WO2011067960A1 - エタノールの製造方法 - Google Patents

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WO2011067960A1
WO2011067960A1 PCT/JP2010/061131 JP2010061131W WO2011067960A1 WO 2011067960 A1 WO2011067960 A1 WO 2011067960A1 JP 2010061131 W JP2010061131 W JP 2010061131W WO 2011067960 A1 WO2011067960 A1 WO 2011067960A1
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WO
WIPO (PCT)
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yeast
fermentation
cellulase
gene
ammonia
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/061131
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
野田　秀夫
昌平 金子
近藤　昭彦
Original Assignee
Ｂｉｏ－ｅｎｅｒｇｙ株式会社
関西化学機械製作株式会社
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Publication date
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Priority to JP2011544207A priority patent/JP5752049B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to the production of ethanol by yeast.
  • non-edible carbon source soft biomass eg, herbaceous wastes such as rice straw, straw, bagasse, rice husk, cotton, bamboo, paper, and corn stover.
  • an acid saccharification method and an enzymatic saccharification method as a method for producing glucose using a cellulose material as a raw material.
  • acid saccharification methods there are known a dilute acid saccharification method using a dilute acid at a high temperature (200 ° C. or higher) and a saccharification method using concentrated sulfuric acid.
  • the cellulose material is hydrolyzed under extreme conditions, so that a secondary decomposition reaction of glucose, which is a decomposition product of the cellulose material, occurs, and the saccharification rate is as low as about 50%.
  • the saccharification of the cellulose material can be performed under mild conditions.
  • the reaction rate of saccharification is slow and a long time is required for sufficient saccharification.
  • the low potency of commercially available enzymes used for saccharification there is a problem that sufficient saccharification requires a large amount of enzyme, and therefore the cost of the enzyme used is increased.
  • a cell surface display technique is preferably used.
  • yeast that surface-displays a group of enzymes that hydrolyze cellulose is produced by cell surface display technology (Patent Documents 1 and 2).
  • Yeast Saccharomyces cerevisiae cannot metabolize xylose, but xylan-degrading enzyme Trichoderma reesei xylanase 2 (XYNII) and Aspergillus oryzae-derived ⁇ -xylosidase (XylA) is displayed on the surface and xylose reductase (XR) gene and xylitol dehydrogenase (XDH) gene (both derived from Pichia stipitis) and xylulokinase (XK) gene (derived from Saccharomyces cerevisiae) are expressed Saccharomyces cerevisiae has been produced, and an attempt has been made to produce ethanol from xylan as a cocoon using this yeast (Non-patent Document 1).
  • XYNII Trichoderma reesei xylanase 2
  • XylA Aspergillus oryzae-derived
  • yeast that displays cellulase on the surface is used for ethanol production from a soft biomass substrate
  • cellulase enzymes have been used in combination in fermentation in order to obtain high ethanol production. Considering the cost, it is desirable that the amount of enzyme used together can be reduced. In addition, for more efficient production of ethanol, it is desirable to prepare an environment in which the substrate degrading enzyme can act more effectively on the soft biomass substrate.
  • hydrothermal methods for example, liquid hot water treatment, steam explosion treatment, pressurized hot water treatment (Patent Document 1), etc.
  • AFEX ammonia explosion
  • ARP ammonia circulation Hydrolysis production of sugar is known by leaching (ARP), lime treatment, pH adjustment, and dilute acid treatment
  • Non-patent Documents 2 and 3 Non-patent Documents 2 and 3).
  • Non-Patent Documents 4 to 7 disclose lignin in soft biomass in addition to cellulose and hemicellulose. It is desirable to remove lignin in order to facilitate the ethanol production reaction. Many papers on selective degradation of lignin by ammonia treatment have been reported (Non-Patent Documents 4 to 7).
  • the present invention aims to provide an efficient method in the production of ethanol using soft biomass.
  • the present invention provides a method for producing ethanol, the method comprising: Subjecting the cellulosic material to hydrothermal treatment and ammonia treatment to obtain a fermentation substrate; and reacting the fermentation substrate with yeast, thereby producing ethanol.
  • the cellulosic material is subjected to the ammonia treatment after the hot water treatment.
  • the yeast is a cellulase yeast.
  • the cellulase yeast is a cellulase surface-displaying yeast in which endoglucanase, cellobiohydrolase, and ⁇ -glucosidase are respectively displayed on the surface.
  • the reaction step is performed by additionally adding the fermentation substrate.
  • the present invention also provides a method of producing a fermentation substrate for ethanol production, the method comprising: A method comprising subjecting a cellulosic material to hydrothermal treatment and ammonia treatment to obtain a fermentation substrate.
  • a method for efficiently producing ethanol from a cellulosic material is provided.
  • Cellulase yeast refers to a yeast that has the ability to hydrolyze cellulose and to ferment ethanol from glucose.
  • An enzyme such as a wild-type yeast
  • cellulose non-hydrolyzable yeast also referred to as “cellulose non-hydrolyzable yeast” in the present specification
  • a transformed yeast to which cellulose hydrolyzing power is imparted or enhanced can be produced.
  • the transformed yeast to which the cellulose hydrolyzing power is imparted or enhanced is included in “cellulase yeast”.
  • cellulase yeast prepared as described below is preferable, but not limited thereto.
  • An enzyme capable of hydrolyzing cellulose can be derived from any cellulose hydrolase-producing bacterium.
  • Cellulose hydrolase producing bacteria typically include the genus Aspergillus (for example, Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger, and Aspergillus oryzae), Trichoderma (for example, Trichoderma reesei), Clostridium (eg, Clostridium thermocellum), Cellulomonas (eg, Cellulomonas fimi and Cellulomonas uda), Examples include microorganisms belonging to the genus Pseudomonas (for example, Pseudomonas fluorescence).
  • the enzyme capable of hydrolyzing cellulose can be an enzyme capable of cleaving a ⁇ 1,4-glucoside bond.
  • enzymes capable of cleaving a ⁇ 1,4-glucoside bond include endo ⁇ 1,4-glucanase (hereinafter simply referred to as “endoglucanase”), cellobiohydrolase, and ⁇ -glucosidase. It is not limited to.
  • Endoglucanase is an enzyme usually referred to as cellulase, which cleaves cellulose from the inside of the molecule to produce glucose, cellobiose, and cellooligosaccharide (the degree of polymerization is 3 or more and usually 10 or less. (“Cellulose intramolecular cleavage”)). Endoglucanase is highly reactive to low crystallinity or amorphous cellulose, such as non-crystallized cellulose, soluble cellooligosaccharides, and cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC), but has a crystalline structure Reactivity to cellulose microfibrils is low.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Endoglucanase is a representative example of an enzyme capable of hydrolyzing amorphous cellulose (hereinafter also referred to as “amorphous hydrolase”).
  • amorphous hydrolase There are five types of endoglucanases, which are called endoglucanase I (EGI), endoglucanase II (EGII), endoglucanase III (EGIII), endoglucanase IV (EGIV), and endoglucanase V (EGV), respectively.
  • EGI endoglucanase I
  • EGII endoglucanase II
  • EGIII endoglucanase III
  • EGIV endoglucanase IV
  • EV endoglucanase V
  • Cellobiohydrolase can be decomposed from either the reducing end or non-reducing end of cellulose to release cellobiose (“cellulose molecular end cleavage”).
  • Cellobiohydrolase can degrade crystalline cellulose such as cellulose microfibrils having a crystalline structure, but is reactive to low crystallinity or amorphous cellulose such as cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose (CMC). Is low.
  • Cellobiohydrolase is a representative example of an enzyme capable of hydrolyzing crystalline cellulose (hereinafter also referred to as “crystalline hydrolase”).
  • CBH1 cellobiohydrolase 1
  • CBH2 cellobiohydrolase 2
  • ⁇ -glucosidase is an exo-type hydrolase that separates glucose units from non-reducing ends in cellulose.
  • ⁇ -glucosidase can cleave ⁇ 1,4-glucoside bond between aglycone or sugar chain and ⁇ -D-glucose, and can hydrolyze cellobiose or cellooligosaccharide to produce glucose.
  • ⁇ -glucosidase is a representative example of an enzyme capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide.
  • One type of ⁇ -glucosidase is currently known and is referred to as ⁇ -glucosidase 1 (BGL1).
  • BGL1 Aspergillus acreatas-derived ⁇ -glucosidase
  • BGL1 Aspergillus acreatas-derived ⁇ -glucosidase
  • Cellulase yeast can be prepared, for example, by introducing a gene group of enzymes capable of hydrolyzing cellulose into cellulose non-hydrolyzable yeast (such as wild type yeast) as described in detail below.
  • the gene group of enzymes capable of hydrolyzing cellulose includes genes of enzymes capable of hydrolyzing crystalline cellulose and genes of enzymes capable of hydrolyzing amorphous cellulose.
  • An enzyme capable of hydrolyzing crystalline cellulose (“crystalline hydrolase”) refers to any enzyme capable of hydrolyzing cellulose having a crystal structure such as microfibril, and examples thereof include cellobiohydrolase. However, it is not limited to this.
  • an enzyme capable of hydrolyzing amorphous cellulose does not degrade cellulose having a crystalline structure, but has a low crystallinity or non-crystallinity such as amorphous cellulose. It refers to any enzyme capable of hydrolyzing a natural cellulose chain, and examples thereof include, but are not limited to, endoglucanase.
  • the gene group of enzymes capable of hydrolyzing cellulose may further include genes of enzymes capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide.
  • the cellooligosaccharide is as described above. Examples of the enzyme capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide include, but are not limited to, ⁇ -glucosidase.
  • Cellulase yeast can be produced, for example, by performing genetic recombination of crystalline hydrolase and / or amorphous hydrolase on cellulose non-hydrolyzable yeast (such as wild-type yeast). It is preferable that it can be produced by genetic recombination so that the expression of both crystalline hydrolase and amorphous hydrolase is increased. That is, the yeast is introduced into a non-hydrolyzable cellulose yeast with an incorporated copy number in which the gene copy number of each enzyme is increased together to obtain a transformed yeast.
  • the expression pattern of the crystalline hydrolase and the amorphous hydrolase is not limited as long as the expressed enzyme acts on the cellulosic substrate. For example, the expression pattern can be surface presentation or secretory expression. At least one or both of the crystalline hydrolase and the amorphous hydrolase can be surface-presented or secreted. The yeast may be transformed so that surface presentation and secretion of crystalline and amorphous hydrolases occur simultaneously.
  • the cellulase yeast has an incorporated gene for an enzyme capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide.
  • an enzyme capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide is also expressed in yeast.
  • the number of incorporated copies of an enzyme gene capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide is 1 copy, whereas the number of incorporated copies of each gene of crystalline hydrolase and amorphous hydrolase is at least 2 copies. It can be.
  • cellobiohydrolase can be used as a crystalline hydrolase
  • endoglucanase can be used as an amorphous hydrolase.
  • a single yeast can be transformed with at least two vectors that together contain the expression cassettes for the genes of these enzymes (detailed below).
  • a single yeast may be transformed with at least two sets of combinations of vectors each containing an expression cassette for the gene of each of these enzymes.
  • the practical yeast does not originally have an auxotrophic marker and it is desirable to impart an auxotrophic marker. It is preferable in terms of the efficiency of the operation to prepare a vector containing the above expression cassettes (examples of vectors include the vectors described in the following Examples).
  • Cellulase yeast may be one in which ⁇ -glucosidase is further incorporated as an enzyme capable of hydrolyzing cellobiose or cellooligosaccharide.
  • the cellulase yeast may be a yeast in which three enzymes, ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and endoglucanase are expressed.
  • each of these can be a surface displayed yeast.
  • Such a yeast is also referred to as “cellulase surface-displaying yeast” for convenience.
  • the ethanol production can be increased by increasing the cellobiohydrolase and endoglucanase integration copy numbers relative to the ⁇ -glucosidase gene integration copy number. Accordingly, at least two copies of each of the cellobiohydrolase and endoglucanase genes can be incorporated with respect to one copy copy of the ⁇ -glucosidase gene. Each of the genes for cellobiohydrolase and endoglucanase can be integrated in 3 copies or more for 1 copy of the ⁇ -glucosidase gene. By performing such genetic recombination on cellulose non-hydrolyzable yeast (such as wild-type yeast), yeast with increased ethanol production can be obtained.
  • cellulose non-hydrolyzable yeast such as wild-type yeast
  • cellobiohydrolase and endoglucanase are surface displayed or secreted, and ⁇ -glucosidase is incorporated to be surface displayed.
  • cellobiohydrolase, endoglucanase, and ⁇ -glucosidase can be displayed on the surface.
  • the gene of the enzyme intended for expression can be obtained from a microorganism producing the enzyme by designing a primer or a probe based on known sequence information and using PCR or a hybridization method.
  • An expression cassette can be constructed using an enzyme gene.
  • the expression cassette may contain so-called regulatory elements such as promoters and terminators that regulate the expression of the gene.
  • the promoter and terminator may be those of the gene intended for expression itself or those derived from other genes.
  • promoters and terminators such as GAPDH (glyceraldehyde 3′-phosphate dehydrogenase), PGK (phosphoglycerate kinase), GAP (glyceraldehyde 3′-phosphate) can be used.
  • GAPDH glycose dehydrogenase
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • GAP glycose
  • the selection of the terminator can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the gene to be expressed. Additional regulators (eg, operators and enhancers) can be further included as needed. Expression regulators such as operators and enhancers can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the expression cassette can further contain necessary functional sequences depending on
  • cell surface engineering techniques can be used.
  • the target enzyme protein is (a) presented on the cell surface via the GPI anchor of the cell surface localized protein, and (b) presented on the cell surface via the sugar chain binding protein domain of the cell surface localized protein.
  • the technique of cell surface engineering is also described in Patent Documents 1 and 2, for example.
  • Cell surface localized proteins that can be used include ⁇ - or a-agglutinin which is a sex aggregation protein of yeast (used as a GPI anchor), Flo1 protein (Flo1 protein has various amino acid lengths on the N-terminal side, Can be used as a GPI anchor: for example, Flo42, Flo102, Flo146, Flo318, Flo428, etc .;
  • a gene encoding a protein localized on the cell surface by a GPI anchor encodes a secretory signal sequence, a cell surface localized protein (sugar chain binding protein domain), and a GPI anchor attachment recognition signal sequence in this order from the N-terminal side.
  • a cell surface localized protein (glycan binding protein) expressed from this gene in the cell is guided to the outside of the cell membrane by a secretion signal, and the GPI anchor attachment recognition signal sequence is selectively cleaved at the C-terminal. It binds to the GPI anchor of the cell membrane via the portion and is fixed to the cell membrane. Thereafter, it is cut by the PI-PLC near the base of the GPI anchor, incorporated into the cell wall, fixed to the cell surface layer, and presented to the cell surface layer.
  • GPI anchor refers to a glycolipid called ethanolamine phosphate-6 mannose ⁇ 1-2 mannose ⁇ 1-6 mannose ⁇ 1-4 glucosamine ⁇ 1-6 inositol phospholipid, called glycosylphosphatidylinositol (GPI).
  • GPI-PLC refers to phosphatidylinositol-dependent phospholipase C.
  • the secretory signal sequence generally means an amino acid sequence containing many amino acids rich in hydrophobicity at the N-terminal of a protein (secretory protein) secreted extracellularly (including periplasm). Sex proteins are removed when they pass through the cell membrane and are secreted outside the cell. Any secretory signal sequence can be used as long as it is a secretory signal sequence capable of leading the expression product to the cell membrane, regardless of its origin.
  • a glucoamylase secretion signal sequence, a yeast ⁇ - or a-agglutinin secretion signal sequence, a secretion signal sequence of the expression product itself, and the like are preferably used as the secretion signal sequence. If the activity of other proteins fused to the cell surface localized protein is not affected, for example, a part or all of the secretory signal sequence and the pro sequence may remain at the N-terminus.
  • the GPI anchor adhesion recognition signal sequence is a sequence recognized when the GPI anchor binds to the cell surface localized protein, and is usually located at or near the C terminal of the cell surface localized protein.
  • the GPI anchor attachment signal sequence for example, the sequence of the C-terminal part of yeast ⁇ -agglutinin is preferably used. Since the GPI anchor adhesion recognition signal sequence is included on the C-terminal side of the sequence of 320 amino acids from the C-terminus of ⁇ -agglutinin, the gene used in the above method encodes a sequence of 320 amino acids from the C-terminus. DNA sequences are particularly useful.
  • a DNA encoding a secretory signal sequence-a structural gene encoding a cell surface localized protein-a sequence having a DNA sequence encoding a GPI anchor adhesion recognition signal, and a structural gene encoding this cell surface localized protein By substituting all or part of the sequence with DNA encoding the target enzyme protein, recombinant DNA for presenting the target enzyme protein on the cell surface via the GPI anchor can be obtained.
  • the cell surface localized protein is ⁇ -agglutinin
  • the enzyme presented on the cell surface by introducing such DNA into yeast and expressing it has its C-terminal side immobilized on the surface.
  • the sugar chain binding protein domain has a plurality of sugar chains, and this sugar chain interacts with or entangles with sugar chains in the cell wall. It is possible to stay. Examples thereof include sugar chain binding sites such as lectins and lectin-like proteins.
  • sugar chain binding sites such as lectins and lectin-like proteins.
  • an aggregation functional domain of GPI anchor protein and an aggregation functional domain of FLO protein can be mentioned.
  • the aggregation functional domain of the GPI anchor protein is a domain that is located on the N-terminal side of the GPI anchoring domain, has a plurality of sugar chains, and is considered to be involved in aggregation.
  • the enzyme is presented on the cell surface layer by binding the sugar chain binding protein domain (or aggregation functional domain) of the cell surface localized protein and the target enzyme protein.
  • the enzyme is bound to the N-terminal side of the sugar chain binding protein domain (or aggregation functional domain) of the cell surface localized protein
  • the enzyme is bound to the C-terminal side
  • the same or different enzymes can be bound to both the N-terminal side and the C-terminal side.
  • DNA encoding secretory signal sequence-gene encoding target enzyme-structural gene encoding sugar chain binding protein domain (or aggregation functional domain) of cell surface localized protein or ( 2) DNA encoding secretory signal sequence-structural gene encoding sugar chain binding protein domain (or aggregation functional domain) of cell surface localized protein-gene encoding target enzyme; or (3) secretory signal sequence Encoding DNA-First gene encoding target enzyme-Structural gene encoding sugar chain binding protein domain (or aggregation functional domain) of cell surface localized protein-Second gene encoding target enzyme (However, the first gene and the second gene may be the same or different.
  • the target enzyme protein can be expressed on the cell surface as a fusion protein with a periplasm free protein.
  • the periplasmic free protein include invertase (Suc2 protein).
  • the target enzyme can be appropriately fused to the N-terminal or C-terminal depending on these periplasmic free proteins.
  • a method for secreting proteins out of cells and expressing them in yeast is well known to those skilled in the art.
  • a recombinant DNA in which the gene for the target enzyme protein is linked to the DNA encoding the secretory signal sequence may be prepared and introduced into yeast.
  • a recombinant gene in which the gene of the target enzyme protein is linked may be prepared and introduced into yeast without using the cell surface display technique or the secretion signal.
  • Synthesis and binding of DNA containing various sequences can be performed by techniques that can be commonly used by those skilled in the art.
  • the binding between the secretory signal sequence and the structural gene of the target enzyme can be performed using site-directed mutagenesis. By using this method, it is possible to cleave the secretory signal sequence accurately and to express the active enzyme.
  • the enzyme gene or expression cassette can be inserted into a vector in the form of a plasmid.
  • a shuttle vector of yeast and E. coli is preferable.
  • the vector can include regulatory sequences as described above.
  • a replication origin (Ori) of 2 ⁇ m plasmid of yeast and a replication origin of Escherichia coli plasmid ColE1, and a yeast selection marker (eg, drug resistance gene, auxotrophic marker)
  • Genes eg, a gene encoding imidazoleglycerol phosphate dehydrogenase (HIS3), a gene encoding malate beta-isopropyl dehydrogenase (LEU2), a gene encoding tryptophan synthase (TRP5), and argininosuccinate lyase (ARG4)
  • a gene encoding 3) a gene encoding dihydrooro
  • starting material plasmids include plasmids pYGA2270 or pYE22m containing the GAPDH promoter and GAPDH terminator, or plasmids pWI3, PGK containing UPR-ICL (isocitrate lyase upstream region) and Term-ICL (isocitrate lyase terminator region) Examples thereof include a plasmid pGK406 containing a promoter and a PGK terminator. Plasmid vectors can be prepared as shown in the examples below.
  • introduction of a gene or DNA means not only the introduction of a gene or DNA into a cell but also the expression thereof.
  • Transformation refers to the alteration or manipulation of a host's genetic trait by introducing and expressing a gene or DNA into a cell.
  • yeast cells for gene or DNA introduction or transformation include a method using lithium acetate and a protoplast method.
  • the introduced DNA may exist in the form of a plasmid, or may be inserted into a host gene, or may be incorporated into a chromosome by causing homologous recombination with the host gene.
  • the host yeast is a cellulose non-hydrolyzable yeast, which can be a wild type yeast.
  • the type of yeast is not particularly limited, but yeast belonging to the genus Saccharomyces is particularly preferable, and Saccharomyces cerevisiae is preferable.
  • it is a wild type yeast of a practical yeast. Wild-type yeast may be genetically modified to enhance the ability to ferment alcohol from a monosaccharide (eg, glucose) as a substrate.
  • a monosaccharide eg, glucose
  • “Practical yeast” refers to any yeast conventionally used in ethanol fermentation (for example, sake yeast, shochu yeast, wine yeast, brewer's yeast, baker's yeast, etc.). Among practical yeasts, sake yeast having high ethanol fermentation ability and high ethanol tolerance and genetically stable is preferable.
  • the “practical yeast” is a yeast having high ethanol tolerance, and is preferably a yeast that can survive even at an ethanol concentration of 10% or more. Further, it preferably has acid resistance, heat resistance and the like. More preferably, it may be cohesive.
  • Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 strain (MAT ⁇ , haploid yeast, heat and acid resistant, and cohesive) available from the Independent Administrative Agency Product Evaluation Technology Board Organization And NBRC 1445 strain (MATa, haploid yeast, heat and acid resistant, no cohesiveness).
  • yeasts Since practical yeasts have extremely high resistance to ethanol, they can be used for ethanol fermentation as they are after producing monosaccharides. Among them, since it is resistant to various culture stresses, it is preferable in terms of showing stable cell growth even in industrial production in which strict control is difficult and harsh culture conditions may occur. In addition, since practical yeasts are polyploid, it is possible to incorporate multiple gene constructs (expression vectors) into homologous chromosomes, and as a result, compared to the case of integrating into laboratory yeasts, which are often haploid, Increases the expression level of the target protein.
  • auxotrophic marker suitable for the gene transfer of interest is a practical yeast (especially a yeast that does not have auxotrophy and has high ethanol tolerance (preferably can survive even at an ethanol concentration of 10% or more)). ) Makes it easy to introduce the target gene.
  • the auxotrophic marker includes, but is not limited to, uracil requirement, trypsin requirement, leucine requirement, histidine requirement, etc. due to its genetic manipulation.
  • the uracil requirement can be imparted by transferring a ura3 - fragment obtained from a uracil requirement mutant (for example, Saccharomyces cerevisiae MT-8 strain) to a normal ura3 gene of a practical yeast.
  • auxotrophy eg, trypsin requirement, leucine requirement, histidine requirement, etc.
  • fragments are used to destroy these genes. Can be designed and granted.
  • the practical yeast introduced with the above expression cassette can be selected with a yeast selection marker (for example, the above-mentioned auxotrophic marker) as described above. Furthermore, it can be confirmed by measuring the activity of the expressed enzyme protein. Whether the protein is immobilized on the cell surface layer can be confirmed, for example, by an immunoantibody method using an anti-protein antibody and a FITC-labeled anti-IgG antibody.
  • a yeast selection marker for example, the above-mentioned auxotrophic marker
  • the step of reacting yeast with a substrate and thereby producing ethanol is also referred to as a “fermentation step” for convenience.
  • a cellulosic material as described below is subjected to a hot water treatment and an ammonia treatment before the reaction with yeast (“fermentation step”).
  • the ammonia treatment may be performed after the hot water treatment (for convenience, also referred to as “ammonia treatment after the hot water treatment”), or the hot water treatment may be performed after the ammonia treatment (for convenience, the “ammonia treatment”). Also referred to as post-hydrothermal treatment).
  • a cellulosic material that has been subjected to hot water treatment and ammonia treatment (preferably subjected to ammonia treatment after the hot water treatment) is used as a substrate for the fermentation process.
  • the substrate of the fermentation process is also referred to as “fermentation substrate”.
  • cellulosic material refers to any material, product, and composition containing cellulose.
  • cellulose refers to a fibrous polymer in which glucopyranose is linked by ⁇ 1,4-glucoside bonds, but also includes derivatives or salts thereof, or those whose degree of polymerization has been reduced by decomposition.
  • Cellulosic material includes, for example, paper products produced in the manufacture or recycling of paper, cotton products such as used clothing and waste towels, and wood parts or herbs of wood that are not harvested agriculturally or disposed of in the process of food production Also included are any materials containing cellulose, such as the foliage and skin (especially non-edible parts) of sex plants. “Cellulosic materials” can also include cellulose compounds such as carboxymethylcellulose (CMC) in which the cellulose is carboxymethylated, phosphate-swelled cellulose, and crystalline cellulose (eg, Avicel). Among cellulose compounds, phosphate-swelled cellulose is a cellulose that is often used as an alternative substrate for cellulose in actual biomass in order to measure the cellulose hydrolyzing power of an enzyme capable of hydrolyzing cellulose.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • phosphate-swelled cellulose is a cellulose that is often used as an alternative substrate for cellulose in actual biomass in order to measure the cellulose hydrolyzing power of an
  • the material containing cellulose exemplified above may contain a plant cell wall component mainly composed of cellulose.
  • Plant cell walls usually contain hemicellulose and lignin as components in addition to cellulose.
  • plant parts organs, tissues, the degree of growth, etc., the content of these components may vary. Can be used regardless of plant parts or degree of growth.
  • cellulosic materials also include any materials and wastes and products that contain the plant cell wall components described above.
  • Insoluble dietary fiber is also included in the “plant cell wall component content”.
  • wastes that are discarded is preferred in terms of reuse.
  • Cellulosic substances include cellulose compounds themselves and compositions containing cellulose compounds, agricultural waste such as rice husks, bamboo, bagasse, straws (rice straw, wheat straw, etc.), corn cobs, wood (wood chips, Waste materials), old newspapers, magazines, cardboard, office waste paper, linter, cotton, pulp and waste pulp discharged from paper manufacturers.
  • the present invention can be suitably used even when a cellulosic material containing lignin is used as a raw material.
  • Corn fiber or DDG Disillers dry grain, corn distillation dry residue
  • Corn fiber is the portion of corn husk that is removed before fermentation in the ethanol production process.
  • DDG is a solid residue after saccharification by enzyme addition and fermentation by yeast, is a corn portion (such as husk) excluding starch used for fermentation, and can also include yeast used for fermentation.
  • Corn fiber or DDG is a material containing cellulose (cellulosic material). Both corn fiber and DDG can be obtained from corn starch manufacturers or distributors (eg, Sungrain Corporation).
  • Examples of the “hot water treatment” include a non-catalytic hydrothermal method as described in Patent Document 1.
  • the cellulosic material is ground if necessary and mixed with water at a concentration of, for example, about 10% by weight, and this mixture is subjected to processing.
  • a cellulose-based substance having a concentration of about 10% by mass is 120 to 300 ° C., preferably 150 to 280 ° C. More preferably, the treatment can be carried out at 180 to 250 ° C., and the treatment time is generally preferably in the range of 1 hour to 15 seconds.
  • the temperature can be raised slightly in relation to the heat history time.
  • a cellulosic substance having a concentration of about 10% by mass is 120 to 373 ° C., preferably 150 to 320 ° C., preferably 1 hour to 1 second.
  • the processing temperature and time can vary depending on the material used, and increasing the processing temperature can shorten the processing time.
  • the pressurization can be automatically or manually set by a device such that a temperature within the above range can be achieved.
  • ammonia treatment examples include ammonia solution treatment, ammonia explosion (AFEX), and ammonia circulation leaching (ARP).
  • AFEX ammonia explosion
  • ARP ammonia circulation leaching
  • the ammonia solution treatment is, for example, about 100 to about 200 ° C., preferably about 150 to about 190 ° C., more preferably about 170 using an aqueous ammonia solution having a concentration of about 10 to about 25% by mass, preferably about 15% by mass. It can be performed at about 5 minutes to about 90 minutes.
  • the treatment conditions can be appropriately set depending on the starting cellulosic material.
  • the ammonia treatment may be performed only once or repeatedly.
  • Each of the hot water treatment and the ammonia solution treatment may be performed in separate and independent devices, or both treatments may be sequentially performed in the same device.
  • the following treatment can be performed after separating the cellulosic material after the hot water treatment or the cellulosic material after the ammonia solution treatment from those treatment liquids (solutions).
  • the hydrothermal treatment of the cellulosic material it can be left under ammonia treatment conditions (for example, after the hydrothermal treatment is finished, the temperature in the reactor is changed to a temperature suitable for the ammonia treatment, and ammonia is injected to a predetermined concentration.
  • ammonia can be removed after the cellulosic material is treated with ammonia and then placed under hydrothermal treatment conditions. After the ammonia treatment, ammonia can be removed and recovered by distillation or stripping. The recovered ammonia can again be used for processing another batch.
  • the treatment with ammonia after the hot water treatment (for example, treatment of the cellulosic material after the hot water treatment with an ammonia solution) is preferred.
  • the hydrothermal treatment is performed in the reactor of the apparatus in a sealed and necessary pressure at a high temperature (eg, 170-230 ° C.) for a predetermined time, after which the temperature in the reactor is lowered to a lower temperature (eg, 150-230 ° C.).
  • the ammonia treatment can be performed for a predetermined time by injecting ammonia to a predetermined concentration. Thereafter, the temperature of the liquid obtained after the hot water treatment and after the ammonia treatment is lowered to, for example, 100 ° C.
  • the ammonia in the liquid can be evaporated by opening the reactor and then the ammonia can be further removed by drying the liquid and recovered as a fermentation substrate.
  • the liquid whose temperature has been lowered to 100 ° C. is introduced into the atmospheric distillation column and refluxed, for example, 28 wt% ammonia water is recovered from the top of the column and the ammonia is removed.
  • the product can be recovered from the bottom as a fermentation substrate.
  • the ammonia that can be contained in the fermentation substrate is less than several ppm, and the ammonia content is acceptable for practical use as a fermentation substrate.
  • the temperature in each step of the hot water treatment, the ammonia treatment, and the ammonia removal may be lowered in order, and the temperature fluctuation can be reduced in a series of these processes.
  • a higher ethanol production can be obtained.
  • the product generated after completion of the hot water treatment and ammonia treatment can be appropriately cooled or dried and then used as a fermentation substrate.
  • drying method There is no particular limitation on the drying method.
  • freeze-drying, low-temperature drying, room-temperature drying, high-temperature drying and the like can be mentioned, and any of them may be under ventilation or in vacuum.
  • ethanol in the fermentation process, can be produced by reacting with a yeast using a cellulosic material treated with hot water and ammonia as a fermentation substrate.
  • yeast having the ability to ferment ethanol from glucose can be used, but cellulase yeast can be preferably used.
  • Cellulase yeast is as described above.
  • cellulose can be decomposed into glucose by one yeast
  • a mixture of a plurality of types of yeasts that can decompose cellulose into glucose may be used.
  • it can be a combination of yeasts that express different enzymes so as to provide three enzymes, ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and endoglucanase, in the fermentation process.
  • ⁇ -glucosidase is preferably displayed on the surface.
  • Cellobiohydrolase and endoglucanase are also preferably displayed on the surface.
  • yeasts used for normal ethanol fermentation for example, wild-type practical yeasts
  • the reaction between the fermentation substrate and yeast can be performed by culturing yeast (preferably liquid culture) in a medium containing the fermentation substrate.
  • a fermentation process may be normally performed on the conditions which perform ethanol fermentation.
  • the fermentation medium may further include components necessary or desirable for yeast growth.
  • the temperature during the reaction of the fermentation process can depend on the yeast used, but is usually about 30 ° C. to about 38 ° C.
  • the fermentation pH is preferably about 4 to about 6, more preferably about 5.
  • Fermentation culture can be performed anaerobically (dissolved oxygen concentration can be, for example, about 1 ppm or less, more preferably about 0.1 ppm or less, and even more preferably about 0.05 ppm or less).
  • the form of the fermentation process includes a batch process, a fed batch process, a repeated batch process, a continuous process, and the like, and any of these may be used.
  • an additional fermentation substrate can be added at any time during the fermentation process to improve ethanol production (fed batch).
  • Yeast input, initial input of fermentation substrate and additional input and timing as needed, and fermentation time depend on requirements such as substrate type and condition, fermentation culture capacity, target production of fermented ethanol, etc. And can be determined appropriately.
  • the additional input amount and timing of the fermentation substrate may be determined while monitoring the viscosity of the fermentation medium, the amount of ethanol produced, or the amount of carbon dioxide generated due to the progress of fermentation.
  • the number of yeasts can be increased by culturing under aerobic conditions before being subjected to the fermentation process.
  • the medium may be a selective medium or a non-selective medium.
  • the pH of the medium during culture is preferably about 4 to about 6, more preferably about 5.
  • the dissolved oxygen concentration in the medium during aerobic culture is preferably about 0.5 to about 6 ppm, more preferably about 1 to about 4 ppm, and still more preferably about 2 ppm.
  • the culture temperature may be about 20 to about 45 ° C., preferably about 25 to about 40 ° C., more preferably about 30 to about 37 ° C.
  • the culture time can be determined based on the yeast load used for the fermentation reaction.
  • the total yeast cell concentration is 20 g (wet amount) / L or more, more preferably 50 g (wet amount) / L, more preferably 75 g (wet amount) / L or more, about 20 It can be on the order of about 50 hours.
  • Cellulase enzyme can be used as an auxiliary in the fermentation process.
  • Cellulase enzyme includes any form isolated as an enzyme.
  • “cellulase enzyme” includes an enzyme isolated and purified from a microorganism producing cellulase (ie, endoglucanase) as described above, and an enzyme produced by genetic recombination using a cellulase gene. It is done. Commercially available cellulase enzymes can also be used.
  • cellulase enzyme for example, Cellase of Nagase ChemteX Corporation: Cellulase derived from Trichoderma reesei: Potency 7.6 FPU / mL (“FPU” is an abbreviation of “Filter Paper Unit”, and 1 ⁇ mol per minute from the filter paper. The amount of the enzyme that produces a reducing sugar corresponding to the glucose of (1FPU) is mentioned.
  • a cellulase enzyme may be further added during the reaction between cellulase yeast and a cellulosic material in order to promote production efficiency.
  • the ethanol-containing medium is withdrawn from the fermenter, and ethanol is isolated by a separation process commonly used by those skilled in the art, such as a separation operation using a centrifuge and a distillation operation.
  • Yeast that preferably reacts with a fermentation substrate (preferably cellulase yeast, more preferably ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and endoglucanase, one or more (more preferably all three) yeasts that surface display) ) And optionally the cellulase enzyme is preferably immobilized on a carrier. As a result, reuse becomes possible.
  • a fermentation substrate preferably cellulase yeast, more preferably ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and endoglucanase, one or more (more preferably all three) yeasts that surface display
  • the cellulase enzyme is preferably immobilized on a carrier.
  • the carrier and method to be immobilized are those commonly used by those skilled in the art, and examples thereof include a carrier binding method, a comprehensive method, and a crosslinking method.
  • a porous body is preferably used as the carrier.
  • foams or resins such as polyvinyl alcohol, polyurethane foam, polystyrene foam, polyacrylamide, polyvinyl formal resin porous body, and silicon foam are preferable.
  • the size of the opening of the porous body can be determined in consideration of the microorganism to be used and its size, but in the case of practical yeast, it is preferably 50 to 1000 ⁇ m.
  • the shape of the carrier does not matter. Considering the strength of the carrier, the culture efficiency, etc., a spherical shape or a cubic shape is preferable.
  • the size may be determined depending on the microorganism to be used. In general, the diameter is preferably 2 to 50 mm for a spherical shape, and 2 to 50 mm square for a cubic shape.
  • a fermentation substrate can be additionally added at any time during the fermentation reaction to improve the ethanol production.
  • the increase in the viscosity of the fermentation medium caused by the input of the substrate can be reduced as the fermentation progresses, facilitating the additional input of the fermentation substrate, allowing the production of ethanol efficiently from the fermentation substrate, and ethanol after completion of the fermentation process Is easily isolated.
  • the amount of cellulase enzyme used as a supplement can be reduced.
  • Cellulase yeasts preferably ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and yeasts that display one or more (more preferably all three) of endoglucanase on the surface, can enhance these effects. obtain.
  • strains Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 (MAT ⁇ ) and Saccharomyces cerevisiae MT8-1 (MATa ade his3 leu2 trp1 ura3) used in this example were obtained from the National Institute of Technology and Evaluation.
  • yeast transformations shown in this example were performed with lithium acetate using a YEAST® MAKER yeast transformation system (Clontech® Laboratories, “Palo Alto, California, USA”).
  • Preparation Example 1-1 Preparation of yeast provided with auxotrophic markers of URA3, HIS3, TRP1, and LEU2
  • Preparation Example 1-1-1 Granting of URA3 requirement to NBRC1440 strain
  • a primer for forward primer SEQ ID NO: 1
  • reverse primer SEQ ID NO: 2
  • This fragment was introduced into Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 (MAT ⁇ ) strain, and a URA3 mutant was selected with 5-fluoroorotic acid (FOA) medium to obtain NBRC1440 strain imparted with URA3 requirement.
  • FOA 5-fluoroorotic acid
  • the 5-fluoroorotic acid (FOA) medium was prepared as follows. Uracil dropout synthetic dextrose (SD) medium (Non-patent Document 11) supplemented with 50 mg / L uracilic acid and 2% (w / v) agar was autoclaved and maintained at 65 ° C. FOA was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 100 mg / mL and added to the autoclaved medium at about 65 ° C. to make the final concentration of FOA 1 mg / mL.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Fusion PCR was performed as follows: PCR using a primer pair of PCR1, HIS3-Green U (SEQ ID NO: 3; Forward) and HIS3-Green R (SEQ ID NO: 4; Reverse) and genomic DNA extracted from Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 strain as a template HIS3 upstream partial sequence was prepared; URA3 was prepared by PCR using a primer pair of PCR2, URA3 fragment (SEQ ID NO: 5; Forward) and HIS3-40Uc (SEQ ID NO: 6; Reverse) using the pRS406 plasmid (Stratagene) as a template; A fusion fragment is prepared by PCR using a primer pair of PCR3, HIS3-Green U (SEQ ID NO: 3; Forward) and HIS3-40Uc (SEQ ID NO: 6; Reverse) and mixing the products of PCR1 and PCR2 as templates. did.
  • homologous recombination was performed by a conventional method for the NBRC1440 strain to which the URA3 marker prepared as described above was added. Strains without uracil requirement were selected on uracil dropout (uracil-free medium) plates. When this construct is integrated into the chromosome of the above-mentioned practical yeast NBRC1440, HIS3 gene disruption occurs, and the URA3 marker and the repeated sequences on both sides thereof are integrated into the chromosome.
  • the strain in which this homologous recombination occurred was grown in YPD medium at 30 ° C. for 24 hours. They were then grown to 1.0 ⁇ 10 7 cells / 200 ⁇ L on 5-FOA media plates. All colonies that grew on 5-FOA media plates were of the uracil auxotrophic (Ura ⁇ ) phenotype and were selected. In strains grown on 5-FOA media plates, due to further homologous recombination caused by repeat sequences flanking the URA3 marker, the URA3 marker that had been introduced by the previous homologous recombination is removed from the chromosome, It showed a uracil auxotrophy (Ura ⁇ ) phenotype.
  • TRP1 upstream partial sequence was prepared by PCR using PCR1, TRP1-988 (SEQ ID NO: 7; Forward) and RP1-28r (SEQ ID NO: 8; Reverse) primer pairs and genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae NBRC1440 as a template.
  • URA3 was prepared by PCR using the primer pair of PCR2, TRP1-URA3 (SEQ ID NO: 9; Forward) and TRP1-40r (SEQ ID NO: 10; Reverse) and the pRS406 plasmid (Stratagene) as a template;
  • a fusion fragment was prepared by PCR using a primer pair of PCR3, TRP1-988 (SEQ ID NO: 7; Forward) and TRP1-40r (SEQ ID NO: 10; Reverse) and mixing the products from PCR1 and PCR2 as templates. .
  • URA3, HIS3, and TRP1 were prepared in the same manner as in Preparation Example 1-1-2 from the NBRC1440 strain provided with the URA3, HIS3, and TRP1, and LEU2 markers prepared as described above. , And NBRC1440 strain with LEU2 requirement was obtained. This strain is represented as “NBRC1440 / UHWL” for convenience.
  • PEG23u31H6 (non-patented) using a 2719 bp DNA fragment containing the secretory signal sequence of the glucoamylase gene derived from Rhizopus oryzae, the EGII gene, and the 3 ′ half region of the ⁇ -agglutinin gene (non-patent document 12) as a template. It was prepared by PCR using a primer pair of SEQ ID NO: 15 (Forward) and SEQ ID NO: 16 (Reverse).
  • PGK phosphoglycerate kinase promoter and PGK terminator
  • Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain obtained from American Type Culture Collection (ATCC)
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the primer pair of SEQ ID NO: 17 (Forward) and SEQ ID NO: 18 (Reverse) and the PGK terminator were prepared by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 19 (Forward) and SEQ ID NO: 20 (Reverse).
  • a multicloning site was prepared by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 21 (Forward) and SEQ ID NO: 22 (Reverse).
  • the PGK promoter was digested with XhoI and NheI, the multicloning site was digested with NheI and BglII, and the PGK terminator was digested with BglII and NotI, respectively, and ligated to the XhoI-NotI sites of the pTA2 vector (Toyobo).
  • the resulting vector was digested with XhoI and NotI, the fragment was ligated to pRS406 (Stratagene), and the resulting vector was designated as pGK406.
  • the above 2719 bp DNA fragment is digested with NheI and XmaI, inserted between the NheI and XmaI sites of plasmid pGK406 containing the URA3 gene and its promoter and terminator, PGK promoter and PGK terminator, and the URA3 gene and its promoter and terminator,
  • a plasmid containing the PGK promoter, the secretory signal sequence of the Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene, the endoglucanase (EGII) gene, the 3 ′ half region of the ⁇ -agglutinin gene, and a PGK terminator was obtained.
  • the obtained plasmid was designated as pGK406 EG.
  • Non-patent Document 14 Using plasmid pFCBH2w3 (Non-patent Document 14) as a template, GAPDH (glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase) promoter, secretion signal sequence of Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene, CBH2 gene from Trichoderma reesei, 3 of ⁇ -agglutinin gene
  • GAPDH glycose promoter
  • secretion signal sequence of Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene CBH2 gene from Trichoderma reesei, 3 of ⁇ -agglutinin gene
  • SEQ ID NO: 23 Forward
  • SEQ ID NO: 24 Reverse
  • pGK403 EG From pGK406, a fragment containing the PGK promoter, the secretory signal sequence of the Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene, the EGII gene, and the PGK terminator was excised with ApaI and NotI and similarly digested with ApaI and NotI into pRS403 (manufactured by Stratagene). Connected. The obtained plasmid was designated as pGK403 EG.
  • GAPDH glycosylchoderma reesei
  • secretion signal sequence of Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene CBH2 gene derived from Trichoderma reesei, 3 ′ half region of ⁇ -agglutinin gene, and GAPDH terminator
  • the fragment was digested with NotI and ligated to pGK403 EG similarly digested with NotI, and the resulting plasmid was named pRS403 EG CBH2.
  • pGK405 EG From pGK406, a fragment containing the PGK promoter, the secretory signal sequence of the Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene, the EGII gene, and the PGK terminator was excised with ApaI and NotI and similarly digested with ApaI and NotI into pRS405 (Stratagene) Connected. The obtained plasmid was designated as pGK405 EG.
  • GAPDH glycosylchoderma reesei
  • secretion signal sequence of Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene CBH2 gene derived from Trichoderma reesei, 3 ′ half region of ⁇ -agglutinin gene, and GAPDH terminator
  • the fragment was digested with NotI and ligated into pGK405 EG that was also digested with NotI.
  • the obtained plasmid was designated as pRS405 EG CBH2.
  • bgl1 primer 1 (SEQ ID NO: 25) was prepared using a 2.5 kbp NcoI-XhoI DNA fragment encoding the ⁇ -glucosidase 1 (BGL1) gene derived from Aspergillus aculeatus as a template using plasmid pBG211 (gift from Kyoto University). ;) And bgl1 primer 2 (SEQ ID NO: 26; Reverse).
  • This DNA fragment was digested with NcoI and XhoI, and the cell surface expression plasmid pIHCS (non-patent document 12) containing the secretory signal sequence of the Rhizopus oryzae-derived glucoamylase gene and the 3 ′ half region of the ⁇ -agglutinin gene (non-patent document 12) It was inserted into the NcoI-XhoI site of Patent Document 13). The resulting plasmid was named pIBG13.
  • pIBG13 By using this pIBG13 as a template and PCR using a primer pair of SEQ ID NO: 23 (Forward) and SEQ ID NO: 24 (Reverse), the GAPDH promoter, Rhizopus oryzae-derived glucoamylase secretion signal sequence, BGL1 gene, ⁇ -agglutinin gene 3 A fragment containing the 'half region and the GAPDH terminator was prepared. This fragment was digested with NotI and ligated to pRS 404 similarly digested with NotI, and the resulting plasmid was named pIWBGL.
  • Preparation Example 1-6 Preparation of a yeast strain into which endoglucanase II and cellobiohydrolase 2 were incorporated at a copy number of 1
  • pRS406 EG CBH2 was cleaved with restriction enzyme NdeI to be linearized, introduced into NBRC1440 / UHWL, and a strain having no uracil requirement on a uracil dropout (uracil-free medium) plate was selected. The introduction of the gene was confirmed when the URA3 gene in which NBRC1440 / UHWL was destroyed was restored. This strain was named “NBRC1440 / pRS406 EG CBH2”.
  • pRS403 EG CBH2 was cleaved with restriction enzyme NdeI to be linearized, introduced into NBRC1440 / pRS406 EG CBH2, and a strain having no histidine requirement was selected on a histidine dropout (histidine-free medium) plate.
  • the NBRC1440 / pRS406 EG CBH2 disrupted HIS3 gene was revived to confirm gene introduction.
  • This strain was named “NBRC1440 / pRS406 EG CBH2 / pRS403 EG CBH2”.
  • This strain was named “NBRC1440 / pRS406 EG CBH2 / pRS403 EG CBH2 / pRS405 EG CBH2”. For simplicity, it is also expressed as “NBRC1440 / EG-CBH2-3c”.
  • pIWBGL is cut with Bst1107I into a straight line, introduced into NBRC1440 / pRS406 EG CBH2 / pRS403 EG CBH2 / pRS405 EG CBH2 (NBRC1440 / EG-CBH2-3c), and tryptophan on a tryptophan dropout (tryptophan-free medium) plate A strain having no requirement was selected. The introduction of ⁇ -glucosidase 1 gene was confirmed by reviving each disrupted TRP1 gene.
  • Plasmid pRS403 / ssEG2-CBH2 was constructed to have a histidine gene (HIS3) marker and to be incorporated to secrete endoglucanase II (EGII) and cellobiohydrolase 2 (CBH2).
  • Non-patent Document 15 Non-patent Document 15
  • F XYL2c-Xho
  • R XYL2c-NotI
  • a DNA fragment encoding a cloning site (SalI, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI) and a GAPDH terminator was prepared. The fragment was introduced into the XhoI / NotI site of pRS403 (Stratagene) to obtain plasmid pIHGP3.
  • the above 1308 bp DNA fragment is digested with SmaI and inserted into the SmaI part of the plasmid pIHGP3 containing the HIS3 gene and its promoter and terminator, GAPDH promoter and GAPDH terminator, and the secretion signal of the HIS3 gene and its promoter and terminator, GAPDH promoter and glucoamylase gene
  • a plasmid containing the sequence, EGII gene and GAPDH terminator was obtained.
  • the resulting plasmid was named pRS403 / ssEG2.
  • the above 1416 bp DNA fragment is digested with SmaI and inserted into the SmaI part of the plasmid pIHGP3 containing the HIS3 gene and its promoter and terminator, GAPDH promoter and GAPDH terminator, and the secretion signal of the HIS3 gene and its promoter and terminator, GAPDH promoter and glucoamylase gene
  • a plasmid containing the sequence, CBH2 gene and GAPDH terminator was obtained.
  • the resulting plasmid was named pRS403 / ssCBH2.
  • GAPDH glycosylchoderma reesei-derived CBH2 gene
  • GAPDH terminator-containing fragment is digested with NotI, and similarly digested with NotI PRS403 / ssEG2 was ligated.
  • the obtained plasmid was designated as pRS403 / ssEG2-CBH2.
  • PRS405 having the LEU2 gene marker was digested with ApaI and NotI, and the above fragment was inserted.
  • the resulting plasmid was named pRS405 / ssCBH2.
  • pRS403 / ssEG2 as a template, a fragment prepared by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 23 (Forward) and SEQ ID NO: 24 (Reverse) was digested with NotI and ligated to pRS405 / ssCBH2 similarly digested with NotI.
  • the obtained plasmid was designated as pRS405 / ssEG2-CBH2.
  • PRS406 having a URA3 gene marker was digested with ApaI and NotI, and the fragment obtained above was inserted.
  • the resulting plasmid was named pRS406 / ssCBH2.
  • pRS403 / ssEG2 as a template, a fragment prepared by PCR using the primer pair of SEQ ID NO: 23 (Forward) and SEQ ID NO: 24 (Reverse) was digested with NotI and ligated to pRS406 / ssCBH2 similarly digested with NotI.
  • the obtained plasmid was designated as pRS406 / ssEG2-CBH2.
  • Preparation Example 2-4 Preparation of yeast strain in which both secretory endoglucanase II and cellobiohydrolase 2 were incorporated at a copy number of 1
  • a pRS406 / ssEG2-CBH2 is cleaved with the restriction enzyme NdeI to be linearized, introduced into NBRC1440 / UHWL (Preparation Example 1-1), and a strain having no uracil requirement on a uracil dropout (uracil-free medium) plate Selected.
  • the introduction of the gene was confirmed when the URA3 gene in which NBRC1440 / UHWL was destroyed was restored. This strain was named “NBRC1440 / pRS406 / ssEG2-CBH2”.
  • Preparation Example 2-6 Preparation of a yeast strain into which endoglucanase II and cellobiohydrolase 2 were incorporated at a copy number of 3) pRS405 ssEG2-CBH2 is cleaved with restriction enzyme HpaI, linearized, introduced into NBRC1440 / pRS406 / ssEG2-CBH2 / pRS403 / ssEG2-CBH2, and has leucine requirement on leucine dropout (leucine-free medium) plate Selected no stock.
  • NBRC1440 / pRS406 / ssEG2-CBH2 / pRS403 / ssEG2-CBH2 was revived, and the introduction of the gene was confirmed.
  • This strain was named “NBRC1440 / pRS406 / ssEG2-CBH2 / pRS403 / ssEG2-CBH2 / pRS405 ssEG2-CBH2”. For simplicity, it is also expressed as “NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c”.
  • pIWBGL was cut into a straight line by cutting with Bst1107I and introduced into NBRC1440 / pRS406 / ssEG2-CBH2 / pRS403 / ssEG2-CBH2 / pRS405 ssEG2-CBH2 (NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c). Strains without tryptophan requirement were selected on tryptophan dropout (tryptophan-free medium) plates. The introduction of ⁇ -glucosidase 1 gene was confirmed by reviving each disrupted TRP1 gene.
  • This strain is also abbreviated as “NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL”. According to this preparation example, a strain that secreted 1 copy number of ⁇ -glucosidase on the surface was obtained in the strain that secreted endoglucanase II and cellobiohydrolase 2 of copy number 3 in Preparation Example 2-6.
  • Powdered corn fiber is mixed with water to a concentration of about 10% by mass, and this is put into a reactor of an autoclave type (model SR type) pressurized hot water treatment apparatus (manufactured by Shin Sakashita Seisakusho Co., Ltd.), 180 The treatment was performed for 30 minutes at 0 ° C. (this treatment is also simply referred to as “hot water treatment”). Subsequently, this was dried with a dryer at 70 ° C. for 12 hours to remove moisture, and a solid matter was obtained. This solid was used as a fermentation substrate.
  • Yeast cell pellets were prepared as follows. Yeast, SD medium supplemented with essential amino acids (synthetic dextrose medium: yeast nitrogen source other than 6.7 g / L amino acids (Yeast nitro base without amino acids) [Difco) and appropriate supplements; 20 g / L For 24 hours, pre-incubated at about 30 ° C at about pH 5.0 (dissolved oxygen concentration: about 2.0 ppm), and then for 48 hours at 30 ° C. The cells were cultured under the same conditions in a YPD medium (yeast extract / polypeptone / dextrose medium: 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 20 g / L glucose). The culture supernatant and the cell pellet were separated by centrifugation at 6,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a cell pellet. At the start of fermentation, the cell concentration was adjusted to 75 g / L (wet cells).
  • 500 ⁇ L (3.8 FPU) of cellulase Cellulase® SS, manufactured by Nagase ChemteX Corporation
  • the ethanol concentration during fermentation was measured by HPLC.
  • HPLC analysis was performed by using a refractive index (RI) detector (L-2490® RI detector, Hitachi, Ltd.).
  • the column used for the separation was Shim-pack SPR-Pb Column (Shimadzu Corporation).
  • the HPLC was operated at 80 ° C. with water at a flow rate of 0.6 mL / min as the mobile phase.
  • the fermentation medium became viscous as the fermentation reaction proceeded.
  • 50 g / L of fermentation substrate was added at 12 hours, 24 hours, and 48 hours after the start of fermentation, but such additional charge became difficult.
  • the effect of cellulase surface display yeast was hardly seen.
  • Cell pellet of NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (cellulase surface display yeast) or NBRC1440 cells (wild type yeast) prepared in the same manner as in Reference Example 1 (cell concentration at the start of fermentation is 75 g / L (wet cells)) Is inoculated into a fermentation medium containing 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5 g / L potassium disulfite, followed by Then, it was cultured and fermented in the same manner as in Reference Example 1. At the start of fermentation, 500 ⁇ L (3.8 FPU) of cellulase was added. In the same manner as in Reference Example 1, the ethanol concentration during fermentation was measured.
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface display yeast
  • the fermentation medium became viscous, making it difficult to stir for additional charging of the substrate. For this reason, the amount of input is increased by reducing the amount of input once, and as an additional input, 20 g / L each at 12 hours, 18 hours, 24 hours, 28 hours, 36 hours, and 48 hours after the start of fermentation.
  • the fermentation medium became viscous with the progress of the fermentation reaction even when cellulase surface-displaying yeast was used, and the viscosity of the final fermentation medium was very high.
  • Example 1 Fed-batch fermentation using ammonia-treated corn fiber after hot water treatment
  • the powdered corn fiber was treated with hot water in the same manner as in Reference Example 1 and dried to remove moisture to obtain a solid content. Subsequently, this was treated with ammonia in the same manner as in Reference Example 2, and then evaporated and dried to obtain moisture and ammonia. Was removed to obtain a solid. This solid was used as a fermentation substrate.
  • Cell pellet of NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (cellulase surface display yeast) or NBRC1440 cells (wild type yeast) prepared in the same manner as in Reference Example 1 (cell concentration at the start of fermentation is 75 g / L (wet cells)) Is inoculated into a fermentation medium containing 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5 g / L potassium disulfite, followed by Then, it was cultured and fermented in the same manner as in Reference Example 1. At the start of fermentation, 500 ⁇ L (3.8 FPU) of cellulase was added. In the same manner as in Reference Example 1, the ethanol concentration during fermentation was measured.
  • Example 2 Comparison of cellulase surface display yeast and cellulase-secreting yeast for ethanol production by fed-batch fermentation using ammonia-treated corn fiber after hot water treatment
  • the fermentation substrate was prepared in the same manner as in Example 1.
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface display yeast: Preparation Example 1
  • NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL Cellulase-secreting yeast: Preparation Example 2
  • Cell pellet of NBRC1440 cells wild type yeast
  • 50 g / L fermentation substrate 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone
  • 50 mM citrate A fermentation medium containing a buffer solution (pH 5.0) and 0.5 g / L of potassium disulfite was inoculated, followed by fermentation in the same manner as in Reference Example 1.
  • the amount of cellulase added at the start of fermentation was 500 ⁇ L of cellulase (3.8 FPU).
  • the ethanol concentration during fermentation was measured.
  • Reference Example 3 Fed batch fermentation using hot water treated rice straw
  • the crushed rice straw was subjected to hot water treatment and dried to obtain a solid.
  • the hot water treatment was performed at 180 ° C. for 90 minutes. This solid was used as a fermentation substrate.
  • FIG. 1 is a graph showing the change over time in the amount of ethanol produced by cellulase surface-displaying yeast or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using hot water-treated rice straw.
  • the horizontal axis of this graph represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circles represent the results of NBRC1440 (W: wild type yeast)
  • white circles represent the results of NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (C: cellulase surface display yeast).
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface-displaying yeast
  • Yeast was slightly higher than wild type yeast.
  • the ethanol production continued to increase in the wild-type yeast, whereas it stagnated in the cellulase surface-displaying yeast.
  • stagnant ethanol production was observed even in wild-type yeast.
  • Phenolic compounds can be derived from rice straw lignin.
  • the foreign thiocult method was used for the measurement of the amount of phenolic compounds.
  • FIG. 2 is a graph showing time-dependent changes in the amount of phenolic compounds produced by cellulase surface-displaying yeast or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using hot water-treated rice straw.
  • the horizontal axis of this graph represents fermentation time (hour), and the vertical axis represents phenolic compound production (g / L).
  • the black triangle represents the result of NBRC1440 (W: wild type yeast)
  • the white triangle represents the result of NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (C: cellulase surface-displaying yeast).
  • the production amount of the phenolic compound increased with time, and was about 4 g / L in 24 hours after the start of fermentation in which the stagnation of ethanol production occurred in the cellulase surface-displaying yeast.
  • the lignin associated with the cellulose is eluted into the fermentation medium as the cellulose is monosaccharified, leading to the production of phenolic compounds. It was found that the ethanol production of cellulase surface display yeast was influenced by the production of phenolic compounds from lignin in rice straw.
  • Example 3 Comparison of ethanol production by fed-batch fermentation using hot water treatment, ammonia treatment, and ammonia-treated rice straw after hot water treatment
  • fed-batch fermentation was performed using each of hot water-treated rice straw, ammonia-treated rice straw, and hot-treated ammonia-treated rice straw as fermentation substrates, and ethanol production was examined.
  • the hot water treated rice straw of Reference Example 3 was used as the hot water treated rice straw.
  • the ammonia-treated rice straw was subjected to ammonia treatment in the same manner as in Reference Example 2, and water and ammonia were removed by evaporation and drying to obtain a solid.
  • the ammonia treatment was performed at 170 ° C. for 90 minutes.
  • the hot water treatment was performed at 180 ° C. for 90 minutes, and the ammonia treatment was performed at 170 ° C. for 90 minutes.
  • the initial input amount of the fermentation substrate was 50 g / L, but the timing and amount of additional input of the fermentation substrate were determined by monitoring the viscosity of the slurry of the fermentation medium.
  • the viscosity of the slurry is high, it becomes difficult to stir the substrate in the fermentation medium. Therefore, in the case of hot water-treated rice straw, as an additional input, 40 g / L of fermentation substrate was added at 12 hours, 24 hours, 36 hours, and 48 hours after the start of fermentation.
  • 40 g / L of fermentation substrate was added at 12 hours, 24 hours, and 48 hours after the start of fermentation.
  • 50 g / L each of fermentation substrate was added at 6 hours, 24 hours, and 48 hours after the start of fermentation.
  • FIG. 3 is a graph showing the change over time in the amount of ethanol produced by cellulase surface-displaying yeast or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using hot water treatment, ammonia treatment, or ammonia-treated rice straw after hot water treatment.
  • the horizontal axis of this graph represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circle is NBRC1440 + hot water treated rice straw (W-hot water)
  • white circle is NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL + hot water treated rice straw (C-hot water)
  • black triangle is NBRC1440 + ammonia treated rice straw ( W-NH3)
  • white triangles are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL + ammonia-treated rice straw (C-NH3)
  • black squares are NBRC1440 + hot water-treated ammonia-treated rice straw (hot water ⁇ NH3 W)
  • white squares are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL + Ammonia-treated rice straw after hot water treatment (hot water ⁇ NH3 C).
  • the cellulase surface-displaying yeast increased the ethanol production in the same manner as the wild-type yeast, and the final ethanol production was higher in the cellulase surface-displaying yeast than in the wild-type yeast.
  • Cellulase surface-displaying yeast did not show stagnation as seen in hot water-treated rice straw.
  • the fermentation medium became viscous, making it difficult to add additional fermentation substrate.
  • the final fermentation medium viscosity was very high.
  • the ethanol production was higher in the ammonia-treated rice straw after the hot water treatment than in the other treated rice straw, and the difference became more noticeable as the fermentation time progressed.
  • the highest ethanol production was obtained when fermentation was performed with cellulase surface-displaying yeast using ammonia-treated rice straw as a fermentation substrate after hydrothermal treatment.
  • Yeast cell pellets were prepared as follows. Yeast, SD medium supplemented with essential amino acids (synthetic dextrose medium: yeast nitrogen source other than 6.7 g / L amino acids (Yeast nitro base without amino acids) [Difco) and appropriate supplements; 20 g / L For 24 hours, pre-incubated at about 30 ° C at about pH 5.0 (dissolved oxygen concentration: about 2.0 ppm), and then for 48 hours at 30 ° C. The cells were cultured under the same conditions in a YPD medium (yeast extract / polypeptone / dextrose medium: 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 20 g / L glucose). The culture supernatant and the cell pellet were separated by centrifugation at 6,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a cell pellet. At the start of fermentation, the cell concentration was adjusted to 75 g / L (wet cells).
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface display yeast
  • NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL cellulase-secreting yeast
  • NBRC1440 cells wild-type yeast prepared in the same manner as in Reference Example 1.
  • the pellet was inoculated into a fermentation medium containing 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5 g / L potassium disulfite. Then, it fermented by culture
  • the ethanol concentration during fermentation was measured by HPLC.
  • HPLC analysis was performed by using a refractive index (RI) detector (L-2490® RI detector, Hitachi, Ltd.).
  • the column used for the separation was Shim-pack SPR-Pb Column (Shimadzu Corporation).
  • the HPLC was operated at 80 ° C. with water at a flow rate of 0.6 mL / min as the mobile phase.
  • FIG. 4 is a graph showing the change over time in the amount of ethanol produced by cellulase surface-displaying yeast, cellulase-secreting yeast, or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using hot water-treated DDG.
  • the horizontal axis represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circles are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (Arm: cellulase surface display yeast), black triangles are NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL (Sec: cellulase-secreting yeast), and black squares are NBRC1440 cells
  • W wild type yeast
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface display yeast
  • NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL cellulase-secreting yeast
  • NBRC1440 cells wild-type yeast prepared in the same manner as in Reference Example 1.
  • Pellets (cell concentration at the start of fermentation is 75 g / L (wet cells)), 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5
  • a fermentation medium containing g / L of potassium disulfite was inoculated, and then cultured and fermented in the same manner as in Reference Example 1.
  • 500 ⁇ L (3.8 FPU) of cellulase was added.
  • the ethanol concentration during fermentation was measured.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in ethanol production over time by cellulase surface-displaying yeast, cellulase-secreting yeast, or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using ammonia-treated DDG.
  • the horizontal axis represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circles are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (Arm: cellulase surface display yeast), black triangles are NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL (Sec: cellulase-secreting yeast), and black squares are NBRC1440 cells
  • W wild type yeast
  • the fermentation medium became viscous as the fermentation progressed, and it was difficult to stir for additional input of the substrate.
  • 50 g / L of each fermentation substrate was added at 12 hours, 24 hours, and 48 hours after the start of fermentation, but the fermentation medium was fermented even when cellulase surface display yeast was used. The viscosity of the final fermentation medium was very high as the reaction progressed.
  • Example 4 Fed-batch fermentation using ammonia-treated DDG after hot water treatment
  • DDG was subjected to hot water treatment and ammonia treatment in the same manner as in Example 1 to obtain a solid. This solid was used as a fermentation substrate.
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface display yeast
  • NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL cellulase-secreting yeast
  • NBRC1440 cells wild-type yeast prepared in the same manner as in Reference Example 1.
  • Pellets (cell concentration at the start of fermentation is 75 g / L (wet cells)), 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5
  • a fermentation medium containing g / L of potassium disulfite was inoculated, and then cultured and fermented in the same manner as in Reference Example 1.
  • 500 ⁇ L (3.8 FPU) of cellulase was added.
  • the ethanol concentration during fermentation was measured.
  • FIG. 6 is a graph showing the change over time in the amount of ethanol produced by cellulase surface-displaying yeast, cellulase-secreting yeast, or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using ammonia-treated DDG after hot water treatment.
  • the horizontal axis represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circles are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (Arm: cellulase surface display yeast), black triangles are NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL (Sec: cellulase-secreting yeast), and black squares are NBRC1440 cells
  • W wild type yeast
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL showed an improvement effect on ethanol production
  • NBRC1440 / ss-EG-CBH2-3c / BGL cellulase-secreting yeast
  • the amount of ethanol produced increased without increasing the viscosity of the fermentation medium as the fermentation progressed by applying ammonia treatment after the hot water treatment before fermentation.
  • the production of ethanol was improved by using cellulase surface display yeast.
  • Example 5 Fed batch fermentation using ammonia after hot water treatment or DDG that has been treated with hot water after ammonia treatment
  • DDG was subjected to hydrothermal treatment (180 ° C. for 30 minutes) and then ammonia treatment (170 ° C. for 45 minutes) in the same manner as in Example 1 to obtain a solid, and this solid was treated with hot water and then ammonia. Used as fermentation substrate.
  • the DDG was subjected to ammonia treatment (at 170 ° C. for 45 minutes) in the same manner as in Reference Example 2 to remove moisture and ammonia by evaporation and drying to obtain a solid, and then the solid was heated in the same manner as in Reference Example 1. It was subjected to water treatment (at 180 ° C. for 30 minutes) and dried to remove water to obtain a solid, and this solid was used as a hydrothermal treatment fermentation substrate after ammonia treatment.
  • a cell pellet of NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (cellulase surface-displaying yeast) or NBRC1440 cells (wild-type yeast) prepared in the same manner as in Reference Example 1 was added to a 50 g / L fermentation substrate, 10 g / L yeast extract, 20 g A fermentation medium containing 1 / L polypeptone, 50 mM citrate buffer (pH 5.0), and 0.5 g / L potassium disulfite was inoculated. Then, it fermented by culture
  • FIG. 7 is a graph showing changes over time in the amount of ethanol produced by cellulase surface-displaying yeast or wild-type yeast under the addition of cellulase in fed-batch fermentation using post-hydrothermal treatment ammonia treatment or post-ammonia treatment hydrothermal treatment DDG.
  • the horizontal axis represents fermentation time (hours), and the vertical axis represents ethanol production (g / L).
  • black circles are NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (C: cellulase surface display yeast) in the case of an ammonia-treated fermentation substrate after hydrothermal treatment
  • black triangles are NBRC1440 cells in the case of an ammonia-treated fermentation substrate after hydrothermal treatment.
  • white circle is NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL (C: cellulase surface display yeast) in the case of a hydrothermal treatment fermentation substrate after ammonia treatment
  • white triangle is a hydrothermal treatment fermentation substrate after ammonia treatment
  • the results of NBRC1440 cells in the case of
  • Both the post-hydrothermal treatment ammonia-treated fermentation substrate and the post-ammonia hydrothermal treatment fermentation substrate were each supplemented with 50 g / L of fermentation substrate at 12 and 24 hours after the start of fermentation.
  • NBRC1440 / EG-CBH2-3c / BGL cellulase surface-displaying yeast
  • the ethanol production amount was higher when the ammonia-treated fermentation substrate after the hot water treatment was used than when the ammonia-treated fermentation substrate after the ammonia treatment was used.
  • a cellulosic material containing lignin is used as a raw material, it is possible to achieve an increase in ethanol production and rate, which can be advantageous for the industrial production of ethanol.
  • corn fiber or DDG that may be a by-product of the ethanol production process from corn can be efficiently reused in the production of ethanol. It is expected that the amount of cellulase enzyme used can be reduced. Ethanol can be efficiently produced from soft biomass that can be normally discarded, which can lead to cost reduction.

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Abstract

　本発明は、エタノールを製造する方法を提供し、この方法は、セルロース系物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程；および該発酵基質と酵母とを反応させる工程であって、それによりエタノールを生産する、工程を含む。本発明はまた、酵母によるエタノール製造用の発酵基質を製造する方法を提供し、この方法は、セルロース系物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程を含む。このようにして得られた発酵基質は、酵母によるエタノール製造を増強し得る。

Description

エタノールの製造方法
　本発明は、酵母によるエタノールの製造に関する。
　近年、食料穀物（例えば、トウモロコシ、イモ類、およびサトウキビ）からのバイオ燃料の増産が食物価格の高騰を招いている。したがって、非食用炭素源ソフトバイオマス（例えば、稲わら、麦わら、バガス、籾殻、綿、竹、紙、およびコーンストーバーのような草本性の廃棄物）からのエタノール生産が急務となっている。
　セルロースやヘミセルロースを含むバイオマスから発酵微生物が資化できるグルコースを得るために、バイオマスに対して酸処理または超臨界処理を施す方法が提案されている。
　従来、セルロース材料を原料とするグルコースの製造方法としては、酸糖化法および酵素糖化法がある。酸糖化法としては、高温（２００℃以上）で希酸を用いてセルロース系物質を糖化する希酸糖化方法と、濃硫酸などでセルロース材料を糖化する方法とが知られている。しかし、いずれの方法も過激な条件下でセルロース材料を加水分解するために、セルロース材料の分解物であるグルコースの二次分解反応が起こり、糖化率は約５０％と低い。さらに、グルコースの分解物を糖化液から除去する必要がある。上記グルコースの分解物を除去せずに糖化液を発酵用炭素源として利用するには、種々の問題がある。
　酵素糖化法は、セルロース材料の糖化を温和な条件下で行うことができる。しかし、糖化の反応速度が遅く、十分な糖化には長時間を要するという問題がある。さらに、糖化に使用する市販の酵素の力価が低いことにより、十分な糖化には酵素を大量に必要とし、したがって、使用酵素のコストが高くなるという問題がある。
　ソフトバイオマスの主成分であるセルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない発酵微生物を、生物工学的手法を用いて改変することにより、非食用炭素源から直接エタノールを発酵させる試みがなされている。このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が好適に利用されている。例えば、セルロースを加水分解する酵素群を表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１および２）。また、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はキシロースを代謝することができないが、キシラン分解酵素であるトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来キシラナーゼ２（ＸＹＮＩＩ）およびアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来β－キシロシダーゼ（ＸｙｌＡ）を表層提示し、かつキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（ともにピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来）ならびにキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）を発現するサッカロマイセス・セレビシエが作製され、この酵母を用いて樺材のキシランからエタノールを生産する試みもなされている（非特許文献１）。
　セルラーゼを表層提示する酵母をソフトバイオマス基質からのエタノール生産に用いる場合、高いエタノール生産量を得るためには、発酵時にセルラーゼ酵素を併用することが行われてきた。コスト面を考慮すると、併用する酵素量が削減できることが望ましい。また、エタノールのさらに効率的な製造のために、ソフトバイオマス基質に対して基質分解酵素がより有効に作用し得る環境を整えることが望ましい。
　例えば、コーンストーバーからのエタノール生産の前処理として、水熱法（例えば、液状熱水処理、水蒸気爆砕処理、加圧熱水処理（特許文献１）など）、ならびにアンモニア爆砕（ＡＦＥＸ）、アンモニア循環浸出（ＡＲＰ）、石灰（Ｌｉｍｅ）処理、ｐＨ調節、および希酸処理（非特許文献２および３）による糖の加水分解生産が知られている。
　また、ソフトバイオマスには、セルロース、ヘミセルロース以外にリグニンが存在するため、エタノール生産反応を容易にするためには、リグニンを除去することが望ましい。アンモニア処理によるリグニンの選択的分解に関する多くの論文が、報告されている（非特許文献４～７）。
国際公開第０１／７９４８３号 特開２００８－８６３１０号公報
S. Katahiraら, Applied and Environmental Microbiology, 2004年, 70巻, 5407-5414頁 Mosierら, Bioresour. Technol., 2005年, 96巻6号, 673-686頁 Wymanら, Bioresour. Technol., 2005年, 96巻18号, 2026-2032頁 Y. Kimら, Bioresource Technology, 2008年, 99巻, 5206-5215頁 T.H. Kimら, Bioresource Technology, 2005年、96巻、2007-2013頁 T.H. Kimら, Applied Biochemistry and Biotechnology, 2007年、136巻、136-140頁 T.H. Kimら, Bioresource Technology, 2003年、90巻、39-47頁 Appl. Microbiol. Biotech., 2002年, 60巻, 469-474頁 Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 4517-4522頁 R. Akadaら, Yeast, 2006年, 23巻, 399-405頁 Roseら, Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1990年 P. N. Lipkeら, Mol. Cell. Biol., 1989年8月, 9(8), 3155-65頁 Y. Fujitaら, Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 5136-41頁 Y. Fujitaら, Applied and Environmental Microbiology, 2004年, 70巻, 1207-12頁 Takahashiら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001年, 55巻, 454-462頁
　本発明は、ソフトバイオマスを利用したエタノールの製造において、効率的な方法を提供することを目的とする。
　本発明は、エタノールを製造する方法を提供し、この方法は、
　セルロース系物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程；および
　該発酵基質と酵母とを反応させる工程であって、それによりエタノールを生産する、工程
を含む。
　１つの実施態様では、上記セルロース系物質を上記熱水処理後上記アンモニア処理に供する。
　１つの実施態様では、上記酵母はセルラーゼ酵母である。
　さらなる実施態様では、上記セルラーゼ酵母は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ－グルコシダーゼがそれぞれ表層提示されているセルラーゼ表層提示酵母である。
　１つの実施態様では、上記反応工程は、上記発酵基質を追加投入して行われる。
　本発明はまた、エタノール製造用の発酵基質を製造する方法を提供し、この方法は、
　セルロース物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程
を含む、方法。
　本発明によれば、セルロース系物質から効率的にエタノールを製造する方法が提供される。
熱水処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 熱水処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるフェノール性化合物生産量の経時変化を示すグラフである。 熱水処理稲わら、アンモニア処理稲わら、または熱水処理後アンモニア処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 熱水処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 熱水処理後アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 熱水処理後アンモニア処理またはアンモニア処理後熱水処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。
　（セルラーゼ酵母）
　本明細書中で、「セルラーゼ酵母」とは、セルロースを加水分解し、そしてグルコースからエタノールを発酵する能力を有する酵母をいう。本来セルロースを加水分解する能力がないかまたはほとんどない酵母（野生型酵母など）（本明細書中では、「セルロース非加水分解性酵母」ともいう）に対して、セルロースを加水分解し得る酵素（以下に詳述する）を少なくとも１種発現するように遺伝子組換えを行うことにより、セルロース加水分解力が付与または強化された形質転換酵母が作製され得る。このセルロース加水分解力が付与または強化された形質転換酵母は、「セルラーゼ酵母」に包含される。例えば、以下に説明するように調製されたセルラーゼ酵母が好ましいが、これに限定されない。
　セルロースを加水分解し得る酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
　セルロースを加水分解し得る酵素とは、β１，４－グルコシド結合を切断し得る酵素であり得る。β１，４－グルコシド結合を切断し得る酵素としては、代表的には、エンドβ１，４－グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ－グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
　エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であり得るが、これに限定されない）を生じ得る（「セルロース分子内切断」）。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「非晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、エンドグルカナーゼIII（ＥＧIII）、エンドグルカナーゼIV（ＥＧIV）、およびエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）と称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧII）が用いられ得るが、これに限定されない。
　セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離し得る（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解し得るが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「結晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅くなり得る。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１（ＣＢＨ１）およびセロビオヒドロラーゼ２（ＣＢＨ２）と称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異によるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が用いられ得るが、これに限定されない。
　β－グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β－グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ－Ｄ－グルコースとのβ１，４－グルコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β－グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β－グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β－グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β－グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）が用いられ得るが、これに限定されない。
　セルラーゼ酵母は、例えば、以下に詳述するように、セルロース非加水分解性酵母（野生型酵母など）に、セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群を導入することで作製され得る。セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群は、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子および非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子を含む。結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（「結晶性加水分解酵素」）とは、ミクロフィブリルのような結晶構造を有するセルロースを加水分解し得る任意の酵素をいい、例えば、セロビオヒドロラーゼが挙げられるがこれに限定されない。非晶性セルロースを加水分解し得る酵素（「非晶性加水分解酵素」）とは、結晶構造を有するセルロースは分解しないが、非結晶化されたセルロースのような結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースの鎖を加水分解し得る任意の酵素をいい、例えば、エンドグルカナーゼが挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群には、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子がさらに含まれ得る。セロオリゴ糖については上述の通りである。セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素としては、例えば、β－グルコシダーゼが挙げられるがこれに限定されない。
　セルラーゼ酵母は、例えば、セルロース非加水分解性酵母（野生型酵母など）に対して、結晶性加水分解酵素および／または非晶性加水分解酵素の遺伝子組換えを行うことにより作製され得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の発現が共に増大されるように遺伝子組換えを行うことにより作製され得ることが好ましい。すなわち、それぞれの酵素の遺伝子のコピー数を共に増大させた組み込みコピー数でセルロース非加水分解性酵母に導入し、形質転換酵母を得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の発現様式は、発現された酵素がセルロース性基質に対して作用する限り問わない。例えば、発現様式は、表層提示または分泌発現であり得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素は、少なくとも一方、または両方が共に、表層提示または分泌され得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の表層提示と分泌とを同時に生じるように、酵母を形質転換してもよい。
　セルラーゼ酵母には、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子が組み込まれていることが好ましい。それにより、セルロースからのグルコースの生産能を高め得る。この酵素もまた、表層提示または分泌させ得るが、好ましくは表層提示される。セルロースからのエタノール発酵をさらに効率的に行うために、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素もまた酵母で発現されることが好ましい。
　セルラーゼ酵母では、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子の組み込みコピー数が１コピーに対し、結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素のそれぞれの遺伝子の組み込みコピー数は少なくとも２コピーであり得る。
　一例として、結晶性加水分解酵素としてセロビオヒドロラーゼ、そして非晶性加水分解酵素としてエンドグルカナーゼが用いられ得る。これらの酵素の発現を共に増大させるために、これらの酵素の遺伝子の発現カセット（以下に詳述する）を一緒に含む少なくとも２つのベクターで単一の酵母を形質転換し得る。これらの各酵素の遺伝子の発現カセットを単独で含むそれぞれのベクターの組み合わせの少なくとも２組で単一の酵母を形質転換してもよい。実用酵母を形質転換する場合は、以下に詳述するように、実用酵母は、栄養要求性マーカーを本来有しておらず、栄養要求性マーカーを付与することが望ましいので、これらの酵素の遺伝子の発現カセットを一緒に含むベクター（ベクターの例としては、以下の実施例に説明するベクターが挙げられる）を調製することが操作の効率上好ましい。
　セルラーゼ酵母は、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素として、β－グルコシダーゼがさらに組み込まれたものであり得る。
　１つの実施態様としては、セルラーゼ酵母は、β－グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼの３酵素が発現されている酵母であり得る。さらなる実施態様では、これらのそれぞれが表層提示されている酵母であり得る。このような酵母を、便宜上、「セルラーゼ表層提示酵母」ともいう。
　β－グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数に対してセロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの組み込みコピー数を増大させることにより、エタノール生産量を増大させ得る。したがって、β－グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数１コピーに対して、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼのそれぞれの該遺伝子が少なくとも２コピーが組み込まれ得る。セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼのそれぞれの該遺伝子は、β－グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数１コピーに対して３コピーまたはそれ以上でも、組み込まれ得る。セルロース非加水分解性酵母（野生型酵母など）にこのような遺伝子組換えを行うことにより、エタノール生産量を増大した酵母が得られ得る。
　１つの実施態様としては、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの少なくとも一方、または両方ともに表層提示または分泌され、そしてβ－グルコシダーゼが表層提示されるように組み込まれる。好ましくは、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、およびβ－グルコシダーゼが表層提示され得る。
　以下、セルラーゼ酵母の作製について説明するが、これらに限定されない。
　発現を目的とする酵素の遺伝子は、酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。
　酵素遺伝子を用いて発現カセットを構築し得る。発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するプロモーターおよびターミネーターなどのいわゆる調節因子を含み得る。プロモーターおよびターミネーターは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものを利用してもよい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’－リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、発現させる遺伝子に応じて、当業者によって適宜選択され得る。必要に応じて、さらなる調節因子（例えば、オペレーターおよびエンハンサー）などをさらに含み得る。オペレーター、エンハンサーなどの発現調節因子についても、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、遺伝子の発現の目的に応じて、必要な機能配列をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
　遺伝子を含む発現カセットの構築に際して、細胞表層工学の技術が利用され得る。例えば、目的の酵素タンパク質を（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介して細胞表層に提示する方法があるが、これらに限定されない。細胞表層工学の技術は、例えば、特許文献１および２にも記載される。
　用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα－またはａ－アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；非特許文献８：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず凝集性を利用する、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；非特許文献９）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
　まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ－ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
　ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸－６マンノースα１－２マンノースα１－６マンノースα１－４グルコサミンα１－６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ－ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
　ここで、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端にある、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列としては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα－またはａ－アグルチニン分泌シグナル配列、発現産物自身の分泌シグナル配列などが好適に用いられる。細胞表層局在タンパク質に融合している他のタンパク質の活性に影響を及ぼさないのであれば、例えば、分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
　ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα－アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α－アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
　したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ－細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子－ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的の酵素タンパク質をコードするＤＮＡに置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素タンパク質を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα－アグルチニンである場合、上記α－アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このため、「α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域」が利用され得る。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示された酵素は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
　次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
　この細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）と目的の酵素タンパク質とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ－目的とする酵素をコードする遺伝子－細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ－細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子－目的とする酵素をコードする遺伝子；あるいは（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ－目的とする酵素をコードする第一の遺伝子－細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子－目的とする酵素をコードする第二の遺伝子（但し、第一の遺伝子と第二の遺伝子とは同じでも異なっていてもよい）、を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡは、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さで酵素を細胞表層に提示できる点で、ならびに酵素のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
　次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的とする酵素タンパク質を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的の酵素は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
　酵母にてタンパク質を細胞外に分泌して発現させる方法は、当業者に周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作成し、酵母に導入すればよい。
　酵母の細胞内にて遺伝子を発現させる方法もまた、当業者に周知である。この場合、上記細胞表層提示技術や上記分泌シグナルを用いることなく、目的の酵素タンパク質の遺伝子を連結した組換え遺伝子を作成し、酵母に導入すればよい。
　各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的酵素の構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性な酵素の発現が可能である。
　酵素遺伝子または発現カセットは、プラスミドの形態のベクターに挿入され得る。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクター作製の出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ori）と大腸菌プラスミドColE1の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ－イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ－（５'－ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン－５－リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ－アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
　出発材料のプラスミドの例としては、GAPDHプロモーターおよびGAPDHターミネーターを含むプラスミドpYGA2270もしくはpYE22m、またはUPR-ICL（イソクエン酸リアーゼ上流領域）およびTerm-ICL（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）を含むプラスミドpWI3、PGKプロモーターおよびPGKターミネーターを含むプラスミドpGK406などが挙げられる。プラスミドベクターは、以下の実施例に示すように調製され得る。
　本明細書で遺伝子またはＤＮＡの「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入することだけでなく、発現させることも意味する。「形質転換」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入して発現させることにより宿主の遺伝的形質を変えること、またはその操作をいう。遺伝子またはＤＮＡの導入、または形質転換のために、酵母細胞に関しては、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で存在してもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入されて、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
　宿主の酵母は、セルロース非加水分解性酵母であり、これは、野生型酵母であり得る。酵母の種類は特には限定されないが、特に、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。好ましくは、実用酵母の野生型酵母である。野生型酵母は、基質の単糖（例えば、グルコース）からのアルコールの発酵能を高めるように遺伝子組換えされていてもよい。
　「実用酵母」とは、従来エタノール発酵に用いられる任意の酵母（例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など）をいう。実用酵母の中でも、高いエタノール発酵能および高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。「実用酵母」は、高いエタノール耐性を有する酵母であり、好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる酵母である。さらに耐酸性、耐熱性などを有することが好ましい。さらに好ましくは、凝集性であり得る。例えば、このような性質を有する実用酵母としては、独立行政法人製品評価技術基板機構により入手可能であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性あり）およびＮＢＲＣ１４４５株（ＭＡＴａ、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性なし）が挙げられる。
　実用酵母は、エタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しく過酷な培養条件になる場合もある工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で好ましい。また実用酵母は多倍体となるため、相同染色体に複数の遺伝子構築物（発現ベクター）を組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に較べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。
　実用酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しない。したがって目的の遺伝子導入に適した特定の栄養要求性マーカーを、実用酵母（特に、栄養要求性を有しない酵母であって、エタノール耐性の高い（好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる）酵母）に付与することにより、目的の遺伝子の導入が容易になる。栄養要求性マーカーとしては、その遺伝子操作上の利用から、ウラシル要求性、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性などが挙げられるがこれらに限定されない。ウラシル要求性に関しては、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ－８株）から獲得したｕｒａ３－断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と乗り換えさせることによって付与することができる。ウラシル要求性以外の栄養要求性（例えば、トリプシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）に関しては、例えば、非特許文献１０に記載の方法に準じて、これらの遺伝子を破壊するようにフラグメントを設計して付与することができる。
　上記発現カセットが導入された実用酵母は、上で説明したように、酵母選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。さらに、発現された酵素タンパク質の活性を測定することによって確認され得る。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
　（エタノールの製造）
　本明細書中では、酵母と基質とを反応させて、それによりエタノールを生産する工程を、便宜上、「発酵工程」ともいう。
　本発明においては、以下に説明するようなセルロース系物質を、酵母との反応（「発酵工程」）の前に、熱水処理およびアンモニア処理に供する。熱水処理を行った後にアンモニア処理を施してもよく（便宜上、「熱水処理後アンモニア処理」ともいう）、またはアンモニア処理を行った後に熱水処理を施してもよい（便宜上、「アンモニア処理後熱水処理」ともいう）。
　熱水処理およびアンモニア処理に供した（好ましくは、熱水処理後アンモニア処理をした）セルロース系物質が、発酵工程の基質として用いられる。本明細書中では、発酵工程の基質を「発酵基質」ともいう。
　用語「セルロース系物質」は、本明細書中においては、セルロースを含有する任意の物質、産物、および組成物をいう。用語「セルロース」とは、β１，４－グルコシド結合によりグルコピラノースが連なった繊維状高分子をいうが、その誘導体または塩、あるいは分解により重合度が低下したものもまた含む。
　「セルロース系物質」には、例えば、紙の製造または再生において生じる紙粕、古着および廃タオルなどの綿製品、ならびに農業上収穫されずにまたは食品製造の過程で廃棄される木材の木質部もしくは草本性植物の茎葉部および皮部（特に非可食部）のような、セルロースが含まれている任意の材料をも包含される。「セルロース系物質」には、セルロースがカルボキシメチル化されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース、および結晶性セルロース（例えば、アビセル）などのセルロース化合物もまた含まれ得る。セルロース化合物の中でも、リン酸膨潤セルロースは、セルロースを加水分解し得る酵素のセルロース加水分解力を測定するために、実際のバイオマスのセルロースの代替基質としてよく用いられるセルロースである。
　上記で例示したセルロースが含まれている材料（特に、木材の木質部、ならびに草本性植物の茎葉部および皮部）は、セルロースを主成分の１つとする植物細胞壁成分を含有し得る。植物細胞壁は、通常、セルロースに加え、ヘミセルロースおよびリグニンを成分として含む。植物種（特に、木材であるかまたは草本性であるか）、植物の部分（器官、組織）、生育程度などに依存してそれらの成分の含有量は変動し得るが、セルロースを含む限りいずれの種でも植物の部分や生育の程度に関わらず用いられ得る。
　したがって、セルロース系物質としては、上述した植物細胞壁成分を含有する任意の物質および廃棄物および産物もまた挙げられる。不溶性食物繊維もまた、「植物細胞壁成分含有物」に含まれる。上述した木材の木質部や草本性植物の茎葉部・皮部に加え、これらの部分から加工したものも含むが、廃棄される不要物の使用が再利用の点で好ましい。
　セルロース系物質としては、セルロース化合物自体およびセルロース化合物を含む組成物に加え、籾殻、竹、バガス、ワラ類（稲わら、麦わらなど）、トウモロコシ穂軸などの農産廃棄物、木材質（木材チップ、廃材）、古新聞、雑誌、段ボール、オフィス古紙、リンター、綿、パルプ及び製紙メーカーから排出する廃パルプなどが挙げられる。本発明は、特にリグニンを含むセルロース系物質を原料として用いた場合でも、好適に用いられ得る。トウモロコシからのエタノール製造工程の副産物であり得るコーンファイバーまたはＤＤＧ（ディスティラーズ・ドライ・グレイン、トウモロコシ蒸留乾燥残渣）も用いられ得る。コーンファイバーは、エタノール製造工程の発酵前に除去されるトウモロコシの皮の部分である。ＤＤＧは、酵素添加による糖化および酵母による発酵後の固形残渣であり、発酵に用いた澱粉を除くトウモロコシ部分（皮など）であり、発酵に用いた酵母も含み得る。コーンファイバーまたはＤＤＧはいずれもセルロースを含む材料（セルロース系物質）である。コーンファイバーおよびＤＤＧは共に、トウモロコシ澱粉の製造または販売会社（例えば、サングレイン株式会社）より入手され得る。
　「熱水処理」としては、例えば、特許文献１に記載されるような無触媒水熱法が挙げられる。セルロース系物質を、必要に応じて粉砕し、例えば約１０質量％の濃度で水と混合し、この混合物を処理に供する。特許文献１に記載の方法では、回分（バッチ）式の場合、処理する濃度にも依存するが、例えば約１０質量％濃度のセルロース系物質を、１２０～３００℃、好ましくは１５０～２８０℃、より好ましくは１８０～２５０℃で処理され得、そして処理時間は、一般に、１時間～１５秒の範囲が好ましい。連続法の場合、熱履歴時間の関係で若干温度を高くでき、例えば約１０質量％濃度のセルロース系物質を、１２０～３７３℃、好ましくは１５０～３２０℃で、好ましくは１時間～１秒で処理し得る。処理温度および時間は用いる材料によって変動し得、処理温度の上昇は処理時間を短縮し得る。なお、加圧は、上記範囲内の温度が達成され得る程度の圧力が、装置により自動または手動で設定され得る。
　「アンモニア処理」としては、例えば、アンモニア溶液処理、アンモニア爆砕（AFEX）、アンモニア循環浸出（ARP）が挙げられる。例えば、非特許文献４～７（好ましくは、非特許文献５）に記載の手法が利用され得る。アンモニア溶液処理は、例えば約１０～約２５質量％、好ましくは約１５質量％の濃度のアンモニア水溶液を用いて、約１００～約２００℃、好ましくは約１５０～約１９０℃、より好ましくは約１７０℃にて、約５分～約９０分にわたって、行われ得る。例として、以下の実施例に記載のアンモニア処理が挙げられるが、特にこれに限定されない。処理条件は、出発セルロース系物質に依存して、適宜設定され得る。アンモニア処理は１回のみでも繰り返し行ってもよい。
　熱水処理およびアンモニア溶液処理のそれぞれを別個の独立した装置で行っても、または両方の処理を同一の装置内で順次行ってもよい。例えば、熱水処理後のセルロース系物質またはアンモニア溶液処理後のセルロース系物質をそれらの処理液（溶液）から分離した後、次の処理を施し得る。あるいは、セルロース系物質の熱水処理後そのままアンモニア処理条件下に置き得る（例えば、熱水処理の終了後に反応器内の温度をアンモニア処理に適切な温度に変更し、アンモニアを所定濃度に注入し、放置する）か、またはその逆に、セルロース系物質のアンモニア処理後にアンモニアを除去し、次いで熱水処理条件下に置き得る。アンモニア処理後、アンモニアは、蒸留またはストリッピングにより除去および回収し得る。回収したアンモニアは再度、別のバッチの処理に用い得る。
　熱水処理後アンモニア処理（例えば、熱水処理後のセルロース系物質をアンモニア溶液処理すること）が好ましい。好ましくは、装置の反応器内で熱水処理を密封および必要な加圧下で高温（例えば、１７０～２３０℃）にて所定時間行い、その後反応器内の温度をより低い温度（例えば、１５０～１９０℃）に低下させアンモニアを所定濃度に注入してアンモニア処理を所定時間行い得る。その後、上記の熱水処理後アンモニア処理後に得られた液状物の温度を、例えば１００℃まで低下させる。実験室規模では、反応器を開放することにより液状物中のアンモニアを蒸発させ、次いでこの液状物を乾燥することによりアンモニアがさらに除去され、発酵基質として回収し得る。実用プロセス規模では、温度を１００℃まで低下させた液状物を常圧蒸留塔に導入し、還流をかけて、例えば２８ｗｔ％のアンモニア水を塔頂より回収し、アンモニアが除去された上記処理後産物を発酵基質として塔底から回収し得る。この発酵基質に含まれ得るアンモニアは数ｐｐｍ未満であり、このアンモニア含量は、発酵基質としての実用に許容され得る程度である。熱水処理後アンモニア処理では、熱水処理、アンモニア処理、およびアンモニア除去の各工程の際の温度を順に低下させればよく、これらの一連の過程で温度の変動を少なくすることができる。熱水処理後アンモニア処理では、より高いエタノール生産量が得られ得る。
　熱水処理およびアンモニア処理の終了後に生じた産物を適宜冷却し、または乾燥した後、発酵基質として用い得る。乾燥方法には特に限定はない。例えば、凍結乾燥、低温乾燥、常温乾燥、高温乾燥などが挙げられ、通風下または真空中のいずれでもよい。
　発酵工程では、熱水処理およびアンモニア処理をしたセルロース系物質を発酵基質として、酵母と反応させることにより、エタノールを生産し得る。
　発酵工程には、グルコースからエタノールを発酵する能力を有する酵母が用いられ得るが、セルラーゼ酵母が好適に用いられ得る。セルラーゼ酵母については上述したとおりである。１つの酵母でセルロースをグルコースにまで分解し得ることが好ましいが、セルロースをグルコースにまで分解するような複数種の酵母の混合であってもよい。後者に関しては、例えば、発酵工程において、β－グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼの３酵素を提供できるように、異なる酵素を発現する酵母の組み合わせであり得る。β－グルコシダーゼは表層提示されることが好ましい。セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼもまた、表層提示されることが好ましい。発酵工程には、通常のエタノール発酵に用いられる酵母（例えば、野生型の実用酵母）を、単独で用いてもまたはセルラーゼ酵母と併用してもよい。
　発酵基質と酵母との反応は、発酵基質を含む培地で酵母を培養（好ましくは液体培養）することで行われ得る。発酵工程は、通常、エタノール発酵を行う条件下で行われ得る。発酵培地には、酵母の生育に必要または望ましい成分がさらに含められ得る。発酵工程の反応時の温度は、用いる酵母に依存し得るが、通常、約３０℃～約３８℃であり得る。発酵pHは、好ましくは約４～約６、より好ましくは約５である。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、約１ppm以下、より好ましくは約0.1ppm以下、よりさらに好ましくは約0.05ppm以下であり得る）。
　発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分（フェドバッチ）工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。好ましくは、エタノール生産量の向上のために、発酵工程中に発酵基質を随時追加投入し得る（フェドバッチ）。
　酵母の投入量、発酵基質の初期投入量および必要に応じて追加の投入量および時期、ならびに発酵時間は、基質の種類および状態、発酵培養の容量、発酵エタノールの目的生産量などの要件に依存して適宜決定され得る。発酵基質の追加の投入量および時期は、発酵の進行による発酵培地の粘度、エタノール生産量または炭酸ガス発生量などをモニタリングしながら決定してもよい。
　酵母は、発酵工程に供する前に好気的条件下で培養することにより、その数を増加させ得る。培地は、選択培地であっても非選択培地であってもよい。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約４～約６、より好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約0.5～約６ppm、より好ましくは約１～約４ppm、よりさらに好ましくは約２ppmである。また、培養時の温度は、約２０～約４５℃、好ましくは約２５～約４０℃、より好ましくは約３０～約３７℃であり得る。培養時間は、発酵反応に用いる酵母負荷量に基づいて決定し得る。例えば、総酵母の菌体濃度が20g（湿潤量）/L以上、より好ましくは50g（湿潤量）/L、さらに好ましくは75g（湿潤量）/L以上になるまで培養する場合は、約20～約50時間程度であり得る。
　発酵工程には、セルラーゼ酵素を補助的に用い得る。「セルラーゼ酵素」とは、酵素として単離された任意の形態を含む。例えば、「セルラーゼ酵素」としては、上で説明したようなセルラーゼ（すなわち、エンドグルカナーゼ）を生産する微生物から単離精製された酵素、およびセルラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。市販のセルラーゼ酵素も使用可能である。市販のセルラーゼ酵素としては、例えば、ナガセケムテックス社のCellulase SS：トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ：力価7.6FPU/mL（「FPU」は「Filter Paper Unit」の略であり、ろ紙から１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量が「1FPU」とされる）が挙げられる。特に、エタノールを工業的に製造する場合、生産効率を促進するために、セルラーゼ酵母とセルロース系物質との反応の際に、セルラーゼ酵素をさらに添加してもよい。
　発酵の進行とともにエタノールの発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
　発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
　発酵基質と反応させる酵母（好ましくは、セルラーゼ酵母、より好ましくは、β－グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼの３酵素のいずれか１つ以上（より好ましくは３種全部）を表層提示する酵母）および必要に応じてセルラーゼ酵素は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
　固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
　担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、50～1000μｍが好ましい。
　また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が2～50ｍｍ、立方体状の場合、2～50ｍｍ角が好ましい。
　本発明によれば、発酵反応中に発酵基質を随時追加投入して、エタノールの生産量を向上させ得る。好ましくは、基質の投入で生じる発酵培地の粘性上昇が発酵の進行と共に減少され得、発酵基質の追加投入を容易にし、発酵基質から効率的にエタノールが生産でき、また、発酵工程終了後のエタノールの単離が容易になる。さらに、補助的に添加するセルラーゼ酵素の使用量を低減し得る。セルラーゼ酵母、好ましくはβ－グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびエンドグルカナーゼの３酵素のいずれか１つ以上（より好ましくは３種全部）を表層提示する酵母を用いることで、これらの効果がより増強され得る。
　以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　本実施例で用いた菌株サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）およびサッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した。
　本実施例に示す全てのＰＣＲ増幅は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて実施した。
　本実施例に示す全ての酵母形質転換は、YEAST MAKER酵母形質転換システム（Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA）を用いて酢酸リチウムによって実施した。
　（調製例１：セルラーゼ表層提示酵母）
　以下に、セルラーゼ表層提示酵母（エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼ、ならびにβ－グルコシダーゼを、それぞれ表層提示されるように組み込んだ酵母）の調製手順を説明する。
　（調製例１－１：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２の栄養要求性マーカーを付与した酵母の調製）
　（調製例１－１－１：NBRC1440株へのＵＲＡ３要求性の付与）
　変異ＵＲＡ３断片を、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）から常法で抽出したゲノムＤＮＡを用いて、フォワードプライマー（配列番号１）およびリバースプライマー（配列番号２）のプライマー対を用いるＰＣＲにより取得した。この断片をサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株に導入し、５－フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地でＵＲＡ３変異株を選択し、ＵＲＡ３要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
　なお、５－フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地は以下のように調製した。50mg/Lウラシル酸および２％（w/v）寒天を添加したウラシルドロップアウト合成デキストロース（ＳＤ）培地（非特許文献１１）をオートクレーブ処理し、６５℃を維持した。ＦＯＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に100mg/mLの濃度で溶解し、約６５℃の上記オートクレーブした培地に添加し、ＦＯＡの最終濃度を1mg/mLとした。
　（調製例１－１－２：NBRC1440株へのＨＩＳ３要求性の付与）
　以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
　ＰＣＲ１、HIS3-Green U（配列番号３；Forward）およびHIS3-Green R（配列番号４；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株から常法で抽出したゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより、ＨＩＳ３上流部分配列を調製した；
　ＰＣＲ２、URA3 fragment（配列番号５；Forward）およびHIS3-40Uc（配列番号６；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
　ＰＣＲ３、HIS3-Green U（配列番号３；Forward）およびHIS3-40Uc（配列番号６；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
　この得られた融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株について常法で相同組換えを行った。ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。この構築物が上記実用酵母NBRC1440の染色体に組み込まれると同時にＨＩＳ３遺伝子破壊が生じ、ＵＲＡ３マーカーおよびその両側の反復配列とが染色体内に組み込まれる。
　引き続き、この相同組換えが生じた株を３０℃にて２４時間、ＹＰＤ培地中で増殖させた。次いで５－ＦＯＡ培地プレート上で1.0×107細胞／200μLまで増殖させた。５－ＦＯＡ培地プレート上で増殖した全てのコロニーは、ウラシル要求性（Ｕｒａ－）の表現型であり、これを選択した。５－ＦＯＡ培地プレート上で増殖した株では、ＵＲＡ３マーカーの両側にある反復配列により生じたさらなる相同組換えのため、先の相同組換えにより導入されたはずのＵＲＡ３マーカーが染色体上から除去され、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ－）の表現型を示していた。
　最終的に、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失してこれらの栄養要求性を有する株、すなわち、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３マーカーが付与されたNBRC1440株が得られた。
　（調製例１－１－３：NBRC1440株へのＴＲＰ１要求性の付与）
　以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
　ＰＣＲ１、TRP1-988（配列番号７；Forward）およびRP1-28r（配列番号８；Reverse）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＴＲＰ１上流部分配列を調製した；
　ＰＣＲ２、TRP1-URA3（配列番号９；Forward）およびTRP1-40r（配列番号１０；Reverse）のプライマー対を用い、ｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
　ＰＣＲ３、TRP1-988（配列番号７；Forward）およびTRP1-40r（配列番号１０；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
　この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＨＩＳ３およびＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株から上記調製例１－１－２と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１要求性が付与されたNBRC1440株を得た。
　（調製例１－１－４：NBRC1440株へのＬＥＵ２要求性の付与）
　以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
　ＰＣＲ１、LEU2-UP 3rd（配列番号１１；Forward）およびLEU2-down 3rd（配列番号１２；Reverse）のプライマー対を用い、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株のゲノムＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、ＬＥＵ２上流部分配列を調製した；
　ＰＣＲ２、LEU2-URA3 3rd（配列番号１３；Forward）およびLEU2-40r（配列番号１４；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いるＰＣＲにより、ＵＲＡ３を調製した；
　ＰＣＲ３、LEU2-UP 3rd（配列番号１１；Forward）およびLEU2-40r（配列番号１４；Reverse）のプライマー対を用い、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合して用いるＰＣＲにより、融合フラグメントを調製した。
　この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２マーカーが付与されたNBRC1440株から上記調製例１－１－２と同様にして、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１、およびＬＥＵ２要求性が付与されたNBRC1440株を得た。この株を、便宜上、「NBRC1440/UHWL」と表す。
　（調製例１－２：pRS406 EG CBH2の調製）
　まず、ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK406 EGを構築した。
　リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびα－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域（非特許文献１２）を含む2719bp DNAフラグメントを、鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献１３）を用い、配列番号１５（Forward）および配列番号１６（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲによって調製した。
　２つのＤＮＡ断片、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターおよびＰＧＫターミネーターを、サッカロマイセス・セレビシエBY4741株（アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より入手）から常法で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＧＫプロモーターについて、配列番号１７（Forward）および配列番号１８（Reverse）のプライマー対、ＰＧＫターミネーターについて、配列番号１９（Forward）および配列番号２０（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した。マルチクローニングサイトを、配列番号２１（Forward）および配列番号２２（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した。ＰＧＫプロモーターをXhoIおよびNheIで、マルチクローニングサイトをNheIとBglIIで、ＰＧＫターミネーターをBglIIおよびNotIでそれぞれ消化し、pTA2ベクター（東洋紡社製）のXhoI－NotI部位に連結した。得られたベクターをXhoIおよびNotIで消化し、その断片をpRS406（Stratagene社製）に連結し、得られたベクターをpGK406とした。
　上記2719bp ＤＮＡフラグメントをNheIおよびXmaIで消化し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406のNheI部位とXmaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、エンドグルカナーゼ（ＥＧII）遺伝子、α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＰＧＫターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpGK406 EGと命名した。
　プラスミドpFCBH2w3（非特許文献１４）を鋳型として用い、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、配列番号２３（Forward）および配列番号２４（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した。得られた断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK406 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS406 EG CBH2と命名した。
　（調製例１－３：pRS403 EG CBH2の調製）
　まず、ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK403 EGを構築した。
　pGK406から、ApaIおよびNotIで、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS403（Stratagene社製）に連結した。得られたプラスミドをpGK403 EGと命名した。
　上記のＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK403 EGに連結し、得られたプラスミドをpRS403 EG CBH2と命名した。
　（調製例１－４：pRS405 EG CBH2の調製）
　まず、ロイシン遺伝子（ＬＥＵ２）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK405 EGを構築した。
　pGK406から、ApaIおよびNotIで、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS405（Stratagene社製）に連結した。得られたプラスミドをpGK405 EGと命名した。
　上記のＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpGK405 EGに連結した。得られたプラスミドをpRS405 EG CBH2と命名した。
　（調製例１－５：pIWBGLの調製）
　アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来β－グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子をコードする2.5kbp NcoI-XhoI DNAフラグメントを、プラスミドpBG211（京都大学より贈与戴いた）を鋳型として用い、bgl1プライマー１（配列番号２５；Forward）およびbgl1プライマー２（配列番号２６；Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した。このＤＮＡフラグメントをNcoIおよびXhoIで消化し、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびα－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域（非特許文献１２）を含有する細胞表層発現プラスミドpIHCS（非特許文献１３）のNcoI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpIBG13と命名した。
　このpIBG13を鋳型として用い、配列番号２３（Forward）および配列番号２４（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル配列、ＢＧＬ１遺伝子、α－アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を調製した。この断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpRS 404に連結し、得られたプラスミドをpIWBGLと命名した。
　（調製例１－６：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS406 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWLに導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2」と命名した。
　（調製例１－７：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数２で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS403 EG CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2に導入し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS406 EG CBH2の破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2」と命名した。
　（調製例１－８：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数３で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS405 EG CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-3c」とも表記する。
　（調製例１－９：表層提示β－グルコシダーゼ１遺伝子の組み込み）
　pIWBGLをBst1107Iで切断して直線状にし、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2（NBRC1440/EG-CBH2-3c）に導入し、トリプトファンドロップアウト（トリプトファン不含培地）プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。各々の破壊されたＴＲＰ１遺伝子が復活することで、β－グルコシダーゼ１遺伝子の導入を確認した。したがって、コピー数３のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株にさらにβ－グルコシダーゼ１を表層提示した株が得られた。この株を簡略化して、「NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL」とも表記する。
　（調製例２：セルラーゼ分泌酵母）
　以下に、β－グルコシダーゼを表層提示するが、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを分泌するように組み込んだ酵母（以下、便宜上、「セルラーゼ分泌酵母」ともいう）の調製手順を説明する。
　（調製例２－１：pRS403/ssEG2-CBH2プラスミド）
　ヒスチジン遺伝子（HIS3）マーカーを有し、かつエンドグルカナーゼII（EGII）およびセロビオヒドロラーゼ２（CBH２）を分泌させるように組み込むためのプラスミドpRS403/ssEG2-CBH2を構築した。
　pUGP3（非特許文献１５）を鋳型として、XYL2c-Xho(F)（配列番号２７；Forward）およびXYL2c-NotI(R)（配列番号２８；Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨプロモーター、マルチクローニングサイト（SalI, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI）、ＧＡＰＤＨターミネーターをコードするＤＮＡ断片を調製した。その断片をpRS403（Stratagene社製）のXhoI/NotIサイトに導入してプラスミドpIHGP3を得た。
　リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（EGII）遺伝子を含む1308bp DNAフラグメントを、鋳型としてpEG23u31H6を用い、配列番号２９（Forward）および配列番号３０（Reverse）のプライマー対を用いるPCRによって調製した。
　上記1308bpDNAフラグメントをSmaIで消化し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、GAPDHターミネーターを含むプラスミドpIHGP3のSmaI部分に挿入し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、EGII遺伝子およびGAPDHターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpRS403/ssEG2と命名した。
　リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびトリコデルマ・リーセイ由来CBH２遺伝子を含む1416bp DNAフラグメントを、プラスミドpFCBH2w3を鋳型とし、配列番号３１（Forward）および配列番号３２（Reverse）のプライマー対を用いるPCRによって調製した。
　上記1416bpDNAフラグメントをSmaIで消化し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、GAPDHターミネーターを含むプラスミドpIHGP3のSmaI部分に挿入し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、CBH２遺伝子およびGAPDHターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpRS403/ssCBH2と命名した。
　上記のＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpRS403/ssEG2に連結した。得られたプラスミドをpRS403/ssEG2-CBH2と命名した。
　（調製例２－２：pRS405/ssEG2-CBH2プラスミド）
　GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ２（CBH２）遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。
　LEU2遺伝子マーカーを持つpRS405をApaIおよびNotIで消化し、上記断片を挿入した。得られたプラスミドをpRS405/ssCBH2と命名した。
　pRS403/ssEG2を鋳型として用い、配列番号２３（Forward）および配列番号２４（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpRS405/ssCBH2に連結した。得られたプラスミドをpRS405/ssEG2-CBH2と命名した。
　（調製例２－３：pRS406/ssEG2-CBH2プラスミド）
　GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ２（CBH２）遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。
　URA3遺伝子マーカーを持つpRS406をApaI, NotIで消化し、上記で得た断片を挿入した。得られたプラスミドをpRS406/ssCBH2と命名した。
　pRS403/ssEG2を鋳型として用い、配列番号２３（Forward）および配列番号２４（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲにより調製した断片をNotIで消化し、同様にNotIで消化したpRS406/ssCBH2に連結した。得られたプラスミドをpRS406/ssEG2-CBH2と命名した。
　（調製例２－４：分泌型エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS406/ssEG2-CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/UHWL（調製例１－１）に導入し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/UHWLの破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2」と命名した。
　（調製例２－５：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数２で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS403/ssEG2-CBH2を制限酵素NdeIで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2に導入し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2の破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2」と命名した。
　（調製例２－６：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数３で組み込んだ酵母株の調製）
　pRS405 ssEG2-CBH2を制限酵素HpaIで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2に導入し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2/ pRS405 ssEG2-CBH2」と命名した。簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c」とも表記する。
　（調製例２－７：表層提示β－グルコシダーゼ１遺伝子の組み込み）
　pIWBGLをBst1107Iで切断して直線状にし、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2/ pRS405 ssEG2-CBH2（NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c）に導入した。トリプトファンドロップアウト（トリプトファン不含培地）プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。各々の破壊されたＴＲＰ１遺伝子が復活することで、β－グルコシダーゼ１遺伝子の導入を確認した。この株を、簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL」とも表記する。本調製例によって、調製例２－６のコピー数３のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２を分泌する株においてさらに、１コピー数のβ－グルコシダーゼを表層提示するようにした株が得られた。
　（参考例１：熱水処理コーンファイバーを用いるフェドバッチ発酵）
　粉末状コーンファイバーを約10質量％の濃度となるように水と混合し、これをオートクレーブ式（型式SR型）加圧熱水処理装置（株式会社　新坂下製作所製）の反応器に入れ、１８０℃にて３０分間処理した（この処理を単に「熱水処理」ともいう）。次いで、これを７０℃で１２時間、乾燥器で乾燥して水分を除去し、固形物を得た。この固形物を、発酵基質として用いた。
　酵母の細胞ペレットの調製を以下のように行った。酵母を、必須アミノ酸を添加したＳＤ培地（合成デキストロース培地：6.7g/Lのアミノ酸以外の酵母窒素源（yeast nitrogen base without amino acids）［Difco社製］と適切な補充物を含む；20g/Lのグルコースが単一炭素源として添加されている）中で２４時間、pH 約5.0で約３０℃にて好気的（溶存酸素濃度：約2.0ppm）前培養し、次いで３０℃にて４８時間ＹＰＤ培地（酵母エキス・ポリペプトン・デキストロース培地：10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、20g/Lのグルコースを含む）中で同様の条件下で培養した。培養上清と細胞ペレットとを４℃にて１０分間６，０００×ｇの遠心分離によって分離し、細胞ペレットを得た。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。
　NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレットを、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。引き続き、約３０℃にて嫌気的（溶存酸素濃度：約0.05ppm）に培養して、発酵を実施した。発酵開始時に、セルラーゼ（Cellulase SS、ナガセケムテックス社製）を500μL（3.8FPU）添加した。発酵は72時間まで実施した。
　発酵中のエタノール濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析は、屈折率（ＲＩ）検出器（L-2490 RI detector、日立製作所）を用いることによって実施した。分離に用いたカラムは、Shim-pack SPR-Pb Column（島津製作所）であった。移動相として0.6mL/分の流速の水を用いてＨＰＬＣを８０℃にて操作した。
　熱水処理コーンファイバーを発酵基質とした場合、発酵反応が進むにつれて発酵培地が粘性化した。追加投入として、発酵開始後の12時間、24時間、および48時間の時点で各々50g/Lずつの発酵基質を添加したが、このような追加投入が難しくなっていった。セルラーゼ表層提示酵母の効果はほとんど見られなかった。
　（参考例２：アンモニア処理コーンファイバーを用いるフェドバッチ発酵）
　粉末状コーンファイバーを約10質量％の濃度となるように水と混合し、この混合物および15質量％濃度のアンモニアの水溶液をオートクレーブ式（型式SR型）加圧熱水処理装置（株式会社　新坂下製作所製）の反応器に入れ、170℃にて45分間処理した（この処理を単に「アンモニア処理」ともいう）。次いで、温度を１００℃まで低下させた後、加圧熱水処理装置の反応器を開放して水分およびアンモニアを蒸発させた。次いで、これを参考例１と同様に乾燥して水分およびアンモニアをさらに除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、セルラーゼを500μL（3.8FPU）添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　アンモニア処理では、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）がNBRC1440（野生型酵母）よりも多くエタノールを生産するという傾向が見られた。発酵の進行と共に発酵培地の粘性化が生じ、基質の追加投入のための撹拌が困難であった。このため、１回の投入量を少量にして投入数を増やし、追加投入として、発酵開始後の12時間、18時間、24時間、28時間、36時間、および48時間の時点で各々20g/Lずつの発酵基質を添加したが、セルラーゼ表層提示酵母を用いた場合であっても発酵培地は発酵反応の進行と共に粘性化し、最終的な発酵培地の粘性は非常に高かった。
　（実施例１：熱水処理後アンモニア処理コーンファイバーを用いるフェドバッチ発酵）
　粉末状コーンファイバーを、参考例１と同様にして熱水処理し乾燥して水分を除去して固形分を得、引き続きこれを参考例２と同様にしてアンモニア処理し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、セルラーゼを500μL（3.8FPU）添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　熱水処理後アンモニア処理では、追加投入として、発酵開始後の12時間および24時間の時点で、各々50g/Lずつの発酵基質を添加し、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL株（セルラーゼ表層提示酵母）を用いた場合は、参考例１および参考例２では追加投入を行った発酵開始後48時間の時点で発酵基質をさらに追加投入することなく、高いエタノール生産量が得られた。発酵基質の投入直後に生じる発酵培地の粘性の上昇が、発酵が進むにつれて低下し、終了時の発酵培地はさらさらしたものであった。
　（実施例２：熱水処理後アンモニア処理コーンファイバーを用いるフェドバッチ発酵によるエタノール生産に関するセルラーゼ表層提示酵母およびセルラーゼ分泌酵母の比較）
　発酵基質の調製は、実施例１と同様にして行った。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母：調製例１）、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母：調製例２）、またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に添加するセルラーゼの量は、セルラーゼを500μL（3.8FPU）とした。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　熱水処理後アンモニア処理コーンファイバーを発酵基質として用いた場合、追加投入として、発酵開始後の12時間および24時間の時点で、各々50g/Lずつの発酵基質を添加した。NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）では、エタノール生産量に対する向上効果が見られたのに対し、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母）は、NBRC1440細胞（野生型酵母）と同程度の生産量であった。
　（参考例３：熱水処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵）
　参考例１と同様にして、粉砕した稲わらを熱水処理に供し、乾燥して固形物を得た。但し、熱水処理は１８０℃にて９０分間行った。この固形物を発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、7.6FPU/mLのセルラーゼ（Cellulase SS、ナガセケムテックス社製）を0.5FPU/g基質の量、すなわち500μL（3.8FPU）で添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　結果を図１に示す。図１は、熱水処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。本グラフの横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸はNBRC1440（Ｗ：野生型酵母）、白丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Ｃ：セルラーゼ表層提示酵母）の結果を表す。
　追加投入として、発酵開始後の12時間、24時間、36時間、および48時間の時点で各々40g/Lずつの発酵基質を添加した。発酵開始後24時間までは、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）は、NBRC1440細胞（野生型酵母）と同様にエタノール生産量を増大し、エタノール生産量は、セルラーゼ表層提示酵母が野生型酵母よりもわずかに高かった。しかし、24時間経過後は、野生型酵母では引き続きエタノール生産量が増大したのに対し、セルラーゼ表層提示酵母では停滞した。48時間経過後では、野生型酵母でもエタノール生産量の停滞が見られた。
　該発酵中のフェノール性化合物の生産量もまた調べた。フェノール性化合物は、稲わらのリグニンから生じ得る。フェノール性化合物量の測定には、フォーリン・チオカルト法を用いた。
　この結果を図２に示す。図２は、熱水処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるフェノール性化合物生産量の経時変化を示すグラフである。本グラフの横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はフェノール性化合物生産量（g/L）を表す。図中、黒三角はNBRC1440（Ｗ：野生型酵母）、白三角はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Ｃ：セルラーゼ表層提示酵母）の結果を表す。
　いずれの酵母を用いた場合でも、フェノール性化合物の生産量は経時的に増大し、セルラーゼ表層提示酵母でエタノール生産量の停滞が生じた発酵開始後24時間では約4g/Lであった。セルラーゼによる稲わらの分解の際に、セルロースが単糖化するにつれてセルロースに付随していたリグニンが発酵培地中に溶出し、フェノール性化合物の生産につながっていると考えられる。セルラーゼ表層提示酵母のエタノールの生産は、稲わら中のリグニンからのフェノール性化合物の生産によって影響を受けることが分かった。
　（実施例３：熱水処理、アンモニア処理、および熱水処理後アンモニア処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵によるエタノール生産比較）
　本実施例では、発酵基質として熱水処理稲わら、アンモニア処理稲わら、および熱水処理後アンモニア処理稲わらのそれぞれを用いてフェドバッチ発酵を行い、エタノール生産量を調べた。
　熱水処理稲わらは、参考例３の熱水処理稲わらを用いた。アンモニア処理稲わらは、参考例２と同様にして、粉砕した稲わらをアンモニア処理に供し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。但し、アンモニア処理は１７０℃にて９０分間行った。熱水処理後アンモニア処理稲わらは、実施例１と同様にして、粉砕した稲わらを熱水処理に供した後、アンモニア処理に供し、蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。但し、熱水処理は１８０℃にて９０分間行い、アンモニア処理は１７０℃にて９０分間行った。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母：Ｃ）またはNBRC1440細胞（野生型酵母：Ｗ）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、7.6FPU/mLのセルラーゼ（Cellulase SS、ナガセケムテックス社）を0.5FPU/g基質の量、すなわち500μL（3.8FPU）で添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　いずれの前処理の場合も、発酵基質の初期投入量は50g/Lであるが、発酵基質の追加投入のタイミングおよび量は、発酵培地のスラリーの粘度をモニタリングして決定した。スラリーの粘性が高いと、発酵培地中での基質の撹拌が困難となる。したがって、熱水処理稲わらの場合は、追加投入として、発酵開始後の12時間、24時間、36時間、および48時間の時点で各々40g/Lずつの発酵基質を添加した。アンモニア処理稲わらの場合は、追加投入として、発酵開始後の12時間、24時間、および48時間の時点で各々40g/Lずつの発酵基質を添加した。熱水処理後アンモニア処理稲わらの場合は、追加投入として、発酵開始後の６時間、24時間、および48時間の時点で各々50g/Lずつの発酵基質を添加した。
　結果を図３に示す。図３は、熱水処理、アンモニア処理、または熱水処理後アンモニア処理稲わらを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。本グラフの横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸はNBRC1440＋熱水処理稲わら（Ｗ－熱水）、白丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL＋熱水処理稲わら（Ｃ－熱水）、黒三角はNBRC1440＋アンモニア処理稲わら（Ｗ－ＮＨ３）、白三角はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL＋アンモニア処理稲わら（Ｃ－ＮＨ３）、黒四角はNBRC1440＋熱水処理後アンモニア処理稲わら（熱水→ＮＨ３　Ｗ）、白四角はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL＋熱水処理後アンモニア処理稲わら（熱水→ＮＨ３　Ｃ）の結果を表す。
　熱水処理稲わらを用いた場合、参考例３と同様の傾向が見られた。すなわち、発酵開始後24時間までは、セルラーゼ表層提示酵母は、野生型酵母と同様にエタノール生産量を増大し、エタノール生産量は、セルラーゼ表層提示酵母が野生型酵母よりもわずかに高かった。しかし、24時間経過後は、野生型酵母では引き続きエタノール生産量が増大したのに対し、セルラーゼ表層提示酵母では停滞した。発酵が進むにつれて発酵培地が粘性化した。
　アンモニア処理稲わらを用いた場合、セルラーゼ表層提示酵母は、野生型酵母と同様にエタノール生産量を増大し、最終的なエタノール生産量は、セルラーゼ表層提示酵母が野生型酵母よりも高くなった。セルラーゼ表層提示酵母は、熱水処理稲わらで見られたような停滞は見られなかった。発酵が進むにつれて発酵培地が粘性化し、発酵基質を追加して投入することが難しくなった。最終的な発酵培地の粘性は非常に高かった。
　熱水処理後アンモニア処理稲わらを用いた場合、エタノール生産量は、セルラーゼ表層提示酵母が野生型酵母を上回り、発酵時間の経過と共に、セルラーゼ表層提示酵母と野生型酵母との差異は顕著になった。セルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母のいずれを用いた場合でも、発酵基質の投入初期には発酵培地の粘性が上昇するが、発酵が進むにつれて発酵培地の粘性の減少が見られ、終了時はさらさらしたものであった。セルラーゼ表層提示酵母で、より早い粘性の減少が見られた。
　セルラーゼ表層提示酵母および野生型酵母ともに、エタノール生産量は、熱水処理後アンモニア処理稲わらが他の処理稲わらと比較して高く、発酵時間の経過と共にその差は顕著になった。全ての条件の中で、熱水処理後アンモニア処理稲わらを発酵基質として用いてセルラーゼ表層提示酵母で発酵を行った場合に、最も高いエタノール生産量が得られた。
　（参考例４：熱水処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵）
　ＤＤＧ（ディスティラーズ・ドライ・グレイン、トウモロコシ蒸留乾燥残渣）を、参考例１と同様にして熱水処理に供し乾燥して固形物を得た。この固形物を、発酵基質として用いた。
　酵母の細胞ペレットの調製を以下のように行った。酵母を、必須アミノ酸を添加したＳＤ培地（合成デキストロース培地：6.7g/Lのアミノ酸以外の酵母窒素源（yeast nitrogen base without amino acids）［Difco社製］と適切な補充物を含む；20g/Lのグルコースが単一炭素源として添加されている）中で２４時間、pH 約5.0で約３０℃にて好気的（溶存酸素濃度：約2.0ppm）前培養し、次いで３０℃にて４８時間ＹＰＤ培地（酵母エキス・ポリペプトン・デキストロース培地：10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、20g/Lのグルコースを含む）中で同様の条件下で培養した。培養上清と細胞ペレットとを４℃にて１０分間６，０００×ｇの遠心分離によって分離し、細胞ペレットを得た。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレットを、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。引き続き、約３０℃にて嫌気的（溶存酸素濃度：約0.05ppm）に培養して、発酵を実施した。発酵開始時に、セルラーゼ（Cellulase SS、ナガセケムテックス社製）を500μL（3.8FPU）添加した。発酵は72時間まで実施した。
　発酵中のエタノール濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析は、屈折率（ＲＩ）検出器（L-2490 RI detector、日立製作所）を用いることによって実施した。分離に用いたカラムは、Shim-pack SPR-Pb Column（島津製作所）であった。移動相として0.6mL/分の流速の水を用いてＨＰＬＣを８０℃にて操作した。
　結果を図４に示す。図４は、熱水処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Arm：セルラーゼ表層提示酵母）、黒三角はNBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（Sec：セルラーゼ分泌酵母）、黒四角はNBRC1440細胞（Ｗ：野生型酵母）の結果を表す。
　熱水処理ＤＤＧを発酵基質とした場合、そもそも発酵反応がスムーズに進まず、追加の発酵基質として、発酵開始後の24時間の時点で50g/Lの発酵基質を添加したが、セルラーゼ表層提示酵母を用いた場合でも、エタノール生産の収率はなかなか向上しなかった。また、どの酵母の場合でも、発酵時間が経過するにつれて、酵母の死滅が確認された。
　（参考例５：アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵）
　ＤＤＧを、参考例２と同様にアンモニア処理に供し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、セルラーゼを500μL（3.8FPU）添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　結果を図５に示す。図５は、アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Arm：セルラーゼ表層提示酵母）、黒三角はNBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（Sec：セルラーゼ分泌酵母）、黒四角はNBRC1440細胞（Ｗ：野生型酵母）の結果を表す。
　アンモニア処理では、発酵の進行と共に発酵培地の粘性化が生じ、基質の追加投入のための撹拌が困難であった。追加投与として、発酵開始後の12時間、24時間、および48時間の時点で、各々50g/Lずつの発酵基質を添加したが、セルラーゼ表層提示酵母を用いた場合であっても発酵培地は発酵反応の進行と共に粘性化し、最終的な発酵培地の粘性は非常に高かった。
　（実施例４：熱水処理後アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵）
　ＤＤＧを、実施例１と同様に熱水処理後アンモニア処理に供し、固形物を得た。本固形物を、発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレット（発酵開始時の細胞濃度は75g/L（湿潤細胞））を、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種し、続いて、参考例１と同様に培養して発酵を行った。発酵開始時に、セルラーゼを500μL（3.8FPU）添加した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　結果を図６に示す。図６は、熱水処理後アンモニア処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母、セルラーゼ分泌酵母、または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Arm：セルラーゼ表層提示酵母）、黒三角はNBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（Sec：セルラーゼ分泌酵母）、黒四角はNBRC1440細胞（Ｗ：野生型酵母）の結果を表す。
　熱水処理後アンモニア処理では、追加投与として、発酵開始後の12時間および24時間の時点で、各々50g/Lずつの発酵基質を添加し、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL株（セルラーゼ表層提示酵母）を用いた場合、参考例５では追加投入を行った発酵開始後48時間の時点で発酵基質をさらに追加投入することなく、高いエタノール生産量が得られた。また発酵基質の投入直後に生じる発酵培地の粘性の上昇が、発酵が進むにつれて低下し、終了時の発酵培地はさらさらしたものであった。
　熱水処理後アンモニア処理の場合、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）で、エタノール生産量に対する向上効果が見られたのに対し、NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ分泌酵母）は、NBRC1440細胞（野生型酵母）と同程度の生産量であった。
　いずれの基質を用いた場合も、発酵前に熱水処理後アンモニア処理を施すことにより、発酵が進むにつれて、発酵培地が高粘度化することなく、エタノールの生産量が増大した。特に、セルラーゼ表層提示酵母を用いることで、エタノールの生産が向上した。
　（実施例５：熱水処理後アンモニア処理またはアンモニア処理後熱水処理したＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵）
　ＤＤＧを、実施例１と同様に熱水処理（１８０℃にて３０分間）後アンモニア処理（１７０℃にて４５分間）に供し、固形物を得、本固形物を、熱水処理後アンモニア処理発酵基質として用いた。
　ＤＤＧを、参考例２と同様にアンモニア処理（１７０℃にて４５分間）に供し蒸発および乾燥により水分およびアンモニアを除去して固形分を得、次いでこの固形物を、参考例１と同様に熱水処理（１８０℃にて３０分間）に供し乾燥して水分を除去して固形分を得、本固形物を、アンモニア処理後熱水処理発酵基質として用いた。
　参考例１と同様に調製したNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）またはNBRC1440細胞（野生型酵母）の細胞ペレットを、50g/L発酵基質、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。引き続き、約３０℃にて嫌気的（溶存酸素濃度：約0.05ppm）に培養して、発酵を実施した。発酵開始時に、セルラーゼ（Cellulase SS、ナガセケムテックス社製）を500μL（3.8FPU）添加した。発酵は72時間まで実施した。参考例１と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。
　結果を図７に示す。図７は、熱水処理後アンモニア処理またはアンモニア処理後熱水処理ＤＤＧを用いるフェドバッチ発酵におけるセルラーゼ添加下のセルラーゼ表層提示酵母または野生型酵母によるエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。横軸は発酵時間（時間）を表し、縦軸はエタノール生産量（g/L）を表す。図中、黒丸は熱水処理後アンモニア処理発酵基質の場合のNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Ｃ：セルラーゼ表層提示酵母）、黒三角は熱水処理後アンモニア処理発酵基質の場合のNBRC1440細胞（Ｗ：野生型酵母）、白丸はアンモニア処理後熱水処理発酵基質の場合のNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（Ｃ：セルラーゼ表層提示酵母）、白三角はアンモニア処理後熱水処理発酵基質の場合のNBRC1440細胞（Ｗ：野生型酵母）の結果を表す。
　熱水処理後アンモニア処理発酵基質およびアンモニア処理後熱水処理発酵基質の両方とも、追加投与として、発酵開始後の12時間および24時間の時点で、各々50g/Lずつの発酵基質を添加した。アンモニア処理後熱水処理発酵基質の場合も、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（セルラーゼ表層提示酵母）で高いエタノール生産量が得られ、また発酵基質の投入直後に生じる発酵培地の粘性の上昇が、発酵が進むにつれて低下し、終了時の発酵培地はさらさらしたものであった。前処理間で比較すると、熱水処理後アンモニア処理発酵基質を用いた場合の方が、アンモニア処理後熱水処理発酵基質を用いた場合よりも高いエタノール生産量が得られた。
　本発明によれば、特にリグニンを含むセルロース系物質を原料として用いた場合でも、エタノール生産量および速度の増大を達成でき、エタノールの工業的製造に有利となり得る。また、トウモロコシからのエタノール製造工程の副産物であり得るコーンファイバーまたはＤＤＧを、エタノールの製造に効率よく再利用できる。用いるセルラーゼ酵素の量を削減できることが期待される。通常廃棄され得るソフトバイオマスから効率よくエタノールが生産でき、さらにコストの低減につながり得る。

Claims (6)

  1. 　エタノールを製造する方法であって
    　セルロース系物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程；および
    　該発酵基質と酵母とを反応させる工程であって、それによりエタノールを生産する、工程
    を含む、方法。
  2. 　前記セルロース系物質を前記熱水処理後前記アンモニア処理に供する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記酵母がセルラーゼ酵母である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記セルラーゼ酵母が、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ－グルコシダーゼがそれぞれ表層提示されているセルラーゼ表層提示酵母である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記反応工程が、前記発酵基質を追加投入して行われる、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 　酵母によるエタノール製造用の発酵基質を製造する方法であって
    　セルロース物質を熱水処理およびアンモニア処理に供し、発酵基質を得る工程
    を含む、方法。
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