CN111876338A - 利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，还涉及上述菌株的构建方法。本发明所提供的利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述的菌株是以木霉为出发菌株，利用木霉中的强效启动子——铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达转录因子基因xyr1，在此基础上，进一步利用该启动子过表达胞外主要β‑葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。本发明构建的菌株有效避免了在基因组上因随机插入可能导致的对纤维素酶表达的抑制作用；有效弥补了过表达xyr1产生的纤维素酶酶系中β‑葡萄糖苷酶活性的不足；可利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶，降低了生产工艺的复杂性。

Description

利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株及构建方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株，还涉及上述菌株的构建方法。
背景技术
里氏木霉（Trichoderma reesei）是一种十分高效的纤维素降解真菌，在纤维素存在的条件下，能表达分泌大量的纤维素酶以实现对纤维素的高效降解，因此被开发为重要的纤维素酶工业生产菌株。
经过多年研究，已经获得了多个里氏木霉纤维素酶高产菌株，其产酶性能也得到了极大的提高。但是目前纤维素酶的高成本依然是制约生物能源及大宗生物基产品工业化生产的一个瓶颈。
里氏木霉纤维素酶的表达受不溶性纤维素的高效诱导，但纤维素的不溶性在纤维素酶生产中存在许多缺点，如发酵操作过程复杂（包括灭菌、生物量测定、连续加料取样以及酶的分离纯化等），纤维素酶极易被吸附到不溶性纤维素上导致纤维素酶的损失，以及不溶性纤维素使得发酵过程中的搅拌、曝气等过程耗能增加。上述缺点使得不溶性纤维素不宜作为诱导物用于工业化生产纤维素酶。
葡萄糖是一种相对简单廉价的可溶性碳源，但以里氏木霉QM9414为产酶菌种时，纤维素酶几乎无法诱导表达。伍红等人在《碳源对里氏木霉QM9414胞外酶基因表达的影响》一文中披露：葡萄糖作为碳源时，在培养120小时之前，几乎未见纤维素酶活性；在培养120小时之后，出现了很低的酶活性。这种抑制可能是由于葡萄糖作为容易利用的碳源，产生了分解代谢阻遏抑制效应。可见，以葡萄糖作为碳源会抑制纤维素酶基因的表达。
构建利用可溶性碳源生产纤维素酶并且提升纤维素酶的表达水平和水解效率的菌株是解决该问题的有效策略。而里氏木霉纤维素酶基因的表达受转录激活因子Xyr1的调控，过表达该转录因子可有效提高纤维素酶的表达量，并且可实现在葡萄糖等非诱导物为碳源时纤维素酶的高效表达。尽管如此，过表达转录因子Xyr1之后，β-葡萄糖苷酶活性仍然不高。
因此，需要针对上述过表达转录因子Xyr1之后，β-葡萄糖苷酶活性仍然不高和葡萄糖作为碳源会抑制纤维素酶基因的表达等瓶颈问题进行解决，发明了一种进一步提高纤维素酶表达水平的菌株。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种以木霉例如里氏木霉QM9414为出发菌株，经过系列遗传操作后能利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶的菌株OXG1；该菌株（OXG1，以下内容中所提到的OXG1都代表本发明所构建的菌株）是以里氏木霉QM9414为出发菌株，利用里氏木霉QM9414中的强效启动子—铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达转录因子基因xyr1，在此基础上，利用该启动子过表达胞外主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。
本发明仅仅是以里氏木霉QM9414为例来说明如何以木霉为出发菌株构建产高活性纤维素酶的菌株OXG1的过程，但并不仅限于以上的里氏木霉QM9414菌株，还可以是其它的木霉菌株，类似的变换也是本发明所要保护的内容。
本发明的菌株OXG1构建方法如下：
S1：用于高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的质粒的构建：
获得pMD19TS-hph，然后以里氏木霉基因组为模板，克隆出 pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，将2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子Ptcu1和TtrpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到质粒pLX1；
从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，得到xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1；从里氏木霉基因组上克隆出3.2kb 的 bgl1 基因表达盒，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4表达载体进而获得bgl1 过表达质粒 pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1；
S2：高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的菌株的构建：
将S1中pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9(pyr4 -)；
在xyr1过表达菌株OEX9的基础上，bgl1过表达质粒pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1质粒转入其中，利用不含尿苷的基本培养基筛选原养型转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。
优选的，目标菌株OXG1的构建方法如下：
S1：用于高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的质粒的构建：
S1.1：首先将潮霉素抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC插入pMD19THindIII/PmeI/AscI/NotI/XhoI 和EcoRI/NcoI 位点，获得pMD19TS-hph；以里氏木霉基因组为模板，克隆出 pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，各带有HindIII/PmeI 和 EcoRI/NcoI酶切位点，作为下一步利用同源重组在pyr4 基因位点定点插入xyr1的同源臂片段；
S1.2：将S1.1中的2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，得到pMDhph-Lpyr4；从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子tcu1和trpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到在pyr4位点定点高效表达功能基因的质粒pLX1；所述的铜离子透性酶启动子tcu1为jgi:Trire2:52315；
S1.3：从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，最终得到可在里氏木霉基因组pyr4位点定点高效表达xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1；
S1.4：从里氏木霉基因组上克隆出3.2-kb 的 bgl1 gene (jgi:Trire2: 76672) 基因组表达盒，两端带有NotI/SpeI位点，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4表达载体进而获得最终的bgl1 过表达质粒 pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1；所述的pMD-Ptcu1-pyr4为带有铜离子透性酶启动子和pyr4基因表达盒；
S2：构建同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株：
将S1中pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9(pyr4 -)；
在xyr1过表达菌株OEX9的基础上，将载体pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1单酶切后得到线性化的质粒，通过真菌原生质体转化法先后转入里氏木霉OEX9中，利用不含尿苷的基本培养基筛选得到原养型转化子，然后经过三轮单孢分离，得到纯化的转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。
通过本发明的方法构建的菌株OXG1生产的高活性纤维素酶可用于高效的降解富含纤维素的农业生产废弃物，并且将上述的废弃物转化为葡萄糖；比如玉米芯、甜高粱、花生壳、牡丹果荚等，不限于以上的种类。
本发明有的有益效果在于：
（1）本发明利用里氏木霉菌中的强效启动子——铜离子透性酶基因启动子Ptcu1，在基因组上的pyr4基因位点定点过表达Xyr1转录因子，有效避免了在基因组上因随机插入可能导致的对纤维素酶表达的抑制作用；
（2）利用该铜离子启动子过表达胞外主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1，有效弥补了过表达Xyr1产生的纤维素酶酶系中β-葡萄糖苷酶活性的不足；
（3）本发明所构建的菌株可利用可溶性碳源葡萄糖高效生产纤维素酶，降低了生产工艺的复杂性；
（4）采用本发明所构建的菌株生产的纤维素酶活性高，能高效降解玉米芯、甜高粱、花生壳、牡丹果荚等富含纤维素的农业生产废弃物，产生葡萄糖；对工业上提高纤维素酶生产效率及农业废弃物综合利用具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中过表达相关基因对菌株生物量的影响图；
图2为实施例2中强效表达xyr1和bgl1菌株的纤维素酶活性图；以1% (v/v) 的甘油或葡萄糖或乳糖为碳源，RUT-C30、OEX9P、OXG1菌株发酵培养96小时后的外切纤维素酶活性（A），内切纤维素酶活性（B），β-葡萄糖苷酶活性（C），滤纸酶活（D）；
图3为实施例3中工程菌株产纤维素酶的糖化能力图；
A表示分别以Avicle和葡萄糖为碳源时，QM9414、RUT-C30、OEX9P、OXG1菌株发酵培养96小时后的滤纸酶活；
B表示分别以Avicle和葡萄糖为碳源时，QM9414、RUT-C30、OEX9P、OXG1菌株发酵培养96小时后的蛋白浓度对比；
C表示以Avicle为碳源，利用QM9414、RUT-C30、OEX9P、OXG1菌株发酵培养96小时后产的等量纤维素酶作用于酸处理的玉米芯后的葡糖糖产量对比；
D表示以葡萄糖为碳源，利用QM9414、RUT-C30、OEX9P、OXG1菌株发酵培养96小时后产的等量纤维素酶作用于酸处理的玉米芯后的葡糖糖产量对比。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
1. 高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1菌株的构建
（1）转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1高效表达载体的构建
首先将潮霉素抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC插入pMD19T-HindIII/PmeI/AscI/NotI/XhoI and EcoRI/NcoI 位点，获得pMD19TS-hph；以里氏木霉基因组为模板，克隆出pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，各带有HindIII/PmeI 和 EcoRI/NcoI酶切位点，作为下一步利用同源重组在pyr4 基因位点定点插入xyr1的同源臂片段。
将上述2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，得到pMDhph-Lpyr4。从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子Ptcu1 (jgi: Trire2:52315)和TtrpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到在pyr4位点定点高效表达功能基因的质粒pLX1；从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，最终得到可在里氏木霉基因组pyr4位点定点高效表达xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1。
从里氏木霉基因组上克隆出3.2-kb 的 bgl1 (jgi:Trire2: 76672) 基因表达盒，两端带有NotI/SpeI位点，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4（带有铜离子透性酶启动子和pyr4基因表达盒）表达载体进而获得最终的bgl1 过表达质粒 pMD-Ptcu1-pyr4- bgl1.
（2）xyr1和bgl1高效表达菌株的构建
首先，构建过表达xyr1基因的菌株。将pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9(pyr4 -)；为使单一过表达xyr1菌株OEX9可在基本培养基（不添加外源尿苷）上生长，在OEX9菌株中转入含有pyr4基因的质粒pFG1，获得原养型菌株OEX9P，此菌株用于分析仅仅过表达xyr1基因对纤维素酶活性和表达量的影响。此外，与出发菌株QM9414、高产纤维素酶菌株RUT-C30以及后续构建的OXG1进行对比分析不同菌株所产纤维素酶的活性差异。
其次，构建同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株。在菌株OEX9基础上，将载体pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1单酶切后得到线性化的质粒，通过真菌原生质体转化法先后转入里氏木霉OEX9中，利用不含尿苷的基本培养基筛选得到原养型转化子，然后经过三轮单孢分离，得到纯化的转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。
实施例2
对于实施例1中构建所获得的菌株OXG1，本发明人对其所产的纤维素酶的活性和蛋白进行了分析，具体如下：
高效表达xyr1和bgl1菌株的纤维素酶活性和蛋白分析
（1）菌株的发酵培养
将QM9414、RUT-C30、OEX9P和OXG1菌株（出发菌株QM9414、高产纤维素酶菌株RUT-C30为对照）在甘油唯一碳源的MA培养基（17.907 g/L Na2HPO4·12H2O, 2 g/L KH2PO4, 1.4 g/L(NH4)2SO4, 0.3 g/L Urea, 0.5 ml/L Tween-80, 0.6 g/L MgSO4, 0.4 g/L CaCl2, 5.0mg/L FeSO4·7H2O, 2.0 mg/L CoCl2·6H2O, 1.6 mg/L MnSO4·4H2O, 1.4 mg/L ZnSO4·7H2O)中进行两轮预培养（36 h预培养菌体，再转接预培养12 h），然后根据实验目的进行转接至葡萄糖或Avicel为唯一碳源的MA培养基进行培养。
（2）纤维素酶活性和蛋白分析
分别以pNPC和pNPG为底物测定外切纤维素酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和总酶活。
1) 外切纤维素酶酶活测定
a) 反应体系：200 μl；其组成是：100 μl pH4.8 的 NaAc-HAc buffer，加入 50 μl反应底物pNPC (2mM，加 1%葡萄糖内酯作抑制剂)，50 μl发酵液的上清；
b) 反应条件：45℃反应30 min；反应结束后加入50 μl浓度为 10%的Na2CO3 终止反应；
c) 测定和分析：取 200μl 测OD420；根据pNP标准曲线计算 pNPC 酶活。
d) 酶活单位定义为：每分钟产生1 μmol pNP所需的酶量为一个酶活单位，用 U表示。
2) β-葡萄糖苷酶酶活测定
a) pNPG 酶活测定方法同上述pNPC 酶活测定方法，反应底物为5 mM pNPG。
b) 由于发酵上清液对 pNPG 的反应很灵敏，所以需要将发酵上清进行稀释，通常稀释10~20 倍。pNPG 酶活计算和分析参见 pNPC 酶活。
3）内切纤维素酶酶活测定
a) 配制反应底物：0.5 % CMC溶于50 mM，pH4.8的NaAc-HAc缓冲液；
b) 取60 μl的发酵液、60μl的 0.5% CMC，50°C反应 30 min；以灭活的发酵液作为对照；通常发酵液需要进行适当稀释（5 倍~20 倍），以保证最终的度数在线性范围内；
c) 反应结束后，加入等体积的 DNS (120 μl)，混匀、离心后煮沸10 min；
d) 煮沸结束后，离心，取出180 μl反应液测定OD550读数，根据OD550 数值计算酶活。
e) 酶活单位及计算：定义每min产生1 μmol 还原糖所需的酶量为1个酶活单位，用 U 表示。根据还原糖的标准曲线计算酶活单位。
3) 总纤维素酶酶活测定
a) 将 Whatman NO.1 定量滤纸裁剪成 0.5 cm×0.5 cm 大小的滤纸片，每个反应管（2ml离心管）中放1片该大小的滤纸片；
b) 往上述离心管中加入60 μl pH 4.8 的 HAc-NaAc缓冲液，加入60 μl发酵液，反应体积为120 μl（实际测量时，发酵液需要稀释 5~10 倍，以保证最终读数在线性范围内，因此，加入适量发酵液后，用缓冲液补齐至120 μl即可）；
c) 50℃反应30 min；
d) 反应结束后，加入等体积的 DNS(120 μl)，混匀、离心后煮沸10 min；
e) 煮沸结束后，离心，取出180 μl反应液测定 OD550 读数，根据 OD550 数值计算酶活。
4）蛋白分析
以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，采用Bradford法测定蛋白浓度；同时利用SDS-PAGE法测定总分泌蛋白，通过加载相应菌株等体积的发酵液上清，使用考马斯亮蓝R-250进行凝胶染色。
利用1%葡萄糖为唯一碳源的MA培养基（17.907 g/L Na2HPO4·12H2O, 2 g/LKH2PO4, 1.4 g/L (NH4)2SO4, 0.3 g/L Urea, 0.5 ml/L Tween-80, 0.6 g/L MgSO4, 0.4g/L CaCl2, 5.0 mg/L FeSO4·7H2O, 2.0 mg/L CoCl2·6H2O, 1.6 mg/L MnSO4·4H2O,1.4 mg/L ZnSO4·7H2O)发酵培养QM9414、RUT-C30、OEX9P和OXG1菌株。结果表明，各株菌培养48h后，菌丝干重基本一致，说明构建的工程菌中过表达不同的基因对菌株的生长基本无影响 (附图1)。
分别以甘油、葡萄糖和乳糖为碳源的MA培养基，培养RutC-30、OEX9P和OXG1菌株。
发酵96小时后，在菌株RUT-C30中仅检测到非常低的纤维素酶活性（包括纤维素酶外切酶活性、内切酶活性、β-葡萄糖苷酶活性以及总的纤维素酶活性），而在菌株OEX9P 和OXG1中，获得了较高的纤维素酶活性，且OXG1中的β-葡萄糖苷酶活性明显比OEX9P的高，进而菌株OXG1的总的纤维素酶活性比OEX9P显著升高(附图2)。
实施例3
工程菌生产的高活性纤维素酶作用于玉米芯材料对葡萄糖产量的影响
首先，分析以Avicel或葡萄糖为碳源发酵培养OEX9P和OXG1获得的胞外粗酶液的总的纤维素酶活（出发菌株QM9414、高产纤维素酶菌株RUT-C30为对照）。菌株OXG1以Avicel或葡萄糖为碳源在摇瓶中发酵获得的总的纤维素酶活，分别比RUT-C30 以Avicel为碳源获得的总的纤维素酶活高99%和102%（最高达到5IU/ml）。相应的胞外蛋白浓度也比RUT-C30 以Avicel为碳源培养产生的蛋白浓度高(附图3)。
为评价工程菌产的纤维素酶对纤维素的水解能力，以5%的酸处理玉米芯为底物进行糖化实验验证。反应体系为 30mL，纤维素酶添加量为 1.5mg，用 0.1 mol·L−1 pH4.8的醋酸缓冲液补齐至30mL，50℃、150 r· min−1 进行糖化，取糖化24h、48h 糖化液，利用SBA-40C（BISAS，China）生物传感仪进行葡萄糖的测定。结果如图3所示，与菌株RUT-C30经过Avicel为唯一碳源的培养基发酵产生的纤维素酶相比，以葡萄糖为碳源发酵培养的OXG1菌株产的纤维素酶作用于酸预处理的玉米芯后，葡萄糖的释放量显著提高，增加了85%。
从附图中可以看出，xyr1和bgl1同时过表达的工程菌株OXG1可以有效的利用葡萄糖为碳源高效生产纤维素酶，并且可以以玉米芯为原料发生糖化作用，进而生产葡萄糖。
综上，从以上的数据及附图可以看出，本发明通过构建工程菌株OXG1，达到了能有效利用葡萄糖为碳源来高效生产纤维素酶的目的，并且其所产的纤维素酶水解能力显著增强（从葡萄糖的释放量增加了85%可获知），解决了背景技术中所提到的问题。

Claims (6)

1.利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述的菌株是以木霉为出发菌株，利用木霉中的强效启动子铜离子透性酶基因启动子Ptcu1在基因组上的pyr4基因位点定点过表达xyr1转录因子，同时利用该铜离子启动子过表达胞外主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1构建的。
2.如权利要求1所述的利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株的构建方法，其特征在于，所述的木霉为里氏木霉QM9414。
3.如权利要求1或2所述的利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株的构建方法，包括以下的步骤：
S1：用于高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的质粒的构建：以里氏木霉基因组为模板，克隆出 pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，将2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子Ptcu1和TtrpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到质粒pLX1；
从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，得到xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1；从里氏木霉基因组上克隆出3.2kb 的 bgl1 基因表达盒，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4表达载体进而获得bgl1 过表达质粒 pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1；
S2：高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的菌株的构建：将S1中pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9；
在xyr1过表达菌株OEX9的基础上，将bgl1的过表达质粒pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1质粒转入其中，利用不含尿苷的基本培养基筛选原养型转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。
4.如权利要求2所述的利用可溶性碳源葡萄糖生产纤维素酶的菌株的构建方法，包括以下的步骤：
S1：用于高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的质粒的构建
S1.1：首先将潮霉素抗性基因表达盒PtrpC-hph-TtrpC插入pMD19THindIII/PmeI/AscI/NotI/XhoI and EcoRI/NcoI 位点，获得pMD19TS-hph；以里氏木霉基因组为模板，克隆出 pyr4 基因序列上下游各2kb的片段，各带有HindIII/PmeI 和 EcoRI/NcoI酶切位点，作为下一步利用同源重组在pyr4 基因位点定点插入xyr1的同源臂片段；
S1.2：将S1.1中的2个2kb的同源臂片段酶切后连入pMD19TS-hph中，得到pMDhph-Lpyr4；从里氏木霉基因组序列上分别克隆1.7 kb的铜离子透性酶启动子Ptcu1和TtrpC 终止子序列，作为高水平表达相关功能基因的启动子和终止子，分别连入pMDhph-Lpyr4后得到在pyr4位点定点高效表达功能基因的质粒pLX1；所述的铜离子透性酶启动子Ptcu1 为jgi: Trire2:52315；
S1.3：从里氏木霉基因组序列上克隆出xyr1基因序列通过AscI 和 NotI酶切后，连入质粒pLX1，最终得到可在里氏木霉基因组pyr4位点定点高效表达xyr1基因的表达载体pLX1-xyr1；
S1.4：从里氏木霉基因组上克隆出3.2kb 的 bgl1的基因表达盒，两端带有NotI/SpeI位点，将该片段酶切后连入pMD-Ptcu1-pyr4表达载体进而获得最终的bgl1 过表达质粒pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1；所述的pMD-Ptcu1-pyr4为带有铜离子透性酶启动子和pyr4基因表达盒；所述的bgl1基因为jgi:Trire2: 76672；
S2：高效表达转录因子基因xyr1和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的菌株的构建：
将S1中pLX1-xyr1载体经线性化后转化至里氏木霉QM9414菌株中，通过在pyr4 基因位点发生同源双交换的原理，同时利用5-氟乳清酸和潮霉素抗性筛选得到阳性转化子转化子，从而获得定点整合于pyr4基因位点的尿苷营养缺陷型的xyr1过表达菌株OEX9；
在xyr1过表达菌株OEX9的基础上，将载体pMD-Ptcu1-pyr4-bgl1单酶切后得到线性化的质粒，通过真菌原生质体转化法先后转入里氏木霉OEX9中，利用不含尿苷的基本培养基筛选得到原养型转化子，然后经过三轮单孢分离，得到纯化的转化子，进而通过PCR验证相关基因在里氏木霉基因组上的插入情况，最终得到同时过表达达xyr1基因和bgl1 基因的菌株OXG1。
5.如权利要求1所述菌株产的高活性纤维素酶用于降解富含纤维素的农业生产废弃物并将其转化为葡萄糖。
6.如权利要求1所述菌株产的高活性纤维素酶用于降解玉米芯、甜高粱、花生壳、牡丹果荚中的任一种农业废弃物，并将它们转化为葡萄糖。
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