CN113913443A - 一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法 - Google Patents

一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，是制备利用纤维素诱导型启动子Pegl2过表达转录调控因子xyr1基因的表达盒，将其转化到里氏木霉QEB4菌株中得到高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株QE2X，并利用该工程菌株发酵制备高活性的纤维素水解酶。实验证实利用本发明方法生产的纤维素水解酶活性为34.9IU/mg，显著高于出发菌株QEB4(10IU/mg)，酶系各组分均大幅提升，并且β‑葡萄糖苷酶的酶活为92.4IU/mg，为出发菌株的2.83倍。本发明具有良好的工业开发和应用前景。

Description

一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活 的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株。
背景技术
木质纤维素生物质作为地球上的可再生资源之一，其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，资源丰富。木质纤维素分解酶水解生物质是将生物质转化为可发酵糖以生产生物燃料的有效方法。但是，在实际应用中纤维素水解酶较高的生产成本极大地影响了最终产品的价格和竞争力。为了解决该问题，亟需提升产纤维素水解酶菌株的生产能力。
目前用来提升纤维素水解酶产量的方法主要有：发酵工艺优化、菌株诱变，以及利用基因工程技术构建工程菌株等；其中通过基因工程技术优化酶系组分是提升纤维素水解酶产量的最常用的方法之一。然而根据现有的文献记载，在提升酶活方面，操纵主要纤维素水解酶基因的表达远不如改造纤维素酶转录调控因子有效。同时影响纤维素水解酶生产成本的另一个因素是酶系中β-葡萄糖苷酶的不足，β-葡萄糖苷酶的缺乏导致纤维素水解过程中纤维二糖的积累，这会抑制外切纤维素酶的活性，进而导致整个酶系效率的降低。
丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)由于其强大的分泌纤维素水解酶的能力而被认为是生产生物燃料的主要细胞工厂，其存在一个强大且复杂的转录调控网络，控制着纤维素水解酶基因的表达。到目前为止，已经发现了至少四个转录激活因子(Xyr1、Ace2、Ace3和Hap2/3/5复合体)以及三种转录抑制因子(Ace1、Cre1、Rce1)，这些转录因子在纤维素水解酶的生物合成中发挥重要功能。通过对里氏木霉纤维素水解酶基因表达的转录调控网络进行改造，有望能够降低生物酶制剂的成本；然而实验发现通过改造转录调控因子提升纤维素水解酶活的方法即便有效，但是对β-葡萄糖苷酶的提升作用不明显。经检索，在提升纤维素水解酶产量实际的应用中对于包括Xyr1在内的转录因子改造的文献或成熟的技术方案以及具体的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株还鲜见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法和其专用工程菌株。
本发明所述的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，步骤是：
(1)以里氏木霉QEB4基因组为模板，利用引物对Egl2-F/Egl2-R扩增含有纤维素诱导型启动子的核苷酸序列，该启动子命名为Pegl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；以里氏木霉QEB4基因组为模板扩增xyr1基因及其终止子区域，利用引物对Hph-UF/Hph-UR、Hph-DF/Hph-DR分别扩增hph基因的上下游同源臂，然后将其上游同源臂、抗性基因prtA、Pegl2、xyr1基因及其终止子、下游同源臂按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒；其中所述的ptrA抗性基因扩增于质粒T-ptrA，所述引物的核苷酸序列如下：
Egl2-F：AAACACCTCGCTCCAGTGC；
Egl2-R：TGTCGATGACGGGGAGATAT；
Hph-UF：GCTGTTCTCCAAGGCGTCA；
Hph-UR：AACAAAGATGCAAGAGCGGGGAGCCGAGAGGGTAGTAATG；
Hph-DF：AGAAAGGCATTTAGCAAGAAGG；
Hph-DR：TTCAGGGCGAAGCTGTCC；
(2)将步骤(1)构建的制得Pegl2-xyr1过表达盒转化到里氏木霉QEB4菌株中，得到纤维素水解酶活性提高的里氏木霉工程菌株，该菌株命名为QE2X；
(3)将工程菌株QE2X在设定的发酵培养基中培养，发酵条件为32±2℃、220±20r/min，发酵过程中定时检测纤维素水解酶活性；其中，所述发酵培养基配方是：微晶纤维素25-35g/L，CaCl2 1-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g/L，KH2PO4 3-5g/L，(NH4)2SO4 2-4g/L，CaCO3 0.5-1.0g/L，玉米浆10-20g/L，FeSO4·7H2O 0-0.02g/L，MnSO4·H2O 0-0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0-0.005g/L，CoCl2·2H2O 0-0.01g/L，pH 4.0-6.0。
上述利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法中：所述工程菌株QE2X的发酵条件优选为32℃、220r/min，发酵培养基配方优选是：微晶纤维素30g/L，CaCl21.2g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KH2PO4 5g/L，(NH4)2SO4 3g/L，CaCO3 0.8g/L，玉米浆15g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.0032g/L，ZnSO4·7H2O 0.0014g/L，CoCl2·2H2O0.004g/L，pH 5.0。
本发明还提供了一种用于提高纤维素水解酶活的纤维素诱导型启动子，其特征在于，所述启动子命名为Pegl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种用于提高纤维素水解酶活的过表达盒，其特征在于，所述过表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒，该表达盒内基因组成顺序为：hph基因的上游同源臂、抗性基因prtA、启动子Pegl2、xyr1基因及其终止子、hph基因的下游同源臂。
本发明还提供了一种具有高纤维素水解酶酶活的里氏木霉工程菌株，其特征在于：所述工程菌株命名为QE2X，该菌株是以里氏木霉QEB4为出发菌株，利用纤维素诱导型启动子Pegl2表达xyr1基因的菌株；在其基因组中xyr1基因被整合到hph位点上，其中xyr1基因的上游为纤维素诱导型启动子Pegl2，下游为xyr1本源的终止子，抗性基因ptrA位于上游同源臂和启动子Pegl2之间。
本发明公开的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法所具有的显著优点和有益效果体现在：
实验证实，利用本发明方法生产的纤维素水解酶活力明显增强，酶系各组分均得到显著提升，其中工程菌株QE2X的外切纤维素酶活力为6.8IU/mg，比出发菌株QEB4(2.7IU/mg)提高了2.52倍；工程菌株QE2X的内切纤维素酶活力为93.5IU/mg，比出发菌株(34IU/mg)提高了2.75倍；工程菌株QE2X的滤纸酶活力为34.9IU/mg，显著高于出发菌株QEB4(10IU/mg)，其滤纸酶活提高了3.49倍；并且β-葡萄糖苷酶的酶活为92.4IU/mg，比出发菌株提高了2.83倍。表明利用本发明方法所获取的工程菌株能够显著提高里氏木霉纤维素水解酶活力。
本发明公开的提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法使生产的纤维素水解酶产量提高，极大地提升了纤维素水解酶的水解效率，且公开的经优化后的发酵条件和培养基使发酵时间成本和经济成本也显著降低，能够全面而高效的应用于生物燃料的生产，具有良好的工业开发和应用前景。
附图说明
图1.高纤维素水解酶活的里氏木霉工程菌株的构建和验证。
其中：A是Pegl2-xyr1过表达菌株里氏木霉工程菌株QE2X构建的示意图；B是工程菌株QE2X的xyr1基因转录水平分析；QEB4为出发菌株。
图2.工程菌株的纤维素水解酶活力平板检测图。
图3.工程菌的纤维素酶活力测定结果。
其中：A是外切纤维素酶活力测定结果；B是内切纤维素酶活力测定结果。
图4.工程菌的β-葡萄糖苷酶活力和滤纸酶活力测定结果。
其中：A是β-葡萄糖苷酶活力测定结果；B是滤纸酶活力测定结果。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所涉及的菌株里氏木霉QEB4已在Qian,Y.,Zhong,L.,Gao,J.,Sun,N.,Wang,Y.,Sun,G.,Qu,Y.,&Zhong,Y.(2017).Production of highly efficientcellulase mixtures by genetically exploiting the potentials of Trichodermareesei endogenous cellulases for hydrolysis of corncob residues.Microbialcell factories,16(1),207.https://doi.org/10.1186/s12934-017-0825-3中公开，其构建方法见该篇文献。其他所使用的材料、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1.转录调控因子xyr1过表达盒的构建。
以里氏木霉QEB4的基因组DNA为模板，使用引物对Egl2-F/Egl2-R扩增纤维素诱导型启动子Pegl2(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，使用引物对Xyr1-F/Xyr1-R扩增xyr1基因及其终止子区域，使用引物对Hph-UF/Hph-UR和Hph-DF/Hph-DR扩增hph基因的上下游同源臂；并且使用引物对ptrA-F1/ptrA-R1从T-ptrA质粒中扩增ptrA表达盒。然后将hph基因的上游同源臂、抗性基因prtA、Pegl2、xyr1基因及终止子、hph基因的下游同源臂进行融合，融合PCR程序为：Buffer酶25μl、dNTP 1μl、Phata酶1μl、片段共5μg并用ddH2O补足50μl；融合程序为：95℃预变性5min，94℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸5min进行10个循环，72℃延伸5min，得到表达盒，该表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒；表达盒示意图见图1A所示。
上述引物对具体核苷酸序列如下：
Egl2-F：AAACACCTCGCTCCAGTGC
Egl2-R：TGTCGATGACGGGGAGATAT
Hph-UF：GCTGTTCTCCAAGGCGTCA
Hph-UR：AACAAAGATGCAAGAGCGGGGAGCCGAGAGGGTAGTAATG
Hph-DF：AGAAAGGCATTTAGCAAGAAGG
Hph-DR：TTCAGGGCGAAGCTGTCC
Xyr1-F：ATATCTCCCCGTCATCGACAATGTTGTCCAATCCTCTCCGT
Xyr1-R：CCTTCTTGCTAAATGCCTTTCTCTGCACGCATCATAGAATCG
PtrA-F：CCGCTCTTGCATCTTTGTT
PtrA-R：TGAACCGATTGCTGCGATCCCCAGGCTTTACACTTTAT。
实施例2.利用Pegl2-xyr1过表达盒转化里氏木霉QEB4菌株构建高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株
里氏木霉QEB4的遗传转化是利用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法，吡啶硫胺素抗性基因ptrA为选择标记。
将纯化的Pegl2-xyr1过表达盒转化里氏木霉QEB4原生质体构建高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株QE2X。其中所述PEG/CaCl2介导的原生质体转化的具体方法如下：
(1)里氏木霉QEB4原生质体的制备：
准备新鲜的里氏木霉孢子(2周之内)，涂布于5-6个铺有玻璃纸的PDA平板上，每个平板涂布150μL浓度为108个/mL的孢子悬液。32℃培养14h，待菌丝生长到合适的长度后，将菌丝从玻璃纸上轻轻洗到细胞壁裂解液中(0.15g裂解酶溶解到15mL溶液I)，混匀后32℃静置裂解90min；将裂解物用四层擦镜纸过滤，50mL离心管收集滤液；将滤液4℃，3,000rpm离心9min，弃上清；用溶液II将轻轻地重新悬浮沉淀，4℃,3,000rpm再次离心9min后弃上清；加入200-800μL溶液II重悬浮沉淀，其置于冰上以备后续实验。整个制备原生质体细胞的过程需在冰上进行，所用枪头应剪掉头部。
其中上述PDA培养基组成为：土豆300g，加水煮沸2h，8层纱布过滤，滤液添加葡萄糖20g，并补足水分至1L，自然pH，2％琼脂粉，115℃灭菌30min；
上述溶液I：1.2M山梨醇，0.1M KH2PO4，pH 5.6，115℃灭菌30min；
上述溶液II：1M山梨醇，50mM CaCl2.2H2O，10mM Tris-HCl，pH 7.5，115℃灭菌30min。
(2)Pegl2-xyr1过表达盒转化里氏木霉QEB4菌株获得高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株：
将Pegl2-xyr1过表达盒、预冷的PEG溶液、QM53原生质体按体积比1:5:25的比例混合，冰浴30min，后在混合液中加2mL预热的PEG溶液，37℃水浴5min，最后加4mL溶液II，轻轻混匀；将上述溶液加入到含0.5μg/mL吡啶硫胺素氢溴酸盐(购自Sigma公司)的50mL转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，冷却凝固后，32℃培养5-6天，挑选转化株进行分子验证，将验证正确的工程菌株命名为高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株QE2X。
其中上述PEG培养基为：25％PEG 6000，50mM CaCl2.2H2O，10mM Tris-HCl，pH7.48。
上述转化上层培养基(g/L)：葡萄糖10，MgSO4·7H2O 1，KH2PO4 10，(NH4)2SO4 6，C6H5Na3O7 3，山梨醇182.18，琼脂糖6；
上述转化下层培养基(g/L)：葡萄糖10，MgSO4·7H2O 1，KH2PO4 10，(NH4)2SO4 6，C6H5Na3O7 3，琼脂粉20；以上培养基均经115℃灭菌30min后使用。
实施例3.高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株的纤维素酶转录调控因子xyr1基因的转录水平分析
将实施例2获得的高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株QE2X与出发菌株QEB4按108个/mL分别接种到50mL(250mL的三角瓶)种子培养基中，摇瓶培养40小时后分别取10mL各自接种到发酵培养基中，32℃，220rpm摇瓶培养72h，抽滤收集菌丝体并提取RNA，并进行反转录qPCR分析。结果如图2A所示，显示QE2X中的xyr1的转录量显著提升，与出发菌株相比提高了4倍。进一步表明，Pegl2-xyr1过表达盒成功整合到基因组中且xyr1实现了高水平表达。
其中上述种子培养基为(g/L)：葡萄糖10，微晶纤维素5，CaCl2 1.2，MgSO4·7H2O0.7，KH2PO4 10，(NH4)2SO4 1.5，115℃灭菌30min。
其中上述发酵培养基为(g/L)：微晶纤维素30，CaCl2 1.2，MgSO4·7H2O 0.7，KH2PO45，(NH4)2SO4 3，CaCO3 0.8，玉米浆15，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.0032，ZnSO4·7H2O0.0014，CoCl2·2H2O 0.004，pH 5.0，115℃灭菌30min。
实施例4.高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株的纤维素酶活性平板分析
将实施例2获得的工程菌株QE2X和出发菌株里氏木霉QEB4，利用纤维素平板培养基检测方法对转化株酶活力进行检测，具体方法是：取等量菌丝接种至纤维素平板上，32℃培养5d后，观察菌落周围的水解圈的形成。如图2所示，QE2X菌落周围的水解圈明显大于出发菌株的水解圈，说明工程菌株QE2X的纤维素酶活性得到显著提升。
其中上述纤维素平板培养基(g/L)组成为：球磨微晶纤维素10，KH2PO4 15，(NH4)2SO4 6，CaCl2·2H2O 0.6，MgSO4·7H2O 0.6，Peptone 2，FeSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O0.0016，ZnSO4·7H2O 0.0014，CoCl2·2H2O 0.002，pH 6.0，琼脂粉6，115℃灭菌30min。
实施例5.高纤维素水解酶活里氏木霉工程菌株的酶活性测定
将实施例2获得的工程菌株QE2X与出发菌株QEB4(108个/mL)分别接种到50mL(250mL的三角瓶)种子培养基中，32℃，220rpm培养40小时后，每株取10mL菌液分别转接到100mL发酵培养基中培养7d后取发酵液，离心，取上清，测定纤维素水解酶活力。
图3A显示工程菌株QE2X的外切纤维素酶活力为6.8IU/mg，比出发菌株(2.7IU/mg)提高了2.52倍；图3B显示工程菌株QE2X的内切纤维素酶活力为93.5IU/mg，比出发菌株(34IU/mg)提高了2.75倍；图4显示工程菌株QE2X的滤纸酶活力为34.9IU/mg，显著高于出发菌株QEB4(10IU/mg)，其滤纸酶活提高了3.49倍；并且β-葡萄糖苷酶的酶活为92.4IU/mg，比出发菌株提高了2.83倍。表明利用本发明方法所获取的工程菌株能够显著提高里氏木霉纤维素水解酶活力。
基于此，可以确定本发明公开的利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法不仅显著提升了纤维素水解酶的产量，并且能够弥补酶系中β-葡萄糖苷酶活性的不足。该方法具有较高的理论研究意义和实际应用价值。
上述滤纸酶活力、内切纤维素酶活力、外切纤维素酶活力、β-葡萄糖苷酶活力依据中华人民共和国轻工业标准QB 2583-2003测定执行。
1)滤纸酶活力测定方法：
将1×6cm(50±1mg)滤纸折叠放入试管底部，加入1.5mL pH 4.8的柠檬酸缓冲液和0.5mL适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴60min后加入3mL DNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25mL，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。
2)内切纤维素酶活力测定方法：
取CMC-Na溶液(0.67％)2.00mL，加入0.5mL适当稀释的酶液，混匀。50℃反应30min后加入3mL DNS，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25mL，摇匀，540nm测OD值。空白对照是先加DNS再加酶液。
酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，将每分钟产生1μmoL葡萄糖所需的酶量定为一个酶活力单位。
3)外切纤维素酶活力(pNPCase)测定方法：
取100μL适当稀释的酶液，加入50μL 10mmol/L对硝基苯基-D-纤维二糖苷(pNPC)柠檬酸Buffer溶液(pH 4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μL 10％Na2CO3终止反应。405nm测OD值。同时以未加酶液的管为空白对照。
4)β-葡萄糖苷酶活力(pNPGase)测定方法：
取100μL适当稀释的酶液，加入50μL 10mmol/L对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)柠檬酸Buffer溶液(pH 4.8)，混匀，50℃水浴30min后加入150μL 10％Na2CO3终止反应。405nm测OD值。同时以未加酶液的管为空白对照。
酶活的定义：在50℃、pH4.8条件下，每毫升酶液每分钟产生对硝基酚(pNP)的微摩尔数。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> 一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法
<141> 2021-12-04
<160> 1
<210> 1
<211> 2007
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 纤维素诱导型启动子Pegl2核苷酸序列
<222>（1）…（2007）
<400> 1
aaacacctcg ctccagtgct ggtgccgcca cggttaacat caagacagga cgacagagga 60
gaatgtcaac aagatcaggg agaaatttgg cgaccatgtt atcattgaca ttgtcaacta 120
agcttagagc tgatgattag gggagaacag tagggatgcc atttatgggc tcgtggtata 180
taatggccgg caatcaggac aggatggtcc gacgggaaac atacagagtg aaacagggac 240
tctgggaatt gatataaaac aagaagacca tagatgaata tattcgaacg tgcgtgacat 300
tgccaccacg ctgaaattgc tatcccatat cttttgcgac atctgtctgt gcacgtggag 360
ggcgtaaatc gaactcctcg taaaaaagac atcaaagcaa aacatatcag tatctacgcc 420
cagggtataa tagtagcctt ggccatacag tcttcggtca gcgagctgtc agtaaattgt 480
ctaagacaag aaatcgggtg tttaggtaat tgctggaggg ggggggggcg gcctgcagag 540
caaacgagtg tctgcggaga gtcgcggtgc gaaaaataac aggctagccg gctttggaag 600
tagttaattt ctgctatgtg tcttcttccc ggcaactcag acctacaggc aatgtactat 660
caaagagaag caaaagggtt tcaggatata tcacctggca caatgcatat ccctgatgat 720
gtacgcttcg tgagtcttgc aaccttgcac acgaaccaac atggcgcgct aaatcaagtg 780
ataacagact ccacggggta ctagaccaac ctcaacatag cggacaggaa agcgaatcaa 840
tgatccagat agacgaagga tgaacgcttt gggagcgtat gaagcccacc ggttacgaaa 900
gattgtcatc ccaagagctc gtgagtaagg caggacggtt tattttatta ttcacactct 960
cagaataaat tcatcgccaa tttgacaccg tcactgaaag cctgctacac ttagactttg 1020
ccagtcagac gtgtaggaga tataggctct ctattcatca accttcgagc cgttacagat 1080
gcattaagcc tgtacgagaa caacacatcc gttaggctat aaatccagga acgaaaactg 1140
gttgtctacc gtcttgtcac cgacccatga agaacttttt ttggctgaat ggtgtcgtct 1200
ttatcaagca cctaggtatg attcggcttc ccggtggggt gagtcgcatc gacaattttg 1260
ccgaccggtt ataccgcaag tgcctgagtg aagattgagc ttaaacatga tgctattcta 1320
gcatgtaacc ctattgcgaa gtttgtcact aactcctttg cctcaaaacg gaggttgata 1380
tgagcaacaa tttagtatta cccctgggtg taatcttgag ggagcaacct gtggctgatg 1440
ggaaggtcaa agagccggga acgcgttatt caggctcaat acgtattgtt gtgcaaacag 1500
taactcaggg aacctaccag gatcgtccgg ccaagcattg cttgcttggt gctgtcactt 1560
gcgctggtgt aaagtcgctg cgaagaagaa agctatacta cttgtacaat gtcagatcag 1620
tctgctatgc aggtcataga acgtcaagtg atcgaggaga aatttttcag actataaata 1680
cattgttggc ggctacattc tccacggatg tgattgaggt actgtgaaga gtgggatatc 1740
agcaattgcc atttctgacc tggataggtt ttcctatggt cattcctata agagacacgc 1800
tctttcgtcg gcccgtagat atcagattgg tattcagtcg cacagacgaa ggtgagttga 1860
tcctccaaca tgagttctat gagccccccc cttgcccccc cccgttcacc ttgacctgca 1920
atgagaatcc caccttttac aagagcatca agccgtatta atggcgctga atagcctctg 1980
ctcgataata tctccccgtc atcgaca 2007
1

Claims (5)

1.一种利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，步骤是：
(1)以里氏木霉QEB4基因组为模板，利用引物对Egl2-F/Egl2-R扩增含有纤维素诱导型启动子的核苷酸序列，该启动子命名为Pegl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；以里氏木霉QEB4基因组为模板扩增xyr1基因及其终止子区域，利用引物对Hph-UF/Hph-UR、Hph-DF/Hph-DR分别扩增hph基因的上下游同源臂，然后将其上游同源臂、抗性基因prtA、Pegl2、xyr1基因及其终止子、下游同源臂按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒；其中所述的ptrA抗性基因扩增于质粒T-ptrA，所述引物的核苷酸序列如下：
Egl2-F：AAACACCTCGCTCCAGTGC；
Egl2-R：TGTCGATGACGGGGAGATAT；
Hph-UF：GCTGTTCTCCAAGGCGTCA；
Hph-UR：AACAAAGATGCAAGAGCGGGGAGCCGAGAGGGTAGTAATG；
Hph-DF：AGAAAGGCATTTAGCAAGAAGG；
Hph-DR：TTCAGGGCGAAGCTGTCC；
(2)将步骤(1)构建的制得Pegl2-xyr1过表达盒转化到里氏木霉QEB4菌株中，得到纤维素水解酶活性提高的里氏木霉工程菌株，该菌株命名为QE2X；
(3)将工程菌株QE2X在设定的发酵培养基中培养，发酵条件为32±2℃、220±20r/min，发酵过程中定时检测纤维素水解酶活性；其中，所述发酵培养基配方是：微晶纤维素25-35g/L，CaCl2 1-1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g/L，KH2PO4 3-5g/L，(NH4)2SO4 2-4g/L，CaCO30.5-1.0g/L，玉米浆10-20g/L，FeSO4·7H2O 0-0.02g/L，MnSO4·H2O 0-0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0-0.005g/L，CoCl2·2H2O 0-0.01g/L，pH 4.0-6.0。
2.根据权利要求1所述利用纤维素诱导型启动子提高里氏木霉纤维素水解酶活的方法，其特征在于：所述工程菌株QE2X的发酵条件为32℃、220r/min，发酵培养基配方是：微晶纤维素30g/L，CaCl2 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，KH2PO4 5g/L，(NH4)2SO4 3g/L，CaCO30.8g/L，玉米浆15g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.0032g/L，ZnSO4·7H2O0.0014g/L，CoCl2·2H2O 0.004g/L，pH 5.0。
3.一种用于提高纤维素水解酶活的纤维素诱导型启动子，其特征在于，所述启动子命名为Pegl2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种用于提高纤维素水解酶活的过表达盒，其特征在于，所述过表达盒命名为Pegl2-xyr1过表达盒，该表达盒内基因组成顺序为：hph基因的上游同源臂、抗性基因prtA、启动子Pegl2、xyr1基因及其终止子、hph基因的下游同源臂。
5.一种具有高纤维素水解酶酶活的里氏木霉工程菌株，其特征在于：所述工程菌株命名为QE2X，该菌株是以里氏木霉QEB4为出发菌株，利用纤维素诱导型启动子Pegl2表达xyr1基因的菌株；在其基因组中xyr1基因被整合到hph位点上，其中xyr1基因的上游为纤维素诱导型启动子Pegl2，下游为xyr1本源的终止子，抗性基因ptrA位于上游同源臂和启动子Pegl2之间。
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