产物时的活性增加意指，在木质纤维素水解产物的存在下，给定量的分离的纤维二糖水解酶（包含修饰的家族7催化结构域，或者包含亲本或修饰的家族7催化结构域和修饰的家族1CBM）比在基本相当的反应条件下相应的纤维二糖水解酶（包含亲本家族7催化结构域或包含亲本家族7催化结构域和亲本家族1CBM）从纤维质底物产生的产物更多。可以通过在存在或不存在所述水解产物的情况下测量纤维质底物的转化率，然后得到存在水解产物的情况下与不存在水解产物的情况下的纤维质底物的转化程度的比率，来确定存在木质纤维素水解产物时的活性增加。木质纤维素水解产物意指通过使用本领域技术人员已知的方法，通过对木质纤维素生物质进行化学或酶学处理产生的戊糖和己糖、木质素单体、有机酸和糖分解产物例如糠醛或羟甲基糠醛中的一种或多种的混合物。因此，可以通过比较存在水解产物的情况下（例如，“未冲洗的”预处理底物或冲洗的底物和水解产物的混合物）和不存在水解产物的情况下（例如“冲洗的预处理底物）这类预处理的木质纤维素底物中纤维素的转化程度，来确定存在木质纤维素水解产物时的活性增加。
存在木质纤维素水解产物时的活性增加可能是由于由木质纤维素水解产物引起的分离的纤维二糖水解酶抑制和/或失活下降引起的。本发明的实施不受所述分离的纤维二糖水解酶展示出存在木质纤维素水解产物时的活性增加的一种或多种机制的限制。
编码分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体
本发明还涉及包含与调节多核苷酸序列可操作地连接的编码分离的纤维二糖水解酶的多核苷酸序列的遗传构建体，所述调节多核苷酸序列指导从宿主微生物表达和分泌所述分离的纤维二糖水解酶。用于本文时，“遗传构建体”是指包含指导表达所述分离的纤维二糖水解酶的元件的分离的多核苷酸。这些元件可包括但不限于包含编码所述分离的纤维二糖水解酶的多核苷酸序列的编码区、与所述编码区可操作地连接的并且包含指导所述编码区转录的多核苷酸序列的启动子以及编码分泌信号肽并且与所述编码区可操作地连接的序列，或者指导所述构建体同源重组到宿主微生物的基因组中的靶向多核苷酸序列。
术语“分泌信号肽”、“分泌信号”和“信号肽”是指可参与成熟或前体形式的分泌蛋白的分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列相对于宿主微生物可为内源的或外源的。信号序列可为来自编码另一分泌蛋白的基因的与目的蛋白正常连接的序列，或者为由来自两个或多个编码分泌蛋白的基因的部分序列编码的“杂合信号序列”。
如本领域普通技术人员所理解的，启动子和编码分泌信号肽的序列可衍生自宿主微生物或衍生自不同的生物，和/或在体外合成。例如，启动子和编码分泌信号肽的序列可衍生自一种或多种编码在宿主微生物中高度表达并分泌的蛋白的基因，例如编码纤维素酶、β-葡糖苷酶、纤维素酶增强蛋白、半纤维素酶或其任意组合。然而，应理解，本发明的实施不受所述遗传构建体中对启动子和编码分泌信号肽的序列的选择的限制。还可以通过相对于天然存在的多核苷酸进行一个或多个核酸的替换、置换、添加或删除来改变或设计这些多核苷酸元件。本发明的实施不受这类对包含元件的遗传构建体进行的改变的约束。
遗传构建体可含有可选择的标记物，用于确定宿主微生物的转化。所述可选择的标记物可存在于遗传构建体上，或所述可选择的标记物可以是与所述遗传构建体共转化的单独的分离的多核苷酸。可选择的标记物的选择是本领域技术人员熟知的，包括赋予所述转化细胞能够利用通常由所述微生物代谢所生成的代谢产物（例如构巢曲霉（A.nidulans）的amdS基因，其编码乙酰胺酶，并且赋予以乙酰胺为唯一氮源生长的能力）的能力或获得抗生素抗药性（例如，大肠杆菌（Escherichia coli）的hph基因，其编码潮霉素-β-磷酸转移酶，并其赋予对潮霉素的抗药性）的（合成或天然）基因。如果宿主菌株基本不表达或不表达所选标记物活性，那么就使用相应的基因作为标记物。这类标记物的实例包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等。因此，相应的宿主微生物将必须缺失与所选择的标记物相关的功能基因，即不表达trp、pyr、arg、leu等。
如本领域技术人员所知的，遗传构建体可含有在宿主微生物中具有功能的转录终止子。转录终止子可位于紧邻编码区的下游处。本发明的实施不受足以在宿主微生物中指导转录终止的转录终止子的选择的约束。
遗传构建体可含有位于如本文所述的多个序列元件之间的另外的多核苷酸序列。这些序列可以是天然的或者合成的，其可导致一个或多个氨基酸被加入到由所述构建体编码的分离的纤维二糖水解酶中。本发明的实施不受位于宿主微生物中遗传构建体的多个序列元件之间的另外的多核苷酸序列的存在的约束。
将遗传构建体引入宿主微生物中的方法是本领域技术人员所熟悉的，包括但不限于，对微生物细胞或真菌原生质体进行氯化钙处理以削弱细胞膜，加入聚乙二醇以使得细胞膜能够融合，通过电穿孔对细胞膜进行去极化，或使用粒子枪经微粒轰击发射所述构建体使其穿过细胞壁和细胞膜。本发明的实施不受将遗传构建体引入真菌细胞的方法的约束。
表达分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物
遗传修饰的微生物可表达并分泌所述分离的纤维二糖水解酶，所述微生物是通过使用编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体对宿主微生物进行转化而产生的。所述宿主微生物可为酵母或丝状真菌，特别是被分类为子囊菌门（Ascomycota）的那些。可用作表达本发明的分离的纤维二糖水解酶的宿主微生物的酵母的属包括酵母菌属、毕赤酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、子囊菌酵母属（Yarrowia）和Arxula。可用作表达本发明的分离的纤维二糖水解酶的微生物的真菌的属包括木霉属、肉座菌属、曲霉菌属、镰刀菌属、腐质霉属、链孢霉属、金孢子菌属、毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属和青霉属（Penicillium）。例如，所述宿主微生物可为里氏木霉和嗜热毁丝菌的工业菌株。
可通过微生物转化领域的技术人员已知的任意数量的方法，将所述遗传构建体引入宿主微生物中，所述方法包括但不限于，用CaCl2处理细胞、电穿孔、基因枪轰击、PEG介导的原生质体融合（例如以引用的方式纳入本文的White et al.,WO2005/093072）。选择了表达所述分离的纤维二糖水解酶的重组体真菌菌株之后，可以在诱导所述分离的纤维二糖水解酶表达的条件下在深层液体发酵中培养所选择的重组体菌株。
产生分离的纤维二糖水解酶
本发明的分离的纤维二糖水解酶可在发酵过程中产生，在所述方法中在深层液体培养发酵中培养遗传修饰的微生物，所述微生物包含编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。
微生物（包含木霉属、毁丝霉属和分类学上相当的属的工业菌株）的深层液体发酵通常以分批、分批补料或连续过程来进行。在分批过程中，除了需氧过程的氧气之外，全部所需材料都在操作开始时被放入反应器中，然后进行发酵直至完成，此时收集产物。用于产生本发明的分离的纤维二糖水解酶的分批过程可以在摇瓶或生物反应器中进行。
在分批补料过程中，在不除去培养液的情况下，用一种或多种培养基成分对培养物进行连续或不断进料。在连续过程中，以体积上相等的速度连续供应新鲜的培养基并除去培养液，以使培养基能够维持稳定的生长速率。
本领域技术人员知晓，发酵培养基包含碳源、氮源以及其他营养素、加入发酵培养基中以改善宿主细胞的生长和酶的产生的维生素和矿物质。可在将宿主细胞接种在培养物中之前、同时或之后，加入这些其他培养基成分。
对于用于产生本发明的分离的纤维二糖水解酶的方法，碳源可包含碳水化合物，所述碳水化合物诱导分离的纤维二糖水解酶从遗传修饰的微生物中的遗传构建体表达。例如，如果所述遗传修饰的微生物是分解纤维素的真菌（例如木霉属或毁丝霉属）菌株，那么所述碳源可包含以下的一种或多种：纤维素、纤维二糖、槐糖、木聚糖、木糖、木二糖以及已知在这类分解纤维素的真菌中诱导纤维素酶和β-葡糖苷酶表达的单糖、二糖、寡糖或多糖。
在分批发酵的情形中，可在接种前或同时将碳源加入发酵培养基中。在分批补料或连续过程的情形中，可在发酵过程中连续或间歇供应碳源。例如，当遗传修饰的微生物是木霉属或毁丝霉属的菌株时，碳进料速度是0.2-4g碳/L培养物/小时，或其之间的任何数量。
用于产生成本发明的分离的纤维二糖水解酶的方法可在约20℃-约50℃的温度或其间的任何温度下进行，例如约25℃-约37℃或其间的任何温度，或20、22、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40、45、50℃或其间的任何温度。
用于产生本发明的分离的纤维二糖水解酶的方法可在约3.0-8.5的pH或其间的任何pH下进行，例如约pH3.5-pH7.0，或其间的任何pH，例如约pH3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或其间的任何pH。
发酵之后，可直接使用含有所述分离的纤维二糖水解酶的发酵液，或者可从所述真菌细胞中分离所述分离的纤维二糖水解酶，例如通过过滤或离心。可通过超滤法去除低分子溶质例如发酵培养基的未消耗成分。可通过例如蒸发、沉淀、沉降（sedimantation）或过滤来浓缩所述分离的纤维二糖水解酶。可加入化学物质例如甘油、蔗糖、山梨醇等以使所述分离的纤维二糖水解酶稳定。可向所述分离的纤维二糖水解酶中加入其他化学物质例如苯甲酸钠或山梨酸钾，以防止微生物污染物的生长。
本发明的分离的纤维二糖水解酶还可由在半固体培养基（例如琼脂，其含有诱导所述分离的纤维二糖水解酶表达的碳源）上生长的遗传修饰微生物产生，所述微生物包含编码所述分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体。例如，所述遗传修饰的微生物可在如上文所限定的含有纤维质底物的琼脂培养基上生长。
包含分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物
所述分离的纤维二糖水解酶可为纤维素酶混合物的一部分。用于本文时，纤维素酶混合物是包含所述分离的纤维二糖水解酶以及一种或多种纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、半纤维素酶、纤维素酶增强蛋白、木质素降解酶、酯酶、蛋白酶、果胶酶、果胶酸裂合酶、半乳聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖醛酸糖苷酶的制剂。本发明的实施不受所述纤维素酶混合物的组成的限制。
以下定义涉及纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、半纤维素酶和相关蛋白的分类，如国际生物化学和分子生物学联合会的生物化学命名联合委员会所定义的（发表于Enzyme Nomenclature1992,Academic Press,San Diego,California,ISBN0-12-227164-5；增刊于Eur.J.Biochem.1994,223,1-5；Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J.Biochem.1996,237,1-5；Eur.J.Biochem.1997,250；1-6,和Eur.J.Biochem.1999,264,610-650，其中每个都以引用的方式纳入本文；又见：chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/），也涉及糖苷水解酶（GH）家族，如公认为糖苷水解酶的标准命名法的CAZy系统所定义的（Coutinho,P.M.&Henrissat,B.,1999,"Carbon-active enzymes:an integrated databaseapproach."In Recent Advances in Carbon Bioengineering,H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat and B.Svensson eds.,The Royal Society ofChemistry,Cambridge,pp.3-12,其以引用的方式纳入本文；又见：afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/），并且为本领域技术人员所熟知。
从广义上讲，术语纤维素酶是指催化纤维素聚合物中连接单个葡萄糖单元的β-1,4糖苷键水解的酶。催化机制涉及内切葡聚糖酶（E.C.3.2.1.4）与纤维二糖水解酶（E.C.3.2.1.91）的协同作用。内切葡聚糖酶水解易接近的纤维素链中部的糖苷键，同时纤维二糖水解酶从这些链的末端持续地释放纤维二糖。纤维二糖水解酶也被称为外切葡聚糖酶。大多数纤维素酶具有相似的分子结构，所述结构由柔性连接肽连接的一个或多个催化结构域和一个或多个碳水化合物结合模块（CBM）组成。大多数纤维素酶包含GH家族5、6、7、8、9、12、44、45、48、51、61和74的至少一个催化结构域。
纤维素酶增强蛋白是一种增强纤维素酶水解纤维素的速率或程度、但其本身不展示出明显的纤维素降解活性的蛋白。纤维素酶增强蛋白包括但不限于分类为GH家族61的蛋白、膨胀因子和扩展因子。
半纤维素酶或半纤维素降解酶是能够水解半纤维素聚合物中的糖苷键的酶。半纤维素酶包括但不限于木聚糖酶（E.C.3.2.1.8）、β-甘露聚糖酶（E.C.3.2.1.78）、α-阿拉伯呋喃糖酶（E.C.3.2.1.55）、β-木糖苷酶（E.C.3.2.1.37）和β-甘露糖苷酶（E.C.3.2.1.25）。半纤维素酶通常包含糖苷水解酶家族5、8、10、11、26、43、51、54、62或113的催化结构域。
β-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21）将纤维二糖水解为葡萄糖。β-葡萄糖苷酶通常包含GH家族1或3的催化结构域，但常常不包含CBM。
木质素降解酶是氧化并参与木质素解聚的酶，包括例如漆酶（E.C.1.10.3.2）、木质素过氧化物酶（E.C.1.11.1.14）、锰过氧化物酶（E.C.1.11.1.13）和纤维二糖去氢酶（E.C.1.1.99.18）。
本发明的纤维素酶混合物还可包含一种或多种酯酶，所述酯酶包括但不限于乙酰木聚糖酯酶（E.C.3.1.1.72）和阿魏酸酯酶（E.C.3.1.1.73）。所述纤维素酶混合物还可包括一种或多种另外的酶活性，例如果胶酶、果胶酸裂合酶、半乳聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖醛酸糖苷酶和半乳糖醛酸糖苷酶。
本发明的发酵过程的实施不受纤维素酶混合物的具体组成的限制。然而，取决于产生的纤维素酶混合物的预期用途，可能需要本发明的分离的纤维二糖水解酶占所述纤维素酶混合物中存在的蛋白的约10wt%-约100wt%，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100wt%，或者其间的任意wt%。
在本发明的一个实施方案中，所述分离的纤维二糖水解酶是由宿主细胞中表达的许多蛋白（包括但不限于上述的纤维素酶混合物）之一。所述纤维素酶混合物中的分离的纤维二糖水解酶和一种或多种其他蛋白可以由单个遗传修饰的微生物或由不同的微生物在组合发酵或单独发酵中分泌。类似地，所述纤维素酶混合物中的分离的纤维二糖水解酶和一种或多种其他蛋白可以单独表达，或在由不同生物的不同菌株以亚组的形式表达并将所述酶结合以制成所述纤维素酶混合物。还可以想到，所述纤维素酶混合物中的分离的纤维二糖水解酶和一种或多种其他蛋白可单独表达，或由单个生物的不同菌株以亚组的形式表达，例如由酵母菌属、毕赤酵母属、汉逊氏酵母属、木霉属、肉座菌属、曲霉菌属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢子菌属、毁丝霉属、梭孢壳属、侧孢霉属、踝节菌属、链孢霉属或青霉属的不同菌株表达，并将所述酶结合以制成所述纤维素酶混合物。优选地，全部所述酶都由单个宿主生物表达，例如属于木霉属、肉座菌属、曲霉菌属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢子菌属、毁丝酶属、梭孢壳属、侧孢霉属、踝节菌属、链孢霉属或青霉属的种的分解纤维素的真菌菌株。
使用分离的纤维二糖水解酶水解纤维质底物
本发明的分离的纤维二糖水解酶可用于水解纤维质底物。术语“纤维质底物”意指衍生自植物生物质并包含纤维素的任何底物，包括但不限于结晶的或不可溶的纤维素、无定形纤维素（例如磷酸膨胀纤维素）、用于产生乙醇或其他高价值产物的预处理的木质纤维素原料、动物饲料、食品、林产品（例如纸浆、纸和木屑）、纺织品、无定形纤维素（例如磷酸膨胀纤维素）、可溶性纤维素衍生物（例如羧甲基纤维素或羟乙基纤维素，也称为CMC和HEC）、着色的纤维素（例如azo-CMC），以及低分子量的纤维素衍生物例如纤维寡糖、荧光底物例如甲基伞形酮-β-D-纤维素二糖苷（MUC）或甲基伞形酮-β-D-乳糖苷（MUL）、或比色底物例如对硝基苯β-D-纤维二糖苷（pNP-G2）或对硝基苯β-D-乳糖苷（pNP-lac）。
在一个实施方案中，所述分离的纤维二糖水解酶可单独或作为纤维素酶混合物的一部分，用于从预处理的木质纤维素原料产生可发酵的糖。
预处理的木质纤维素原料或预处理的木质纤维素是植物来源的材料，其在预处理之前含有20-90%的纤维素（干重），更优选约30-90%的纤维素（干重），甚至更优选40-90%的纤维素（干重），例如20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90%（干重）或其间的任意%（干重），以及至少10%的木质素（干重），更通常至少12%（干重），并且已经经受物理、化学或生物过程以使得纤维更易接近和/或可接受分解纤维素的酶的作用。
对所述原料进行酸预处理的一种方法是使用美国专利No.4,461,648中列出的处理条件进行蒸汽爆破。对原料浆体进行预处理的另一方法包括连续预处理，意指连续抽吸木质纤维素原料通过反应器。连续的酸预处理是本领域技术人员所熟悉的；见，例如，美国专利No.5,536,325；WO2006/128304；和美国专利No.4,237,226。需要时可使用本领域已知的其他技术，例如美国专利No.4,556,430公开的方法。
也可以使用碱来进行所述预处理。与酸预处理相比，用碱进行的预处理不水解所述原料的半纤维素成分，而是所述碱与存在于半纤维素上的酸性基团反应以打开底物的表面。碱的加入还可以改变纤维素的晶体结构，使得其更易水解。可在所述预处理中使用的碱的实例包括铵、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。合适的碱预处理的实例是如美国专利No.5,171,592；5,037,663；4,600,590；6,106,888；4,356,196；5,939,544；6,176,176；5,037,663和5,171,592所述的氨冷冻爆裂、氨纤维爆破或氨纤维膨胀（“AFEX”方法）。优选地，不使用不溶于水的碱（例如氧化钙和氢氧化镁）来实施所述预处理。
然而，本发明使用的预处理过程的另一非限制性实例包括使用有机溶剂对所述原料进行化学处理。Converse等人描述了预处理系统中的有机液体（美国专利No.4,556,430；以引用的方式纳入本文），这类方法的优势是低沸点液体可以容易地被回收并重新使用。其他预处理例如OrganosolvTM方法也使用有机液体（见美国专利No.7,465,791，其也以引用的方式纳入本文）。用加压水处理所述原料也可以是合适的预处理方法（见Weil et al.(1997)Appl.Biochem.Biotechnol.68(1-2):21-40，其以引用的方式纳入本文）。
如本领域技术人员所熟悉的，可在预处理之后、酶促水解之前，通过任意的若干步骤（例如用水稀释、用水洗涤、缓冲、过滤、离心、或者这些方法的组合）对预处理的木质纤维素原料进行处理。可将预处理的原料浆体的pH调至更易被所述纤维素酶处理的值，所述值通常为约4-约8。
使用包含所述分离的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物对预处理的木质纤维素进行酶促水解。术语“酶促水解”意指纤维素酶和另一糖苷酶或混合物对多糖例如纤维素和半纤维素起作用，以将全部或一部分所述多糖转化成可溶性糖例如葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖或其混合物的过程。所述可溶性糖可大部分为纤维二糖和葡萄糖。
在所述纤维素酶混合物的最适pH和温度下或其附近进行酶促水解。例如，实施酶促水解的温度可为约30℃-约75℃或其间的任意温度，例如温度为30、35、40、45、50、55、60、65、70、75℃，或其间的任意温度，并且pH可为约3.5-约8.0，或其间的任意pH，例如pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或其间的任意pH。
在开始对预处理的木质纤维素进行酶促水解之前，纤维素的初始浓度优选为约0.01%（w/w）-约20%（w/w），或其间的任意量，例如0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4、6、8、10、12、14、15、18、20%（w/w）或其间的量。全部纤维素酶的组合剂量可为约0.001-约100mg蛋白质/g纤维素，或其间的任意量，例如0.001、0.01、0.1、1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白/g纤维素或其间的任意量。
可持续约1.5小时-约200小时，或其间的任意时间对预处理的木质纤维素进行酶促水解，例如可持续2小时-100小时，或其间的任意时间进行所述水解，或可持续0.5、1、2、5、7、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200小时或其间的任意时间进行所述水解。
应理解，所述反应条件不意味着以任何方式对本发明进行限制，并且本领域技术人员可根据需要调整所述反应条件。
对预处理的木质纤维素进行的酶促水解可为分批水解、连续水解或其组合。水解可以是被搅动的、非混合的或其组合。酶促水解通常在水解反应器中进行。可以在加入底物到水解反应器中之前、其间或之后，将纤维素酶加入至预处理的木质纤维素底物。
以上描述不意欲以任何方式对所要求保护的发明进行限制。此外，所论述的特征的组合可以不是发明的解决方案所绝对必需的。
实施例
在以下实施例中将会对本发明作进一步的论述。然而，应理解，这些实施例是仅为了进行说明性目的，而不应用于以任何方式对本发明的范围进行限制。
实施例1描述了以下实施例中使用的菌株和载体。实施例2描述了克隆TrCel7A基因和制备TrCel7A的位点饱和（site-saturation）诱变文库。实施例3描述了制备TrCel7A的随机诱变文库。实施例4描述了用表达分离的纤维二糖水解酶的遗传构建体转化里氏木霉宿主菌株。实施例5描述了由微量培养物表达野生型和分离的TrCel7A纤维二糖水解酶。实施例6描述了对编码分离的纤维二糖水解酶的多核苷酸进行测序。实施例7至12描述了用于鉴定对处理底物活性改善的分离的纤维二糖水解酶的高通量筛选测定。
实施例1：菌株和载体
从Invitrogen获得大肠杆菌菌株DH5α（F-ф80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169recA1endA1hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44thi-1gyrA96relA1λ-）(cat.No.18265-017和/或18258-012)。IogenCorporation的专有菌株里氏木霉菌株P297J是里氏木霉菌株BTR213的衍生物，编码TrCel7A、TrCel6A和TrCel7B的基因已经被从所述里氏木霉菌株BTR213中删除（美国公开No.2010-0221778）。菌株BTR213是Iogen Corporation的专有菌株，衍生自里氏木霉菌株RutC30（编号56765TM）。通过选择自发对0.15%w/v的5-氟乳清酸（FOA）有抗性的突变体而获得P297J的尿苷营养缺陷型P297Jaux4。
从Fermentas获得质粒pJET1.2载体，所述载体作为CloneJETTMPCR克隆试剂盒（cat.No.K1232）的一部分。用于表达TrCel7A、TrCel7A-R449E-R450E和从其衍生出的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的里氏木霉转化载体是pTr7Ap-NheI-KpnI-7aT-DRmUra3或pTr7Ap'-NheI-KpnI-7aT-DRmUra3（分别图1和2）。两者都使用trcel7a启动子和终止子启动编码分离的纤维二糖水解酶的多核苷酸的转录。质粒pTr7Ap-NheI-KpnI-7aT-DRmUra3含有野生型trcel7a启动子；质粒pTr7Ap'-NheI-KpnI-7aT-DRmUra3在3’末端含有4个所述启动子的最后18个碱基对的重复序列。这些载体还含有用于克隆编码分离的纤维二糖水解酶的多核苷酸的Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ位点、用于促进天然的trcel7a位点的定向整合的正向重复序列、以及用于使转化体能够在尿嘧啶耗尽的培养基上生长的里氏木霉ura3基因。
实施例2：TrCel7A的位点饱和诱变（SSM）
a.SSM PCR
使用含有靶向多个氨基酸位置的简并密码子（NNS）的引物生成TrCel7A的位点饱和诱变（SSM）文库。使用两步PCR方法进行SSM，所述PCR方法包括Megaprimer合成和随后的PCR介导的重叠延伸。使用iProofTM高保真DNA聚合酶（Bio-Rad）进行PCR反应。将含有编码TrCel7A的基因组DNA与侧翼序列（SEQ ID NO:384）的载体用作L375X文库的模板。将含有编码TrCel7A-R449E-R450E的基因组DNA与侧翼序列（SEQ ID NO:385）的载体用作全部其他SSM文库的模板。
对于每个SSM文库，使用外部正向引物AC639和内部诱变反向引物扩增MegaPrimer A，同时通过将外部反向引物AC640与内部诱变正向引物结合来得到MegaPrimer B。诱变引物含有简并密码子序列，以在靶位点引入随机的氨基酸置换。所有引物序列列于表5中。使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Gel and PCR Clean-Up system,Promega）对MegaPrimers A和B进行琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中纯化所述MegaPrimers A和B。在第二轮PCR中，将用于给定SSM文库的两种MegaPrimer退火，并延伸5-10个循环，以产生最终模板。然后，加入外部引物AC639和AC640用于另一轮的25个循环，以扩增最终产物。使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Promega）对最终SSMPCR扩增子进行琼脂糖电泳，并从凝胶中纯化约1.7kb的TrCel7A扩增子。
表5：用于生成TrCel7A SSM文库的引物的列表
1在简并密码子中，N代表A、T、C或G，而S代表C或G。
b.体外重组和在大肠杆菌中扩增文库
用于克隆L375X文库的载体为pTr7Ap'-Nhe Ⅰ-Kpn Ⅰ-7aT-DRmUra3（图2），而用于所有其他SSM文库的载体为pTr7Ap-Nhe Ⅰ-Kpn Ⅰ-7aT-DRmUra3（图1）。用Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ消化两种载体，并用Antarctic磷酸酶（New England Biolabs）处理两种载体。使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Promega）对消化的载体进行琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶中纯化约8.1kb的线性化载体片段。
使用Quant-iTTM dsDNA试剂盒（Invitrogen）按照制造商的方案确定线性化的载体和每个SSM PCR扩增子的DNA浓度。外部引物（AC639和AC640）含有与线性化的所得载体的游离末端同源的序列。该同源性使得能够通过体外重组将SSM PCR扩增子克隆至所得载体中。使用In-FusionTM重组酶（Clontech）按照制造商的建议通过体外重组来克隆线性载体片段和每个SSM PCR扩增子。按照制造商的建议使用重组酶反应物来转化100μL的DH5αTM Efficiency感受态细胞（Invitrogen）。将来自每个文库转化的细胞在两个15cm的选择性琼脂培养基平板上铺板，使其在37℃下过夜生长。
从转化平板上刮取得到来自每个文库的菌落。用于收获细胞的方案改进自Current Protocols in Molecular Biology Unit5.8A:Productionof a complete cDNA library,pg.5.8.4(Klickstein,L.B.,2001)。具体地，将Luria Bertani肉汤培养基（5mL）加入到每个15cm的琼脂平板，在室温下静置5分钟。使用无菌塑料细胞刮棒（Costar）轻轻地从琼脂表面刮取菌落。将来自所述文库的两个平板的细胞混合在一起。制成细胞悬液的甘油保存液（15%的终浓度），以备将来扩增文库所需。使用Plus SV Minipreps DNA纯化系统（Promega）从其余的细胞悬液中提取质粒DNA，随后将所述质粒DNA用于转化里氏木霉宿主菌株P297Jaux（实施例4）。
实施例3：TrCel7A的随机诱变
a.易错PCR
通过易错PCR使用II DNA聚合酶（Agilent）生成随机诱变文库。进行两次易错PCR。一个反应使用20fmol的含有编码TrCel7A-R449E-R450E的多核苷酸和侧翼序列（SEQ ID NO:442）的载体。使用100fmol的含有编码TrCel7A的多核苷酸和侧翼序列（SEQID NO:443）的载体进行另一易错PCR。两个反应都含有IIDNA聚合酶以及引物AC639和AC640。将退火温度设置为60℃，持续20个循环完成扩增。使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Promega）对易错PCR扩增子进行琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶中纯化约1.6kb的扩增子。以下示出了引物序列：
AC639：5'CCGCACTCCCCATCCCTACCATCTATCCGAACTTCCCCGTC(SEQ ID NO：386)
AC640：5’TTCGCCACGGAGCTGGTACCTTACAGGCACTGAGAGTAGTAAG(SEQ ID NO：387)
b.体外重组和在大肠杆菌中扩增文库
用Nhe Ⅰ和Kpn Ⅰ消化pTr7Ap-Nhe Ⅰ-Kpn Ⅰ-7aT-DRmUra3(图2)载体，并用Antarctic磷酸酶（New England Biolabs）处理该载体。使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Promega）对消化的载体进行琼脂糖凝胶电泳，并从凝胶中纯化约8.1kb的线性化载体片段。使用Quant-iTTM dsDNA试剂盒（Invitrogen）按照制造商的方案确定线性化的载体和易错PCR扩增子的DNA浓度。外部引物（AC639和AC640）含有与线性化的所得载体的游离末端同源的序列。该同源性使得能够通过体外重组将易错PCR扩增子克隆至所得的载体中。使用In-FusionTM重组酶（Clontech）按照制造商的建议通过体外重组来克隆线性载体片段和易错PCR扩增子文库。
按照制造商的建议使用重组酶反应物来转化500μL的DH5αTM Efficiency感受态细胞（Invitrogen）。将来自文库转化的细胞接种在10个15cm的选择性琼脂培养基平板上，使其在37℃下过夜生长。
从转化平板上刮取得到来自文库的菌落。用于收获细胞的方案改进自Current Protocols in Molecular Biology Unit5.8A（Ausubel.et al.,Eds.,John Wiley&Sons,p.5.8.4）。具体地，将Luria Bertani肉汤培养基（5mL）加入到每个15cm的琼脂平板，在室温下静置5分钟。使用无菌塑料细胞刮棒（Costar）轻轻地从琼脂表面刮取菌落。将来自所述文库的全部10个平板的细胞混合在一起。制成细胞悬液的甘油保存液（15%的终浓度），以备将来扩增文库所需。使用Plus SVMinipreps DNA纯化系统（Promega）从其余的细胞悬液中提取质粒DNA，随后将所述质粒DNA用于转化里氏木霉宿主菌株P297Jaux（实施例4）。
实施例4.分离的纤维二糖水解酶在里氏木霉宿主菌中的表达
a.基因枪转化
使用具有Hepta适配器（adapter）的PDS-1000/He系统（BioRad;E.I.DuPont de Nemours and Company）通过基因枪金粒子轰击对如在实施例2和3中制备的具有TrCel7A文库表达载体的菌株P297Jaux进行转化。将金粒子（中间粒径为0.6μm，BioRad Cat.No.1652262）用作微载体。在转化前，在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Difco）平板上培养里氏木霉菌P297Jaux4-5天直到形成孢子。收集孢子并使其悬浮在无菌水中。将大约3.5×108个孢子在含有基本培养基（MM）的100mm直径的平板上铺板。转化使用以下参数：破坏压为1350psi，氦气压为28mm Hg，靶距离为3cm。粒子递送后，用2.5mL的无菌0.9%NaCl洗涤来自每个转化平板的孢子，将其涂布在3-4个含有MM的150mm的平板上，在30℃下孵育5-10天。将所有转化体转移至PDA培养基，在30℃下孵育直至孢子形成，然后在ASC平板上进行进一步筛去。
基本培养基（MM）琼脂：
1f.s.–过滤灭菌的
b.筛去表达无活性的纤维二糖水解酶的转化体
磷酸膨胀纤维素（ASC）的制备如下：将400g的SIGMACel T50用600mL的丙酮浸湿，并用叶片式混砂器在20L的桶中充分混合。然后，将桶的内容物在冰水浴中冷却。将总共4L的商品级磷酸（85%）缓慢加到浸湿的纤维素中并不断搅拌。将预冷的去离子水加到酸/纤维素凝胶状混合物中，导致白色块状物沉淀。加入5-7%的碳酸氢盐溶液以开始中和浆体。将所述溶液缓慢地加到浆体中，同时不断混合。一旦浆体的pH达到5-7，通过真空过滤使其过滤通过GF/A滤纸。用多于4L的去离子水洗涤湿的白色纤维素制备物，以确保从所得的无定形纤维素中去除了盐和可溶性糖。酸处理后纤维素的一般固体含量为7-9%。
为了筛去表达无活性的TrCel7A纤维二糖水解酶的转化体，如下用富含内切葡聚糖酶的酶处理ASC。将64.7g的ASC与25mL250mMpH5.0的柠檬酸盐缓冲液混合。加入水以将浆体补足至120mL。浆体包含在250mL的螺旋盖锥形烧瓶中。将约170-180mg的包含纤维素酶制备物的总蛋白加入体积不大于10mL的浆体中，所述纤维素酶制备物来自TrCel7A和TrCel6A纤维素酶组分有缺陷的里氏木霉菌株。富含内切葡聚糖酶的酶的剂量为40mg蛋白/g纤维素（干重）。将烧瓶在50℃、200rpm下震荡孵育16小时过夜，然后使用来自Fisher Scientific的Powergen1000均化器进行均化处理。然后，将酶处理的ASC用等体积的水稀释，并将pH调至4.5-4.6，然后在标准厨房搅拌器中混合1分钟，继而在高压灭菌器中在标准温度和压强下进行灭菌。此时，ASC的浓度为25g/L。
通过转化体的孢子在ASC筛去培养基上萌发，对表达分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的木霉转化体中的TrCel7A活性进行了评估（表6）。将灭菌的培养基（200mL）倒入245mm×245mm×l.5mm的正方形塑料生物测定平板中。将表达分离的TrCel7A纤维二糖水解酶、野生型TrCel7A或TrCel7A-R449E-R450E的转化体点在所述培养基上，将平板在30℃下孵育6天，然后在50℃下孵育1天。通过在转化体菌落周围形成的透明圈来评估TrCel7A的活性。
表6：ASC筛去培养基的组成
组分 每L培养基含有的量
5×基本培养基盐* 40mL
眎蛋白胨＃3（Difco） 0.2g
牛胆汁（Difco） 1.8g
琼脂 4g
去离子水 80mL
磷酸膨胀纤维素（25g/L） 80mL
1M MgSO4-7H2O 4mL
*5×基本培养基盐组成（/L培养基）：50g KH2PO4，30g NH4（SO4)，15g柠檬酸钠-2H2O，25mg FeSO4-7H2O，8mg MnSO4-H2O，7mgZnSO4-7H2O，10mg CaCl2-2H2O。
实施例5：在微量培养物中产生分离的TrCel7A纤维二糖水解酶
在28-30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂上培养里氏木霉菌，直至获得孢子的汇合菌苔。收集孢子并用来接种于0.7mL的表达培养基，所述培基具有以下初始组成：100mM pH3.5的DL-苹果酸，12.7g/L(NH4)2SO4，8.0g/L KH2PO4，4.0g/L MgSO4＊7H2O，1.02g/L CaCl2，5.0g/L干玉米浸液，10mg/L FeSO4＊7H2O，3.2mg/L MnSO4＊H2O，2.8g/LZnSO4＊7H2O。在28-30℃下在96孔深孔板中使用具有诱导作用的碳水化合物源培养所述培养物，所述平板在以60-80°角倾斜的RolloDrum(New Brunswick Scientific,Edison,NJ)上以45-60rpm的速度摇动。5-6天后，离心所述培养物，上清液用于分析。
对于更大规模的分析，收集每个变体的孢子，用来接种在24孔深孔板的12个孔，每个孔含有4mL上文所述的表达培养基。在28-30℃下使用具有诱导作用的碳水化合物源培养所述培养物，在1英寸的轨道摇床上以225-275rpm摇动。5-6天后，离心所述培养物，将来自12个孔中每个孔的上清液混合并进行分析。
通过ELISA确定微量培养滤液中的TrCel7A的浓度。将培养物上清液和纯化的组分标准物在磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.2）中稀释至0.01-10μg/mL，在微量滴定板（Costar EIA#9018）中4℃孵育过夜。将这些平板用含有0.1%吐温-20的PBS（PBS/吐温）洗涤，然后在含有1%牛血清白蛋白的PBS（PBS/BSA）中室温孵育1小时。将封闭的微量滴定孔用PBS/吐温洗涤。将TrCel7A特异性的兔多克隆抗血清在PBS/BSA中稀释，加到单独的微量滴定板中，室温孵育2小时。将平板洗涤并与在PBS/BSA中1:2000稀释的与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体（Sigma Cat.No.A6154）室温孵育1小时。洗涤后，将四甲基联苯胺（Sigma Cat.No.T0440）加到每个平板中，室温孵育30分钟。测量每个孔在660nm下的吸光度，使用TrCel7A标准曲线将吸光度转化为蛋白浓度。
实施例6：对里氏木霉文库克隆进行测序
为了分离里氏木霉基因组DNA，用无菌吸液头将从马铃薯葡萄糖琼脂平板上收集的（或来自甘油保存液的）里氏木霉孢子接种到1mL的马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Difco）中。30℃下培养所述培养物20-24小时。20000×g离心5分钟使菌丝体沉淀。
使用Wizard基因组DNA提取试剂盒（Promega）按照修改的方案提取基因组DNA。将Nuclei Lysis Solution（包含在试剂盒中）和400-650μm的玻璃珠加至沉淀的菌丝体。然后，使用涡旋器（vortex）或均化器以最大速度（6.5米/秒）处理1分钟，对菌丝体进行物理裂解。然后，按照制造商的方案3.E：Isolating gDNA from planttissue对基因组DNA进行纯化。通过测量溶液在260nm下的吸光度来确定DNA的浓度（Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Second Edition",Cold Spring Harbor Press,p.C1）。
将提取的基因组DNA用作模板用于从里氏木霉基因组PCR扩增TrCel7A。将反向引物KAP070设计成针对文库的载体骨架，以确保扩增的TrCel7A基因实际上是来自文库的插入拷贝，而不是来自里氏木霉基因组的内源遗传物质。在PCR混合物中引物KAP070和KAP072与iProofTM高保真DNA聚合酶（Bio-Rad）一起使用。引物序列示于以下：
KAPO70：5’AAGCCGATGTCACACGCG(SEQ ID NO：444)
KAP072：5’CAGATCCTCCAGGAGACTTG(SEQ ID NO：445)
使用Wizard凝胶和PCR纯化系统（Promega）对扩增子（对于TrCel7A cDNA为约2.2kb，对于具有双内含子的TrCel7A为约2.3kb）进行琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中纯化所述扩增子。通过测量溶液在260nm下的吸光度确定DNA的浓度（p.C1，Sambrook et al.,1989,其以引用的方式纳入本文）。
可将纯化的扩增子直接送去测序，或者使用CloneJETTM试剂盒（Fermentas）按照制造商的建议将其平末端克隆到pJET1.2载体中，或者在将其送去测序之前对其进行第二轮的扩增。按照制造商的建议将pJET1.2-TrCel7A构建体转化到Subcloning EfficiencyTMDH5αTM感受态细胞（Invitrogen）中。从单个转化体或转化体的混合物中少量制备质粒DNA，并将该质粒DNA送去外部测序机构（Genome Quebec）进行序列分析。
实施例7：筛选分离的对纤维素的比活性提高的纤维二糖水解酶
在使用96孔微孔板格式的0.20mL柠檬酸盐缓冲的（pH5）纤维素水解测定中，测试了来自里氏木霉微量培养物（实施例5）的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶。将来自每个微量培养物的上清液的等分试样加入到每个含有0.15%w/v纤维素的孔中，50℃下孵育20小时。用里氏木霉TrCel7B和TrCel5A内切葡聚糖酶（每种酶都是40mg蛋白/g纤维素）以及125IU/g纤维素的黑曲霉（A.niger）β-葡糖苷酶来补充里氏木霉上清液。每个96孔微量培养板中含有6个相应的亲本对照，用于比较。通过浊度下降（OD600）来测量纤维素酶的活性。通过将纤维素酶活性除以TrCel7A的浓度来确定比活性（通过ELISA确定；实施例5）。将每种分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的比活性与具体微量培养板的6个相应亲本对照的平均值进行比较。确定6个亲本对照的标准差，然后选择如下的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶作为阳性结果：展示出与对照距离至少2.5个标准差的比活性。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，对编码纤维二糖水解酶(展示出对纤维素的比活性提高)的多核苷酸进行测序，如实施例6。
表7：对纤维素比活性提高的分离的纤维二糖水解酶
亲本 一个或多个氨基酸置换 提高
SEQ ID NO：1 P137S；K353M +++
SEQ ID NO：1 T5I；T26A；E325K；T356I +++
SEQ ID NO：446 P390A ++
SEQ ID NO：446 N200F ++
SEQ ID NO：446 P390W ++
SEQ ID NO：446 G358S；P390C +
SEQ ID NO：446 P390K +
SEQ ID NO：446 D241L +
SEQ ID NO：446 P390G +
SEQ ID NO：446 P382L +
SEQ ID NO：446 F95L +
SEQ ID NO：446 N219S +
SEQ ID NO：446 E385G +
SEQ ID NO：446 G253D +
SEQ ID NO：446 E385I +
SEQ ID NO：1 T332I；M364V +
＊提高：+++距离亲本平均值＞10个sd；++距离亲本平均值＞4个sd；+距离亲本平均值＞2个sd(sd，标准方差)。
实施例8：筛选对木质纤维素的比活性提高的分离的纤维二糖水解酶
使用美国专利No.4,461,648中所述的方法对小麦秸秆进行预处理。预处理后，加入浓度为0.5%的苯甲酸钠作为防腐剂。然后，在使用之前，使用布氏漏斗（Buchner funnel）和滤纸用6倍体积的微热的（约35℃）的自来水来洗涤预处理的材料。
在使用96孔微量培养板格式的0.21mL柠檬酸盐缓冲的（pH5）小麦秸秆水解测定中，测试了来自里氏木霉微量培养物（实施例5）的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶。将来自每种微量培养物的上清液的等分试样加入到包含小麦秸秆（0.9%w/v纤维素）的孔中，在50℃下孵育18小时。用里氏木霉TrCel7B和TrCel5A内切葡聚糖酶（每种酶都是40mg蛋白/g纤维素）以及125IU/g纤维素的黑曲霉β-葡糖苷酶来补充里氏木霉上清液。每个96孔微量培养板中含有6个相应的亲本对照，用于比较。将微量培养板在2800×g下离心3分钟，并采集上清液的等分试样，用于测定葡萄糖含量。通过用标准的葡萄糖氧化酶/葡萄糖过氧化物酶偶联的反应测定检测葡萄糖，来测量酶的活性（Trinder,P.(1969)Annals of Clinical Biochemistry,6:24-27）。通过将所述酶活性除以TrCel7A的浓度来确定比活性（通过ELISA确定；实施例5）。将每种分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的比活性与具体微量培养板上的6个相应的亲本对照的平均值进行比较。确定6个相应的亲本对照的标准差，然后选择如下分离的TrCel7A纤维二糖水解酶作为阳性结果：展示出距离对照至少2.5个标准差的比活性。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，并对编码分离的纤维二糖水解酶（展示出对木质纤维素的比活性提高）的多核苷酸进行测序，如实施例6。
表8：对木质纤维素的比活性提高的分离的纤维二糖水解酶
亲本 一个或多个氨基酸置换 提高＊
SEQ ID NO：446 N45D；D52R +++
SEQ ID NO：446 S46T +++
SEQ ID NO：446 S46G +++
SEQ ID NO：446 P390G +++
SEQ ID NO：446 Q27L ++
SEQ ID NO：446 D241L ++
SEQ ID NO：446 P390L ++
SEQ ID NO：446 G53A ++
SEQ ID NO：446 D241R ++
SEQ ID NO：446 S46L ++
SEQ ID NO：446 N197L ++
SEQ ID NO：446 D368A +
SEQ ID NO：446 E385L +
SEQ ID NO：446 N200F +
WT TrCel7A Q186K；Q351R +
SEQ ID NO：1 A372T；V393A +
＊提高：+++距离亲本平均值＞10个sd；++距离亲本平均值＞5个sd；+距离亲本平均值＞2个sd(sd，标准方差)。
实施例9：筛选由葡萄糖引起的抑制作用减弱的纤维二糖水解酶
在使用96孔微孔板格式的0.20mL柠檬酸盐缓冲的(pH5)纤维素水解测定中，测试了来自里氏木霉微量培养物(实施例5)的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶。将来自每种微量培养物的上清液的等分试样加入到含有60g/L葡萄糖的孔和不含葡萄糖的孔中，与0.15w/v的纤维素在50℃下孵育20小时。用里氏木霉TrCel7B和TrCel5A内切葡聚糖酶(每种酶都是40mg蛋白/g纤维素)以及125IU/g纤维素的黑曲霉β-葡糖苷酶来补充里氏木霉上清液。每个96孔微量培养板中含有6个相应的亲本对照，用于比较。通过浊度下降(OD600)来测量纤维素酶的活性。通过用存在葡萄糖的情况下纤维素酶的活性除以不存在葡萄糖的情况下纤维素酶的活性，来计算所有分离的TrCel7A纤维二糖水解酶和6个相应的亲本对照的±葡萄糖活力比。将每种分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的±葡萄糖活力比与具体微量培养板上6个相应亲本对照的平均值进行比较。确定6个相应的亲本对照的标准差，然后选择如下的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶作为阳性结果：展示出比对照高至少2个标准差的±葡萄糖活力比。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，并对编码分离的纤维二糖水解酶（展示由葡萄糖引起的抑制作用减弱）的多核苷酸进行测序，如实施例6。
表9：由葡萄糖引起的抑制作用减弱的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶
＊提高：+++距离亲本平均值>4个sd；++距离亲本平均值>3个sd；+距离亲本平均值>2个sd（sd，标准方差）。
实施例10：筛选存在木质纤维素水解产物时的活性增加的分离的纤维二糖水解酶
用高剂量的纤维素酶（75mg/g）处理未洗涤的预处理的小麦秸秆（如美国专利No.2010-0056774中制备的），在最适于纤维素酶活性的温度下孵育96小时。然后，将反应物煮沸以使酶失活，并使其通过玻璃纤维过滤器，以除去残留的固体。剩下的滤液在本文中被称为水解产物。
在使用96孔微孔板格式的0.25mL柠檬酸盐缓冲的（pH5）纤维素水解测定中，测试了来自里氏木霉微量培养物（实施例5）的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶。将来自每个微量培养物的上清液的等分试样加入到含有100μL水解产物（+水解产物）或100μL水（-水解产物）的孔中，与0.15w/v的纤维素在50℃下孵育20小时。用里氏木霉TrCel7B和TrCel5A内切葡聚糖酶（每种酶都是40mg蛋白/g纤维素）以及125IU/g纤维素的黑曲霉β-葡糖苷酶来补充里氏木霉上清液。每个96孔微量培养板中含有6个相应的亲本对照，用于比较。通过浊度下降（OD600）来测量纤维素酶的活性。通过用存在水解产物的情况下纤维素酶的活性除以不存在水解产物的情况下纤维素酶的活性，来计算所有分离的TrCel7A纤维二糖水解酶和6个相应的亲本对照的±水解产物活力比。将每个分离的TrCel7A纤维二糖水解酶的±水解产物活力比与具体微量培养板上6个相应的亲本对照的平均值进行比较。确定6个相应的亲本对照的标准差，然后选择如下的分离的TrCel7A纤维二糖水解酶作为阳性结果：展示出比对照高至少2个标准差的±水解产物活力比。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，并对编码分离的纤维二糖水解酶(展示出存在木质纤维素水解产物时的活性增加)的多核苷酸进行测序，如实施例6。
表10.存在木质纤维素水解产物时活性增加的分离的纤维二糖水解酶
亲本 一个或多个氨基酸置换 提高＊
SEQ ID NO：1 D114E；D150N；T453S ++
SEQ ID NO：1 M111T；G435S +
SEQ ID NO：1 I93V；V131A +
SEQ ID NO：1 C209S；P265T；D378E；T445I +
＊提高＊：＝++距离亲本平均值＞3个sd；+距离亲本平均值＞2个sd(sd，标准方差)。
实施例11：筛选由木质素引起的失活下降的分离的纤维二糖水解酶
a.木质素的制备
使用美国专利No.4,461,648中描述的方法对小麦秸秆进行预处理。预处理后，加入浓度为0.5％的苯甲酸钠作为防腐剂。然后，在提取木质素之前，使用布氏漏斗(Buchner funnel)和滤纸用6倍体积的微热的(约35℃)自来水洗涤预处理的材料。
通过在625mL82％的H2SO4中搅拌4小时，从预处理的小麦秸秆(333g湿重；约30％固体；约60％纤维素)中对木质素进行酸提取。使用布氏漏斗和玻璃纤维过滤器过滤剩下的固体至潮湿状态，将其重悬于2L水中，用NaOH将pH调至4.5。过滤所述固体并用8L水洗涤。所述固体在本文中被称为“木质素”。
通过将等量(w/w)的木质素与牛血清白蛋白(BSA)(30g/L，50mM柠檬酸盐缓冲液，pH5，0.1％苯甲酸钠)在50℃下摇动孵育5小时，对木质素进行BSA处理。
b.高通量筛选分离的纤维二糖水解酶
将里氏木霉微量培养物过滤物(实施例5)在水中稀释5倍，并分装为0.15mL的等分试样用于在0.25mL含有木质素（0.4%w/v）或BSA处理的木质素（0.4%w/v）的用柠檬酸盐缓冲（50mM；pH5）的反应物中进行预孵育。在含有1个玻璃珠的96孔微量培养板中以轨道摇动（NB Innova44）在50℃下预孵育2小时。每个96孔微量培养板含有6个相应的亲本纤维二糖水解酶对照，用于比较。预孵育后，将微量培养板2800×g离心5分钟，吸出上清液用于残余活性测定。将上清液在水中稀释10倍，然后进行活性测量。
将稀释的上清液（0.05mL）与0.25mM的4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷（MUL）在100μL柠檬酸盐缓冲的（50mM；pH5）反应物中在黑色Costar3915微量培养板中在50℃下孵育15分钟。在范围为5-0.08μΜ的第一列中制备4-甲基伞形酮（4-MU）标准曲线。通过向所有孔中加入100μL0.2M（pH10）的甘氨酸来终止反应。370nm下进行激发后，在445nm下测量荧光发射。通过将荧光单元转换成释放的4-MU的量，来确定残余的酶活。通过将存在未处理的木质素时的残余酶活除以存在BSA处理的木质素时的残余酶活来计算活力比。将每个分离的纤维二糖水解酶的活力比与具体微量培养板上的6个相应的亲本对照的平均值进行比较。使用t检验以95%置信水平来选择阳性结果（具有增加的比率的那些）。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，并对编码分离的纤维二糖水解酶（展示出由木质素引起的失活下降）的多核苷酸进行测序，如实施例6。表11：由木质素引起的失活下降的分离的纤维二糖水解酶
亲本 一个或多个氨基酸置换* 归一化比率
SEQ ID NO：1 T59A；S156G；C486stop 2.18
SEQ ID NO：1 T281I；T455A；Q463K 2.05
SEQ ID N0：1 Y466S 1.97
SEQ ID NO：1 G75S；S400G；C486stop 1.96
SEQ ID NO：1 G483V；S498stop 1.93
SEQ ID NO：1 D249N；Q487frame 1.89
SEQ ID NO：1 N54I：G471S 1.88
SEQ ID NO：1 N420D；G444D；L489P 1.82
SEQ ID NO：446 A100G 1.70
SEQ ID NO：446 N197A；Q468stop 1.66
SEQ ID NO：1 C138S 1.65
SEQ ID NO：1 G476D 1.65
SEQ ID N0：1 P194Q；T478ins 1.65
SEQ ID NO：1 V155M；C486R 1.60
SEQ ID NO：1 A316V；T383A；P437T；G467D 1.60
SEQ ID NO：446 P390V 1.55
SEQ ID NO：446 K102R；D130N 1.53
SEQ ID NO：446 P382I 1.52
SEQ ID NO：446 N200C 1.50
SEQ ID NO：1 N441D；T453I；G483S；L489Q 1.50
SEQ ID NO：1 L108I：N436D 1.47
SEQ ID NO：1 S211T；Q463L；V488D 1.47
SEQ ID NO：1 R450S；S482N 1.37
SEQ ID NO：446 K102S 1.34
SEQ ID NO：446 N200F 1.34
SEQ ID NO：446 G253RQ463S 1.33
SEQ ID NO：446 K181L 1.28
＊“frame”是指在指示的氨基酸位置开始引入移码；“stop”是指在指示的氨基酸位置引入终止密码子
实施例12：筛选存在木质素时的活性增加的分离的纤维二糖水解酶
对于每个分离的纤维二糖水解酶和相应的亲本纤维二糖水解酶对照，计算对预处理的小麦秸秆的比活性(如实施例8中所述的“WS活性”)与对纤维素的比活性(如实施例7中所述的“纤维素活性”)的比率。将分离的纤维二糖水解酶的WS活性：纤维素活性的比率与其具体微量培养板上的6个相应的亲本纤维二糖水解酶对照的平均WS活性：纤维素活性的比率进行比较。确定6个相应的亲本纤维二糖水解酶对照的标准差，然后选择如下的分离的纤维二糖水解酶作为阳性结果：展示出WS活性：纤维素活性的比率比所述6个相应的亲本纤维二糖水解酶对照高至少2.5个标准差。将所有阳性结果再次在微量培养物中产生并重新筛选，并对编码分离的纤维二糖水解酶(展示出在存在木质素时对纤维素的活性增加)的多核苷酸进行测序，如实施例6。
表12：存在木质素时活性增加的分离的纤维二糖水解酶
亲本 一个或多个氨基酸置换 提高＊
SEQ ID NO：446 A143G +++
SEQ ID NO：446 A197Q +++_
SEQ ID NO：1 A372T；V393A +++
SEQ ID NO：446 A197W +++
SEQ ID NO：1 Y370H ++
SEQ ID NO：446 D368G ++
SEQ ID NO：446 F95Y +
SEQ ID NO：446 D368A +
SEQ ID NO：1 A299T +
SEQ ID NO：446 M374V +
提高：+++距离亲本平均值＞4个sd；++距离亲本平均值＞3个sd；+距离亲本平均值＞2个sd(sd，标准方差)。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶，所述修饰的家族7催化结构域具有一个或多个选自于如下的氨基酸置换：
X390G，X390A，X390K，X390W，X390C，X390L，X241L，X241R，X46T，X26A，X45D，X51I，X52R，X53A，X95L，X219S，X351R，X353M，X368A，X382I，X385I，X46L，X52W，X53R，X95Y，X138S，X139Q，X143L，X143G，X144V，X197L，X197Q，X197W，X241V，X379C，X390V，X53M，X53W，X87T，X139E，X139M，X139S，X144A，X181L，X264C，X264Y，X326F，X343L，X374V，X375A，X382L，X382Q，X385L，X419F，X436D，X54S，X54I，X75S，X93V，X102R，X111T，X129S，X130N，X150N，X183N，X184S，X237T，X253R，X271I，X364V，X378E，X379E，X383S，X400G，X406P，X46A，X54D，X130E，X139R，X197V，X260D，和X373Y，
或其任意组合；所述位置根据相应的亲本家族7催化结构域与SEQ IDNO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸的比对确定，其中所述修饰的家族7催化结构域展示出与SEQ ID NO：1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO：2的1-438位氨基酸约80％-约99.9％的同一性，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族7催化结构域的亲本家族7催化结构域的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
2.权利要求1的分离的纤维二糖水解酶，还包含碳水化合物结合模块和位于所述修饰的家族7催化结构域与所述碳水化合物结合模块之间的连接肽。
3.权利要求2的分离的纤维二糖水解酶，其中所述碳水化合物结合模块是家族1碳水化合物结合模块，所述家族1碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO：2的474-509位氨基酸约50％-约99％的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T和X489Q，所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQID NO：1的461-497位氨基酸的比对确定。
4.分离的纤维二糖水解酶，其包含家族7催化结构域、修饰的家族1碳水化合物结合模块和在所述家族7催化结构域与所述修饰的家族1碳水化合物结合模块之间的连接肽，其中所述修饰的家族1碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO：2的474-509位氨基酸约50％-约99％的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T和X489Q，所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸的比对确定，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族1碳水化合物结合模块的亲本家族1碳水化合物结合模块的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
5.一种分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，D241L，D241R，S46T，T26A，N45D，Y51I，D52R，G53A，F95L，N200F，N219S，Q351R，K353M，D368A，P382I，E385I，S46L，S46G，D52W，D52T，G53R，F95Y，A100G，C138S，G139Q，A143L，A143G，L144V，N197L，N197Q，N197W，D241V，S379C，P390V，Y466S，G467D，G53M，G53W，S87T，A100T，A100V，A100W，A100L，K102S，G139E，G139M，G139S，L144A，K181L，N200C，G253D，N264Y，P314A，L326F，F343L，D368G，M374V，L375A，P382L，P382Q，E385L，E385G，S419F，N431R，N436D，S475N，T26S，R39L，S46I，N54S，N54I，G75S，G88V，I93V，K102R，L108I，M111T，D114E，F129S，D130N，V131A，P137S，D150N，V155M，S156G，I183N，N184S，P194Q，N197A，C209S，S211T，I237T，G253R，T271I，A316V，N324D，G339D，T356I，G358S，M364V，A372T，D378E，S379E，T383A，T383S，V393A，S400G，Q406P，N420D，F423Y，G435S，P437T，N441D，G444D，T446A，T447S，R450S，T453I，T453S，T454I，T455A，Q463L，Q463S，Q463K，G471S，G476D，S482N，G483V，G483S，C486R，V488D，L489P，L489Q，S46A，N54D，D130E，G139R，N197V，G260D，L282I，Y370H，N373Y，S398P，和P459L，
其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸具有约80％-约99.9％的同一性，并且相对于从中衍生出所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的亲本里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
6.权利要求5的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，D241L，D241R，S46T，，N45D，D52R，G53A，N200F，D368A，P382I，E385I，S46L，S46G，G53R，A100G，G139R，A143G，A143L，L144V，N197L，N197Q，N197W，D241V，S379C，P390V，G467D，G53M，G53W，S87T，A100T，A100V，A100W，A100L，G139M，G139S，N200C，G253D，N264Y，P314A，L326F，F343L，D368G，P382L，P382Q，E385L，E385G，N431R，S475N，T26S，R39L，N54S，N54I，K102R，F129S，D130N，I183N，N184S N197A，1237T，G253R，T271I，A316V，N324D，G339D，G358S，M364V，A372T，T383S，T383A，V393A，Q406P，F423Y，P437T，T446A，T447S，T454I，G483V，S46A，N54D，N197V，N264C，L282I，和S398P，
其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸具有约90％-约99.9％的同一性。
7.一种遗传构建体，其包含编码以下酶的核酸序列：
a.权利要求1-4任一项的分离的纤维二糖水解酶，或
b.权利要求5或6的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
8.包含权利要求7的遗传构建体的遗传修饰的微生物。
9.权利要求8的遗传修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的种。
10.权利要求9的遗传修饰的微生物，其中所述微生物是链霉菌属（Streptomyces）、酵母菌属（Saccharomyces）、毕赤酵母属（Pichia）、汉逊酵母属（Hansenula）、肉座菌属（Hypocrea）、木霉属（Trichoderma）、曲霉菌属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、金孢子属（Chrysosporium）、侧孢霉属（Sporotrichum）、毁丝霉属（Myceliophthora）或其分类学上等价的属的种。
11.一种用于产生分离的纤维二糖水解酶的方法，包括
a.用遗传构建体转化宿主微生物，所述遗传构建体包含编码（ⅰ）权利要求1-4任一项的分离的纤维二糖水解酶或（ⅱ）权利要求5或6的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的核酸序列；
b.选择表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物；和
c.在使得能够从所述遗传构建体表达所述分离的纤维二糖水解酶的条件下，培养所述遗传修饰的微生物。
12.一种纤维素酶的酶混合物，包含：
a.权利要求1-4任一项的分离的纤维二糖水解酶，或
b.权利要求5或6的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
13.一种用于水解纤维素底物的方法，包括将所述底物与权利要求12的纤维素酶混合物接触。
14.权利要求13的方法，其中所述纤维素底物是预处理的木质纤维素原料。
15.权利要求14的方法，其中所述预处理的木质纤维素原料选自玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和次品、甘蔗渣、硬木材、软木材、锯屑、柳枝稷、芒草、米草和草芦。

Claims (19)

1.一种包含修饰的家族7催化结构域的分离的纤维二糖水解酶，所述修饰的家族7催化结构域在以下位置具有一个或多个氨基酸置换：
26，39，45，46，51，52，53，54，75，87，93，95，102，111，114，129，130，131，138，139，143，144，150，155，156，181，183，184，197，209，211，219，237，241，253，260，264，271，282，314，316，324，326，339，343，351，353，358，364，368，370，373，374，375，378，379，382，383，385，390，398，400，406，419，420，423，435，436，
或其任意组合；所述位置根据相应的亲本家族7催化结构域与SEQ IDNO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸的比对确定，其中所述修饰的家族7催化结构域展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约45%-约99.9%的氨基酸序列同一性，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族7催化结构域的亲本家族7催化结构域的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
2.权利要求1的分离的纤维二糖水解酶，包含修饰的家族7催化结构域，所述催化结构域在以下位置或其任意组合上具有一个或多个氨基酸置换：
26，39，45，46，52，53，54，87，95，102，129，130，139，143，144，183，197，237，241，253，264，271，282，314，316，324，326，339，343，364，368，379，382，385，390，398，406，423，
或其任意组合。
3.权利要求1的分离的纤维二糖水解酶，其中所述修饰的家族7催化结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
X26A，X45D，X46A，X46L，X46T，X51I，X52R，X52W，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X54I，X54D，X75S，X87T，X93V，X95L，X95Y，X102R，X111T，X129S，X130N，X130E，X138S，X139E，X139M，X139Q，X139S，X139R，X143L，X143G，X144A，X144V，X150N，X181L，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X219S，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X260D，X264C，X264Y，X271I，X326F，X343L，X351R，X353M，X364V，X368A，X373Y，X374V，X375A，X378E，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385I，X385L，X390A，X390G，X390K，X390W，X390C，X390L，X390V，X400G，X406P，X419F，和X436D，
其中所述修饰的家族7催化结构域包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸具有约65%-约99.9%的同一性。
4.权利要求3的分离的纤维二糖水解酶，其中所述修饰的家族7催化结构域包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
X45D，X46A，X46L，X46T，X52R，X53A，X53M，X53R，X53W，X54S，X54I，X54D，X87T，X95L，X95Y，X102R，X129S，X130N，X139M，X139S，X139R，X143L，X143G，X144V，X183N，X184S，X197L，X197V，X197Q，X197W，X237T，X241L，X241R，X241V，X253R，X264C，X271I，X282I，X314A，X326F，X343L，X364V，X368A，X368G，X379C，X379E，X382L，X382Q，X382I，X383S，X385G，X385I，X385L，X390A，X390G，X39OK，X390W，X390C，X390L，X390V，X398P，X406P和X423Y，
并且展示出与SEQ ID NO:1的1-436位氨基酸或SEQ ID NO:2的1-438位氨基酸约80%-约99.9%的同一性。
5.权利要求1-4任一项的分离的纤维二糖水解酶，还包含碳水化合物结合模块和位于所述修饰的家族7催化结构域与所述碳水化合物结合模块之间的连接肽。
6.权利要求5的分离的纤维二糖水解酶，其中所述碳水化合物结合模块是家族1碳水化合物结合模块，所述家族1碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO:1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO:2的474-509位氨基酸约50%-约99%的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T和X489Q，所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQID NO:1的461-497位氨基酸的比对确定。
7.分离的纤维二糖水解酶，其包含家族7催化结构域、修饰的家族1碳水化合物结合模块和在所述家族7催化结构域与所述修饰的家族1碳水化合物结合模块之间的连接肽，其中所述修饰的家族1碳水化合物结合模块展示出与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸或SEQ ID NO：2的474-509位氨基酸约50％-约99％的同一性，并且包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：X466S、X467D、X471S、X483V、X483S、X486R、X489T和X489Q，所述位置根据亲本家族1碳水化合物结合模块与SEQ ID NO：1的461-497位氨基酸的比对确定，并且其中相对于包含从中衍生出所述修饰的家族1碳水化合物结合模块的亲本家族1碳水化合物结合模块的纤维二糖水解酶，所述分离的纤维二糖水解酶展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
8.一种分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
T26X，R39L，N45D，S46X，Y51I，D52X，G53X，N54X，G75X，S87X，I93X，F95X，A100X，K102X，L108X，M111X，D114X，F129X，D130X，V131X，P137X，C138X，G139X，A143X，L144X，D150X，V155X，S156X，K181X，I183X，N184X，P194X，N197X，N200X，C209X，S211X，N219X，I237X，D241X，G253X，G260X，N264X，T271X，L282X，P314X，A316X，N324X，L326X，G339X，F343X，Q351X，K353X，G358X，M364X，D368X，Y370X，A372X，N373X，M374X，L375X，D378X，S379X，S379X，P382X，T383X，E385X，P390X，V393X，S398X，S400X，Q406X，S419X，N420X，F423X，N431X，G435X，N436X，P437X，N441X，G444X，T446X，T447X，R450X，T453X，T454X，T455X，P459X，Q463X，Y466X，G467X，G471X，S475X，G476X，S482X，G483X，G483X，C486X，V488X，和L489X，
其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸具有约75％-约99.9％的同一性，并且相对于从中衍生出所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的亲本里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，其展示出
a.比活性增加，
b.由葡萄糖引起的抑制下降，
c.由木质素引起的失活下降，
d.存在木质素时的活性增加，
e.存在木质纤维素水解产物时的活性增加，或
f.a-e的任意组合。
9.权利要求8的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：
T26A，T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46I，S46L，S46T，Y51I，D52R，D52T，D52W，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，G75S，S87T，G88V，I93V，F95L，F95Y，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102S，K102R，L108I，M111T，D114E，F129S，D130N，D130E，V131A，P137S，C138S，G139E，G139M，G139Q，G139S，G139R，A143L，A143G，L144A，L144V，D150N，V155M，S156G，K181L，I183N，N184S，P194Q，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，C209S，S211T，N219S，I237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，G260D，N264Y，T271I，L282I，，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，Q351R，K353M，T356I，G358S，M364V，D368A，D368G，D378E，Y370H，A372T，N373Y，M374V，L375A，D378E，S379C，S379E，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，V393A，S398P，S400G，Q406P，S419F，N420D，F423Y，N431R，G435S，N436D，P437T，N441D，G444D，T446A，T447S，R450S，T453I，T453S，T454I，T455A，P459L，Q463L，Q463S，Q463K，Y466S，G467D，G471S，S475N，G476D，S482N，G483V，G483S，C486R，V488D，L489P，和L489Q，
其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸具有约80％-约99.9％的同一性。
10.权利要求9的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶，包含一个或多个选自以下的氨基酸置换：T26S，R39L，N45D，S46G，S46A，S46L，S46T，D52R，G53A，G53M，G53R，G53W，N54S，N54I，N54D，S87T，A100T，A100V，A100W，A100L，A100G，K102R，F129S，D130N，G139M，G139S，G139R，A143L，A143G，L144V，I183N，N184S，N197L，N197V，N197Q，N197W，N197A，N200F，N200C，I237T，D241L，D241R，D241V，G253D，G253R，N264C，N264Y，T271I，L282I，P314A，A316V，N324D，L326F，G339D，F343L，G358S，M364V，D368A，D368G，A372T，S379C，P382L，P382Q，P382I，T383S，T383A，E385G，E385I，E385L，P390A，P390G，P390K，P390W，P390C，P390L，P390V，V393A，S398P，Q406P，F423Y，N431R，P437T，T446A，T447S，T454I，G467D，S475N，和G483V，
其中所述分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的1-497位氨基酸具有约90％-约99.9％的同一性。
11.一种遗传构建体，其包含编码以下酶的核酸序列：
a.权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶，或
b.权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
12.包含权利要求11的遗传构建体的遗传修饰的微生物。
13.权利要求12的遗传修饰的微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的种。
14.权利要求13的遗传修饰的微生物，其中所述微生物是链霉茵属(Streptomyces)、酵母茵属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、肉座茵属(Hypocrea)、木霉属(Trichoderma)、曲霉茵属(Aspergilus)、镰刀茵属(Fusarium)、金孢子属(Chrysosporium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、毁丝霉属(Myceliophthora)或其分类学上等价的属的种。
15.一种用于产生分离的纤维二糖水解酶的方法，包括
a.用遗传构建体转化宿主微生物，所述遗传构建体包含编码(i)权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶或(ii)权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶的核酸序列；
b.选择表达所述分离的纤维二糖水解酶的遗传修饰的微生物；和
c.在使得能够从所述遗传构建体表达所述分离的纤维二糖水解酶的条件下，培养所述遗传修饰的微生物。
16.一种纤维素酶的酶混合物，所述纤维素酶混合物包含包含如下酶的所述纤维素酶混合物：
a.权利要求1-7任一项的分离的纤维二糖水解酶，或
b.权利要求8-10任一项的分离的里氏木霉TrCel7A纤维二糖水解酶。
17.一种用于水解纤维素底物的方法，包括将所述底物与权利要求16的纤维素酶混合物接触。
18.权利要求17的方法，其中所述纤维素底物是预处理的木质纤维素原料。
19.权利要求18的方法，其中所述预处理的木质纤维素原料选自玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和次品、甘蔗渣、硬木材、软木材、锯屑、柳枝稷、芒草、米草和草芦。
CN201280052603.5A 2011-08-31 2012-08-29 新的纤维二糖水解酶 Pending CN103958677A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161529333P 2011-08-31 2011-08-31
US61/529,333 2011-08-31
PCT/CA2012/050596 WO2013029176A1 (en) 2011-08-31 2012-08-29 Novel cellobiohydrolase enzymes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103958677A true CN103958677A (zh) 2014-07-30

Family

ID=47744250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280052603.5A Pending CN103958677A (zh) 2011-08-31 2012-08-29 新的纤维二糖水解酶

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9279163B2 (zh)
EP (1) EP2751265A4 (zh)
CN (1) CN103958677A (zh)
BR (1) BR112014004780A2 (zh)
CA (1) CA2844421A1 (zh)
WO (1) WO2013029176A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611386A (zh) * 2016-12-12 2018-10-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 多酶催化制备纤维二糖的方法
CN116334111A (zh) * 2023-03-03 2023-06-27 上海市农业科学院 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途
CN116949017A (zh) * 2023-06-13 2023-10-27 天津科技大学 一种高活性乳糖酶突变体及其应用
CN116949017B (zh) * 2023-06-13 2024-06-07 天津科技大学 一种高活性乳糖酶突变体及其应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011097713A1 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Iogen Energy Corporation Carbohydrate binding modules with reduced binding to lignin
WO2013138357A1 (en) * 2012-03-12 2013-09-19 Codexis, Inc. Cbh1a variants
WO2013188313A2 (en) * 2012-06-11 2013-12-19 Codexis, Inc. Fungal xylanases and xylosidases
KR20150093724A (ko) * 2012-12-12 2015-08-18 다니스코 유에스 인크. 셀로바이오하이드롤라제의 변이체
EP2931890A1 (en) * 2012-12-12 2015-10-21 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
US20160122734A1 (en) * 2012-12-12 2016-05-05 Danisco Us Inc. Variants of cellobiohydrolases
US8771994B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-08 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8778641B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8778640B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8753860B1 (en) * 2013-02-12 2014-06-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8993275B2 (en) * 2013-02-12 2015-03-31 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US10221406B2 (en) * 2013-03-08 2019-03-05 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
MX2016001315A (es) 2013-07-29 2016-04-07 Danisco Us Inc Variantes de enzimas.
FR3013731B1 (fr) 2013-11-22 2017-09-01 Ifp Energies Now Variants d'endoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
EP3149028B1 (en) 2014-05-30 2021-09-15 Novozymes A/S Variants of gh family 11 xylanase and polynucleotides encoding same
FR3022557B1 (fr) 2014-06-20 2019-01-25 Proteus Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
FR3022558B1 (fr) 2014-06-20 2019-01-25 Proteus Variants d'exoglucanases a activite amelioree et leurs utilisations
EP3594335B1 (en) 2014-09-05 2024-05-01 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same
DK3191587T3 (da) * 2014-09-08 2019-10-14 Novozymes As Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, som koder for dem
EP3262165B1 (en) 2015-02-24 2020-06-03 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US20230242955A1 (en) * 2021-08-30 2023-08-03 Alliance For Sustainable Energy, Llc Chimeric cellobiohydrolases

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001065A2 (en) * 2003-04-01 2005-01-06 Genencor International, Inc. Variant humicola grisea cbh1.1

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7375197B2 (en) * 2002-01-14 2008-05-20 Midwest Research Institute Cellobiohydrolase I gene and improved variants
DK2322606T3 (en) 2002-08-16 2015-12-14 Danisco Us Inc NOVEL HYPROCREA JECORINA CBH1 cellulase WITH INCREASED THERMAL STABILITY COMPREHENSIVE SUBSTITUTION OR DELETION FOR POSITION T332
CA2519760C (en) 2003-03-21 2012-05-22 Genencor International, Inc. Cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
CN104212822A (zh) * 2007-01-30 2014-12-17 Bp法人北美有限公司 用于处理木质纤维素的酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
WO2010096931A1 (en) * 2009-02-27 2010-09-02 Iogen Energy Corporation Novel lignin-resistant cellulase enzymes
WO2011097713A1 (en) * 2010-02-11 2011-08-18 Iogen Energy Corporation Carbohydrate binding modules with reduced binding to lignin
US8759064B2 (en) 2010-05-14 2014-06-24 Codexis, Inc. Cellobiohydrolase variants
JP2014502144A (ja) 2010-10-06 2014-01-30 ビーピー・コーポレーション・ノース・アメリカ・インコーポレーテッド バリアントｃｂｈｉポリペプチド

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001065A2 (en) * 2003-04-01 2005-01-06 Genencor International, Inc. Variant humicola grisea cbh1.1

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611386A (zh) * 2016-12-12 2018-10-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 多酶催化制备纤维二糖的方法
CN116334111A (zh) * 2023-03-03 2023-06-27 上海市农业科学院 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途
CN116334111B (zh) * 2023-03-03 2024-02-09 上海市农业科学院 一种草菇纤维二糖水解酶及其用途
CN116949017A (zh) * 2023-06-13 2023-10-27 天津科技大学 一种高活性乳糖酶突变体及其应用
CN116949017B (zh) * 2023-06-13 2024-06-07 天津科技大学 一种高活性乳糖酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2751265A1 (en) 2014-07-09
WO2013029176A1 (en) 2013-03-07
EP2751265A4 (en) 2015-07-15
US20130052694A1 (en) 2013-02-28
BR112014004780A2 (pt) 2019-09-24
CA2844421A1 (en) 2013-03-07
US9279163B2 (en) 2016-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103958677A (zh) 新的纤维二糖水解酶
Olsson et al. Influence of the carbon source on production of cellulases, hemicellulases and pectinases by Trichoderma reesei Rut C-30
CN105316303B (zh) 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
Guerriero et al. Destructuring plant biomass: focus on fungal and extremophilic cell wall hydrolases
Ahamed et al. Culture-based strategies to enhance cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUT-C30 in bioreactor culture conditions
Narra et al. Production, purification and characterization of a novel GH 12 family endoglucanase from Aspergillus terreus and its application in enzymatic degradation of delignified rice straw
Singhania et al. Cellulases
US8790894B2 (en) Mutant cellobiohydrolase
JP2016533739A (ja) 変異酵素
CN102762727A (zh) 能产生用于降解木质纤维素材料的酶的宿主细胞
JP2010536390A (ja) セルラーゼを生成するための方法
CN102971419A (zh) 具有降解碳水化合物材料的活性或帮助降解碳水化合物材料的活性的多肽及其用途
CN103502444A (zh) 糖基水解酶及其在生物质水解方面的用途
CN102292438A (zh) 用于生产纤维素酶的宿主和发酵方法
CN105441509A (zh) 改善纤维素转化过程产率的方法
CN107109386A (zh) 与β‑葡糖苷酶相关的组合物和方法
CN105829530A (zh) 包含β-葡萄糖苷酶多肽的组合物及其使用方法
US20210123030A1 (en) Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
US20200392475A1 (en) Beta-glucosidase and uses thereof
MX2012014990A (es) Polipeptido que tiene actividad suolenina y sus usos.
US20190002860A1 (en) Beta-glucosidase and uses thereof
Massarente et al. Biochemical characterization of endoglucanases produced by Myceliophthora thermophila M. 7.7 in solid-state culture
US20190002859A1 (en) Beta-glucosidase and uses thereof
Anusuiya Singh et al. Genetic modification: a tool for enhancing cellulase secretion.
Isaac Screening of fungal isolates for endoglucanase activity and cloning of a thermostable endoglucanase from phialophora alba.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140730