CN109852554A - 一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β‑葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。本发明还公开了所述工程菌株在发酵生产纤维素酶中的应用，实验证实该工程菌株的egl2的表达量较出发菌株提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍，内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖甘酶活力分别为117.5IU/mL和34.5IU/mL。其发酵生产纤维素酶系可以高效应用于玉米芯以及其他木质纤维素酶材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。

Description

一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程 菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源。将复杂的生物质酶促水解成可发酵糖进而转化为生物燃料和化学品已成为克服能源危机的有效途径。但是，过高的纤维素酶用酶成本制约了纤维素能源的工业大规模生产。纤维素酶生产效率低、酶的比活力不强及酶组分比例不适合等问题是酶成本过高的主要因素。因此，为了解决该瓶颈问题，一方面需要从菌株本身角度考虑，提高菌株的纤维素酶生产能力；另一方面需要结合基因工程策略优化纤维素酶系的组成以增加其催化效率。

将纤维素转化为可发酵糖的过程需要多种酶组分的参与。这些酶包括外切葡聚糖酶(CBHs)，内切葡聚糖酶(EGs)和β-葡萄糖苷酶(BGLs)。CBHs沿纤维素链滑动，并从纤维素链的两端切除纤维二糖；而EG在纤维素链内随机水解糖苷键，生成纤维寡糖；随后，BGL将产生寡糖和纤维二糖转化为葡萄糖；三者协同水解纤维素。各种酶组分之间的协同效应使得纤维素酶系的酶活力远高于单组分酶的总活力。单个酶的性质以及在酶系中所占的比例影响了纤维素酶系的催化效率。通过调整纤维素酶系中单酶组分的比例已成为优化纤维素酶系的重要策略。基于主要酶组分的复配纤维素酶系已经显示出在各种纤维素底物的水解中接近甚至超过商业纤维素酶的性能。例如，仅用三种主要纤维素酶(CBH1，CBH2和EG1)体外复配的最小酶系可以达到用商业酶制剂获得的纤维素水解率的80.0％。然而，单个纯化的酶组分制备是繁琐且昂贵的，因此阻碍了体外优化的工业应用。因此，利用基因工程策略体内设计和优化纤维素酶系具有重要工业应用价值和理论指导意义。

丝状真菌里氏木霉是目前商业纤维素酶制剂得主要生产菌株(Trichodermareesei)，且能够分泌木质纤维素完全水解所必需的所有核心酶。这些降解酶包括两个CBHs(CBH1和CBH2)、至少四个EGs(EG1，EG2，EG3和EG5)以及BGL1，它们以协同方式起作用以降解纤维素材料。EG1和EG2是里氏木霉两种主要的内切酶，EG的蛋白量占分泌蛋白总量的20％。虽然EG2的比活力是EG1的两倍，但其蛋白分泌量要远低于EG1。因此，EG2是重要的纤维素酶优化靶点。另外，长期以来一直认为BGL不足导致纤维素水解过程中纤维二糖的积累，从而抑制了外切酶的活力，进而导致整个纤维酶系催化效率的降低。因此，BGL1是另一个重要的改造靶点。尽管通过增加单一酶组分比例能够适度的改良纤维素系。然而，仅增加单组分比例并不能达到最优的纤维素酶的催化效率，因此，需要对多酶组分进行复配和设计。迄今为止，国内外尚无利用基因工程优化里氏木霉内源多酶组分以提高纤维素酶系催化效率的报道，更未见有关内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β-葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。

上述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，步骤是：将内切葡聚糖酶2的基因(egl2)表达盒与pMD 19-T载体连接，得到融合基因表达载体pTeg2；再将该载体转化进出发菌里氏木霉QM9414的基因组，即获得内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株；随后将含有β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)表达盒的质粒pTHB，转化入内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株的基因组中，筛选、验证即可获得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌QMEB5；其中，所述egl2基因其上游为内切葡聚糖酶2启动子Peg2，下游为内切葡聚糖酶2终止子Teg2；bgl1基因其上游为外切葡聚糖酶1启动子Pcbh1，下游为外切葡聚糖酶1终止子Tcbh1；所述egl2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述bgl1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法中，所述的内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1优选来自里氏木霉RUT-C30基因组；所述的eg2的启动子Peg2和终止子Teg2优选来源于里氏木霉QM9414；所述的bgl1基因的启动子Pcbh1和终止子Tcbh1优选来源于质粒PTHB。

本发明所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌在发酵生产纤维素酶中的应用。

上述应用中，所述发酵生产纤维素酶的方法是：

将基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5接种到装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤、收集湿菌丝，再按0.5-1g湿菌丝转接到100mL发酵培养基的比例扩大接种，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min收集上清液，即得到含纤维素酶的酶液；其中，

所述种子培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米粉15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L；

所述发酵培养基的组成成分为：结晶纤维40g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄，5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L，CaCO₃ 2.5g/L，甘油2.5g/L，Tween-80 2g/L。

本发明所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌发酵产生酶液在水解玉米芯材料中的应用。

本发明公开了一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用。较现有技术中的里氏木霉QM9414比，本发明的里氏木霉工程菌QMEB5具有以下突出效果：

本发明所述的里氏木霉菌株QMEB5较出发菌株具有更强的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶分泌能力，实验证实该工程菌株的egl2的表达量较出发菌株提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍，其滤纸酶活力为10.3IU/mL，内切葡聚糖酶活力117.5IU/mL,外切葡聚糖酶酶活力4.5IU/mL，葡萄糖苷酶活力34.5IU/mL。与出发菌株相比分别提高2.38倍、3.8倍、2.3倍和27.8倍。另外，利用本发明的里氏木霉工程菌QMEB5所生产的纤维素酶系处理玉米芯材料时，与出发株相比，葡萄糖得率提高了2.81倍；在水解玉米芯材料40h时，其纤维素转化率能够到达95％，显著高于出发菌株(33％)。本发明提供的基因工程菌的纤维素酶和β葡萄糖苷酶产量高，生产成本低，并且该酶系可以高效应用于玉米芯及其他木质纤维素材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。

附图说明

图1.内切葡聚糖酶基因表达载体pTeg2图谱和β-葡萄糖苷酶基因表达载体pTHB图谱。

其中：A是内切葡聚糖酶表达载体pTeg2的质粒图谱；B是β-葡萄糖苷酶表达载体pTHB的质粒图谱。

图2.内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的双高分泌里氏木霉工程菌的验证。

其中：A是内切葡聚糖酶基因egl2的PCR验证电泳图；B是β-葡萄糖苷酶基因bgl1的PCR验证电泳图；M为1kb DNA marker。

图3.工程菌株的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活力平板检测图。

其中：A是工程菌的内切葡聚糖酶活力的平板检测图，QMEB5为双高高分泌工程菌，QM9414为出发菌株，为阴性对照。B是工程菌β-葡萄糖苷酶活力的平板检测图。

图4.里氏木霉工程菌的内切葡聚糖酶基因egl2和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的表达量分析。

其中A是egl2的表达结果，B是bgl1的表达结果。

图5.工程菌的滤纸酶活力和β-葡萄糖苷酶活力测定结果。

其中A是滤纸酶活力(总纤维素酶活力)结果；B是β-葡萄糖苷酶活力测定结果；QM9414为出发菌株。

图6.工程菌的外切葡聚糖酶活力和内切葡聚糖酶活力测定结果。

其中A是外切葡聚糖酶活力结果；B是内切葡聚糖酶活力，测定结果；QM9414为出发菌株。

图7.工程菌生产的对玉米芯材料的糖化应用。

其中A是葡萄糖得率的测定结果；B是葡萄糖转化率的测定结果；QM9414为出发菌株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

一般性说明：

实施例所用出发菌种里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414，购自美国菌种保藏中心，其保藏号为ATCC 26921。里氏木霉(Trichoderma reesei)RUT-C30购自美国菌种保藏中心，其保藏号为ATCC 56765。

实施例所用质粒提取试剂盒试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自美国OMEGABiotek公司，片段扩增所用Taq酶PrimeSTAR和菌株验证所用Taq酶2*Phanta mix购自诺唯赞有限公司；质粒pMD19-T购买自TAKARA公司；表达载体pTHB的构建见(Zhang et al.,Bioresource Technology.2010,101,9815–18)；质粒PAN7-1的构建见(Punt et al.,Gene.1987,56,117-24.)。

实施例1.内切葡聚糖酶2表达载体pTeg2和β-葡萄糖苷酶表达载体pTHB的构建。

首先以里氏木霉QM9414的基因组DNA为模板，以EG2-1524UF/EG2-1813DR为引物扩增带有启动子和终止子的3360bp的egl2表达元件，然后将该表达元件克隆至商业质粒pMD19-T载体中，挑取单克隆子进行测序，将测序正确的质粒命名为pTeg2，质粒图谱见图1A所示。β-葡萄糖苷酶表达载体pTHB(Zhang et al.,Bioresource Technology.2010,101,9815–18)，质粒图谱见图1B所示。

上述引物对具体序列如下：

EG2-1524UF：GACAAGAAATCGGGTGTTTAGGT；

EG2-1813DR：ATAAGAATGCGGCCGCGTGGGCTGGGTAGGGTTTG。

实施例2.利用表达载体pTeg2和pTHB转化里氏木霉QM9414构建内切葡聚糖酶2和β-葡萄糖苷酶的高分泌基因工程菌

里氏木霉QM9414的遗传转化是利用PEG/CaCl₂介导的原生质体转化方法，吡啶硫胺素抗性基因ptrA为和潮霉素B抗性基因hph为选择标记。将纯化的10μg pTeg2质粒和1μg含有hph抗性基因的质粒PAN7-1(Punt et al.,Gene.1987,56,117-24.)混匀后共转化里氏木霉QM9414的原生质体；将纯化的10μg pTHB质粒和1μg含有ptrA表达盒的pME2892质粒(Krappmann et al.,Eukaryotic Cell.2005,4,1298–1307.)混匀后共转化QM9414原生质体。

上述PEG/CaCl₂介导的原生质体转化的具体方法如下：

(1)里氏木霉QM9414原生质体的制备：

准备新鲜的里氏木霉孢子(1周之内)，涂布含有玻璃纸的PDA平板上，30℃培养，待菌丝生长到合适的长度后，将菌丝刮入含有裂解酶的转化液1中，混匀后30℃静置裂解1.5h；将裂解物过滤，收集滤液；2500rpm离心10min，弃上清；用转化液2将轻轻地重新悬浮沉淀，4℃,2500rpm再次离心10min后弃上清；加入0.5mL转化液2重悬浮沉淀，置于冰上以备后续实验。

其中上述PDA培养基组成为：土豆200g，加水煮沸30min，8层纱布过滤，滤液添加葡萄糖20g，定容至1L，2％琼脂粉，115℃灭菌30min；

转化液1：1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄，pH 5.6，115℃灭菌30min；

转化液2：1M山梨醇，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH 7.5，115℃灭菌30min。

(2)内切葡聚糖酶载体pTeg2转化里氏木霉QM9414的原生质体：

将混匀后的pTeg2和PAN7-1质粒，加入50μL预冷的转化液3，冰浴20min，后加2mL常温的转化液3，室温放置5min，最后加4mL转化液2，轻轻混匀；然后，将上述混合物加入到含250μg/mL潮霉素B的50mL转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，冷却凝固后，30℃培养3-5天，挑选生长良好的转化株，提取染色体，进行分子验证。结果如图2A所示，以PM19T-150-UF/EG2-1177-UR为引物对EG2高分泌菌株进行PCR验证，其中转化子能够扩增出0.6kb的条带，而出发菌株没有条带产生。

利用同样的方法，将混匀后的pTHB和pME2892质粒转化入egl2的高分泌菌株中，然后，将上述溶液加入到含0.3μg/mL吡啶硫胺素氢溴酸盐的50mL转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，30℃培养3-5天，挑选转化株进行分子验证。结果如图2B所示，以Y1/Y2为引物对β-葡萄糖苷酶高分泌菌株进行PCR验证，其中转化子能够扩增出1.0kb的条带，而出发菌株没有条带产生。将验证正确的EG2和BGL1双高分泌菌株命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1。

其中上述转化液3培养基为：25％PEG 6000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH 7.5。

上层培养基(g/L)：葡萄糖10，SO₄·7H₂O 1，LKH₂PO₄ 10，(NH₄)₂SO₄ 6，C₆H₅Na₃O₇ 3，山梨醇182.18，琼脂糖6；

下层培养基(g/L)：葡萄糖10，MgSO₄·7H₂O 1，KH₂PO₄ 10，(NH₄)₂SO₄ 6，C₆H₅Na₃O₇ 3，琼脂粉20；以上培养基均经115℃灭菌30min后使用。

上述所用引物为：

PM19T-150-UF：CGGCATCAGAGCAGATTG；

EG2-1177-UR：TTCCTGTCCGCTATGTTGAG。

Y1：GCCAGGGATGCTTGAGTGTA；

Y2：CCCAGCCACAGGACCAAGTATG。

实施例3.内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌工程菌株酶活力平板分析：

将实施例2获得的工程菌株QMEB5和出发菌株QM9414，利用内切葡聚糖酶活力平板和β-葡萄糖苷酶活力平板检测方法对转化株酶活力进行检测，具体方法是：取转化株孢子接种至CMC平板上，30℃培养3d后，利用1mg/mL刚果红溶液染色15min，加入适量1M NaCl溶液洗涤脱色30min，弃去脱色液，观察水解圈的大小。如图3A所示，转化株QMEB5的菌落周围产生明显的水解圈较出发菌株的水解圈明显增大，说明pTeg2表达盒成功整合到基因组中且内切葡聚糖酶基因获得表达。同理，将QMEB5接种至七叶苷培养基中，培养2d，观察菌落周围的黑色晕圈的形成。如图3B所示，转化株QMEB5的菌落周围的黑色晕圈显著大于出发菌株的黑色晕圈，说明pTHB成功整合到基因组中且β-葡萄糖苷酶基因获得表达。因此，内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌工程菌可用于后继分析应用。

其中，上述CMC平板培养基(g/L)为：CMC-Na 10，(NH₄)₂SO₄ 2，酵母膏1，MgSO₄·7H₂O0.5，K₂HPO₄ 1，Triton X-100 0.5％。琼脂2％，pH自然，121灭菌30min；

七叶苷平板培养基(g/L)为：CMC-Na 10，七叶苷3，柠檬酸铁0.5，(NH₄)₂SO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.5，K₂HPO₄ 1，酵母膏1，2.5％琼脂粉，115℃灭菌30min。

实施例4.工程菌株的内切葡聚糖酶基因egl2和β-葡萄糖苷酶基因bgl1的表达量分析

将实施例2获得的工程菌株QMEB5与出发菌株QM9414(10⁸个/mL)分别接种至100mL产酶培养基中，30℃，200rpm，进行摇瓶培养36h，抽滤、收集菌丝体并提取RNA，并进行反转录QPCR分析。结果如图4所示，QMEB5中的egl2基因和bgl1基因的表达量都显著提高，其中egl2的表达与出发菌株相比提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍。进一步表明，QMEB5中egl2和bgl1实现了高分泌。

其中，上述发酵培养基为(g/L)：结晶纤维40g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄，5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L，CaCO₃ 2.5g/L，甘油2.5g/L，Tween-80 2g/L。灭菌30min。

实施例5.内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌工程菌株酶活力的测定。

将实施例2获得的工程菌株QMEB5与出发菌株QM9414(10⁸个/mL)分别接种至100mL孢子悬液分别接种到100mL(500mL的三角瓶)种子培养基中，30℃200rpm培养36h后，取10mL菌液转接到100mL(500mL的三角瓶)发酵培养基中培养7d后取发酵液，离心，取上清，测定纤维酶活力。图5A显示工程菌株QMEB5的滤纸酶活力为10.3IU/mL，比出发菌株(4.33IU/mL)提高了2.38倍；图5B显示工程菌株QMEB5的β-葡萄糖甘酶活力为34.5IU/mL，比出发菌株(1.2IU/mL)提高了27.8倍；图6A显示工程菌株QMEB5的β-葡萄糖甘酶活力为34.5IU/mL，比出发菌株(1.2IU/mL)提高了27.8倍；图6显示工程菌株QMEB5的内切葡聚糖酶活力和外切葡聚糖酶活力分别比出发菌株提高了3.76倍和2.35倍。表明，双高表达内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶能够显著提高里氏木霉纤维素酶活力。

其中，上述种子培养基为(g/L)：葡萄糖10g/L，玉米粉15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 15g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L。

滤纸酶活力和内切葡聚糖酶活力根据中华人民共和国轻工业标准QB 2583-2003测定。

1)滤纸酶活力测定方法：

将1×6cm(50mg)滤纸折叠放入试管底部，加入1.5mL pH 4.8的柠檬酸缓冲液和0.5mL适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴60min后加入3mL DNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25mL，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。

2)内切葡聚糖酶活力测定方法：

取CMC-Na溶液(0.67％)2.0mL，加入0.5mL适当稀释的酶液，混匀。50℃反应30min后加入3mL DNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25mL，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。

酶活定义：在50℃、pH 4.8条件下，将每分钟产生1μmol葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。

3)外切葡聚糖酶活力(pNPCase)测定方法：

取100μL适当稀释的酶液，加入50μL 10mmol/L对硝基苯基-D-纤维二糖苷(pNPC)柠檬酸buffer溶液(pH 4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μl 10％Na₂CO₃终止反应。420nm测OD值。同时以先10％Na₂CO₃，后加入酶液作为空白对照。

4)β-葡萄糖苷酶活力(pNPGase)测定方法：

取100μL适当稀释的酶液，加入50μL 10mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)柠檬酸buffer溶液(pH 4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μl 10％Na₂CO₃终止反应。420nm测OD值。同时以先10％Na₂CO₃，后加入酶液作为空白对照。

pNPCase和pNPGase酶活力的定义：在50℃、pH 4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。

实施例6.EG2和BGL1双高分泌工程菌株产生的纤维素酶系在水解玉米芯材料中的应用

将实施例5获得的工程菌株QMEB5和出发菌株QM9414所制备的纤维素酶液应用于实际玉米芯材料的糖化实验中。糖化实验。反应体系为30mL，糖化底物为5％的脱木素处理玉米芯底物，纤维素酶添加量为10FPU/g玉米芯，为了防止染菌加入0.1％NaN₃，用0.1mol·pH4.8的醋酸缓冲液补齐至30mL，50℃、每分钟150rpm进行糖化，糖化结束后、取糖化液，离心，取上清，利用SBA-40C(BISAS，China)生物传感仪进行葡萄糖的测定。结果如图7A所示，工程菌株QEMB5的酶液能够显著提高葡萄糖得率，QMEB5的葡萄糖得率(34mg/mL)与出发菌株QM9414的酶液(12mg/mL)相比提高了2.81倍。图7B，显示，工程菌株QEMB5的酶液的转化率(95％)显著高于QM9414的酶液的转化率(33％)。

其中，上述玉米芯的成分是：纤维素65.7％，半纤维素1.8％，木素3.2％，灰分5.9％，其他成分为23.4％。

综上，本研究成功实现了里氏木霉QM9414遗传操作体系的改进，并以此为基础改良纤维素酶组分，获得了糖化效率显著提高的工程菌，为下一步实际工业应用打下基础。上述事实证明，利用本发明公开的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的双高分泌能够显著提高纤维素酶活力，且在实际应用中，几乎能够达到100％的纤维素转化率。该工程菌株具有较高的理论研究意义和实际应用价值。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

<141> 2018-12-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> bgl2基因的核苷酸序列

<400> 1

atgaacaagt ccgtggctcc attgctgctt gcagcgtcca tactatatgg cggcgccgct 60

gcacagcaga ctgtctgggg ccagtgtgga ggtattggtt ggagcggacc tacgaattgt 120

gctcctggct cagcttgttc gaccctcaat ccttattatg cgcaatgtat tccgggagcc 180

actactatca ccacttcgac ccggccacca tccggtccaa ccaccaccac cagggctacc 240

tcaacaagct catcaactcc acccacgagc tctggggtcc gatttgccgg cgttaacatc 300

gcgggttttg actttggctg taccacagat ggcacttgcg ttacctcgaa ggtttatcct 360

ccgttgaaga acttcaccgg ctcaaacaac taccccgatg gcatcggcca gatgcagcac 420

ttcgtcaacg acgacgggat gactattttc cgcttacctg tcggatggca gtacctcgtc 480

aacaacaatt tgggcggcaa tcttgattcc acgagcattt ccaagtatga tcagcttgtt 540

caggggtgcc tgtctctggg cgcatactgc atcgtcgaca tccacaatta tgctcgatgg 600

aacggtggga tcattggtca gggcggccct actaatgctc aattcacgag cctttggtcg 660

cagttggcat caaagtacgc atctcagtcg agggtgtggt tcggcatcat gaatgagccc 720

cacgacgtga acatcaacac ctgggctgcc acggtccaag aggttgtaac cgcaatccgc 780

aacgctggtg ctacgtcgca attcatctct ttgcctggaa atgattggca atctgctggg 840

gctttcatat ccgatggcag tgcagccgcc ctgtctcaag tcacgaaccc ggatgggtca 900

acaacgaatc tgatttttga cgtgcacaaa tacttggact cagacaactc cggtactcac 960

gccgaatgta ctacaaataa cattgacggc gccttttctc cgcttgccac ttggctccga 1020

cagaacaatc gccaggctat cctgacagaa accggtggtg gcaacgttca gtcctgcata 1080

caagacatgt gccagcaaat ccaatatctc aaccagaact cagatgtcta tcttggctat 1140

gttggttggg gtgccggatc atttgatagc acgtatgtcc tgacggaaac accgactggc 1200

agtggtaact catggacgga cacatccttg gtcagctcgt gtctcgcaag aaagtag 1257

<210> 2

<211> 2235

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> bgl1基因的核苷酸序列

<400> 2

atgcgttacc gaacagcagc tgcgctggca cttgccactg ggccctttgc tagggcagac 60

agtcactcaa catcgggggc ctcggctgag gcagttgtac ctcctgcagg gactccatgg 120

ggaaccgcgt acgacaaggc gaaggccgca ttggcaaagc tcaatctcca agataaggtc 180

ggcatcgtga gcggtgtcgg ctggaacggc ggtccttgcg ttggaaacac atctccggcc 240

tccaagatca gctatccatc gctatgcctt caagacggac ccctcggtgt tcgatactcg 300

acaggcagca cagcctttac gccgggcgtt caagcggcct cgacgtggga tgtcaatttg 360

atccgcgaac gtggacagtt catcggtgag gaggtgaagg cctcggggat tcatgtcata 420

cttggtcctg tggctgggcc gctgggaaag actccgcagg gcggtcgcaa ctgggagggc 480

ttcggtgtcg atccatatct cacgggcatt gccatgggtc aaaccatcaa cggcatccag 540

tcggtaggcg tgcaggcgac agcgaagcac tatatcctca acgagcagga gctcaatcga 600

gaaaccattt cgagcaaccc agatgaccga actctccatg agctgtatac ttggccattt 660

gccgacgcgg ttcaggccaa tgtcgcttct gtcatgtgct cgtacaacaa ggtcaatacc 720

acctgggcct gcgaggatca gtacacgctg cagactgtgc tgaaagacca gctggggttc 780

ccaggctatg tcatgacgga ctggaacgca cagcacacga ctgtccaaag cgcgaattct 840

gggcttgaca tgtcaatgcc tggcacagac ttcaacggta acaatcggct ctggggtcca 900

gctctcacca atgcggtaaa tagcaatcag gtccccacga gcagagtcga cgatatggtg 960

actcgtatcc tcgccgcatg gtacttgaca ggccaggacc aggcaggcta tccgtcgttc 1020

aacatcagca gaaatgttca aggaaaccac aagaccaatg tcagggcaat tgccagggac 1080

ggcatcgttc tgctcaagaa tgacgccaac atcctgccgc tcaagaagcc cgctagcatt 1140

gccgtcgttg gatctgccgc aatcattggt aaccacgcca gaaactcgcc ctcgtgcaac 1200

gacaaaggct gcgacgacgg ggccttgggc atgggttggg gttccggcgc cgtcaactat 1260

ccgtacttcg tcgcgcccta cgatgccatc aataccagag cgtcttcgca gggcacccag 1320

gttaccttga gcaacaccga caacacgtcc tcaggcgcat ctgcagcaag aggaaaggac 1380

gtcgccatcg tcttcatcac cgccgactcg ggtgaaggct acatcaccgt ggagggcaac 1440

gcgggcgatc gcaacaacct ggatccgtgg cacaacggca atgccctggt ccaggcggtg 1500

gccggtgcca acagcaacgt cattgttgtt gtccactccg ttggcgccat cattctggag 1560

cagattcttg ctcttccgca ggtcaaggcc gttgtctggg cgggtcttcc ttctcaggag 1620

agcggcaatg cgctcgtcga cgtgctgtgg ggagatgtca gcccttctgg caagctggtg 1680

tacaccattg cgaagagccc caatgactat aacactcgca tcgtttccgg cggcagtgac 1740

agcttcagcg agggactgtt catcgactat aagcacttcg acgacgccaa tatcacgccg 1800

cggtacgagt tcggctatgg actgtcttac accaagttca actactcacg cctctccgtc 1860

ttgtcgaccg ccaagtctgg tcctgcgact ggggccgttg tgccgggagg cccgagtgat 1920

ctgttccaga atgtcgcgac agtcaccgtt gacatcgcaa actctggcca agtgactggt 1980

gccgaggtag cccagctgta catcacctac ccatcttcag cacccaggac ccctccgaag 2040

cagctgcgag gctttgccaa gctgaacctc acgcctggtc agagcggaac agcaacgttc 2100

aacatccgac gacgagatct cagctactgg gacacggctt cgcagaaatg ggtggtgccg 2160

tcggggtcgt ttggcatcag cgtgggagcg agcagccggg atatcaggct gacgagcact 2220

ctgtcggtag cgtag 2235

Claims (6)

1.一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，其特征在于：所述工程菌株命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因组中含有多拷贝内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1，其基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β-葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。

2.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，步骤是：将内切葡聚糖酶2的基因(egl2)表达盒与pMD 19-T载体连接，得到融合基因表达载体pTeg2；再将该载体转化进出发菌里氏木霉QM9414的基因组，即获得内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株；随后将含有β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)表达盒的质粒pTHB，转化入内切葡聚糖酶EG2高分泌菌株的基因组中，筛选、验证即可获得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌QMEB5；其中，所述egl2基因其上游为内切葡聚糖酶2启动子Peg2，下游为内切葡聚糖酶2终止子Teg2；bgl1基因其上游为外切葡聚糖酶1启动子Pcbh1，下游为外切葡聚糖酶1终止子Tcbh1；所述egl2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述bgl1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶编码基因egl2和β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1来自里氏木霉RUT-C30基因组；所述的eg2的启动子Peg2和终止子Teg2来源于里氏木霉QM9414；所述的bgl1基因的启动子Pcbh1和终止子Tcbh1来源于质粒PTHB。

4.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌在发酵生产纤维素酶中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵生产纤维素酶的方法是：

将基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5接种到装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，得发酵种子液；将得到的种子液先抽滤收集湿菌丝，再按0.5-1g湿菌丝转接到100mL发酵培养基的比例扩大接种，继续培养120-168h，然后以9000-13000rpm，4℃离心5-10min收集上清液，即得到含纤维素酶的酶液；其中，

所述种子培养基的组成成分为：葡萄糖10g/L，玉米粉15g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄15g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L；

所述发酵培养基的组成成分为：结晶纤维40g/L，玉米浆20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄，5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCl₂ 0.6g/L，CaCO₃ 2.5g/L，甘油2.5g/L，Tween-802g/L。

6.权利要求1所述的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌发酵产生酶液在水解玉米芯材料中的应用。