JP5752049B2 - エタノールの製造方法 - Google Patents
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Description
セルロース系物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程;および
該発酵基質と酵母とを反応させる工程であって、それによりエタノールを生産する、工程
を含む。
セルロース物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程
を含む、方法。
本明細書中で、「セルラーゼ酵母」とは、セルロースを加水分解し、そしてグルコースからエタノールを発酵する能力を有する酵母をいう。本来セルロースを加水分解する能力がないかまたはほとんどない酵母(野生型酵母など)(本明細書中では、「セルロース非加水分解性酵母」ともいう)に対して、セルロースを加水分解し得る酵素(以下に詳述する)を少なくとも1種発現するように遺伝子組換えを行うことにより、セルロース加水分解力が付与または強化された形質転換酵母が作製され得る。このセルロース加水分解力が付与または強化された形質転換酵母は、「セルラーゼ酵母」に包含される。例えば、以下に説明するように調製されたセルラーゼ酵母が好ましいが、これに限定されない。
本明細書中では、酵母と基質とを反応させて、それによりエタノールを生産する工程を、便宜上、「発酵工程」ともいう。
以下に、セルラーゼ表層提示酵母(エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ、ならびにβ−グルコシダーゼを、それぞれ表層提示されるように組み込んだ酵母)の調製手順を説明する。
(調製例1−1−1:NBRC1440株へのURA3要求性の付与)
変異URA3断片を、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエMT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)から常法で抽出したゲノムDNAを用いて、フォワードプライマー(配列番号1)およびリバースプライマー(配列番号2)のプライマー対を用いるPCRにより取得した。この断片をサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440(MATα)株に導入し、5−フルオロオロト酸(FOA)培地でURA3変異株を選択し、URA3要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
以下のようにして融合PCRを実施した:
PCR1、HIS3-Green U(配列番号3;Forward)およびHIS3-Green R(配列番号4;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株から常法で抽出したゲノムDNAを用いるPCRにより、HIS3上流部分配列を調製した;
PCR2、URA3 fragment(配列番号5;Forward)およびHIS3-40Uc(配列番号6;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてpRS406プラスミド(Stratagene社)を用いるPCRにより、URA3を調製した;
PCR3、HIS3-Green U(配列番号3;Forward)およびHIS3-40Uc(配列番号6;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてPCR1およびPCR2での産物を混合して用いるPCRにより、融合フラグメントを調製した。
以下のようにして融合PCRを実施した:
PCR1、TRP1-988(配列番号7;Forward)およびRP1-28r(配列番号8;Reverse)のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株のゲノムDNAを鋳型として用いるPCRにより、TRP1上流部分配列を調製した;
PCR2、TRP1-URA3(配列番号9;Forward)およびTRP1-40r(配列番号10;Reverse)のプライマー対を用い、pRS406プラスミド(Stratagene社)を鋳型として用いるPCRにより、URA3を調製した;
PCR3、TRP1-988(配列番号7;Forward)およびTRP1-40r(配列番号10;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてPCR1およびPCR2での産物を混合して用いるPCRにより、融合フラグメントを調製した。
以下のようにして融合PCRを実施した:
PCR1、LEU2-UP 3rd(配列番号11;Forward)およびLEU2-down 3rd(配列番号12;Reverse)のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株のゲノムDNAを鋳型として用いるPCRにより、LEU2上流部分配列を調製した;
PCR2、LEU2-URA3 3rd(配列番号13;Forward)およびLEU2-40r(配列番号14;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてpRS406プラスミド(Stratagene社)を鋳型として用いるPCRにより、URA3を調製した;
PCR3、LEU2-UP 3rd(配列番号11;Forward)およびLEU2-40r(配列番号14;Reverse)のプライマー対を用い、鋳型としてPCR1およびPCR2での産物を混合して用いるPCRにより、融合フラグメントを調製した。
まず、ウラシル遺伝子(URA3)マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来エンドグルカナーゼII(EGII)遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK406 EGを構築した。
まず、ヒスチジン遺伝子(HIS3)マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII(EGII)遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK403 EGを構築した。
まず、ロイシン遺伝子(LEU2)マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII(EGII)遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK405 EGを構築した。
アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)由来β−グルコシダーゼ1(BGL1)遺伝子をコードする2.5kbp NcoI-XhoI DNAフラグメントを、プラスミドpBG211(京都大学より贈与戴いた)を鋳型として用い、bgl1プライマー1(配列番号25;Forward)およびbgl1プライマー2(配列番号26;Reverse)のプライマー対を用いるPCRにより調製した。このDNAフラグメントをNcoIおよびXhoIで消化し、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびα−アグルチニン遺伝子の3’側半分の領域(非特許文献12)を含有する細胞表層発現プラスミドpIHCS(非特許文献13)のNcoI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpIBG13と命名した。
pRS406 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWLに導入し、ウラシルドロップアウト(ウラシル不含培地)プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたURA3遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2」と命名した。
pRS403 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2に導入し、ヒスチジンドロップアウト(ヒスチジン不含培地)プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS406 EG CBH2の破壊されたHIS3遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2」と命名した。
pRS405 EG CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト(ロイシン不含培地)プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2の破壊されたLEU2遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-3c」とも表記する。
pIWBGLをBst1107Iで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2(NBRC1440/EG-CBH2-3c)に導入し、トリプトファンドロップアウト(トリプトファン不含培地)プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。各々の破壊されたTRP1遺伝子が復活することで、β−グルコシダーゼ1遺伝子の導入を確認した。したがって、コピー数3のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ2の表層提示株にさらにβ−グルコシダーゼ1を表層提示した株が得られた。この株を簡略化して、「NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL」とも表記する。
以下に、β−グルコシダーゼを表層提示するが、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを分泌するように組み込んだ酵母(以下、便宜上、「セルラーゼ分泌酵母」ともいう)の調製手順を説明する。
ヒスチジン遺伝子(HIS3)マーカーを有し、かつエンドグルカナーゼII(EGII)およびセロビオヒドロラーゼ2(CBH2)を分泌させるように組み込むためのプラスミドpRS403/ssEG2-CBH2を構築した。
GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ2(CBH2)遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。
GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ2(CBH2)遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。
pRS406/ssEG2-CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWL(調製例1−1)に導入し、ウラシルドロップアウト(ウラシル不含培地)プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたURA3遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2」と命名した。
pRS403/ssEG2-CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2に導入し、ヒスチジンドロップアウト(ヒスチジン不含培地)プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2の破壊されたHIS3遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2」と命名した。
pRS405 ssEG2-CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト(ロイシン不含培地)プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2の破壊されたLEU2遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2/ pRS405 ssEG2-CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c」とも表記する。
pIWBGLをBst1107Iで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2/ pRS405 ssEG2-CBH2(NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c)に導入した。トリプトファンドロップアウト(トリプトファン不含培地)プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。各々の破壊されたTRP1遺伝子が復活することで、β−グルコシダーゼ1遺伝子の導入を確認した。この株を、簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL」とも表記する。本調製例によって、調製例2−6のコピー数3のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ2を分泌する株においてさらに、1コピー数のβ−グルコシダーゼを表層提示するようにした株が得られた。
粉末状コーンファイバーを約10質量%の濃度となるように水と混合し、これをオートクレーブ式(型式SR型)加圧熱水処理装置(株式会社 新坂下製作所製)の反応器に入れ、180℃にて30分間処理した(この処理を単に「熱水処理」ともいう)。次いで、これを70℃で12時間、乾燥器で乾燥して水分を除去し、固形物を得た。この固形物を、発酵基質として用いた。
粉末状コーンファイバーを約10質量%の濃度となるように水と混合し、この混合物および15質量%濃度のアンモニアの水溶液をオートクレーブ式(型式SR型)加圧熱水処理装置(株式会社 新坂下製作所製)の反応器に入れ、170℃にて45分間処理した(この処理を単に「アンモニア処理」ともいう)。次いで、温度を100℃まで低下させた後、加圧熱水処理装置の反応器を開放して水分およびアンモニアを蒸発させた。次いで、これを参考例1と同様に乾燥して水分およびアンモニアをさらに除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
粉末状コーンファイバーを、参考例1と同様にして熱水処理し乾燥して水分を除去して固形分を得、引き続きこれを参考例2と同様にしてアンモニア処理し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
発酵基質の調製は、実施例1と同様にして行った。
参考例1と同様にして、粉砕した稲わらを熱水処理に供し、乾燥して固形物を得た。但し、熱水処理は180℃にて90分間行った。この固形物を発酵基質として用いた。
本実施例では、発酵基質として熱水処理稲わら、アンモニア処理稲わら、および熱水処理後アンモニア処理稲わらのそれぞれを用いてフェドバッチ発酵を行い、エタノール生産量を調べた。
DDG(ディスティラーズ・ドライ・グレイン、トウモロコシ蒸留乾燥残渣)を、参考例1と同様にして熱水処理に供し乾燥して固形物を得た。この固形物を、発酵基質として用いた。
DDGを、参考例2と同様にアンモニア処理に供し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
DDGを、実施例1と同様に熱水処理後アンモニア処理に供し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
DDGを、実施例1と同様に熱水処理(180℃にて30分間)後アンモニア処理(170℃にて45分間)に供し、固形物を得、本固形物を、熱水処理後アンモニア処理発酵基質として用いた。
Claims (3)
- エタノールを製造する方法であって
セルロース系物質を熱水処理後アンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程;および
該発酵基質と酵母とを反応させる工程であって、それによりエタノールを生産する、工程
を含み、ここで該酵母が、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素および非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の一方または両方が表層提示され、そしてセロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素が表層提示されている酵母であり、ここで該反応工程が、該発酵基質を追加投入して行われる、方法。 - 前記酵母が、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼの一方または両方が表層提示され、そしてβ−グルコシダーゼが表層提示されている酵母である、請求項1に記載の方法。
- 前記酵母が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼがそれぞれ表層提示されているセルラーゼ表層提示酵母である、請求項2に記載の方法。
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