MXPA06005705A - Sistemas de expresion mejorada con secrecion de sistema de sec. - Google Patents
Sistemas de expresion mejorada con secrecion de sistema de sec.Info
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Abstract
Juguetes y sistemas de operacion de juguetes, para usarlos en ellos. Un sistema de operacion de juguetes puede incluir un sistema de entrada, que responde a una caracteristicas cuantitativa predeterminada de un cuerpo liquido, tal como su conductividad electrica, y un sistema de respuesta, acoplado al sistema de entrada y configurado para generar uno o mas patrones de salida de juguete, basados por lo menos en parte, en las caracteristicas dadas. Un vehiculo de juguete para uso con dicho sistema de operacion puede incluir un chasis, una camara adaptada para contener un cuerpo liquido, y por lo menos un componente de juguete, operable para desplegar una salida de acuerdo con un patron de salida generado. Los componentes de juguete de ejemplo incluyen un ensamble audiovisual para producir un despliegue audiovisual y un ensamble accionador, para mover le vehiculo de juguete a traves de una superficie de terreno.
Description
"SISTEMAS DE EXPRESIÓN M EJORADA CON SECRECIÓN DE SISTEMA DE SEC"
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de E.U. No. 60/524, 124, presentada el 21 de Noviembre de 2003, titulada "Improved Expression Systems With Sec-System Secretion" ("Sistemas de Expresión Mejorada con Secreción de Sistema de Sec").
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se encuentra en el campo de la producción de proteínas y es un método mejorado para producir proteínas heterólogas procesadas apropiadamente al utilizar péptidos objetivo de Sec y el sistema de secreción de Sec de Pseudomonas fluorescens.
ANTECEDENTES DE LA INVNECIÓN Más de 150 proteínas y péptidos producidos recombinantemente han sido aprobados por la Administración de Alimentos y Drogas de E. U . (FDA - U.S. Food and Drug Administration) para su uso como drogas y vacunas biotecnológicas, junto con otros 370 en pruebas clínicas. A diferencia de los agentes terapéuticos de molécula pequeña que se producen mediante síntesis química, las proteínas y los péptidos se producen muy eficazmente en células vivas. Sin embargo, los métodos actuales de producción de proteínas recombinantes en bacterias frecuentemente producen proteínas inactivas, agregadas o inapropiadamente desplegadas, y muchos tipos de proteínas requieren modificaciones secundarias que se alcanzan ineficazmente utilizando métodos conocidos. Un problema básico con los métodos conocidos yace en la formación de cuerpos de inclusión elaborados de proteínas agregadas en el citoplasma, lo cual ocurre cuando se acumula una cantidad en exceso de proteína en la célula. Otro problema en la producción de proteínas recombinante es establecer la conformación apropiada secundaria y terciaria para las proteínas expresadas. Una barrera es que el citoplasma bacteria resiste activamente la formación de enlaces de bisulfuro, lo que frecuentemente subyace un pliegue de proteínas apropiado (Derman et al. (1993) Science 262: 1 744-7). Como resultado, muchas proteínas recombinantes, particularmente aquellas de origen eucariótico, se pliegan inapropiadamente y son inactivas cuando se producen en bacterias. Se han desarrollado números intentos por incrementar la producción de proteínas plegadas apropiadamente en sistemas recombinantes. Por ejemplo, los investigadores han cambiado las condiciones de fermentación (Schein (1 989) Bio/Technology, 7: 1 141 -1 149), resistencia de activador variada, o proteínas de chaperona sobreexpresada utilizadas (Hockney (1994) Trends Biotechnol. 12:456-463), que pueden ayudar a evitar la formación de cuerpos de inclusión.
Secreción Un planteamiento alternativo para incrementar la cosecha de proteínas plegadas apropiadamente es segregar la proteína del ambiente intracelular. En las bacterias Gram-negativas, una proteína segregada del citoplasma puede terminar en el espacio periplásmico, anexa a la membrana exterior, o en el caldo extracelular. Los cuerpos de inclusión, elaborados de proteínas agregadas normalmente no se encuentran formadas si las proteínas se segregan fuera del citoplasma de la célula. La secreción en el espacio periplásmico tiene también el efecto conocido para facilitar una formación apropiada de enlace de bisulfuro (Bradwell et al. (1994) Phosphate Microorg. (Microorganismos de Fosfato) 270-5; Mandil (2000) Methods in Enz. (Métodos en Enz.) 326: 35-47). La secreción de la proteína recombinante es atractiva porque puede dar como resultado un aislamiento más eficiente de la proteína; puede mejorar el pliegue apropiado y la formación de enlaces de bisulfuro de la proteína transgénica, llevando a un incremento en el porcentaje de la proteína en forma activa; puede dar como resultado la formación reducida de los cuerpos de inclusión y toxicidad reducida a la célula huésped; y puede proporcionar un porcentaje creciente de la proteína recombinante en forma soluble. El potencial para la excreción de la proteína de interés en el medio de cultivo puede también mejorar potencialmente un cultivo continuo en lugar de por lotes para la producción de proteínas. Las bacterias gram-negativas han desarrollado numerosos sistemas para la exportación activa de proteínas a través de sus membranas dobles (ver la Figura 1 ). Estas rutas de secreción incluyen, por ejemplo: la trayectoria ABC (Tipo I), la trayectoria Trayectoria/Fia (Tipo l l l), y la trayectoria Trayectoria/Vir (Tipo IV) para un desplazamiento en un paso a través tanto del plasma como de la membrana exterior; las trayectorias de Sec (Tipo I I), tat, MscL, y Holinas para el desplazamiento a través de la membrana de plasma; y las trayectorias de Sec más porina acomodadora fimbria! (FUP - fimbrial usher porin), Sec más autotransportadora (AT - autotransporter), Sec más dos secreciones socias (TPS - two partner secretion), Sec más rama terminal principal (MTB - main terminal branch), y Tat más MTB para desplazamientos en dos pasos a través de las membranas de plasma y exteriores. No todas las bacterias tienen todas estas trayectorias de secreción. Los sistemas de tres proteínas (tipos I, l l l y IV) segregan proteínas a través de ambas membranas en un solo paso de acoplamiento de energía. Cuatro sistemas (Sec, Tat, MscL, y Holinas) segregan solamente a través de la membrana interior, y otros cuatro sistemas (MTB, FUP, AT y TPS) segregan solamente a través de la membrana exterior. La forma más común de secreción de péptidos con una secuencia de señal involucra el sistema de Sec. El sistema de Sec es responsable de la exportación de proteínas con los péptidos de señal terminales en N a las membranas citoplásmicas (ver Agarraberes y Dice (2001 ) Biochim Ciophys Acta. 1513: 1 -24, Müller et al. (2001 ) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 66: 107-1 57). Los complejos proteínicos de la familia Sec se encuentran universalmente en procariotas y eucariotas. El sistema de Sec bacterial consiste de proteínas de transporte, una proteína chaperona (SecB) o una partícula de reconocimiento de señales (SRP - signal recognition particle) y peptidasas de señal (SPasa I y SPasa I I). El complejo de transporte de Sec en E. coli consiste en tres proteínas de membrana interior integral, SecY, SecE y SecG, y la ATPasa citoplásmica, SecA. La SecA recluta complejos de SecY/E/G para formar el canal de desplazamiento activo. La SecB de la proteína chaperona se une a la cadena naciente de polipéptidos a fin de evitar que se pliegue y selecciona como objetivo a SecA. La cadena de polipéptido lineal se transporta subsecuentemente por el canal SecYEG y, después de la segmentación del péptido de señal, la proteína se pliega en el periplasma. Tres proteínas auxiliares (SecD, SecF y YajC) forman un complejo que no es esencial para la secreción pero estimula la secreción hasta diez veces bajo muchas condiciones, particularmente a bajas temperaturas. Las proteínas que se transportan en el periplasma, es decir, por un sistema de secreción de tipo II, también pueden exportarse al medio extracelular en un paso adicional. Los mecanismos generalmente pasan por un autotransportador, un sistema de secreción de dos asociados, un sistema de ramificación terminal principal o una porina acomodadora fimbrial. De los doce sistemas de secreción conocidos en las bacterias gram-negativas, ocho son conocidos por utilizar péptidos de señal de selección como objetivo encontrados como parte de la proteína expresada. Estos péptidos de señal interactúan con las proteínas de los sistemas de secreción de manera que la célula dirige apropiadamente la proteína a su destino apropiado. Cinco de estos sistemas de secreción basados en péptidos de señal son aquellos que involucran el sistema de Sec. Estos cinco referidos se encuentran involucrados en el desplazamiento de membrana citoplásmica dependiente de Sec y sus péptidos de señal operativos en su interior pueden ser referidos como señales de secreción dependientes de Sec. Uno de los temas para desarrollar una señal de secreción apropiada es asegurar que la señal se expresa y se segmenta apropiadamente de la proteína expresada. Una firma de exportación de proteínas dependientes de Sec es la presencia de una breve (aproximadamente 30 aminoácidos) secuencia de señales amino-terminales básicamente hidrofóbicas en la proteína exportada. La secuencia de señales ayuda a la exportación de proteínas y detiene su segmentación por una peptidasa de señal periplásmica cuando la proteína exportada alcanza el periplasma. Un típico péptido de señal de Sec terminal en N contiene un dominio en N con al menos un residuo de arginina o lisina, seguida de un dominio que contiene un tramo de residuos hidrofóbicos, y un dominio en C que contiene el sitio de segmentación para las peptidasas de señal. Se han desarrollado sistemas bacteriales de producción de proteínas en los cuales se diseñan construcciones como proteínas de fusión que contienen tanto una proteína de interés y una señal de secreción en un intento por seleccionar como objetivo la proteína a partir del citoplasma. Se han desarrollado estrategias para excretar proteínas desde la célula hacia el sobrenatátil. Por ejemplo, la Patente de E. U. No. 5,348,867 por Georgiou se enfoca en la expresión de péptidos en la superficie de la célula. La Patente de E.U. No. 6,329, 1 72 para el Instituto de Ciencias y Tecnologías Avanzadas de Corea describe un transportador de ABC en Pseudomonas fluorescens y un método para excretar las proteínas extracelularmente mediante el uso de este transportador co-expresado con una proteína de interés. La Publicación de PCT No. WO 96/17943 para Novo Nordsk se enfoca en la expresión extracelular de proteínas provenientes de la célula por fuga del periplasma, utilizando porciones de la secuencia de la proteasa I de A. lyticus o de algunas proteasas de Bacillus vinculadas con las proteínas de interés para seleccionarlas como objetivo al periplasma. La Publicación de PCT No. WO 02/40696 y la Publicación de Solicitud de E. U. 2003/00131 50, para Boehringer Ingelheim, Int. , describen la expresión extracelular de las proteínas que utilizan el péptido de señales bacteriales OmpA. Estas publicaciones enseñan que OmpA interactúa con SecE sola o en combinación con las proteínas o péptidos que incluyen la secuencia de aminoácidos SEGN. Otras estrategias para la expresión incrementada se refieren a seleccionar como objetivo la proteína al periplasma. Algunas investigaciones se enfocan en la secreción de tipo no Sec (ver, por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 03/079007 para los Albaceas de la Universidad de Pensilvania; Publicación de E. U. No. 2003/01 80937 georgiou, Publicación de E. U. No. 2003/0064435 para Weiner y Turner; y la Publicación de PCT No. WO 00/59537 para la Fundación de Investigación de la Universidad Estatal de Nueva York (Research Foundation of the State University of New York)). Sin embargo, la mayor parte de la investigación se ha enfocado en la secreción de proteínas exógenas con un sistema de secreción de tipo Sec. Un cierto número de señales de secreción se ha descrito para su uso en la expresión de péptidos o proteínas recombinantes. Por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,914,254 para Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Describe la creciente solubilidad y la actividad de proteínas utilizando asociados de fusión y secuencias líderes que se derivan de las proteínas de tipo interleuquina-1 . La Patente de E.U. No. 4,963,495 para Genentech describe la expresión de proteínas eucarióticas, particularmente la hormona del crecimiento humano, con secuencias de señal procariótica como la secuencia de enterotoxina de E. coli. La Patente Europea No. 0 177 343 para Genentech describe la expresión de HGH periplásmica, lo cual puede llevarse a cabo mediante el uso de una secuencia de señales de enterotoxina A P. aeruginosa. Las Patentes de E.U. Nos. 5,082,783 para Biogen describe la expresión de una proteína tal como la somatomedina C, el activador de plasminogen de tejido o el factor de necrosis de tumor derivado de un activador de fuerza intermedia a lo sumo, tal como un activador de actina o de iso-1 -citocromo c operativamente vinculado a una secuencia de señal de ADN, tal como la secuencia de señal de Mfa1 derivada de levadura. La Publicación de PCT No. WO 89/10971 por Pastan, et al., describe la expresión de la endotoxina Pseudomonas en E. coli utilizando una secuencia de señal OmpA, y muestra la expresión diferencial de las porciones de la proteína en el periplasma y el medio. La Patente de E. U . No. 6, 156,552 para Novo Nordisk describe la expresión en E. coli o una P. mendocina deficiente de lipasa de una lipasa de Pseudomonas modificada utilizando una secuencia de señal. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal de E. coli/ phoA. Las Patentes de E. U. Nos. 6,495,357; 6,509, 1 81 ; 6,524,827; 6,528,298; 6,558,939; 6,608,018; y 6,61 7, 143 para Novozyme describen también la producción de lipasas, celulasas, amilasas y otras enzimas, incluyendo las enzimas de origen Pseudomónada, expresadas con secuencias de señal que son preferentemente nativas a la enzima expresada pero también pueden ser, por ejemplo, provenientes de una especie de Rhizomucor, el gen para el a-factor derivado de Saccharomyces cerevisiae o un gen de amilasa o proteasa derivado de una especie de Bacillus. Las Patentes de E.U. Nos. 5,595,898; 5,698,435; y
6,204,023 para Xoma describen la producción de fragmentos de anticuerpos quiméricos que utilizan un péptido de señal de Masa de pectato. Las patentes describen que las enzimas de Masa de pectato son conocidas en diversos organismos, incluyendo P. fluorescens, sin embargo no se proporciona ninguna ejemplificación de estas secuencias. La Patente de E.U. No. 6,258,560 para Genentech describe la expresión de una proteína de asimilación de ADN en E. coli con una secuencia de señal bacteria que es descrita como preferentemente virgen para la proteína pero también puede seleccionarse del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o secuencias líderes de enterotoxina estables térmicamente. La patente también establece que la proteína puede expresarse en Pseudomónadas, sin embargo no se brinda ninguna ejemplificación. Las Publicaciones de PCT Nos. WO 01 /21662, WO 02/068660 y la Publicación de la Solicitud de E. U. 2003/0044906 para Habermann y Ertl y Aventis describen la secreción de los derivados de hirudina provenientes de E. coli. Una de las secuencias de señal descritas es la secuencia derivada de la proteína OprF de Pseudomonas fluorescens. La solicitud identificada en la publicación '662 es la secuencia NTLGLAIGSLIAATSFGVLA, la cual se describió en De (1995) FEMS Micr. Let. 127:263-272. No hay descripción en la publicación de utilizar los plásmidos de expresión en las Pseudomónadas, y el incremento en la expresión de la hirudina que utiliza esta estrategia es solamente marginal en comparación con la expresión de control en E. coli. U.S. 5,641 ,671 para Unilever Patent Holdings B.V. se refiere a la expresión de una lipasa de Pseudomonas derivada de P. glumae con una proteína estabilizadora y preferentemente una secuencia de señal endógena al gen de lipasa. La Patente Europea No. EP 0 121 352 para Atkinson et al. describe una secuencia líder sin cisterna derivada de la carboxipeptidasa RS-16 de la especie Pseudomonas por utilizarse en un vector para acentuar la expresión periplásmica de una proteína. La patente describe que los residuos de cisterna en la secuencia de señal pueden fomentar la interacción con la membrana celular y la secreción inhibida. La secuencia de señal descrita es
MRPSIHRTAIAAVLATAFVAGT. Las estrategias que se basan en las secuencias originales para la selección como objetivóte proteínas fuera del citoplasma frecuentemente producen las proteínas procesadas inapropiadamente. Esto es particularmente cierto para las señales de secreción amino-terminales tales como aquellas que llevan a la secreción mediante el sistema de Sec. Las proteínas que se procesan mediante este sistema frecuentemente mantienen una porción de la señal de secreción, requieren un elemento de vinculación que frecuentemente se segmenta inapropiadamente, o se truncan en el término. Como es aparente a partir de la materia anteriormente descrita, se han desarrollado muchas estrategias para seleccionar como objetivo proteínas al periplasma de una célula huésped. Sin embargo, las estrategias conocidas no han dado como resultado un rendimiento consistentemente alto de proteínas recombinantes activas, procesadas apropiadamente, las cuales pueden purificarse para uso terapéutico. Una limitación importante en estrategias anteriores ha sido la expresión de proteínas con secuencias de señal de mala secreción en sistemas celulares inadecuados. Como resultado, existe aún una necesidad en la materia de sistemas de expresión mejorada a gran escala capaces de segregar y procesar apropiadamente polipéptidos recombinantes a fin de producir proteínas transgénicas en forma procesada apropiadamente. Un sistema ideal produce altos niveles de proteínas solubles y permite la selección como objetivo de esa proteína en el periplasma y potencialmente en el medio extracelular. Un objeto de la invención es proporcionar un sistema y un método para incrementar la expresión de una proteína recombinada procesada apropiadamente en una célula huésped. Otro objeto de la invención es proporcionar un sistema y método para incrementar la expresión de una proteína recombinante activa en una célula huésped. Otro objeto de la invención es proporcionar un sistema a escala comercial con niveles altos de expresión de proteína recombinante procesada apropiadamente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones mejoradas y procesos para producir niveles elevados de proteína recombinante procesada apropiadamente en un sistema de expresión celular. La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la
Pseudomonas fluorescens es una plataforma mejorada para la producción de proteínas segregadas. En particular, P. fluorescens produce sorprendentemente proteínas exógenas seleccionadas como objetivo en su sistema de secreción de Sec a un nivel superior que lo observado típicamente en otros sistemas de expresión bacteriales, y transporta estas proteínas a un nivel más alto en el periplasma de la célula, llevando a una creciente recuperación de proteínas recombinantes totalmente procesadas. La invención incluye señales de secreción recientemente identificadas, derivadas de un organismo Pseudomonas fluorescens, e incluye péptidos, vectores y sistemas de expresión que incorporan estas secuencias, las cuales pueden mejorar la selección como objetivo de una proteína o péptido expresado de interés al periplasma de bacterias Gram-negativas o dentro del ambiente extracelular. La invención incluye también una célula huésped de P. fluorescens que proporciona una producción mejorada de proteína exógena en forma procesada apropiadamente en el periplasma cuando la proteína exógena se expresa en conjunto con una secuencia líder de péptido de señal. En una modalidad, un péptido aislado con una secuencia, que es, o substancialmente es homologa a, un péptido de secreción del sistema de Sec P. fluorescens seleccionado a partir de una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp - phosphate binding protein), una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE - Outer Membrane Porin E), una señal de secreción de la proteína de unión Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de la proteína de unión de hierro (ll l) o una señal de secreción de lipoproteína B. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que se hibridiza a un ácido nucleico con una secuencia que codifica un péptido que incluye una secuencia que es, o que substancialmente es, homologa a un péptido de secreción de sistema de Sec P. fluorescens seleccionado a partir de una pbp, una proteína de unión de OprE, Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (lll) o una señal de secreción de lipoproteína B. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que hibridiza a un ácido nucleico con una secuencia que codifica un péptido que incluye una secuencia que es, o que substancialmente es homologa a, un péptido de secreción de sistema de sec P. fluorescens seleccionado a partir de una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (l ll) o una señal de lipoproteína B. En una modalidad, los ácidos nucleicos hibridizan bajo condiciones severas. En una modalidad , la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a, la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) de al menos los aminoácidos 2-24 de la secuencia de aminoácidos: Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala (NO DE ID DE SEC: 1 ). En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es ai menos 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de acido nucleico: atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc (NO DE ID DE SEC: 2). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 2 se ajusta con base en el uso del codón de un organismo huésped. En otra modalidad, la secuencia de péptido es, o substancial es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-21 de la secuencia de aminoácidos: Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala lie Ala Gln Gln Ala Gly Ala (NO DE I D DE SEC: 3). En una modalidad separada, la secuencia de acido nucleico que codifica al péptido es al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de ácido nucleico: atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca ate gcc cag caá gca ggc gct (NO DE ID DE SEC: 4). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE I D DE SEC: 4 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad , la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de azurina que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-20 de la secuencia de aminoácidos: Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala (NO DE ID DE SEC: 5). En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de ácido nucleico: atg ttt gcc aaa etc gtt gct gtt tcc ctg ctg acg ctg gcg age ggc cag ttg ctt gct (NO DE ID DE SEC: 6). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE I D DE SEC: 6 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de la proteína de unión de Lys-Arg-Orn (LAObp o KRObp) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-23 de la secuencia de aminoácidos: Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala (NO DE ID DE SEC: 7). En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de ácido nucleico: atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc age gcc acg gcc atg gca (NO DE ID DE SEC: 8). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 8 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. Aún en otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de la proteína de unión de hierro (l l l) [Fe(l l l)bp] que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-32 de la secuencia de aminoácidos: Met Met Me Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser (NO DE ID DE SEC: 9). En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de ácido nucleico: atg atg ate cgt gac aac cga etc aag acá tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc etc ce cta etc age ctg acc ctg etc tcg ecc gcg gcc cat tet (NO DE ID DE SEC: 10). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 10 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. Aún en otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de lipoproteína B (LprB) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-1 7 de la secuencia de aminoácidos: Met lie Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala (NO DE ID DE SEC: 1 1 ). En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia de ácido nucleico: atg ate aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg age gct (NO DE ID DE SEC: 12). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 12 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. Otra modalidad es un vector de expresión el cual incluye un ácido nucleico de un péptido de secreción de sistema de Sec P. fluorescens con una secuencia que es, o substancialmente es, homologa a una proteína de unión de pbp, OprE, Lys-Arg-Orn, de proteína de unión de hierro (lll) o una señal de secreción de lipoproteína B, vinculada operativamente a un activador. En otra modalidad, el vector comprende además una secuencia de codificación para la expresión de una proteína o péptido recombinante de interés. En una modalidad, el vector de expresión comprende además una secuencia de etiqueta adyacente a la secuencia de codificación para la señal de secreción o la secuencia de codificación para la proteína o péptido recombinante. Se proporcionan también células que incluyen el vector de expresión. En una modalidad, la célula expresa una proteína recombinante vinculada a una señal de secreción de sistema de Sec P. fluorescens como se describe en la presente. La célula puede expresar la proteína en un compartimiento de periplasma. En algunas modalidades, la célula puede producir proteínas recombinantes extracelularmente mediante una pared celular exterior. En una modalidad, la célula es una célula bacterial, y en algunas sub- modalidades, la célula es una célula de P. fluorescens o una célula de E.coli. En otras modalidades, la célula es una célula eucariótica, y puede ser una célula de levadura, una célula de insecto, una célula de mamífero o una célula vegetal. En una modalidad, la célula huésped es una célula bacterial.
En otra modalidad, la célula es una Pseudomonada y en una modalidad específica, la célula es una célula Pseudomonas fluorescens. En otra modalidad, se proporciona un proceso y sistema mejorado para preparar una proteína recombinante en una célula huésped. La mejora incluye la expresión de un péptido de secreción de sistema de Sec P. fluorescens que es, o es substancialmente, homologa a un péptido seleccionado a partir de una pbp, proteína de unión de OprE, Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (ll l) o una señal de secreción de lipoproteína B, vinculada operativamente a una proteína o péptido recombinante de interés en una célula huésped. En una modalidad, la expresión ocurre en un cultivo celular de alta densidad. La señal de secreción de Sec puede segmentarse de la proteína madura en la célula. En otra modalidad, la señal de secreción no se segmenta y la célula expresa una proteína recombinante vinculada a la señal de secreción. En una modalidad, una secuencia de etiqueta se vincula operativamente a la proteína de interés. En una modalidad separada, se proporciona un proceso para preparar proteínas segregadas exógenas recombinantes al expresar una proteína vinculada a una señal de secreción de sistema de Sec en P. fluorescens. Esta modalidad se basa en el reconocimiento de P.
fluorescens como una plataforma de expresión mejorada para la expresión de las proteínas segregadas. En una modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de un genoma de P. fluorescens, sin embargo en otra modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de un genoma de E. coli. En otras modalidades, la señal de secreción puede ser nativa a la proteína que se expresa. En una modalidad, la célula huésped tiene un periplasma y la expresión del péptido de sistema de Sec puede seleccionar como objetivo la proteína recombinante al periplasma de la célula. En una submodalidad, la expresión lleva a una producción de proteína extracelular. El proceso también puede incluir el paso para purificar la proteína recombinante del periplasma o del medio extracelular. La señal de Sec puede expresar vinculada a la proteína y la proteína vinculada a la señal puede purificarse a partir de la célula. Por lo tanto, en una modalidad, este péptido aislado es una proteína de fusión de la señal de secreción y una proteína o péptido de interés. Sin embargo, la señal de secreción también puede segmentarse de la proteína cuando la proteína se selecciona como objetivo al periplasma. En una modalidad, el enlace entre la señal de secreción de sistema de Sec y la proteína o péptido se modifica para incrementar la segmentación de la señal de secreción. En una modalidad, el proceso puede producir proteínas recombinantes procesadas apropiadamente en la célula. En otra modalidad, la expresión del péptido de sistema de Sec puede producir proteínas recombinantes activas en la célula. El proceso de la invención también puede llevar a incrementar el rendimiento de la proteína recombinante en comparación cuando la proteína es expresada sin la señal de secreción de Sec. En una modalidad, el proceso produce al menos 0.1 g/L de proteína procesada correctamente. En otra modalidad, el proceso produce 0.1 a 1 g/L de proteína procesada correctamente en la célula. En las submodalidades la proteína total producida puede ser de al menos aproximadamente 2.0 a aproximadamente 50.0 g/L. En algunas modalidades, la cantidad de proteína procesada correctamente producida es de al menos aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, o más de la proteína recombinante producida total. La proteína o péptido de interés puede ser una proteína o péptido terapéuticamente útil. En una modalidad, la proteína o péptido se deriva de una especie eucariótica. En otra modalidad, la secuencia de proteínas se deriva de una secuencia de mamífero. En otra modalidad, la forma activa de la proteína incluye al menos un enlace de bisulfuro. Aún en otra modalidad, la proteína o péptido es un derivado de una hormona, un factor de crecimiento, un receptor o ligante extracelular, una proteasa, una quinasa, un proteína sanguínea, una quimioquina o citoquina o un anticuerpo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : Vista general de los sistemas de secreción de proteínas en bacterias Gram-negativas. Cuatro sistemas (Sec, Tat, MscL y holinas) se desplazan solamente a través de la membrana interna. Las proteínas segregadas por el sistema de Sec se encuentran ubicadas en el periplasma, integradas dentro de la membrana exterior, o son transportadas mediante la membrana exterior por uno de los cuatro sistemas de secreción de membrana exterior como se indica con las flechas. Las proteínas desplazadas por el sistema de Tat se encuentran ubicadas básicamente en el periplasma, pero se ha descubierto que unas cuantas proteínas en P. aeruginosa son también exportadas por el sistema de MTB. Las holinas y MscL transportan solamente proteínas en el periplasma. Los sistemas de Tipos I , l ll y IV exportan las proteínas a través de ambas membranas sin intermediario periplásmico alguno. Abreviaturas: FUP, porina acomodadora fimbrial; AT, autotransportadora; TPS, sistema de secreción en dos partes; MTB, rama termina principal; IM (inner membrana), membrana interna; OM (outer membrane), membrana exterior. Figura 2: Construcciones de secreción de gal2 de P. fluorescens. Se muestran mapas de plásmidos para pDOW1 122 y pDOW1 123 (A) pDOW1 122 contiene ia fusión oprF:gal2 (la secuencia de aminoácidos mostrada en B) y pDOW1 123 contiene la fusión de pbp:gal2 (la secuencia de aminoácidos mostrada en C). El * indica el sitio pronosticado de segmentación de peptidasa de señal. Figura 3: Expresión segregada de Gal2. Una imagen de un análisis de SDS-PAGE de muestras de caldo entero (A) derivadas de P. fluorescens que expresan sea oprF:gal2 (pDOW1 122) o pbp:ga!2 (pDOW1 123). Una dilución de 1 /80 del caldo entero fue cargada en un gel de NuPAGE al 10% y se probó en 1 X de regulador de MOPS. El análisis de Western de los fragmentos solubles (S), insolubles (I), y del sobrenatátil de cultivo sin células (SN) se muestra en B. La cantidad de cultivo cargado, se normalizó a A575=30, se indica debajo del gel. Figura 4: Expresión de pelB:gal2 en E. coli. Se muestra una imagen de un análisis de Western blot de GaI2 expresado en el pelB:gal2 (pDOW1 138). Las flechas apuntan a las proteínas procesadas y no procesadas en los fragmentos solubles (S) e insolubles (I). Las muestras tomadas a las horas 0 (10) y 3 (13) después de la inducción se normalizaron en A575=1 ; se cargó 5ul en un gel de NuPAGE de 4-12% y se lleva a cabo en un regulador de 1X MES. Figura 5: Actividad de scFv purificada derivada de E. coli y P. fluorescens. Se utilizó una prueba de ELISA (A) para medir la actividad de scFv aislada derivada de fermentaciones de pequeña escala (B) o gran escala (C). La actividad se expresa como absorbencia; el anticuerpo y la cantidad se listan bajo cada barra. Se muestra un promedio de las tres cavidades. Figura 6: Expresión segregada de scFv de anti-digoxina. A: muestra la secreción en P. fluorescens a escala de frasco de agitación. B: muestra la secreción en E. coli a escala de frasco de agitación. Todas las muestras se normalizaron en 20 OD (OD575 para P. fluorescens y OD600 para E. coli). Las muestras se desarrollaron en un gel de BT de 4-12% en un Regulador de MES. S= soluble, l= insoluble. Los números son tiempos después de la inducción en horas. Figura 7: Western blots de scFv de anti-digoxina segregada a escala de frasco de agitación. El panel A muestra la proteína expresada P. fluorescens el panel B muestra la proteína expresada E. coli. Las muestras se normalizaron en 20 OD. La proteína es 1 00% insoluble en ambas construcciones, S= soluble, l= insoluble. 0, 3, 24, 48 representan el tiempo después de la inducción. Figura 8: Comparación del rendimiento entre construcciones por cuantificación de scFv de anti-digoxina. Se cargaron 1 0 µL de cada muestra (incluyendo las normas de BSA) en un gel de BT al 4-12% y se probó en 1X de regulador de MES. Se cargaron las muestras de las 0, 3, 24, 48 horas después de la inducción para cada construcción. Se examinaron la construcción pDOW1 142 segregada de P. fluorescens y las construcciones citoplásmicas de E. coli (pDOW1 152) y segregadas (pDOW1 153). Las flechas indican la migración de scFv segregada procesada y no procesada. La curva convencional de BSA se ejecuta como se explica a continuación: 1 , 0.1 , ug; 3, 0.60 ug; 5, 1 .529 ug; 8. 1 .85 ug. Figura 9: Prueba de actividad de scFv de anti-digoxina purificada. En el eje X se prueban las muestras: la scFV purificada derivada de las cepas que contienen pDOW1 142, pDOW1 152 o PDOW1 153; anticuerpo de anti-digoxina policlonal (positivo); o sin proteína (negativo). En el eje Y se encuentran los valores de absorbencia. Las barras de error representan la desviación estándar de las muestras triplicadas. Figura 10: La proteína de Skp se indujo después de 24 horas del desarrollo con 5 mM de benzoato. Se utilizó un frasco no inducido como control. Se cosecharon las células 12 horas después de la inducción y las proteínas se separaron en fragmentos solubles e insolubles. Las proteínas se separaron en un gel de NuPAGE de 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando regulador de MES. Las abreviaturas son las siguientes: I, insoluble; S, soluble; MW (molecular weight), peso molecular; MWM (MW marker), marcador de peso molecular. Figura 1 1 : Secuencia de aminoácidos de la proteína Skp procesada y no procesada. La secuencia subrayada corresponde a la secuencia de señal (superior) y la secuencia identificada por MALDI-SPD (inferior). Figura 12: Imagen de una separación de SDS-PAGE de muestras solubles e insolubles que comparan JM109 transformada con pDOW1 123, desarrollada a 37°C, e inducida con 0.01 mM de IPTG al control positivo, DC265. DC265 soluble en la pista 1 , DC265 soluble en la pista 2, escala de SeeBlue de pista 3 Más 2, JM 109/pDOW1 123 soluble en la pista 4, JM1 09/pDOW1 123 insoluble en la pista 5. Se cargaron 5 uL de una muestra normalizada de 20OD en cada cavidad. El gel de Bis Tris al 4-12% se probó a 150 voltios en 1 x de regulador de MES durante ~50 minutos y después se tiñó con el tinte Simply Blue Safe. Figura 13: Imagen de un análisis de separación de SDS-PAGE de las muestras periplásmicas derivadas de la cepa de E. coli JM1 09 transformada con pDOW1 123 e inducida con 0.01 mM de IPTG, desarrollada a 37°C. Las pistas 1 -3, 10 uL de la muestra insoluble. Pista 4, 10 uL de una dilución 1 :20 del control positivo DC265 de P.
fluorescens. El gel de Bis-Tris al 12% se probó a 200 voltios durante ~50 minutos en 1 x de regulador de MES y se tiñó con el juego de tintes Novex® Colloidal Blue (Azul Coloidal). Figura 14: Imagen de un análisis de SDS-PAGE de las muestras periplásmicas derivadas de la cepa de E. coli JM1 09 transformada con pDOW1 123, inducida con 0.01 mM de IPTG y desarrollada a 37°C. El gel de Bis-Tris al 12% se probó a 200 voltios durante ~50 minutos en regulador de MES y se tiñó con el juego de tintes Novex® Colloidal Blue (Azul Coloidal). Pista 1 - 10 uL de una dilución 1 :20 del control positivo DC265; pistas 2-4 10 uL de muestra periplásmica. Figura 15: Una ¡magen de un análisis de Western de los fragmentos solubles, insolubles, y periplásmicos de un 0.01 mM de cultivo de JM109/pDOW1 123 inducido con IPTG, desarrollado a 37°C. las muestras se probaron en un gel de Bis Tris al 12% en regulador de MES y se transfirió a nitrocelulosa durante 1 hora a 30 voltios, después se examinó con HRP de anti-His. Pista 1 - 10 uL de una dilución de 1 :30 de la porción insoluble del control positivo. Pista 2 - 20 uL del fragmento soluble. Pista 3 - 10 uL del fragmento ¡nsoluble. Pista 4 -20 uL de la preparación periplásmica.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de las secuencias de señal de secreción en P. fluorescens. En una modalidad, la invención proporciona secuencias de péptido de señal, ácidos nucléicos que codifican los péptidos de señal, vectores y células que incluyen ácidos nucleicos que codifican las secuencias de péptido de señal que se derivan del organismo P. fluorescens que pueden acentuar la secreción de una proteína o péptido de interés cuando se expresa en conjunto con la proteína o péptido. También se proporcionan los procesos mejorados para producir altos niveles de proteína recombinante procesada apropiadamente en un sistema de expresión celular que utilizan señales de secreción de Sec derivadas de P. fluorescens. La invención es también el reconocimiento de que P. fluorescens es una plataforma mejorada para la producción de una variedad de proteínas. En particular, P. fluorescens produce proteínas exógenas seleccionadas como objetivo en el sistema de secreción de Sec en una forma procesada correctamente a un nivel superior al observado típicamente en otros sistemas de expresión bacteriales, y transporta estas proteínas a un nivel superior al periplasma de la célula, conduciendo a una creciente recuperación de la proteína recombinante procesada totalmente. Por lo tanto, en una modalidad, la invención proporciona un proceso para producir la proteína exógena en una célula de P. fluorescens expresando la proteína objetivo vinculada a una señal de secreción de Sec. Se ha demostrado con anterioridad que algunas Pseudomónadas ofrecen ventajas para la expresión comercial de péptidos y enzimas, en comparación con otros sistemas de expresión bacterial. En particular, se ha identificado a P. fluorescens como un ventajoso sistema de expresión. P. fluorescens abarca un grupo de saprofitos naftogénicos comunes que colonizan los ambientes superficiales de tierra, agua y plantas. Se han utilizado enzimas comerciales derivadas de P. fluorescens para reducir la contaminación ambiental, como aditivos detergentes, y para la hidrólisis estereoselectiva. P. fluorescens se utiliza también en la agricultura para el control de patógenos. Mycogen, adquirida en su totalidad por Dow AgroSciences en los finales de los 1990's, comenzó a expresar proteínas bacteriales recombinantes en P. fluorescens a mediados de los 1980's y presentó su primera solicitud de patente sobre la expresión de la toxina Bacillus thuringiensis en P. fluorescens el 22 de Enero de 1985 ("Cellular encapsulation of biological pesticides" - "Encapsulación celular de pesticidas biológicos"). Entre 1 985 y 2004, Mycogen, después Dow Agro Sciences, así como también otras compañías, se capitalizó en el uso agrícola de P. fluorescens en las solicitudes de patente sobre la producción de toxinas pesticidas, insecticidas y nematocidas, así como también sobre secuencias tóxicas específicas y manipulación genética para acentuar la expresión de estas. DowPharma tiene actualmente varias solicitudes de patente pendientes en el área de uso de P. fluorescens para producir proteínas recombinantes. Las Solicitudes de PCT Nos. WO 03/068926 y WO 03/068948 para Dow Global Technologies describen sistemas de sobre-expresión de extremoenzimas en los cuales pueden utilizarse Pseudomónadas como células huésped, específicamente P. fluorescens. Las publicaciones generalmente describen la expresión de las extremoenzimas en conjunto con un péptido de señal pero no se describen las secuencias específicas y no existe ningún reconocimiento de que las células son superiores para la secreción. La publicación de PCT No. WO 03/089455 para Dow Global Technologies, presentada el 22 de Abril de 2003, titulada "Low-Cost Production of Peptides" ("Producción de péptidos de bajo costo") describe un método de bajo costo para producir péptidos pequeños, tales como péptidos antimicrobiales, como precusores contataméricos en los Pseudomónadas, específicamente P. fluorescens. La publicación describe la expresión de los péptidos concataméricos en conjunto con un péptido de señal pero no se describen las secuencias específicas. La Solicitud de PCT No. WO 04/005221 para Dow Global Technologies, titulada "Benzoate and Antranilate Inducible Promoters" ("Activadores inducibles de benzoato y antranilato") proporciona activadores inducibles de benzoato a antranilato derivados de P. fluorescens para sistemas comerciales de fermentación procariótica. La publicación describe la inclusión de un péptido de señal con el activador, pero no se describen secuencias de señal específicas.
Péptidos En una modalidad, se proporciona un péptido aislado, con una secuencia de aminoácidos que es, o substancialmente es, homologa a un péptido de secreción de sistema de Sec P. fluorescens seleccionado derivado de una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp), una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE), una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l) y una señal de secreción de lipoproteína B. En otra modalidad, se proporciona un péptido aislado con una secuencia de aminoácidos que es, o que substancialmente es, homólogo a una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (lll) o una señal de secreción de lipoproteína B. En una modalidad, este péptido aislado es una proteína de fusión de la señal de secreción y una proteína o péptido de interés. En una modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) de al menos los aminoácidos: Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala (NO DE ID DE SEC: 1 ). En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende al menos los aminoácidos 2-24 del NO DE ID DE SEC: 1 . En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE ID DE SEC: 1 , el cual se trunca por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos derivados de la terminal de amino pero mantiene su actividad de señal de secreción. En otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos: Met Lys Lys Ser Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Gly Ala Me Ala Gln Gln Ala Gly Ala (NO DE ID DE SEC: 3). En una modalidad, el péptido es, o substancialmente es, homologa para al menos los aminoácidos 2-21 del NO DE ID DE SEC: 3. En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE ID DE SEC: 3, el cual se trunca por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 1 0 aminoácidos derivados de la termina de amino pero mantiene su actividad de señal de secreción. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 3 se modifica de manera que el Lys en la posición 2 se reemplaza con Tyr. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 3 se modifica de manera que Thr en la posición 5 se reemplaza con Ser. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 3 se modifica de manera que Val en la posición 8 se reemplaza con Leu. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 3 se modifica de manera que Val en la posición 10 se reemplaza con Val y Arg. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 3 se modifica de manera que Ala en la posición 14 se reemplaza con Val. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 3 se modifica de manera que Me en la posición 15 se reemplaza con Leu. En otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de azurina que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos: Met Phe Ala Lys Leu Val Ala Val Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Gly Gln Leu Leu Ala (NO DE ID DE SEC: 5). En una modalidad, el péptido es, o substancialmente es homólogo al menos a los aminoácidos 2-20 del NO DE ID DE SEC: 5. En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE ID DE SEC: 5, el cual se trunca por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos derivados de la terminal de amino pero mantiene la actividad de señal de secreción. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Phe-Ala en la posición 2 y 3 se reemplazan con Leu-Arg o Me-Arg. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 5 se modifica de manera que Leu en la posición 5 se reemplaza con Ala. En una modalidad, el NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Val en la posición 6 se reemplaza con Ala. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Val-Ala-Val en las posiciones 6-8 se reemplazan con lle-Ser-Ala. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 5 se modifica de manera que Leu en la posición 1 1 se reemplaza con Me. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Thr en la posición 12 se reemplaza con Ser. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 5 se modifica de manera que Ala en la posición 14 se reemplaza con Leu o Phe. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Gly en la posición 16 se reemplaza con Ala. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 5 se modifica de manera que Gln en la posición 17 se reemplaza con Ser o Pro. En una modalidad, el péptido del NO DE ID DE SEC: 5 se modifica de manera que Leu en la posición 18 se reemplaza con Val. En una modalidad, el péptido del NO DE I D DE SEC: 5 se modifica de manera que Leu-Leu en las posiciones 1 8-19 se reemplazan con Val-Phe. En otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn (LAObp o KRObp) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos: Met Gln Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Leu Ala Ala Ala Val Ser Met Ala Phe Ser Ala Thr Ala Met Ala (NO DE ID DE SEC: 7). En una modalidad, el péptido es, o substancialmente es homólogo a los aminoácidos 2-23 del NO DE ID DE SEC: 7. En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE ID DE SEC: 7, que es truncado por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 1 0 aminoácidos derivados de la terminal de amino pero mantiene la actividad de señal de secreción. Aún en otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l) [Fe(l l l)bp] que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos: Met Met Me Arg Asp Asn Arg Leu Lys Thr Ser Leu Leu Arg Gly Leu Thr Leu Thr Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Pro Ala Ala His Ser (NO DE ID DE SEC: 9). En una modalidad, el péptido es, o substancialmente es homólogo a los aminoácidos 2-32 del NO DE ID DE SEC: 9. En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE I D DE SEC: 9, que es truncado por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 1 0 aminoácidos derivados de la terminal de amino pero mantiene la actividad de señal de secreción. En otra modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de la lipoproteína B (LprB) que tiene la secuencia de al menos Ios aminoácidos: Met Me Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser Ala (NO DE ID DE SEC: 1 1 ). En una modalidad, el péptido es, o substancialmente es homólogo a los aminoácidos 2-17 del NO DE ID DE SEC: 1 1 . En otra modalidad, la secuencia de péptidos comprende un truncamiento del NO DE ID DE SEC: 1 1 , que es truncado por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos derivados de la terminal de amino pero mantiene la actividad de señal de secreción. En una modalidad separada, la señal de secreción es una señal de secreción derivada de una proteína de E. coli. En una modalidad, la señal de secreción es una secuencia de señales nativas para una proteína derivada de E. coli. En una modalidad, la proteína es una proteína chaperona. La proteína puede ser una proteína de formación de enlace de bisulfuro. En una modalidad, la secuencia es la secuencia nativa de una proteína chaperona de E. coli tal como una proteína skp. Los péptidos de señal para la trayectoria de sec generalmente consisten en los siguientes tres dominios: (i) una región n
¡¿cargada positivamente, (ii) una región h hidrofóbica y (ni) una región c polar pero sin cambios. El sitio de segmentación para la peptidasa de señal se encuentra ubicado en la región c. Sin embargo, el grado de conservación y largo de la secuencia de señal, así como también la posición del sitio de segmentación, puede variar entre diferentes proteínas. La secuencia de señal de secreción puede, por ejemplo, ser cualquier secuencia que se identifica utilizando un programa para computadora diseñado para identificar señales de secreción, tal como el programa SignalP o como se describe en Hiller, et al. , (2004) Nucleic Acids Research (Investigación de Ácidos Nucleicos 32 (tema del Servidor de Web):W375-W379; disponible en la internet en URL: http://www.predisi.de.
Homología de Secuencias Como se utiliza en la presente, el término "homólogo" significa i) una proteína o péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es substancialmente similar (es decir, al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98%) a la secuencia de una determinada proteína o péptido original y que mantiene una función deseada de la proteína o péptido original o ii) un ácido nucleico que tiene una secuencia que es substancialmente similar (es decir, al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 98%) a la secuencia de un determinado ácido nucleico y que mantiene una función deseada de la secuencia original de ácidos nucleicos. En todas las modalidades de esta invención y descripción, cualquier proteína, péptido, o ácido nucleico descrito puede sustituirse con una proteína, péptido o ácido nucleico homólogo(a) o substancialmente homólogo(a) que mantenga una función deseada. En todas las modalidades de esta invención y descripción, cuando se describe cualquier ácido nucleico, debe suponerse que la invención incluye también todos los ácidos nucleicos que hibridizan al ácido nucleico descrito. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido homólogo es una variante de un determinado polipéptido original, donde la secuencia de la variante se obtiene reemplazando hasta o aproximadamente 30% de los residuos de aminoácidos del polipéptido original con otro(s) residuo(s) de aminoácidos, incluyendo: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ,9 , 1 0, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30%, visto que la variante sustituida mantiene una función deseada del polipéptido original. Un aminoácido variante con homología sustancial será al menos 70% homólogo a determinado polipéptido, o 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% homólogo. En una modalidad, una variante se sustituirá de manera similar o una variante similar del polipéptido original. El término "variante sustituida de manera similar" se refiere a una variante que contiene, con relación al polipéptido original, diferentes residuos que son sustituciones de residuos de aminoácidos "similares", pero en las cuales no todas las diferencias son sustituciones "similares". Como se utiliza en la presente, el término "variante similar" se refiere a una variante en la cual cada uno de los diferentes residuos es una sustitución de residuos de aminoácidos "similares". Como se utiliza en este contexto, el término residuos de aminoácidos "similares" se refiere a aquellos residuos que son miembros de cualquiera de los 15 grupos conservadores o semi-conservadores mostrados en la Tabla 1 .
En una modalidad, al menos 50% de las sustituciones aparecerán como sustituciones de aminoácidos conservadores, y el resto de las sustituciones serán sustituciones semi-conservadoras. En otras modalidades, al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90% de las sustituciones similares aparecerán como sustituciones de aminoácidos conservadores. En otra modalidad, al menos 50% de las sustituciones similares aparecerán como sustituciones de aminoácidos conservadores, apareciendo el resto de las sustituciones similares como sustituciones semi-conservadoras. En otras modalidades, al menos 55% de las sustituciones similares aparecerán como sustituciones de aminoácidos conservadores, apareciendo el resto de sustituciones similares como sustituciones semi-conservadoras. En otras modalidades, al menos 55%, o al menos 60% , o al menos 65%, o al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 80% de las sustituciones similares aparecerán como sustituciones de aminoácidos conservadores. En una modalidad, una variante sustituida será una variante similar de un determinado polipéptido original.
Secuencias de Ácidos Nucleicos La invención incluye también ácidos nucleicos aislados con una secuencia que codifica un péptido que incluye una secuencia substancialmente homologa a una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (lll) o se proporciona una señal de secreción de lipoproteína B. En otro aspecto de la invención, un ácido nucleico que se hibridiza a un ácido nucleico aislado con una secuencia que codifica un péptido que incluye una secuencia substancialmente homologa a una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (l l l) o se proporciona una señal de secreción de lipoproteína B. En algunas modalidades, el ácido nucleico de hibridación se aglutinará bajo condiciones altamente severas. Las condiciones altamente severas se refieren típicamente a una hibridación a 68°C o más. En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) de al menos los aminoácidos 2-24 de NO DE ID DE SEC: 1 . En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc (NO DE ID DE SEC: 2). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es de al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 98% idéntica a la secuencia del NO DE I D DE SEC: 2. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es de al menos 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 2. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 2 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-21 del NO DE ID DE SEC: 3. En una modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a un péptido del NO DE I D DE SEC: 3 donde Lys en la posición 2 se reemplaza con Tyr; donde Thr en la posición 5 se reemplaza con Ser; donde Val en la posición 8 se reemplaza con Leu; donde Val en la posición 10 se reemplaza con Val y Arg; donde Ala en la posición 14 se reemplaza con Val; donde Me en la posición 15 se reemplaza con Leu. En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg aag aag tcc acc ttg gct gtg gct gta acg ttg ggc gca ate gcc cag caá gca ggc gct (NO DE ID DE SEC: 4). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% idéntica a la secuencia de NO DE ID DE SEC: 4. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 4. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 4 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de azurina que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-20 del NO DE ID DE SEC: 5. En una modalidad, la secuencia de péptidos es, o substancialmente es, homologa a un péptido del NO DE ID DE SEC: 5 donde Phe-Ala en la posición 2 y 3 se reemplazan con Leu-Arg o Ile-Arg; donde Leu en la posición 5 se reemplaza con Ala; donde Val en la posición 6 se reemplaza con Ala; donde Val-Ala-Val en las posiciones 6-8 se reemplazan con lle-Ser-Ala; donde Leu en la posición 1 1 se reemplaza con Me; donde Thr en la posición 12 se reemplaza con Ser; donde Ala en la posición 14 se reemplaza con Leu o Phe; donde Gly en la posición 16 se reemplaza con Ala; donde Gln en la posición 17 se reemplaza con Ser o Pro; donde Leu en la posición 18 se reemplaza con Val; o donde Leu-Leu en las posiciones 18-19 se reemplazan con Val-Phe. En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg ttt gcc aaa etc gtt gct gtt tcc ctg ctg act ctg gcg age ggc cag ttg ctt gct (NO DE ID DE SEC: 6). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% idéntica a la secuencia de NO DE ID DE SEC: 6. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 98%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% idéntica a la secuencia del NO DE I D DE SEC: 6. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 6 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn (LAObp o KRObp) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-23 del NO DE ID DE SEC: 7. En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg cag aac tat aaa aaa ttc ctt ctg gcc gcg gcc gtc tcg atg gcg ttc age gcc acg gcc atg gca (NO DE ID DE SEC: 8). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 8. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 98%, 95%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% idéntica a la secuencia del NO DE I D DE SEC: 8. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 8 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. Aún en otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de proteína de unión de hierro (l ll) [Fe(l l l)bp] que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-32 del NO DE ID DE SEC: 9. En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg atg ate cgt gac aac cga etc aag acá tcc ctt ctg cgc ggc ctg acc etc acc cta etc age ctg acc ctg etc tcg ecc gcg gcc cat tet (NO DE ID DE SEC: 10). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 10. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 98%, 95%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 10. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 10 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. En otra modalidad, se proporciona un ácido nucleico que codifica una secuencia de péptidos substancialmente homologa a la secuencia de un péptido de señal de secreción de lipoproteína B (LprB) que tiene la secuencia de al menos los aminoácidos 2-17 del NO DE ID DE SEC: 1 1 . En una modalidad separada, la secuencia de ácido nucleico que codifica al péptido es: atg ate aaa cgc aat ctg ctg gtt atg ggc ctt gcc gtg ctg ttg age gct (NO DE ID DE SEC: 12). En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90% idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 12. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico es al menos 98%, 95%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% o 50%> idéntica a la secuencia del NO DE ID DE SEC: 12. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico del NO DE ID DE SEC: 12 se ajusta con base en el uso de codón de un organismo huésped. El uso de codón o preferencia de codón es conocido en la materia. La secuencia de codificación seleccionada puede modificarse alterando el código genético de la misma para corresponder con la empleada por la célula huésped bacterial, y la secuencia de codón de la misma puede acentuarse para aproximarse mejor a la empleada por el huésped. La selección de código genético y la mejora de frecuencia de codón pueden realizarse de acuerdo con cualquiera de los diversos métodos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Los recursos de Internet en línea útiles para ayudar en este proceso incluyen, por ejemplo: (1 ) la Base de datos de Uso de Codón del Instituto de Investigación de ADN de kazusa (2-6-7 Kazusa-kamatari, Kisarazu, Chiba 292-081 8 Japón) y disponible en http://www.kazusa.or.ip/codon/; y (2) las tablas de Códigos Genéticos disponibles por la base de datos de Taxonomía de NCBI en http://www. ncbi. ni m.nih.gov/Taxonomy/U ti ls/wprintqc.cgi?mode=c. Por ejemplo, las especies Pseudomonas se reportan por utilizar la Tabla 1 1 de Traducción de Código Genético del sitio de Taxonomía de NCBI, y en el sitio de Kazusa que exhibe la frecuencia de uso de codón de la tabla mostrada en http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/.
Homología de Ácido Nucleico Es aparente para el experto en la materia que puede proporcionarse una variedad de ácidos nucleicos substancialmente homólogos que codifican las secuencias de péptidos substancialmente similares. En caso de homología para secuencias de codificación, una secuencia de codificación homologa a una secuencia de ácido nucleico de codificación de proteínas contendrá no más de 30% (es decir, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 1 8, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30%) de mutaciones que ocasionan un cambio en el marco de lectura y ninguno que cree un codón de paro prematuro, en comparación con la secuencia de ácido nucleico de codificación de proteínas descrita en la presente. Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos pueden diseñarse con base en el uso diferente de codón en los sistemas de expresión deseados. La homología de Secuencia Nucleica se determina convenientemente con cualquiera de los diversos métodos conocidos en la materia. Los ejemplos de metodologías útiles de alineación de secuencias y de determinación de homologías incluyen aquellos descritos a continuación. Las alineaciones y búsquedas para secuencias homologas pueden realizarse utilizando el programa del Centro Nacional de E. U. para la Información de Biotecnología (NCBI - nacional Center for Biotechnology Information), MegaBLAST (actualmente disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). El uso de este programa con opciones para identidad porcentual se establece en un 70% para las secuencias de aminoácidos, o se establece en 90% para secuencias de nucleótidos, identificará aquellas secuencias con 70% o 90% o mayor homología con la secuencia de consulta. También se encuentra disponible en la materia otro software conocido para alinear y/o buscar secuencias homologas, por ejemplo, secuencias al menos 70% o 90% homologas a una cadena de información que contiene una secuencia base de acentuador o una secuencia base de codificación de proteína-activadora de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las alineaciones de secuencia para la comparación con las secuencias de identificación al menos 70% o 90% homologas a una secuencia de consulta pueden realizarse mediante el uso de, por ejemplo, los programas GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA disponibles en el Paquete de Software de Análisis de Secuencia GCG (disponible por Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Centro de Biotecnología, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705), con los parámetros por default especificados en el mismo, más un parámetro para el grado de homología establecido en 70% o 90%. También puede utilizarse, por ejemplo, el programa CLUSTAL (disponible en el paquete de software PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Cal.) Estos y otros métodos de alineación de secuencias son conocidos en la materia y pueden realizarse por alineación manual, por inspección visual, o por la aplicación manual o automática de un algoritmo de alineación de secuencias, tal como cualquiera de aquellos incorporados por los programas anteriormente descritos. Diversos algoritmos útiles incluyen, por ejemplo: el método de búsqueda de similitud descrito en W.R. Pearson & D .J . Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 85:2444-48 (Abr 1988); el método de homología local descrito en T. F. Smith & M.S. Waterman, en Adv. Appl. Math.2:482-89 (1 981 ) y en J. Molec. Biol. 147: 195-97 (1981 ); el método de alineación de homología descrito en S. B. Needleman & C. D. Wunsch, J Molec. Biol. 48(3):443-53 (Marzo de 1970); y los diversos métodos descritos, por ejemplo, por W.R. Pearson, en Genomics 1 1 (3):635-50 (Noviembre de 1 991 ); por W.R. Pearson, en Methods Molec. Biol. 24:307-31 y 25:365-89 (1994); y por D.G. Higgins & P.M. Sharp, en Comp. Appl'ns en Biosci. 5: 151 -53 (1 989) y en Gene 73(1 ):237-44 (15 de Diciembre de 1988). La hibridación de ácido nucleico realizada bajo condiciones de hibridación también es una técnica útil para obtener secuencias suficientemente homologas para su uso en la presente. Las condiciones de hibridación altamente severas generalmente se refieren a la hibridación realizada en condiciones acuosas al menos en 68°C.
Vectores Otra modalidad es un vector de expresión que incluye un ácido nucleico de un péptido de secreción de sistema de Sec de P. fluorescens con una secuencia substancialmente homologa a una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (lll) o una señal de secreción de lipoproteína B, vinculada operativamente a un activador. Las secuencias de codificación expresable se anexan operativamente a un activador de transcripción capaz de funcionar en la célula huésped seleccionado, así como también otros elementos reguladores de transcripción y traducción requeridos. El término "anexo operativamente" se refiere a cualquier configuración en la cual se vinculan covalentemente los elementos reguladores de transcripción y de traducción con la secuencia de codificación en tal(es) disposición(es), con relación a la secuencia de codificación, que en y por acción de la célula huésped, los elementos reguladores pueden dirigir la expresión de la secuencia de codificación. El vector comprenderá típicamente uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de réplica para asegurar el mantenimiento del vector y, si es deseable, para proporcionar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes adecuados para la transformación de acuerdo con la presente descripción incluyen diversas especies dentro del género Pseudomonas, y particularmente se prefiere la cepa de la célula huésped en P. fluorescens. En una modalidad, el vector comprende además una secuencia de codificación para la expresión de una proteína o péptido recombinante de interés, anexo operativamente a la señal de secreción de Sec. Las proteínas y péptidos recombinantes pueden expresarse a partir de polinucleótidos en los cuales la secuencia de codificación de polipéptidos objetivo se anexa operativamente a la secuencia líder y los elementos reguladores de transcripción y traducción para formar un gen funcional a partir del cual la célula huésped puede expresar la proteína o péptido. La secuencia de codificación puede ser una secuencia de codificación nativa para el polipéptido objetivo, si lo hay, pero más preferentemente será una secuencia de codificación que se ha seleccionado, mejorado, u optimizado para su uso en la célula huésped de expresión seleccionado: por ejemplo, sintetizando el gen para reflejar la inclinación del uso de codón de una especie huésped. En una modalidad de la invención, la especie huésped es un P. fluorescens, y la inclinación del codón de P. fluorescens se toma en cuenta cuando se diseña tanto la secuencia de señal como la secuencia de proteínas o péptidos. El(los) gen(es) se construyen dentro o se insertan dentro de uno o más vector(es), los cuales pueden transformarse después en la célula huésped de expresión. Otros elementos reguladores pueden incluirse en un vector (también definido como "construcción de expresión"). Tales elementos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, secuencias acentuadotas de transcripción, secuencias acentuadotas de traducción, otros mejoradores, activadores, señales de inicio y paro de traducción, terminadores de transcripción, reguladores cistrónicos, reguladores de codificación, secuencias de etiquetas, tales como "etiquetas" de secuencias nucleótidas, y secuencias de codificación de péptidos de "etiquetas", lo cual facilita la identificación, separación, purificación, o aislamiento de un polipéptido expresado. En otra modalidad, el vector de expresión comprende además una secuencia de etiqueta adyacente a la secuencia de codificación para la señal de secreción o la secuencia de codificación para la proteína o péptido recombinante. En una modalidad, esta secuencia de etiqueta permite la purificación de la proteína. La secuencia de etiqueta puede ser una etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta de afinidad de hexa-histidina. En otra modalidad, la etiqueta de afinidad puede ser una molécula de glutaniona-S-transferasa. La etiqueta también puede ser una molécula fluorescente, tal como YFP o GFP, o análogos de tales proteínas fluorescentes. La etiqueta también puede ser una porción de una molécula de anticuerpos, o un antígeno o ligante conocido por un asociado de unión conocido útil para su aplicación. Un gen de codificación de proteína de acuerdo con la presente invención puede incluir, además de la secuencia de codificación de proteína, los siguientes elementos reguladores vinculados operativamente al mismo: un activador, un sitio de unión de ribosoma (RBS - ribosome binding site), un terminador de transcripción, señales de inicio y paro de traducción. Los RBSs útiles pueden obtenerse a partir de cualquier especie útil como células huésped en los sistemas de expresión de acuerdo con la presente invención, preferentemente a partir de la célula huésped seleccionada. Son conocidos muchos RBS específicos y una variedad de RBSs de consenso, por ejemplo, aquellos descritos en y con referencia por D. Frishman et al. , Start of bacterial genes: estimating the reliability of computer predictions ("Inicio de genes bacteriales: calcular la confiabilidad de los pronósticos por computadora"), Gene 234(2):257-65 (8 de Julio de 1999); y B.E. Suzek et al., A probabilistic method for identifying start codons in bacterial genomes ("Un método probabilístico para identificar los codones de inicio en genomas bacteriales"), Bioinformatics 17(12): 1 123-30 (Diciembre de 2001 ). Además, pueden utilizarse RBSs nativos o sintéticos, por ejemplo, aquellos descritos en: EP 0207459 (RBSs sintéticos); O. Ikehata et al. , Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence of a Rhadococcus species and its expression in Escherichia coli (Estructura primaria de hidratasa de nitrilo deducida de la secuencia nucleótida de una especie de Rhadococcus y su expresión en Escherichia coli), Eur. J. Biochem. 181 (3):563-70 (1 989) (secuencia nativa de RBS de AAGGAAG). Ejemplos adicionales de métodos, vectores, elementos de transcripción y traducción, y otros elementos útiles en la presente invención se describen en, por ejemplo: la Patente de E. U. No. 5,055,294 para Gilroy y la Patente de E. U. No. 5, 128, 130 para Gilroy et al.; la Patente de E. U. No. 5,281 ,532 para Rammler et al.; las Patentes de E. U. Nos. 4,695,455 y 4,861 ,595 para Barnes et al. ; la Patente de E.U. No. 4,755,465 para Gray et al.; y la Patente de E. U. No. 5, 169,760 para Wilcox. La transcripción del ADN que codifica las proteínas de la presente invención por Pseudomonas se incrementa insertando una secuencia acentuadota en el vector o plásmido. Los acentuadores típicos son elementos c/s-actuantes de ADN, generalmente con un tamaño desde aproximadamente 1 0 hasta aproximadamente 300 bp que actúan en el acentuador para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen diversos acentuadotes de Pseudomonas. En términos generales, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de réplica y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped Pseudomonas y un activador derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales activadores pueden derivarse de los operones que codifican enzimas tales como quinasa de 3-fosfoglicerato (PGK - 3-phosphoglycerate kinase), fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de traducción, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la enzima traducida. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una enzima de fusión que incluye un péptido de identificación terminal en N que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores con conocidos en la materia como útiles para expresar proteínas recombinantes en células huésped, y cualquiera de estos puede utilizarse para expresar los genes de acuerdo con la presente invención. Tales vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, y vectores de expresión de fagos. Los ejemplos de vectores de plásmidos útiles incluyen, pero no se limitan a, los plásmidos de expresión pBBRI MCS, pDSK51 9, pKT240, pML122, pPS10, RK2, RK6, pRO1600, y RSF1 01 0. Otros ejemplos de tales vectores útiles incluyen aquellos descritos, por ejemplo, por: N. Hayase, en Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42 (Septiembre de 1994); A. A. Lushnikov et al. , en Basic Life Sci. 30:657-62 (1 985); S. Graupner & W. Wackernagel, en Biomolec. Eng. 17(1 ): 1 1 -16. (Octubre de 2000); H.P. Schweizer, en Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45 (Octubre de 2001 ); M. Bagdasarian & K.N. Timmis, en Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67 (1982); T. Ishii et al., en FEMS Microbiol. Lett. 1 16(3):307^13 (1 de Marzo de 1 994); I.N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev, en Gene 140(1 ):63-65 (1 1 de Marzo de 1 994); M. Tsuda & T. Nakazawa, en Gene 136(1-2):257-62 (22 de Diciembre de 1993); C. Nieto et al. , en Gene 87(1 ): 145-49 (1 de Marzo de 1990); J.D. Jones & N. Gutterson, en Gene 61 (3):299-306 (1 987); M. Bagdasarian et al., en Gene 16(1 -3):237-47 (Diciembre de 1981 ); H.P. Schweizer et al. , en Genet. Eng. (NY) 23:69-81 (2001 ); P. Mukhopadhyay et al. en J. Bact. 172(1 ):477-80 (Enero de 1990); D.O. Word et al. , en J. Bact. 145(3): 1448-51 (Marzo de 1981 ); y R. Holtwick et al., en Microbiology 147(Pt 2):337-44 (Febrero de 2001 ). Ejemplos adicionales de vectores de expresión que pueden ser útiles en las células huésped de Pseudomonas incluyen aquellos listados en la Tabla 2 como se deriva de los replicones indicados.
El plásmido de expresión, RSF1 010, se describe, por ejemplo, por F. Heffron et al. , en Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 72(9):3623- 27 (Septiembre de 1 975), y por K. Nagahari & K. sakaguchi, en J. Bach.
133(3): 1527-29 (Marzo de 1978). El plásmido RSF1010 y los derivados del mismo son vectores particularmente útiles en la presente invención.
A manera de ejemplo, los derivados útiles de RSF101 0, que son conocidos en la materia, incluyen, por ejemplo, pKT212, pKT214, pKT231 y plásmidos relacionados, y pMYC1050 y plásmidos relacionados (ver, por ejemplo, las Patentes de E. U. Nos. 5,527,883 y 5,840,554 para Thompson et al.), tal como, por ejemplo, pMYC1 803. El plásmido pMYC1803 se deriva del plásmido pTJS260 basado en RSF101 0 (ver la Patente de E. U. No. 5, 169,769 para Wilcox), el cual lleva un marcador de resistencia de tetraciclina regulada y los lugares de réplica y movilización desde el plásmido RSF1010. Otros vectores útiles a manera de ejemplo incluyen aquellos descritos en la Patente de E.U. No. 4,680,264 para Puhler et al. En una modalidad, un plásmido de expresión es utilizado como el vector de expresión. En otra modalidad, RSF1 01 0 o un derivado del mismo es utilizado como vector de expresión. Aún en otra modalidad, pMYC1050 o un derivado del mismo, o pMYC1803 o un derivado del mismo, es utilizado como el vector de expresión. El plásmido puede mantenerse en la célula huésped mediante el uso de un gen marcador de selección, también presente en el plásmido. Este puede ser un gen(es) de resistencia antibiótica, en cuyo caso el(los) antibiótico(s) correspondiente(s) será(n) añadido(s) al medio de fermentación, o cualquier otro tipo de gen marcador de selección conocido como útil en la materia, por ejemplo, un gen de restauración de prototrofia en cuyo caso el plásmido será utilizado en una célula huésped que es autotrófica para el atributo correspondiente, por ejemplo, un atributo biocatalítico tal como una biosíntesis de aminoácidos o un atributo de biosíntesis de nucleótidos o un atributo de utilización de fuente de carbono.
Los activadores utilizados de acuerdo con la presente invención pueden ser activadores constitutivos o activadores regulados. Los ejemplos comunes de activadores regulados útiles incluyen aquellos de la familia del activador de lac (es decir, el activador lacZ), especialmente los activadores tac y trc descritos en la Patente de E.U. No. 4,551 ,433 para DeBoer, así como también Ptac16, Ptac17, Ptacll, PlacUVd, y el activador T7lac. En una modalidad, el activador no se deriva del organismo de células huésped. En algunas modalidades, el activador se deriva de un organismo E. coli. Los ejemplos comunes de activadores de tipo no lac útiles en los sistemas de expresión de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos listados en la Tabla 3.
Ver, por ejemplo: J. Sánchez-Romero & V. De Lorenzo (1 999) Genetic Engineering of Nonpathogenic Pseudomonads strains as Biocatalysts for Industrial and Environmental Processes ("Ingeniería genética de cepas de Pseudomonads no patogénicas como biocatalizadores para procesos industriales y ambientales") en el Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology ("Manual de Microbiología y Biotecnología Industrial") (A. Demain & J. Davies, eds.) págs. 460-74 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001 ) Vectors to express foreign genes and techniques to monitor gene expression for Pseudomonads ("Vectores para expresar genes foráneos y técnicas para monitorear la expresión genética para Pseudomónadas") en Biotechnology, 12:439-445; y R. Slater & R. Williams (2000) The Expression of Foreign DNA in Bacteria ("La expresión de ADN foráneo en bacterias"), en Molecular Biology and Biotechnology (Biología y Biotecnología Molecular) (J. Walker & R. Rapley, eds.) págs. 125-54 (The Royal Society of Chemistry (La Real Sociedad de Química), Cambridge, RU)). Un activador que tiene la secuencia nucleótida de un activador nativo a la célula huésped bacterial seleccionada también puede utilizarse para controlar la expresión del transgen que codifica el polipéptido objetivo, por ejemplo, un activador de operón de antranilato o benzoato de Pseudomonas (Pant, Pben). También pueden utilizarse activadores en serie en los que se anexa covalentemente más de un activador a otro, sea la misma o diferente en secuencia, por ejemplo, un activador en serie de Pant-Pben (híbrido de interactivador) o un activador en serie de Plac-Plac. Los activadores regulados utilizan proteínas reguladoras activadoras con objeto de controlar la transcripción del gen del cual es parte el activador. Cuando se utiliza un activador regulado en la presente, una proteína reguladora activadora correspondiente también será parte de un sistema de expresión de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de proteínas reguladoras activadoras incluyen: proteínas activadoras, por ejemplo, proteína activadora del catabolismo de E. coli, proteína de MaIT; activadores de transcripción de la familia AraC; proteínas represoras, por ejemplo, proteínas de Lacl de E. coli; y proteínas reguladoras de función doble, por ejemplo, proteína de NagC de E. coli. Son conocidos en la materia muchos pares de activador regulador proteína activadora reguladora. Las proteínas reguladoras activadoras interactúan con un compuesto ejecutador, es decir, un compuesto que se asocia reversiblemente o irreversiblemente con la proteína reguladora a fin de permitirle a la proteína sea liberarse o unirse al menos a una región reguladora de transcripción de ADN del gen que se encuentra bajo control del activador, permitiendo o bloqueando consecuentemente la acción de una enzima de transcriptasa para iniciar la transcripción del gen. Los compuestos ejecutores se clasifican como inductores o co-represores, y estos compuestos incluyen compuestos ejecutores nativos y compuestos inductores gratuitos. Son conocidos en la materia muchos tríos de activador regulado/proteína reguladora activadora/compuesto ejecutor. Aunque puede utilizarse un compuesto de ejecutor en el cultivo celular o fermentación, en una modalidad preferida en la que se utiliza un activador regulado, después del desarrollo de una cantidad deseada o densidad de biomasa de células huésped, se añade un compuesto ejecutor apropiado al cultivo con objeto de obtener como resultado directamente o indirectamente la expresión del(los) gen(es) deseado(s) seleccionado(s) como objetivo. A manera de ejemplo, cuando se utiliza un activador de la familia lac, también puede estar presente en el sistema un gen lacl. El gen lacl, el cual es (normalmente) un gen expresado constitutivamente, codifica la proteína represora de Lac (proteína de Lacl) la cual se une al operador de lac de estos activadores. Consecuentemente, cuando se utiliza un activador de la familia lac, el gen lacl también puede incluirse y expresarse en el sistema de expresión. En el caso de miembros de la familia del activador lac, por ejemplo, el activador tac, el compuesto ejecutor es un inductor, preferentemente un inductor gratuito tal como IPTG (isopropil-D-1 -tiogalactopiranosida, también llamada
"isopropiltiogalactosídasa"). El sistema de expresión pET de Champion™ proporciona un alto nivel de producción de proteínas. La expresión es inducida a partir del activador T7/ac fuerte. Este sistema saca ventaja de la alta actividad y especificidad de la polimerasa de ARN T7 bacteriófago para una transcripción de alto nivel del gen de interés. El operador lac ubicado en la región activadora proporciona una regulación más estricta que los vectores tradicionales basados en T7, mejorando la estabilidad de plásmido y la viabilidad celular (Studier, F. W. y B. A. Moffatt (1986) J Molecular Biology 189(1 ): 1 13-30; Rosenberg, et al. (1987) Gene 5681 ): 125-35). El sistema de expresión T7 utiliza el activador T7 y la polimerasa de ARN T7 (T7 RNAP) para la transcripción de alto nivel del gen de interés. Se alcanza un alto nivel de expresión en los sistemas de expresión de T7 debido a que la RNAP T7 tiene más capacidad de de ser procesada que la RNAP de E. coli nativa y se encuentra dedicada a la transcripción del gen de interés. La expresión del gen identificado se induce al proporcionar una fuente de RNAP T7 en la célula huésped. Esto se lleva a cabo utilizando un huésped de E. coli BL21 con contenido de una copia cromosómica del gen RNAP T7. El gen RNAP T7 se encuentra bajo control del activador /acUV5 el cual puede ser inducido por IPTG. RNAP T7 se expresa después de la inducción y transcribe el gen de interés. El sistema de expresión pBAD permite una expresión de titulación dosificable, estrictamente controlada, de proteína recombinante mediante la presencia de fuentes de carbono específicas tales como glucosa, glicerol y arabinosa (Guzman, et al. (1995) J. Bacteriology (Bacteriología) 177(14): 4121 -30). Los vectores pBAD se encuentran diseñados únicamente para brindar un control preciso sobre los niveles de expresión. La expresión del gen heterólogo derivada de los vectores pBAD inicia en el activador araBAD. El activador se regula tanto positivamente como negativamente por el producto del gen araC. AraC es un regulador de transcripción que forma un complejo con L-arabinosa. En ausencia de L-arabinosa, el dímero de AraC bloquea la transcripción. Para una activación máxima de transcripción se requieren dos eventos: (i), la L-arabinosa se une a AraC permitiendo que inicie la transcripción, (ii) El complejo de proteína activadora cAMP (CAP)-cAMP se une al ADN y estimula la unión de AraC a la ubicación correcta de la región activadora. El sistema de expresión de trc permite la expresión regulada de alto nivel en E. coli a partir del activador trc. Se han optimizado los vectores de expresión trc para la expresión de genes eucarióticos en E. coli. El activador trc es un activador híbrido fuerte derivado de los activadores de triptofan (trp) y lactosa (lac). Se regula por el operador lacO y el producto del gen laclQ (Brosius, J. (1 984) Gene 27(2): 161 -72).
Sistemas de expresión En una modalidad, se proporciona un sistema de expresión mejorada para la producción de proteína recombinante. En una modalidad, el sistema incluye una célula huésped y un vector que comprende una proteína o péptido recombinante vinculado operativamente a una señal de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionada a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (lll) y una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señales. En una modalidad separada, se proporciona un sistema de expresión que incluye una célula huésped de P. fluorescens y al menos un vector que incluye una señal de secreción de Sec derivada de cualquier genoma vinculado operativamente a una proteína o péptido e interés. El vector puede tener cualquiera de las características descritas con anterioridad. En una modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de un genoma de P. fluorescens. Sin embargo, en otra modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de cualquier genoma bacterial. En una modalidad, la señal de secreción se deriva de un genoma bacterial que no es un genoma de P. fluorescens, y en una modalidad específica, la señal de secreción se deriva de un genoma de E. coli. La señal de secreción, en algunas modalidades, puede ser nativa a la proteína. En una modalidad separada, la señal de secreción no es nativa a la proteína. Por ejemplo, el sistema de secreción provisto puede incluir una señal de secreción de Sec tal como la señal de secreción para una proteína skp. En modalidades en las cuales la proteína que se expresa recombinantemente es seleccionada como objetivo sea a un compartimiento periplásmico o extracelularmente, la secuencia líder nativa de esa proteína puede incluirse en el vector, vinculada operativamente a la proteína de interés. En otras modalidades, una secuencia de señal de secreción derivada de una proteína diferente puede incluirse en el vector. Sorprendentemente, P. fluorescens puede seleccionar como objetivo apropiadamente proteínas con una variedad de secuencias de señal al periplasma mediante su trayectoria de secreción de Sec. En algunas modalidades, no se proporciona ninguna modificación adicional entre la secuencia de señal y la proteína o péptido de interés. Sin embargo, en algunas modalidades, se incorporan señales de segmentación adicionales para activar el procesamiento apropiado de la terminal de amino del péptido. El sistema de secreción puede incluir también un medio de fermentación, tal como se describe a continuación. En una modalidad, el sistema incluye un medio de sales minerales. En otra modalidad, el sistema incluye un inductor químico en el medio. El sistema también puede incluir un activador, el cual puede ser un activador seleccionable, y un inductor. En algunos casos, este activador es un activador no nativo para P. fluorescens, tal como un activador de E. coli. En algunas modalidades, este activador es, por ejemplo, un activador inducible tal como un activador de lac. El activador también puede ser un híbrido de varios activadores diferentes, al menos uno de los cuales no es nativo a un organismo P. fluorescens. Por ejemplo, el activador puede ser un activador de trc. El activador también puede ser, por ejemplo, un activador de tac.
Proceso En una modalidad, se proporciona un proceso mejorado para la producción de proteína recombinante el cual incluye una célula huésped P. fluorescens que expresa una proteína de fusión de interés vinculada a una señal de secreción de Sec. El proceso puede incluir proporcionar una célula de P. fluorescens que comprende un vector que codifica una proteína o péptido recombinante vinculado operativamente a una secuencia de señal de secreción de sistema de Sec recombinante, y que desarrolla la célula bajo condiciones que producen la expresión de la proteína o péptido. El vector puede tener cualquiera de las características descritas con anterioridad. En una modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de un genoma de P. fluorescens. En otra modalidad, la señal de secreción de Sec se deriva de cualquier genoma bacterial. En una modalidad, la señal de secreción se deriva de un genoma bacterial y en una modalidad específica, la señal de secreción se deriva de un genoma de E. coli. La señal de secreción, en algunas modalidades, puede ser nativa a la proteína. En una modalidad separada, la señal de secreción no es nativa a la proteína. En una modalidad separada, se proporciona un proceso mejorado para preparar una proteína recombinante en cualquier célula huésped que incluye la expresión de un péptido de secreción de sistema de Sec de P. fluorescens seleccionado a partir de una pbp, OprE, proteína de unión de Lys-Arg-Orn, azurina, proteína de unión de hierro (l ll) o una señal de secreción de lipoproteína B, vinculada operativamente a una proteína o péptido recombinante de interés en una célula huésped. En una modalidad, la célula huésped tiene un periplasma y la expresión del péptido de sistema de Sec selecciona como objetivo la proteína recombinante al periplasma de la célula. En una submodalidad, la expresión conduce a la producción de proteína extracelular. El proceso puede incluir también el paso para purificar la proteína recombinante a partir del periplasma o a partir del medio extracelular. La señal de Sec puede expresarse vinculada a la proteína y la proteína vinculada a la señal puede purificarse a partir de la célula. Por lo tanto, en una modalidad, este péptido aislado es una proteína de fusión de la señal de secreción y una proteína o péptido de interés. Sin embargo, la señal de secreción también puede segmentarse a partir de la proteína cuando la proteína se selecciona como objetivo al periplasma. En una modalidad, la vinculación entre la señal de secreción de sistema de Sec y la proteína o péptido se modifica para incrementar la segmentación de la señal de secreción. En una modalidad, e proceso puede producir la proteína ubicada en el periplasma de la célula huésped. En una modalidad, el proceso produce proteína recombinante procesada apropiadamente en la célula. En otra modalidad, la expresión del péptido de sistema de Sec puede producir proteína recombinante activa en la célula. El proceso de la invención también puede llevar a un rendimiento creciente de la proteína recombinante en comparación cuando la proteína es expresada sin la señal de secreción de Sec. En una modalidad, el proceso produce al menos 0.1 g/L de proteína en el compartimiento periplásmico. En otra modalidad, el proceso produce 0.1 a 10 g/L de proteína periplásmica en la célula. En submodalidades, el proceso produce al menos aproximadamente 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o 1 .0 g/L de proteína periplásmica. En una modalidad, la proteína recombinante total producida es de al menos 1 .0 g/L. En algunas modalidades, la cantidad de proteína periplásmica producida es de al menos aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de la proteína recombinante total producida.
En una modalidad, el proceso produce al menos 0.1 g/L de proteína procesada correctamente. Una proteína procesada correctamente tiene un término de amino de la proteína nativa. En otra modalidad, el proceso produce 0.1 a 10 g/L de proteína procesada correctamente en la célula. En submodalidades, el proceso produce al menos aproximadamente 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 o 1 .0 g/L de proteína procesada correctamente. En una modalidad, la proteína recombinante total procesada correctamente producida es de al menos 1 .0 g/L. En submodalidades, la proteína total procesada correctamente producida puede ser de al menos aproximadamente 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0 o 50.0 g/L. En algunas modalidades, la cantidad de proteína procesada correctamente producida es de al menos aproximadamente 5%, aproximadamente 1 0%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de un proteína recombínante total en forma procesada correctamente. En algunas modalidades, también puede producirse la proteína en forma activa. El término "activo" se refiere a la presencia de una función biológica o efecto biológico, donde la función o efecto biológico es comparativo o substancialmente corresponde a la función o efecto biológico de una proteína o péptido nativa(o) correspondiente. En el contexto de las proteínas, esto típicamente significa que un polinucleótido o polipéptido comprende una función o efecto biológica(o) que tiene al menos aproximadamente 20%, aproximadamente 50%, preferentemente al menos aproximadamente 60-80%, y muy preferentemente al menos aproximadamente 90-95% de actividad en comparación con la proteína o péptido nativa(o) correspondiente utilizando parámetros convencionales. La determinación de actividad de proteína o péptido puede realizarse utilizando pruebas convencionales biológicas comparativas de selección de objetivo para proteínas o péptidos particulares. Una indicación de que una función o efecto biológica(o) de proteína o péptido recombinante es que el polipéptido recombinante es inmunológicamente reactivo con el polipéptido nativo. En otra modalidad, más del 50% del péptido transgénico expresado, polipéptido, proteína, o fragmento de los mismos producidos puede producirse de forma renaturalizadora en la célula huésped. En otra modalidad aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la proteína expresada se obtiene en o puede renaturalizarse en forma activa. El proceso de la invención también puede llevar a un rendimiento creciente de proteína recombinante. En una modalidad, el proceso produce proteína recombinante como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50, 55, 60, 65, 70, o 75% de la proteína de célula total (tcp). "Porcentaje de proteína de célula total" es la cantidad de proteína o péptido en la célula huésped como porcentaje de proteína celular agregada. La determinación del porcentaje de proteína celular total es bien conocida en la materia. En una modalidad particular, la célula huésped puede tener un péptido recombinante, polipéptido, proteína, o fragmento del nivel de expresión de al menos de tcp al 1 % y una densidad celular de al menos 40 g/L, cuando se desarrolla (es decir, en un rango de temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 55°C, inclusive) en un medio de sales minerales. En una modalidad particularmente preferida, el sistema de expresión tendrá una proteína recombinante de nivel de expresión de péptido de al menos tcp al 5% y una densidad celular de al menos 40 g/L, cuando se desarrolla (es decir, en un rango de temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 55°C, inclusive) en un medio de sales minerales en una escala de fermentación de al menos 1 0 Litros.
Célula Huésped En una modalidad, la invención proporciona un sistema de expresión de P. fluorescens para la expresión de una proteína recombinante que comprende una señal de secreción de tipo Sec. Este aspecto de la invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que el sistema de secreción de Sec de P. fluorescens es capaz de procesar y de seleccionar como objetivo apropiadamente señales de secreción derivadas tanto de sistemas de señal de Sec de P. fluorescens como no P. fluorescens. En esta modalidad, la célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 18 de protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 18 de protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de todas las subespecies, variedades, cepas, y otras unidades sub-especiales de la especie Pseudomonas fluorescens, incluyendo aquellas que pertenecen, por ejemplo, a las siguientes (con el ATCC u otros números de depósito de cepa(s) a manera de ejemplo mostrada(s) en paréntesis): Pseudomonas fluorescens biotipo A, también llamado biovar 1 o biovar I (ATCC 1 3525); Pseudomonas fluorescens biotipo B, también llamado biovar 2 o biovar II (ATCC 17816); Pseudomonas fluorescens biotipo C, también llamado biovar 3 o biovar l l l (ATCC 17400); Pseudomonas fluorescens biotipo F, también llamado biovar 4 o biovar IV (ATCC 12983); Pseudomonas fluorescens biotipo G, también llamado biovar 5 o biovar V (ATCC 17518); Pseudomonas fluorescens biovar VI; Pseudomonas fluorescens Pf0-1 ; Pseudomonas fluorescens Pf5; (ATCC BAA-477); Pseudomonas fluorescens SBW25; y Pseudomonas fluorescens subesp. cellulosa (MCIMB 10462). La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 19 de protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 19 de protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de todas las cepas de Pseudomonas fluorescens biotipo A. Una cepa particularmente preferida de este biotipo es P. fluorescens cepa MB101 (ver la Patente de E.U . No. 5, 169,760 para Wilcox), y los derivados de la misma. Un ejemplo de un derivado preferido del mismo es P. fluorescens cepa MB124, construida al insertar en el lugar de asd (gen de deshidrogenada de aspartato) cromosómico MB1 01 , una construcción nativa de E. coli Placl-lacl-lacZYA (es decir, en la que se eliminó PlacZ). Las cepas adicionales de P. fluorescens que pueden utilizarse en la presente invención incluyen Pseudomonas fluorescens Migula y Pseudomonas fluorescens Loitokitok, que tiene las siguientes designaciones de ATCC: [NCIB 8286]; NRRL B-1244; NCIB 8865 cepa CO1 , NCIB 886 cepa CO2; 1291 [ATCC 17458; IFO 15837; NCIB 8917; LA; NRRL B-1 864; pirrolidina; PW2 [ICMP 3966; NCPPB 967; NRRL B-899]; 13475: NCTC 10038; NRRL B-1603 [6; IFO 15840]; 52-1 C; CCEB 488-A [BU 140]; CCEB 553 [IEM 15/47]; IAM 1 008 [AHH-27]; IAM 1055 [AHH-23]; 1 [IFO 15842]; 12 [ATCC 25323; NIH 1 1 ; den Dooren de Jong 216]; 18 [I FO 15833; WRRL P-7]; 93 [TR-10]; 108 [52-22; I FO 15832]; 143 [IFO 15836; PL]; 149 [2-40-40; IFO 15838]; 182 [IFO 3081 ; PJ 73], 184 [IFO 15380]; 1 85 [W2 L-1 ]; 186 [IFO 15829; PJ 79]; 187 [NCPPB 263]; 188 [NCPPB 316]; 189 [PJ227; 1208]; 1 91 [IFO 15834; PJ 236; 22/1]; 194 [Klinge R-60; PJ 253]; 196 [PJ 288]; 197 [PJ 290]; 1 98 [PJ 302]; 201 [PJ 368]; 202 [PJ 372]; 203 [PJ 376]; 204 [I FO 15838; PJ 682]; 205 [PJ 686]; 206 [PJ 692]; 207 [PJ 693]; 208 [PJ 722]; 212 [PJ 832]; 215 [PJ 849]; 216 [PJ 885]; 267 [B-9]; 271 [B-1612]; 401 [C71 A; IFO 583; PJ 187]; NRRL B-3178 [4; IFO 15841 ]; KY 8521 ; 3081 ; 30-21 ; [IDO 3081 ]; N; PYR; PW; D946-B83 [BU 21 83; FERM-P 3328]; P-2563 [FERM-P 2894; I FO 13658]; IAM-1 126 [43F]; M-1 ; A506 [A5-06]; A505 [A5-05-1 ]; A526 [A5-26]; B69; 72; NRRL B-4290; PMW6 [NCIB 1 161 5]; SC 12936; A1 [IFO 15839]; F 1847 [CDC-EB]; F 1848 [CDC 93]; NCIB 10586; P17; F-12; AmMS 257; PRA25; 6133D02; 6519E01 ; N1 ; SC15208; BNL-WVC; NCTC 2583 [NCIB 8194]; H 13; 1013 [ATCC 1 1251 ; CCEB 295]; IFO 3903; 1 062; o Pf-5. En otra modalidad, el proceso proporciona la expresión de proteínas de fusión con un péptido de secreción de sistema de Sec de P.
fluorescens seleccionado a partir de una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp), una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE), una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l ll) y una señal de secreción de lipoproteína B. Este proceso se basa en la idea de que la capacidad de las señales de secreción de Sec de P. fluorescens de procesar proteínas segregadas indica que las células son convenientemente ideales para producir proteínas segregadas. Por lo tanto, los sistemas de señalización derivados de estas células podrían ser sistemas de señalización ideales para este tipo de secreción en múltiples sistemas de expresión. Por lo tanto, el proceso para expresar proteínas o péptidos que utilizan las señales de secreción identificadas de sistema de Sec de P. fluorescens puede utilizarse en cualquier sistema de huésped determinado, incluyendo los de origen eucariótico o procariótico. En esta modalidad, la célula huésped puede ser cualquier célula capaz de producir proteínas o péptidos recombinantes, incluyendo una célula de P. fluorescens como se describió con anterioridad. Los sistemas más comúnmente utilizaos para producir proteínas o péptidos recombinantes incluyen algunas células bacteriales, particularmente E. coli, debido a sus requisitos de desarrollo relativamente baratos y a la capacidad potencial para producir proteínas en cultivos de lotes grandes. También se utiliza la levadura para expresar proteínas y péptidos biológicamente relevantes, particularmente para propósitos de investigación. Los sistemas incluyen Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris. Estos sistemas se encuentran bien caracterizados, proporcionan niveles generalmente aceptables de expresión de proteína total y comparativamente son rápidos y baratos. Los sistemas de expresión celular de insectos también han emergido como alternativa para expresar las proteínas recombinantes en forma biológicamente activa. En algunos casos, pueden producirse las proteínas plegadas correctamente que se modifican post-traduccionalmente. Los sistemas de expresión celular mamífera, tales como células de ovarios de hámster Chino, también han sido utilizadas para la expresión de proteínas recombinantes. A pequeña escala, estos sistemas de expresión frecuentemente son eficaces. Algunos agentes biológicos pueden derivarse de las proteínas, particularmente en aplicaciones para la salud de animales o de seres humanos. En otra modalidad, la célula huésped es una célula vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula de tabaco, maíz, una célula derivada de la especie Arabidopsis, papa o célula de arroz. En otra modalidad, un organismo multicelular es analizado o modificado en el proceso, incluyendo pero sin limitarse a un organismo. Las técnicas para analizar y/o modificar un organismo multicelular generalmente se basan en técnicas descritas para modificar las células descritas a continuación. En una modalidad, la célula huésped puede ser un procariota tal como una célula bacterial que incluye, pero no se limita a una especie Escherichia o Pseudomonas. Se describen las células bacteriales típicas, por ejemplo, en "Biological Diversity: Bacteria and Archeaens" ("Diversidad biológica: bacterias y arcaicos"), un capítulo del On-Line Biology Book (Libro de Biología en línea), proporcionado por el Dr. MJ Farabee del Estrella Mountain Community College (Colegio de la Comunidad de Estrella Mountain), Arizona, EUA en el URL: http://www.emc. maricopa.edu/facultv/farabee/BIOBK/BioBookDiversity 2. html. En algunas modalidades, la célula huésped puede ser una célula de Pseudomónada, y típicamente puede ser una célula de P. fluorescens. En otras modalidades, la célula huésped también puede ser una célula de E. coli. En otra modalidad, la célula huésped puede ser una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de insecto, que incluye pero que no se limita a una célula derivada de una especie de Spodoptera, Trichoplusia Drosophila o Estigmene, o una célula de mamífero, que incluye pero que no se limita a una célula murina, una célula de hámster, una célula de mono, de primate o de ser humano. En una modalidad, la célula huésped puede ser un miembro de cualquiera de la taxa bacterial. Por ejemplo, la célula puede ser un miembro de cualquier especie de eubacteria. El huésped puede ser un miembro de cualquier taxa: Acidobateria, Actinobacteria, Aquifícae, Bacteroidetes, Clorobi, Chlamydiae, Choroflexi, Chryosiogenetes, Cianobacterias, Deferribacteres, Deinococcus, Dictyoglomi,
Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospirae, Planctomycetes, Proteobacteria,
Spirochaetes, Thermodesulfobacteria, Thermomicrobia, Thermotogae, Thermus (Termales), o Verrucomicrobia. En una modalidad de una célula huésped eubacterial, la célula puede ser un miembro de cualquier especie de eubacteria, excluyendo las Cianobacterias. El huésped bacterial también puede ser un miembro de cualquier especie de Protobacterias. Una célula huésped protobacterial puede ser miembro de cualquiera de la taxa Alfaprotobacterias, Betaprotobacterias, Gammaprotobacterias, Deltaprotobacterias, o Epsilonprotobacterias. Además, el huésped puede ser miembro de cualquiera de la taxa, Alfaprotobacterias, Betaprotobacterias, o Gammaprotobacterias, y un miembro de cualquier especie de Gammaprotobacterias. En una modalidad de un huésped Gamma Protobacterial, el huésped será miembro de cualquiera de la taxa Aeromonadales, Alteromonadales, Enterobacteriales, Pseudomonadales o
Xanthomonadales; o un miembro de cualquier especie de las Enterobacteriales o Pseudomonadales. En una modalidad, la célula huésped puede ser del orden Enterobacteriales, la célula huésped será un miembro de la familia Enterobacteriaceae, o un miembro de cualquiera de los géneros Erwinia, Escherichia, o Serratla; o un miembro del género Escherichia. En una modalidad de una célula huésped del orden Pseudomonadales, la célula huésped será un miembro de la familia Pseudomonadaceae, incluso del género Pseudomonas. Los huéspedes Gamma Protobacteriale incluyen miembros de la especie
Escherichia coli y los miembros de la especie Pseudomonas fluorescens. También pueden ser útiles otros organismos de
Pseudomonas. Los Pseudomónadas y las especies estrechamente relacionadas incluyen el Subgrupo 1 de Protobacterias Gram-negativas, que incluyen el grupo de Protobacterias que pertenecen a las familias y/o géneros descritos como "Gram-Negative Aerobic Rods y Cocci" ("Bacilos y cocci aeróbicos gram-negativos") por R. E. Buchanan y N.E. Gibbons (eds.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Manual de Bergy de Bacteriología Determinativa), págs. 217-289 (8a ed. , 1 974) (The Williams & Wilkins Co., Baltimore, MD, EUA) (en lo sucesivo "Bergey (1 974)"). La Tabla 4 presenta estas familias y géneros de organismos.
El "Subgrupo 1 de Protobacterias Gram-negativas" incluye también Protobacterias que se clasificarían en este encabezado de acuerdo con los criterios utilizados en la clasificación. El encabezado incluye también grupos que se clasificaron con anterioridad en esta sección pero que ya no lo están más, tal como los géneros Acidovorax, Brevundimonas, Burkholderia, Hydrogenophaga, Oceanimonas, Ralstonia, y Stenotrophomonas, el género Sphlngomonas (y el género Blastomonas, derivado del mismo), el cual se creó por organismos de reagrupación pertenecientes a (y las especies anteriormente llamadas) del género Xanthomonas, el género Acidomonas, el cual se creó por organismos de reagrupación pertenecientes al género Acidomonas como se define en Bergey (1974). Además, los huéspedes pueden incluir células derivadas del género Pseudomonas, Pseudomonas enalla (ATCC 14393), Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375), y Pseudomonas putrefaciens (ATCC 8071 ), que se han clasificado respectivamente como Alteromonas haloplanktis, Alteromonas nigrifaciens, y Alteromonas putrefaciens. De manera similar, por ejemplo, Pseudomonas acidovorans (ATCC 15668) y Pseudomonas testosteroni (ATCC 1 1996) han sido reclasificados como Comamonas acidovorans y Comamonas testosterona, respectivamente; y Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375) y Pseudomonas piscicda (ATCC 15057) han sido reclasificados respectivamente como Pseudoalteromonas nigrifaciens y
Pseudoalteromonas piscicida. El "Subgrupo 1 de Protobacterias Gram-negativas" incluye también las Protobacterias clasificadas como pertenecientes a cualquiera de las familias: Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae (ahora denominada frecuentemente por el sinónimo, el "grupo Azotobacter" de Pseudomonadaceae), Rhizobiaceae, y Methylmonadaceae ahora (ahora denominada frecuentemente por el sinónimo "Methylococcaceae"). Consecuentemente, además de aquellos géneros descritos diferentemente en la presente, géneros Protobacteriales adicionales que se encuentran dentro del "Subgrupo 1 de Protobacterias Gram negativas" incluyen: 1 ) bacterias del grupo Azobacter del género Azorhizophilus; 2) bacterias de la familia Pseudomonadaceae de los géneros Cellvibrio, Oligella, y Teredinibacter; 3) bacterias de la familia Rhizobiaceae de los géneros Chelobacter, Ensifer, Liberibacter (también llamada "Candidatus Liberobacter"), y Sinorhizobium; y 4) bacterias de la familia Methylococcaceae del género Methylobcter, Methylocaldum, Methylomicrobium, Methylosarcina, y Methylosphaera. En otra modalidad, la célula huésped se selecciona a partir del "Subgrupo 2 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 2 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros (con los números totales de cepas de los mismos, depositadas públicamente disponibles y listadas por catálogo, indicados en paréntesis, depositados todos en ATCC, excepto como se indica e otra manera): Acidomonas (2); Actobacter (93); Gluconobacter (37); Brevundimonas (23); Beijerinckia (13); Derxia (2); Brucella (4); Agrobacterium (79); Chelatobacter (2); Ensifer (3); Rhizobium (144); Sinorhizobium (24); Blastomonas (1 ); Sphingomonas (27); Alcaligenes (88); Bordetella (43); Burkholderia (73); Ralstonia (33);
Acidovorax (20); Hydrogenophaga (9); Zoogloea (9); Methylobacter (2); Methylocaldum (1 en NCIMB); Methylococcus (2); Methylomicrobium (2); Methylomonas (9); Methylosarcina (1 ); Methylosphaera; Azomonas (9); Azorhizophilus (5); Pseudomonas (1 139); Francisella (4); Xanthomonas (229); Stenotrophomonas (50); y Oceanimonas (4). La especie de células huésped a manera de ejemplo del "Subgrupo 2 de Protobacterias Gram-negatívas" incluyen, pero no se limitad a las siguientes bacterias (con el ATCC u otros números de depósito de la(s) cepa(s) a manera de ejemplo de las mismas mostradas en paréntesis): Acidomonas methanolica (ATCC 43581 ); Acetobacter aceti (ATCC 15973); Gluconobacter oxydans (ATCC 19357); Brevundimonas diminuta (ATCC 1 1568); Beijerinckia indica (ATCC 9039 y ATCC 19361 ); Derxia gummosa (ATCC 15994); Brucella melitensis (ATCC 23456); Brucella abortus (ATCC 23448); Agrobacterium tumefaciens (ATCC 23308); Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358); Agrobacterium rhizogenes (ATCC 1 1325); Chelatobacter heintzii (ATCC 29600); Ensifer adhaerens (ATCC 33212); Rhizobium leguminosarum (ATCC 10004); Sinorhizobium fredii (ATCC 35423); Blastomonas natatoria (ATCC 35951 ); Sinorhizobium paucimobilis (ATCC 29387); Alcaligenes faecalis (ATCC 8750); Bordetella pertussis (ATCC 9797); Burkholderia cepacia (ATCC 25416); Ralstonia pickettii (ATCC 2751 1 ); Acidovorax facilis (ATCC 1 1228); Hydrogenophaga flava (ATCC 33667); Zoogloea ramigera (ATCC 19544); Methylobacter luteus (ATCC 49878); Methylocaldum gracile (NCIMB 1 1912); Methylococcus capsulatus (ATCC 19069); Methylomicrobium agile (ATCC 35068); Methylomonas methanica (ATCC 35067); Methylosarcina fibrata (ATCC 700909); Methylosphaera hansonii (ACAM 549); Azomonas agilis (ATCC 7494); Azorhizophilus paspali (ATCC 23823); Azotobacter chroococcum (ATCC 9043); Cellvibrio mixtus (UQM 2601 ); Oligella urethralis (ATCC 17960); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Francisella tularensis (ATCC 6223); Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637); Xanthomonas campestris (ATCC 33913); y Oceanimonas doudoroffii (ATCC 27123). En otra modalidad, la célula huésped se selecciona a partir del "Subgrupo 3 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 3 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Agrobacterium; Rhizobium; Sinorhizobium; Blastomonas; Sphingomonas; Alcaligenes; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas;
Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. En otra modalidad, la célula huésped se selecciona la célula huésped se selecciona a partir del "Subgrupo 4 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 4 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Ac/cíovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum;
Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina;
Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio;
Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas;
Xanthomonas; y Oceanimonas. En una modalidad, la célula huésped se selecciona a partir del "Subgrupo 5 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 5 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Methylobacter;
Methylocaldum; Methylococcus; Methylomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus;
Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter;
Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del
"Subgrupo 6 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 6 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas;
Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga;
Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella;
Pseudomonas; Teredinibacter; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del
"Subgrupo 7 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 7 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter;
Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del
"Subgrupo 8 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 8 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Blastomonas;
Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga;
Pseudomonas; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del
"Subgrupo 9 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 9 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Burkholderia;
Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Pseudomonas;
Stenotrophomonas; y Oceanimonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 10 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 10 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia;
Pseudomonas; Stenotrophomonas; y Xanthomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 1 1 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 1 1 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de
Protobacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas;
Stenotrophomonas; y Xanthomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 12 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 12 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 13 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 13 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Burkholderia; Ralstonia; Pseudomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 14 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 14 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas; y Xanthomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 15 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 15 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de los siguientes géneros: Pseudomonas. La célula huésped puede seleccionarse a partir del "Subgrupo 16 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 16 de Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias de las siguientes especies de Pseudomonas (con el ATCC o los números de depósito de la(s) cepa(s) a manera de ejemplo en paréntesis): Pseudomonas abietaniphila (ATCC 700689); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); Pseudomonas alcaligenes (ATCC 14909); Pseudomonas anguilliseptica (ATCC 33660); Pseudomonas citronellolis (ATCC 1 3674); Pseudomonas flavescens (ATCC 51555); Pseudomonas mendocina (ATCC 2541 1 ) Pseudomonas nitroreducens (ATCC 33634); Pseudomonas oleovorans (ATCC 8062); Pseudomonas pseudocalcaligenes (ATCC 17440); Pseudomonas resinovorans (ATCC 14235); Pseudomonas straminea (ATCC 33636); Pseudomonas agarici (ATCC 25941 ); Pseudomonas alcaliphilia; Pseudomonas alginovora; Pseudomonas andersonii; Pseudomonas asplenii (ATCC 23835); Pseudomonas azelaica (ATCC 27162); Pseudomonas beijerinckii (ATCC 19372); Pseudomonas borealis; Pseudomonas boreopolis (ATCC 33662); Pseudomonas brassicacearum; Pseudomonas butanovora (ATCC 43665); Pseudomonas cellulosa (ATCC 55703); Pseudomonas aurantiaca (ATCC 33663); Pseudomonas chlororoaphis (ATCC 9446, ATCC 13985, ATCC 1741 8, ATCC 17461 ); Pseudomonas fragi (ATCC 4973); Pseudomonas lundensis (ATCC 49968); Pseudomonas taetrolens (ATCC 4683); Pseudomonas cissicola (ATCC 33616); Pseudomonas coronafaciens; Pseudomonas diterpeniphilia; Pseudomonas elongata (ATCC 1 0144); Pseudomonas flectens (ATCC 12775); Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrúgala (ATCC 29736); Pseudomonas extremorientalis; Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858); Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas nandelii (ATCC 700871 ); Pseudomonas marginalis (ATCC 10844); Pseudomonas nigulae; Pseudomonas mucidolens (ATCC 4685); Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha (ATCC 9890); Pseudomonas tolaasíi (ATCC 3361 8); Pseudomonas veronii (ATCC 700474); Pseudomonas frederíksbergensis; Pseudomonas geniculata (ATCC 19374); Pseudomonas gingeri; Pseudomonas graminis; Pseudomonas grimontii; Pseudomonas halodenitrificans; Pseudomonas halophila; Pseudomonas hibiscicoia (ATCC 1 9867); Pseudomonas huttiensis (ATCC 14670); Pseudomonas hydrogenovora; Pseudomonas jessenii (ATCC 700870); Pseudomonas kilonensis; Pseudomonas lanceolata (ATCC 14669); Pseudomonas lini;
Pseudomonas marginata (ATCC 25417); Pseudomonas mephitica (ATCC 33665); Pseudomonas denitrificans (ATCC 19244); Pseudomonas pertucinognea (ATCC 190); Pseudomonas pictorum (ATCC 23328);
Pseudomonas psychrophilia; Pseudomonas fulva (ATCC 31418);
Pseudomonas monteilii (ATCC 700476); Pseudomonas mosselii;
Pseudomonas oryzihabitans (ATCC 43272); Pseudomonas plecoglossicida (ATCC 700383); Pseudomonas putida (ATCC 12633);
Pseudomonas reactans; Pseudomonas spinosa (ATCC 14606);
Pseudomonas baleárica; Pseudomonas tuteóla (ATCC 43273);
Pseudomonas stutzeri (ATCC 17588); Pseudomonas amygdalii (ATCC
33614); Pseudomonas avellanae (ATCC 700331 ); Pseudomonas caricapapayae (ATCC 33615); Pseudomonas cichorii (ATCC 10857);
Pseudomonas ficuserectae (ATCC 35104); Pseudomonas fuscovaginae;
Pseudomonas mellae (ATCC 33050); Pseudomonas syringae (ATCC
1931 0); Pseudomonas virídiflava (ATCC 1 3223); Pseudomonas thermocarboxydovorans (ATCC 35961 ); Pseudomonas thermotolerans; Pseudomonas thivervalensis; Pseudomonas vancouverensis (ATCC
700688); Pseudomonas wisconsinensis; y Pseudomonas xiamenensis. La célula huésped puede seleccionarse a partir del
"Subgrupo 17 de Protobacterias Gram-negativas". El "Subgrupo 17 de
Protobacterias Gram-negativas" se define como el grupo de Protobacterias conocidas en la materia como "Pseudomónadas fluorescentes" incluyendo aquellos que pertenecen, por ejemplo, a las siguientes especies de Pseudomonas: Pseudomonas azotoformans; Pseudomonas brenneri; Pseudomonas cedrella; Pseudomonas corrugata; Pseudomonas extremorientalls; Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas gessardii; Pseudomonas libanensis; Pseudomonas mandelii; Pseudomonas marginalis; Pseudomonas migulae; Pseudomonas mucidolens; Pseudomonas orientalis; Pseudomonas rhodesiae; Pseudomonas synxantha; Pseudomonas toiasii; y Pseudomonas veronii. Otros huéspedes adecuados incluyen aquellos clasificados en otras partes de la referencia, tal como las Protobacterias Gram (+). En una modalidad, la célula huésped es un E. coli. La secuencia genómica para E. coli se ha establecido para E. coli MG1655 (Blattner, et al. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 [La secuencia genómica completa de Escherichia coli K-12], Science 277(5331 ): 1453-74) y DNA microarrays are available commercially for E. coli K12 [Se encuentran microarreglos de ADN comercialmente disponibles para E. coli K12] (MWG Inc, High Point, NC). E. coli puede cultivarse sea en un medio rico tal como Luria-Bertani (LB) (10 g/L de tristona, 5 g/L de NaCI, 5 g/L de extracto de levadura) o un medio mínimo definido tal como M9 (6g/L de Na2H'PO4, 3 g/L de KH2PO4, 1 g/L de NH4CI, 0.5 g/L de NaCI, pH de 7.4) con una fuente de carbono apropiada tal como glucosa al 1 %. Rutinariamente, un cultivo con duración de toda la noche de células de E. coli se diluye y se inocula en un medio fresco m ínimo o rico sea en un frasco de agitación o un fermentador y se desarrolla a 37°C. Un huésped también puede ser de origen mamífero, tal como una célula derivada de un mamífero que incluye cualquier mamífero humano o no humano. Los mamíferos pueden incluir, pero no se limitan a primates, monos, porcinos, ovino, bovinos, roedores, ungulados, cerdos, cochinos, corderos, cabras, ganado, ciervo, muías, caballos, monos, simios, perros, gatos, ratas y ratones. Una célula huésped también puede ser de rigen vegetal. Puede seleccionarse cualquier vegetal para la identificación de los genes y secuencias reguladoras. Ejemplos de objetivos vegetales adecuados para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluirían pero no se limitan a alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, arugula, espárrago, aguacate, banano, cebada, frijoles, remolacha, zarzamora, arándano, brócoli, col de Bruselas, repollo, cánola, cantalupo, zanahoria, yuca, ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, frutas cítricas, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, ráspano, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, ajo, ayote, uva, toronja, melata, jicama, kivi, lechuga, puerros, limón, lima, pino de incienso, linaza, mano, melón, hongo, nectarina, nuez, avena, aceite de palma, aceite de semilla de colza, quimbombo, olivo, cebolla, naranjo, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharo, durazno, cacahuate, pera, pimienta, caqui, pino, pina, plátano, ciruela, granada, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino radiata, radiscchio, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del Sur, soya, espinaca, chayóte, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, papa dulce, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, triticale, césped, nabo, vid, melón, sandía, trigo, batatas y calabacín. En algunas modalidades, los vegetales útiles en el proceso son Arabidopsis, maíz, trigo, soya, y algodón. Para la expresión de una proteína o péptido recombinante, o para la modulación de un gen compensador identificado, puede utilizarse cualquier activador de vegetal. Un activador puede ser un activador de polimerasa I I de ARN vegetal. Los elementos incluidos en los activadores vegetales pueden ser una caja TATA o una caja de Goldberg-Hogness, típicamente colocada aproximadamente 25 a 35 pares base corriente arriba (5') del sitio de inicio de transcripción, y la caja CCAAT, ubicada entre 70 y 100 pares base corriente arriba. En vegetales, la caja CCAAT puede tener una secuencia de consenso diferente a la secuencia funcionalmente análoga de activadores mamíferos (Messing et al. (1983) en: Genetic Engineering of Plants (Ingeniería genética de vegetales), Kosuge et al. , eds. , págs. 21 1 -227). Además, prácticamente todos los activadores incluyen secuencias de activación adicionales corriente arriba que activan secuencias o acentuadotes (Benoist y Chambón (1981 ) Nature 290:304-30; Gruss et al. (1981 ) Proc. Nat. Acad. Sci. 78:943-947; y Khoury y Gruss (1983) Cell 27:313-314) que se extienden desde aproximadamente -100 bp (basepair - par base) hasta -1 ,000 bp o más corriente arriba del sitio de inicio de transcripción.
Producción/fermentación de proteína El proceso de la invención conduce óptimamente a una producción incrementada de proteína o péptido recombinante en una célula huésped. La producción incrementada alternativamente puede ser un creciente nivel de proteína o péptido procesado apropiadamente por gramo de proteína producida, o por gramo de proteína huésped. La producción incrementada también puede ser un creciente nivel de proteína o péptido recuperable producido por gramo de recombinante o por gramo de proteína de célula huésped. La producción incrementada también puede ser cualquier combinación de un nivel total incrementado y un nivel incrementado de proteína activa o soluble, procesado apropiadamente. La expresión mejorada de la proteína recombinante puede ser un incremento en la solubilidad de la proteína. La proteína o péptido recombinante pude producirse y recuperarse a partir del citoplasma, periplasma o medio extracelular de la célula huésped. La proteína o péptido puede ser soluble o insoluble. La proteína o péptido puede incluir una o más secuencias de selección como objetivo o secuencias para auxiliar a la purificación.
Desarrollo celular La transformación de las células huésped de Pseudomonas con el(los) vector(es) puede realizarse utilizando cualquier metodología de transformación conocida en la materia, y las células huésped bacteriales pueden transformarse como células intactas o como protoplastos (es decir, incluyen citoplastos). Las metodologías de transformación a manera de ejemplo incluyen metodologías de poración, por ejemplo, electroporación, fusión de protoplastos, conjugación bacterial, y tratamiento de catión bivalente, por ejemplo, tratamiento de cloruro de calcio o tratamiento de CaCI/Mg2+, u otros métodos conocidos en la materia. Ver, por ejemplo, Morrison, J. Bact. , 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología), 101 :347-362 (Wu et al., eds., 1983), Sambrook et al., Molecular Cloning (Clonación Molecular), A Laboratory Manual (Un manual de laboratorio) (2a ed. , 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (Transferencia y expresión genética: Un manual de laboratorio) (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en Biología Molecular) (Ausubel et al. , eds., 1994)). Como se utiliza en la presente, el término "fermentación" incluye ambas modalidades en las cuales se emplea fermentación literal y modalidades en las que se emplean otros modos de cultivo no fermentativos. La fermentación puede realizarse a cualquier escala. En una modalidad, el medio de fermentación puede seleccionarse a partir de medios ricos, medios mínimos, y medios de sales minerales; puede utilizarse un medio rico, pero preferentemente se evita. En otra modalidad se selecciona sea un medio mínimo o sales minerales. Aún en otra modalidad, se selecciona un medio mínimo. Aún en otra modalidad, se selecciona un medio de sales minerales. Son particularmente preferidos los medios de sales minerales.
El medio de sales minerales consiste de sales minerales y una fuente de carbono tal como, por ejemplo, glucosa, sucrosa, o glicerol. Los ejemplos de medios de sales minerales incluyen, por ejemplo, el medio M9, medio Pseudomonas (ATCC 179), medio de Davis y Mingioli (ver, BD Davis & ES Mingioli (1950) en J. Bact. 60: 17-28). Las sales minerales utilizadas para hacer medios de sales minerales incluyen aquellas seleccionadas a partir de, por ejemplo, fosfatos de potasio, sulfato o cloruro de amoníaco, y minerales en residuos tales como cloruro de calcio, borato, y sulfatos de hierro, cobre, manganeso, y cinc. No se incluye ninguna fuente de nitrógeno orgánico, tal como peptona, tristona, aminoácidos, o un extracto de levadura, en un medio de sales minerales. En cambio, se utiliza una fuente de nitrógeno inorgánico y esta puede seleccionarse a partir de, por ejemplo, sales de amoníaco, amoníaco acuoso, y amoníaco gaseoso. Un medio de sales minerales referido contendrá glucosa como fuente de carbono. En comparación con el medio de sales minerales, el medio mínimo también puede contener sales minerales y una fuente de carbono, pero puede complementarse, por ejemplo, con niveles bajos de aminoácidos, vitaminas, peptonas, u otros ingredientes, aunque estos se añaden a niveles muy mínimos. En una modalidad, el medio puede prepararse utilizando los componentes listados en la Tabla 5 mostrada a continuación. Los componentes pueden añadirse en el siguiente orden: primero (NH )HPO4, KH2PO4 y ácido cítrico pueden disolverse en aproximadamente 30 litros de agua destilada, después puede añadirse una solución de elementos residuales, seguidos por la adición de un agente de antiespumante, tal como Ucolub N 1 15. Después de la esterilización térmica (tal como aproximadamente a 121 °C), pueden añadirse soluciones estériles del MgSO de glucosa y la tiamina-HCl. Puede alcanzar un control de pH a aproximadamente 6.8 utilizando amoníaco acuoso. Después puede añadirse agua destilada estéril a fin de ajustar el volumen inicial a 371 menos la solución madre de glicerol (123 mL). Los químicos se encuentran comercialmente disponibles por diversos proveedores, tales como Merck. Estos medios pueden permitir un cultivo de alta densidad celular (HCDC - high cell density cultivation) para el desarrollo de la especie Pseudomonas y las bacterias relacionadas. El HCDC puede comenzar como un proceso por lotes el cual es seguido por un cultivo de lotes alimentado en dos fases. Después del desarrollado ilimitado en la parte de lotes, el desarrollo puede controlarse a una tasa de desarrollo específica reducida durante un periodo de 3 tiempos de duplicación en los cuales la concentración de biomasa puede incrementarse varias veces. Se describen detalles adicionales de tales procedimientos de cultivo por Riesenberg, D.; Schulz, V. ; Knorre, W. A.; Pohl, H. D. ; Korz, D.; Sanders, E. A. ; Ross, A. ; Deckwer, W. D. (1991 ) "High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate" ("Cultivo de alta densidad celular de Escherichia coli a una tasa de desarrollo específica controlada") J Biotechnol:20(1 ) 17-27.
El sistema de expresión de acuerdo con la presente invención puede cultivarse en cualquier formato de fermentación. Por ejemplo, en la presente pueden emplearse los modos de fermentación por lotes, alimentación por lotes, semi-continuo, y continuo. Los sistemas de expresión de acuerdo con la presente invención son útiles para la expresión transgenética en cualquier escala (es decir, volumen) de fermentación. Consecuentemente, por ejemplo, pueden utilizarse volúmenes de fermentación de escala de microlitros, de escala de centilitros, y de escala de decilitros; y pueden utilizarse volúmenes de fermentación de escala de 1 litro y mayores. En una modalidad, el volumen de fermentación será igual o mayor a 1 litro. En otra modalidad, el volumen de fermentación será igual o mayor a 5 litros, 1 0 litros, 15 litros, 20 litros, 25 litros, 50 litros, 75 litros, 100 litros, 200 litros, 500 litros, 1000 litros, 200 litros, 5000 litros, 10000 litros o 50000 litros. En la presente invención, el desarrollo, cultivo, y/o fermentación de las células huésped transformadas se realiza en un rango de temperatura que permite la sobrevivencia de las células huésped, preferentemente a una temperatura en el rango de aproximadamente 4°C a aproximadamente 55°C, inclusive. Consecuentemente, por ejemplo, los términos "desarrollo" (y "desarrollar, "que desarrolla"), "cultivar (y "cultivo") , y "fermentación" (y "fermentar", "que fermenta"), como se utiliza en la presente en referencia a las células huésped de la presente invención, significan inherentemente "desarrollo", "cultivar", y "fermentación", en un rango de temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 55°C, inclusive. Además, "desarrollo" se utiliza para indicar ambos estados biológicos y/o agrandamiento de división celular activa, así como también estados biológicos en los cuales se sostiene metabólicamente una célula de no división y/o de no agrandamiento, siendo sinónimo el uso posterior del término "desarrollo" con el término "mantenimiento".
Densidad celular Una ventaja adicional por utilizar Pseudomonas fluorescens en la expresión de proteínas segregadas recombinantes incluye la capacidad de Pseudomonas fluorescens de desarrollarse a altas densidades celulares en comparación con E. coli u otros sistemas de expresión bacteriales. Para este fin, los sistemas de expresión de Pseudomonas fluorescens de acuerdo con la presente invención pueden proporcionar una densidad celular de aproximadamente 20 g/L o más. Los sistemas de expresión de Pseudomonas fluorescens de acuerdo con la presente invención puede proporcionar asimismo una densidad celular de al menos aproximadamente 70 g/L, como se establece en términos de biomasa por volumen, midiéndose la biomasa como peso celular seco. En una modalidad, la densidad celular será de al menos 20 g/L. En otra modalidad, la densidad celular será de al menos 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 1 10 g/L, 120 g/L, 1 30 g/L, 140 g/L, o al menos 150 g/L. En otras modalidades, la densidad celular en inducción se encontrará entre 20 g/L y 150 g/L; 20 g/L y 120 g/L; 20 g/L y 80 g/L; 25 g/L y 80 g/L; 30 g/L y 80 g/L; 35 g/L y 80 g/L; 40 g/L y 80 g/L; 45 g/L y 80 g/L; 50 g/L y 75 g/L; 50 g/L y 70 g/L, 40 g/L y 80 g/L.
Aislamiento de Proteína o Péptido de Interés En términos generales, el proceso proporciona un incremento en el nivel de proteína recombinante procesada correctamente o apropiadamente, en comparación con sistemas de expresión convencional. En particular, la invención proporciona un nivel incrementado apropiadamente. En algunas modalidades, la invención proporciona un proceso para mejorar la solubilidad de una proteína o péptido recombinante en una célula huésped. El término "soluble" como se utiliza en la presente re refiere a que la proteína no se precipita por centrifugación entre aproximadamente 5,000 y 20,000 x gravedad cuando gira durante 10-30 minutos en un regulador bajo condiciones fisiológicas. Las proteínas solubles no son parte de un cuerpo de inclusión u otra masa precipitada. De manera similar, "insoluble" se refiere a la proteína o péptido que puede precipitarse por centrifugación entre 5,000 y 20,000 x gravedad cuando gira durante 10-30 minutos en un regulador bajo condiciones fisiológicas. Las proteínas o péptidos insolubles pueden ser parte de un cuerpo de inclusión u otra masa precipitada. El término "cuerpo de inclusión" se refiere a que incluye cualquier cuerpo intracelular contenido dentro de una célula en la que se ha secuestrado un agregado de proteínas o péptidos. La invención también puede mejorar la recuperación de proteínas o péptidos recombinantes activos. Los niveles de proteína activa pueden medirse, por ejemplo, midiendo la interacción entre un polipéptido identificado y uno padre, variante de polipéptido, polipéptido sustituido por segmentos y/o polipéptido sustituido por residuos por cualquier prueba conveniente in vitro o in vivo. Consecuentemente, pueden utilizarse pruebas in vitro para determinar cualquier interacción detectable entre una proteína identificada y un péptido de interés, por ejemplo, entre la enzima y el substrato, entre la hormona y el receptor de hormona, entre el anticuerpo y el antígeno. etc. Tal detección puede incluir la medición de cambios colorimétricos, cambios en la radioactividad, cambios en la solubilidad, cambios en el peso molecular como se mide por los procesos de electrofóresis y/o de exclusión de gel, etc. Las pruebas in vivo incluyen, pero no se limitan a, pruebas para detectar efectos fisiológicos, por ejemplo, ganancia en peso, cambio en el equilibrio electrolítico, cambio en el tiempo de coagulación sanguínea, cambios en la disolución de coagulación y la inducción de la respuesta antigénica. En términos generales, puede utilizarse cualquier prueba in vivo siempre y cuando exista un parámetro variable a fin de detectar un cambio en la interacción entre el polipéptido identificado y el de interés. Ver, por ejemplo, la Patente de E.U. No. 5,834,250. A fin de liberar las proteínas recombinantes del periplasma, se han utilizado tratamientos que involucran químicos tales como cloroformo (Ames et al. (1984) J. Bacteriol. 160: 1 1 81 -1 183), guanidina-HCI, y Tritón X-100 (Naglak y Wang (1990) Enzyme Microb. Technol. (Tecnol. de Microb. de Enzimas), 12: 603-61 1 ). Sin embargo, estos químicos no son inertes y pueden tener efectos perjudiciales sobre muchos productos de proteínas recombinantes o procedimientos de purificación subsecuentes. El tratamiento de glicina de células de E. coli, que ocasiona la permeabilización de la membrana exterior, también se ha reportado para liberar el contenido periplásmico (Ariga et al. (1 989) J. Ferm. Bioeng. , 68: 243-246). Los métodos más ampliamente utilizados de liberación periplásmica de proteína recombinante son choques osmóticos (Nosal y Heppel (1966) J. Biol. Chem. , 241 : 3055-3062; Neu y Heppel (1965) J. Biol. Chem. , 240: 3685-3692), tratamiento de clara de huevo de gallina (HEW - hen eggwhite)-lisozima/ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA - ethylenediamine tetraacetic acid) (Neu y Heppel (1 964) J. Biol. Chem. , 239: 3893-3900; Witholt et al. (1976) Biochim. Biophys. ActaK, 443: 534-544; Pierce et al. (1995) ICheme Research Event, 2: 995-997), y un tratamiento combinado de HEW-lisozima/choque osmótico (French et al. (1996) Enzyme and Microb. Tech. , 19: 332-338). El método de French implica la resuspensión de las células en un regulador de fragmentación seguido de la recuperación del fragmento periplásmico, donde el choque osmótico sigue inmediatamente al tratamiento de lisozima. También se describen los efectos de la sobreexpresión de la proteína recombinante, a-amilasa de S. thermoviolaceus, y la fase de desarrollo del organismo huésped en la recuperación. Típicamente, estos procedimientos incluyen una interrupción inicial del medio de estabilización osmótica seguido por la liberación selectiva en un medio de no estabilización. La composición de estos medios (pH, agente protector) y los métodos de interrupción utilizados (cloroformo, HEW-lisozima, EDTA, sonificación) varían entre procedimientos específicos reportados. Una variación en el tratamiento de HEW-lisozima/EDTA utilizando un detergente iónico bipolar en lugar de EDTA se describe por Stabel et al. (1994) Veterinary Microbio!. (Microbiol. Veterinaria), 3: 307-314. Para una revisión general del uso de sistemas de enzimas líticas intracelulares para interrumpir E. coli, ver Dabora y Cooney (1990) en Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology (Avances en el diseño bioquímico/Biotecnología), Vol. 43, A. Fiechter, ed. (Springer-Verlag:Berlin), págs. 1 1 -30. Los métodos convencionales para la recuperación de una proteína recombinante del citoplasma, como proteína soluble o partículas refractarias, involucraron la desintegración de la célula bacterial por fractura mecánica. La interrupción mecánica involucra típicamente la generación de cavitación local en una suspensión líquida, agitación rápida con cuentas rígidas, sonificación, o moliendo la suspensión celular (Bacterial Cell Surface Techniques (Técnicas de superficie celular bacterial), Hancock y Poxton (John Wiley & Sons Ltd. , 1988), Capítulo 3, pág. 55). La HEW-lisozima actúa bioquímicamente para hidrolizar la estructura principal de peptidoglican de la pared celular. El método se desarrolló primeramente por Zinder y Arndt (1 956) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 42: 586-590, quienes trataron E. coli con albúmina de huevo (la cual contiene HEW-lisozima) para producir esferas celulares redondas conocidas posteriormente como esferoplastos. Estas estructuras mantuvieron algunos componentes de pared celular pero tuvieron áreas superficiales grandes en las cuales se expuso la membrana citoplásmica. La Patente de E. U. No. 5, 169,772 describe un método para purificar heparinasa de la bacteria que comprende interrumpir la envoltura de la bacteria en un medio estabilizado osmóticamente, por ejemplo, solución de sacarosa al 20% utilizando, por ejemplo, EDTA, lisozima, o un compuesto orgánico, liberando las proteínas de tipo no heparinasa del espacio periplásmico de las bacterias interrumpidas exponiendo la bacteria a un regulador de baja resistencia iónica, y liberando las proteínas de tipo heparinasa exponiendo las bacterias enjuagadas de baja resistencia iónica a una solución de sal regulada. Se han utilizado muchas modificaciones diferentes de estos métodos sobre un rango amplio de sistemas de expresión con grados variables de éxitos (Joseph-Liazun et al. 81990) Gene, 86: 291 -295; Cárter et al. (1992) Blo/Technology, 10: 163-167). Se han reportado esfuerzos para inducir cultivos celulares recombinantes a que produzcan lisozimas. EP 0 155 189 describe un medio para inducir un cultivo celular recombinante para producir lisozimas, lo cual comúnmente esperaría que mate tales células huésped por medio de la destrucción o lisis de la estructura de pared celular. La Patente de E.U . No. 4,595,658 describe un método para facilitar la externalización de proteínas transportadas al espacio periplásmico de E. coli. Este método permite el aislamiento selectivo de proteínas que se encuentran localizadas en el periplasma sin necesidad de tratamiento de lisozima, moliendo mecánicamente, o por tratamiento de choque osmótico de células. La Patente de E. U. No. 4,637,980 describe la producción de un producto bacterial transformando un lisógeno sensible a la temperatura con una molécula de ADN que codifica, directamente o indirectamente, para el producto, cultivando el transformante bajo condiciones permisivas que expresen el producto genético intracelularmente, y externalizando el producto elevando la temperatura para inducir las funcione codificadas de fagos. Asami et al. (1997) J. Ferment. And Bioeng. 83: 51 1 -516 describe la interrupción sincronizada de las células de E. coli por la infección de fagos T4, y Tanji et al. (1998) J. Ferment. and Bioeng., 85: 74-78 describe la expresión controlada de genes de lisis codificados en fagos de T4 para una suave interrupción de las células E. coli. Después de la lisis celular, el ADN genómico se fuga del citoplasma hacia el medio y da como resultado un incremento significativo en la viscosidad de los fluidos que pueden impedir la sedimentación de los sólidos en un campo centrífugo. En ausencia de fuerzas de cizallamiento tales como las ejercidas durante la interrupción mecánica para segmentar los polímeros de ADN, la tasa de sedimentación más lenta de los sólidos por el fluido viscoso da como resultado una mala separación de los sólidos y líquidos durante la centrifugación. Aparte de la fuerza de cizallamiento mecánico, existen enzimas nucleolíticas que degradan al polímero de ADN. En E. Coli, el gen endógeno endA codifica para una endonucleasa (el peso molecular de la proteína madura es de aproximadamente 24.5 kD) que normalmente se segrega al periplasma y segmenta el ADN en oligodeoxiribonucleótidos de manera endonucleolítica. Se ha sugerido que endA se expresa de manera relativamente débil por E. coli (Wackernagel et al. (1995) Gene 154: 55-59). En una modalidad, no se requiere ninguna condición adicional o agente de mejoras de enlace de bisulfuro con objeto de recuperar el polipéptido identificado con contenido de enlace de bisulfuro en forma soluble y activo desde la célula huésped. En una modalidad, el péptido transgénico, el polipéptido, la proteína, o un fragmento de los mismos tiene una conformación intramolecular plegada en su estado activo. En una modalidad, el péptido transgénico, el polipéptido, la proteína, o un fragmento contiene al menos un enlace de bisulfuro intramolecular en su estado activo; y quizá hasta 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 o más enlaces de bisulfuro. Las proteínas de esta invención pueden aislarse, purificarse hasta una pureza substancial por técnicas convencionales bien conocidas en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, sulfato de amoníaco o precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de níquel, cromatografía de hidroxilapatíta, cromatografía de fase inversa, cromatografía de lectina, electrofóresis preparativa, solubilización de detergente, precipitación selectiva con substancias tales como cromatografía de columna, métodos de inmunopurificación, y otros. Por ejemplo, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas pueden fusionarse inversamente a un ligante.
Con el ligante apropiado, la proteína puede absorberse selectivamente a una columna de purificación y liberarse después de la columna en una forma relativamente pura. La proteína fusionada se elimina después por actividad enzimática. Además, la proteína puede purificarse utilizando columnas de inmunoafinidad o columnas de Ni-NTA. Las técnicas generales se describen adicionalmente en, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (Purificación de Proteínas: Principios y Práctica), Springer-Verlag: N.Y. (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification (Guía para la Purificación de Proteínas), Academia Press (1990); Patente de E.U. No. 4,51 1 ,503; S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Técnicas de Purificación de Proteínas: un Planteamiento Práctico) (Serie Planteamiento práctico), Oxford Press (2001 ); D. Bollag, et al. , Protein Methods (Métodos de Proteína), Wiley-Lisa, Inc. (1996); AK Patra et al. , Protein Expr Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000); y R. Mukhija, et al. , Gene 165(2): pág. 303-6 (1995). Ver también, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y complementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" ("Guía para la Purificación de Proteínas"), Methods ¡n Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, et al. (1996 y Complementos periódicos) Current Protocols in Protein Science (Protocolos actuales en la ciencia de las proteínas) Wiley/Greene, NY; y literatura del fabricante sobre el uso de productos de purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, Calif. La combinación con técnicas recombinantes permiten la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia de BANDERA o un equivalente que puede fusionarse mediante una secuencia de proteasa eliminable. Ver también, por ejemplo, Hochuli (1 989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" ("Purificación de proteínas recombinantes con absorbents de quelatos metálico") en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods (Ingeniería Genética, Principios y Métodos) 12:87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc. , Chatsworth, Calif. La detección de la proteína expresada se alcanza por métodos conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, radioinmunopruebas, técnicas de Western clotting o de inmunoprecipitación. La enzima producida y expresada recombinantemente puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes por numerosos métodos, por ejemplo, puede emplearse la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC - high performance liquid chromatography) para los pasos de purificación final, según sea necesario. Algunas proteínas expresadas en esta invención pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Son adecuados varios protocolos para la purificación de las proteínas provenientes de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la purificación de los cuerpos de inclusión involucra típicamente la extracción, separación y/o purificación de cuerpos de inclusión mediante la interrupción de las células huésped, por ejemplo, por incubación en un regulador de 50 mM de Tris/HCl con un pH de 7.5, 50 mM de NaCI, 5 mM de MgCI2, 1 mM de DTT, 0.1 mM de ATP, y 1 mM de PMSF. La suspensión celular se somete a lisis típicamente utilizando 2-3 pasos por una Prensa Francesa. La suspensión celular también puede homogenizarse utilizando un Polytron (Brinkrnan Instruments) o sonificarse en hielo. Los métodos alternos para someter a lisis a las bacterias son aparentes para aquellos expertos en la materia (ver, por ejemplo, Sambrook et al. , supra; Ausubel et al., supra). Si es necesario, los cuerpos de inclusión pueden solubilizarse, y la suspensión de células sometidas a lisis típicamente puede centrifugarse para eliminar la materia insoluble indeseada. Las proteínas que formaron los cuerpos de inclusión pueden renaturalizarse por dilución o diálisis con un regulador compatible. Los solventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, urea (desde aproximadamente 4 M hasta aproximadamente 8M), formamida (al menos aproximadamente 80%, base de volumen/volumen), e hidrocloruro de guanidina (desde aproximadamente 4 M hasta aproximadamente 8 M). Aunque el hidrocloruro de guanidina y los agentes similares son desnaturalizadotes, esta desnaturalización no es irreversible y la renaturalización puede ocurrir después de la eliminación (por diálisis, por ejemplo) o dilución del desnaturalizante, permitiendo la reformación de proteína activa inmunológicamente y/o biológicamente. Otros reguladores adecuados son conocidos por los expertos en la materia. Alternativamente, es posible purificar las proteínas o péptidos recombinantes provenientes del periplasma de huésped. Después de la lisis de la célula huésped, cuando la proteína recombinante se exporta al periplasma de la célula huésped, la función periplásmica de las bacterias puede aislarse por un choque osmótico frío además de otros métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Para aislar las proteínas recombinantes del periplasma, por ejemplo, las células bacteriales pueden centrifugarse para formar un comprimido. El comprimido puede resuspenderse en un regulador con contenido de sucrosa al 20%. Para someter a lisis a las células, las bacterias pueden centrifugarse y el comprimido puede resuspenderse en 5 mM de MgSO4 helado y mantenerse en un baño helado durante aproximadamente 10 minutos. La suspensión celular puede centrifugarse y el sobrenatátil puede decantarse y guardarse. Las proteínas recombinantes presentes en el sobrenatátil pueden separarse de las proteínas de huésped por técnicas de separación convencionales bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Una fragmentación de sal inicial puede separar muchas de las proteínas de células huésped no deseadas (o proteínas derivadas del medio de cultivo celular) provenientes de la proteína recombinante de interés. Uno de tales ejemplos puede ser sulfato de amoníaco. El sulfato de amoníaco precipita las proteínas reduciendo eficazmente la cantidad de agua en la mezcla de proteína. Las proteínas se precipitan después sobre la base de su solubilidad. Entre más hidrofóbica sea una proteína, es más probable que se precipite a concentraciones menores de sulfato de amoníaco. Un protocolo típico incluye añadirle sulfato de amoníaco saturado a una solución de proteína de manera que la concentración de sulfato de amoníaco resultante se encuentra entre 20-30%. Esta concentración precipitará las proteínas más hidrofóbicas. Después, se descarta el precipitado (a menos que la proteína de interés sea hidrofóbica) y se añade sulfato de amoníaco al sobrenatátil a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. Después, el precipitado se solubiliza en regulador y se elimina el exceso de sal si es necesario, sea mediante diálisis o diafiltración. Otros métodos que se basan en la solubilidad de proteínas, tales como precipitación de etanol fría, son bien conocidos por aquellos expertos en la materia y pueden utilizarse para fragmentar mezclas de proteínas complejas. Puede utilizarse el peso molecular de una proteína recombinante para aislarla de proteínas de tamaños mayores y menores utilizando ultrafiltración mediante membranas de diferentes tamaños de poros (por ejemplo, membranas de Amicon o Millipore). Como primer paso, la mezcla de proteína puede ultrafiltrarse mediante una membrana con un tamaño de poro que tiene un corte de peso molecular más bajo que el peso molecular de la proteína de interés. El retenedor de la ultrafiltración puede entonces ultrafiltrarse contra una membrana con un corte molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará por la membrana en el filtrado. El filtrado puede cromatografiarse después como se describe a continuación. Las proteínas recombinantes también pueden separarse de otras proteínas sobre la base de su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad, y afinidad para ligantes. Además, los anticuerpos surgidos contra proteínas pueden conjugarse en matrices de columnas y las proteínas inmunopurificadas. Todos estos métodos son bien conocidos en la materia. Será aparente para el experto en la materia que pueden ejecutarse técnicas cromatográficas a cualquier escala y utilizando y puede utilizar equipo proveniente de diferentes fabricantes (por ejemplo, Pharmacia Biotech). En la práctica, las proteínas heterólogas seleccionadas como objetivo en el periplasma frecuentemente se encuentran en el caldo (ver la Patente Europea No. EP 0 288 451 ), posiblemente debido al daño a o a un incremento en la fluidez de la membrana celular exterior. La tasa de esta secreción "pasiva" puede incrementarse utilizando una variedad de mecanismos que permeabilizan la membrana celular exterior: colicana (Miksch et al. (1997) Arch. Microbiol. 167: 143-150); tasa de desarrollo (Shokri et al. (2002) App Microbiol Biotechnol (Biotecnol. de Microbiol. Api.) 58:386-392); sobreexpresión de Toll ll (Wan y Baneyx (1998) Protein Expression Purif. (Purif. de Expresión de Proteínas) 14: 1 3-22); proteína de liberación de bacteriocina (Hsiung et al. (1989) Bio/Technology 7: 267-71 ), proteína de lisis A de colicana (Lloubes et al. (1993) Biochimie 75: 451 -8) mutantes que fugan proteínas periplásmicas (Furlong y Sundstrom (1989) Develompents in Indus. Microbio. (Desarrollos en Microbio. Indust.) 30: 141 -8); asociados de fusión (Jeong y Lee (2002) Appl. Environ. Microbio. (Microbio. Ambient. Api.) 68:4979-4985); recuperación por choque osmótico (Taguchi et al. (1990) Biochimica Biophysica Acta 1049: 278-85). Se ha utilizado el transporte de proteínas diseñadas al espacio periplásmico con la subsecuente localización en el caldo para producir las proteínas activas y apropiadamente segmentadas en E. coli (Wan y Baneyx (1998) Protein Expression Purif. (Purif. de Expresión de Proteínas) 14: 13-22; Simmons et al. (2002) J. immun. Meth. 263: 133-147; Lundell et al. (1990) J. Indust. Microbio. 5: 215-27). Las bacterias gram-negativas han evolucionado numerosos sistemas para la exportación de proteínas a través de sus membranas duales (ver la Figura 1 ). Estas rutas de secreción incluyen, por ejemplo: la trayectoria ABC (Tipo I), la trayectoria Path/Fla (Tipo lll), y la trayectoria de Path/Vir (Tipo IV) para el desplazamiento en un paso a través tanto del plasma como de la membrana exterior; las trayectorias de Sec (Tipo I I), Tat, MscL y Holinas para el desplazamiento a través de la membrana de plasma; y las trayectorias de Sec más porina acomodadora fimbrial (FUP), Sec más autotransportadora (AT), Sec más dos secreciones socias (TPS), Sec más rama terminal principal (MTB), y Tat más MTB para desplazamientos en dos pasos a través de las membranas de plasma y exteriores. No todas las bacterias tienen todas estas trayectorias de secreción. Los sistemas de tres proteínas (tipos I, l l l y IV) segregan proteínas a través de ambas membranas en un solo paso de acoplamiento de energía. Cuatro sistemas (Sec, Tat, MscL, y Holinas) segregan solamente a través de la membrana interior, y otros cuatro sistemas (MTB, FUP, AT y TPS) segregan solamente a través de la membrana interior, y otros cuatro sistemas (MTB, FUP, AT y TPS) segregan solamente a través de la membrana exterior. Las proteínas que se transportan al periplasma que utilizan las señales de secreción o células huésped de la invención, pueden exportarse activamente al medio extracelular en un paso adicional. Los mecanismos conocidos para el transporte activo generalmente se dan mediante un autotransportador, un sistema de secreción de dos asociados, un sistema de ramificación terminal principal o una porina acomodadora fimbrial. Las proteínas que se transportan en el periplasma utilizando las señales de secreción o células huésped de la invención, pueden exportarse activamente al medio extracelular en un paso adicional. Los mecanismos conocidos para transporte activo generalmente son un autotransportador, un sistema de secreción de dos asociados, un sistema de ramificación terminal principal o una porina acomodadora fimbrial. Una proteína que se transporta mediante una trayectoria de autotransporte (AT) usualmente contiene un péptido de señal de tipo Sec terminal en N, un dominio de pasajero central y 250-300 residuos aminoácidos terminales en C del dominio a. Los dominios a de diferentes autotransportadores son altamente homólogos, mientras que los dominios de pasajero varían significativamente en secuencia y tamaño. Después de la secreción por la membrana interna por el sistema de Sec y la segmentación del péptido de señal, los oligómeros de los dominios a forman una porina de membrana exterior, mediante la cual se segrega el dominio de pasajero (Veiga ef al. (2002) EMBO J., 21 :2122-2131 ). El dominio de pasajero se libera al ambiente o permanece sobre la superficie celular. La mayoría de los autotransportadores se encuentran relacionados con la virulencia de los patógenos Gram-negativos. El sistema de secreción de dos asociados (TPS) es funcionalmente similar al sistema de AT, aunque las proteínas no son conocidas por compartir la homología de secuencia. Un sistema de TPS se encuentra compuesto de dos proteínas con contenido de péptidos de señal codificados por genes vecinos. Una proteína tiene un dominio de pasajero y la otra tiene un dominio a. Ambas proteínas se segregan al periplasma por el sistema de Sec y la proteína con el dominio de pasajero se exporta adicionalmente mediante el poro de membrana exterior formado por la proteína con el dominio a (Jacob-Dubisson eí al. (2001 ) Mol Microbiol. 40:306-13) . La mayor parte de las proteínas de substratos de los sistemas de TPS son proteínas grandes de 1651 a 5640 aminoácidos. Aunque son altamente similares en los 250 residuos terminales en N, los cuales son la secuencias seleccionadas como objetivo para los transportadores, sus secuencias terminales en C son muy divergentes. La rama terminal principal (MTB) es un complejo grande que desplaza las proteínas ya plegadas del periplasma al medio extracelular. El complejo consiste de al menos 10 constituyentes de proteína, algunos de los cuales comparten la homología de secuencia con el sistema de biogénesis de pelo de tipo 4 (Pugsley (1993) Microbiol. Rev. 57:50-1 08). Los genes que codifican un sistema de MTB funcional forman comúnmente un grupo en el genoma. La señal de selección como objetivo y el mecanismo molecular de secreción de proteína por la MTB no son bien comprendidos. El sistema de FUP es responsable de la biogénesis de numerosas fimbrias (pelos) en protobacterias y cianobacterias Gram-negativas. El operón que codifica las proteínas estructurales de cada fimbria codifica también una proteína chaperona periplásmica específica a la fimbria y una proteína acomodadora de membrana exterior específica a la fimbria. Todas estas proteínas pueden sintetizarse como proteínas precursoras con los péptidos de señal de tipo Sec. Después del desplazamiento a través de la membrana interior por el sistema de Sec, las subunidades de pelo se unen a las proteínas de chaperona, lo cual evita el ensamble independiente de pelos en el periplasma. La interacción entre la chaperona y la proteína acomodadora libera las subunidades de proteína, las cuales interactúan subsecuentemente una con otra y se segregan mediante la proteína acomodadora a través de la membrana exterior.
Renaturalización y Repliegue La proteína insoluble puede renaturalizarse o replegarse para generar una conformación estructural de proteínas secundarias y terciarias. Pueden utilizarse pasos de repliegue de proteínas, según sea necesario, para completar la configuración del producto recombinante. El repliegue y la renaturalización pueden realizarse utilizando un agente conocido en la materia para mejorar la disociación/asociación de proteínas. Por ejemplo, la proteína puede incubarse con ditiotreitol seguida por incubación con sal de disodio de glutationa oxidada seguida por incubación con un regulador que contiene un agente de repliegue tal como urea. La proteína recombinante también puede renaturalizarse, por ejemplo, sometiéndola a diálisis contra una salmuera regulada con fosfato (PBS - phosphate-buffered saline) o 50 mM de acetato de Na, pH de 6 de regulador más 200 mM de NaCl. Alternativamente, la proteína puede replegarse mientras se inmoviliza en una columna, tal como la columna de Ni-NTA utilizando un gradiente de urea lineal de 6M-1 M en 500 mM de NaCI, glicerol al 20%, 20 mM de Tris/HCl con un pH de 7.4, que contiene inhibidores de proteasa. La renaturalización puede realizarse sobre un periodo de 1 .5 horas o más. Después de la renaturalización, las proteínas pueden eludirse por la adición de 250 mM de imidazola. La imidazola puede eliminarse por un paso final de diálisis contra PBS o 50 mM de acetato de sodio con un pH de 6 de regulador más 200 mM de NaCl. La proteína purificada puede almacenarse a 4 grados C o congelarse a -80 grados C. Otros métodos incluyen, por ejemplo, aquellos que pueden describirse en MH Lee et al., Protein Expr. Purif. , 25(1 ): pág. 166-73 (2002), W. K. Cho et al. , J. Biotechnology, 77(2-3): pág. 169-78 (2000), Ausubel, et al. (1987 y complementos periódicos), Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" ("Guía para la purificación de proteínas"), Methods in Enzymology (Métodos en Enzimología) vol. 182, y otros volúmenes en esta serie, Coligan, et al. (1996 y Complementos periódicos) Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY, S. Roe, Protein Purification Techniques: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford Press (2001 ); D. Bollag, et al. , Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc. (1996).
Análisis de Proteína o Péptido Activo Las proteínas activas pueden tener una actividad específica de al menos 20%, 30%, o 40%, y preferentemente al menos 50%, 60%, o 70%, y muy preferentemente al menos 80%, 90%, o 95% de la proteína o péptido nativa(o) de la que se deriva la secuencia. Además, la especificidad de substrato (kcat/ m) opcionalmente es substancialmente similar a la proteína o péptido nativa(o). Típicamente, kcat/Km será de al menos 30%, 40% , o 50% que de la proteína o péptido nativa(o); y más preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, o 90%. Los métodos para analizar y cuantificar las mediciones de la actividad de proteína y péptidos y la especificidad de substratos (kcat/Km), son bien conocidos por aquellos expertos en la materia. La actividad de una proteína o péptido recombinante producida de acuerdo con la presente invención puede medirse por cualquier prueba convencional in vitro o in vivo específica a la proteína conocida en la materia. La actividad de la proteína o péptido recombinante segregada(o) producida(o) de Pseudomonas puede compararse con la actividad de la proteína nativa correspondiente para determinar si la proteína recombinante exhibe una actividad substancialmente similar o equivalente a la actividad observada generalmente en la proteína o péptido nativa(o) bajo las mismas condiciones fisiológicas o similares. La actividad de la proteína recombinante puede compararse con una actividad convencional de proteína o péptido nativa(o) establecida(o) con anterioridad. Alternativamente, la actividad de la proteína o péptido recombinante puede determinarse en una prueba comparativa simultánea, o substancialmente simultánea con la proteína o péptido nativa(o). Por ejemplo, puede utilizarse una prueba in vitro para determinar cualquier interacción detectable entre una proteína o péptido recombinante y un objetivo, por ejemplo, entre una enzima expresada y el substrato, entre la hormona expresada y el receptor de hormonas, entre el anticuerpo expresado y el antígeno, etc. Tal detección puede incluir la medición de cambios colorimétricos, cambios de proliferación, muerte celular, rechazo celular, cambios en la radioactividad, cambios en la solubilidad, cambios en el peso molecular como se midió por los métodos de electrofóresis de gel y/o exclusión de gel, capacidades de fosforilación, pruebas de especificidad de anticuerpos tales como las pruebas ELISA, etc. Además, las pruebas in vivo incluyen, pero no se limitan a, pruebas para detectar los efectos fisiológicos de la proteína o péptido nativa(o), por ejemplo, ganancia en peso, cambio en el equilibrio electrolítico, cambio en el tiempo de coagulación sanguínea, cambios en la disolución de la coagulación e inducción de la respuesta antigénica. Generalmente, cualquier prueba in vitro o in vivo puede utilizarse para determinar la naturaleza activa de la proteína o péptido recombinante producida(o) de Pseudomonas que permite un análisis comparativo de la proteína o péptido nativa(o) siempre y cuando tal actividad sea calculable. Alternativamente, las proteínas o péptidos producidos en la presente invención pueden evaluar la capacidad de estimular o inhibir la interacción entre la proteína o péptido y una molécula que normalmente interactúa con la proteína o péptido, por ejemplo, un substrato o un componente de la trayectoria de señal con la que interactúa normalmente la proteína nativa. Tales pruebas típicamente pueden incluir los pasos para combinar la proteína con una molécula de substrato bajo condiciones que le permiten a la proteína o péptido interactuar con la molécula objetivo, y detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la proteína y la molécula objetivo. Las pruebas que pueden utilizarse para determinar la actividad de proteína o péptido se describen, por ejemplo, en Ralph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132: 1858 o Saiki et al. (1 981 ) J. Immunol. 127: 1044, Steward, W. E. I I (1980) The Interferon Systems (Los sistemas de interferón). Springer-Verlag, Viena y Nueva York, Broxmeyer, H. E. , et al. (1982) Blood (Sangre) 60:595, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a. , Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. , E. F. Fritsch y T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques" ("Métodos en Enzimología: Guía para Técnicas de Clonación Molecular"), Academic Press, Berger, S. L. y A. R. Kimmel eds., 1987, AK PATRA et al., Protein Exp. Purif, 18(2): p/ 182-92 (2000), Kodama et al. , J Biochem. 99: 1465-1472 (1 986); Stewart et al. , Proc Nat'l Acad. Sci. EUA 90: 5209-5213 (1993); (Lombrillo et al., J . Cell Biol. 128: 107-1 15 (1995); (Vale et al. , Cell 42:39-50 (1985)
Proteínas de interés La célula huésped puede diseñarse para expresar una proteína o péptido recombinante. Esta puede ser cualquier especie y de cualquier tamaño. Sin embargo, en algunas modalidades, la proteína o péptido recombinante es una proteína o péptido terapéuticamente útil. En algunas modalidades, la proteína puede ser una proteína de mamífero, por ejemplo, una proteína humana, y puede ser, por ejemplo, un factor de crecimiento, una citoquina, una quimioquina o una proteína de sangre. La proteína o péptido recombinante puede procesarse de manera similar a la proteína o péptido nativa(o). En algunas modalidades, la proteína o péptido no incluye una señal de secreción en la secuencia de codificación. En algunas modalidades, la proteína o péptido recombinante es menor que 100kD, menor que 50 kD, o menor que 30 kD de tamaño. En algunas modalidades, la proteína o péptido recombinante es un péptido de al menos 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos. Se encuentra disponible públicamente vasta ¡nformación de secuencias requerida para las técnicas de genética molecular y de ingeniería genética. El acceso para completar las secuencias nucleótidas de los mamíferos, así como también, las secuencias humanas, genéticas, de cADN, las secuencias de aminoácidas y genomas pueden obtenerse del GenBank en la dirección de URL http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Entrez. También puede obtenerse información adicional proveniente de GeneCards, una enciclopedia electrónica que integra información acerca de los genes y sus productos y aplicaciones biomédicas proveniente del Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics (Instituto Weizmann de Ciencias Genómicas e Informática) (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards). también puede obtenerse información de secuencia de nucleótidos de la Base de datos de Secuencia de Nucleótidos de EMBL (http://www.ebi.ac. uk/embl/) o el Banco de datos de ADN de Japón (DDBJ - DNA Databank of Japan, http://www.ddbi.nig.ac.ip/: sitios adicionales para información sobre las secuencias de aminoácidos incluyen el sitio web de recursos de información de proteínas de Georgetown (http://www-nrbf.georqetown.edu/pir/) y Swiss-Prot (http://au.expasy.org/sprot/sprot/top.html) Los ejemplos de proteínas que pueden expresarse en esta invención incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humano; hormona de crecimiento bovino; factor de liberación de hormona del crecimiento; hormona paratiroides; hormona de estimulación de tiroides; lipoproteínas; a1 -antitripsina; cadena A de insulina; cadena B insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona de estimulación folicular; calcitonina; hormona lutetinizante; glucagon; factores de coagulación tales como el factor VI IC, factor IX, factor de tejido, y el factor de von Willebrands; factores de anti-coagulación tales como la Proteína C; factor naturiético atrial; agente tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o el activador de plasminógeno de tipo tejido (t-PA); bombesina; trombina; factor del crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; enkefalinasa; una albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; substancia de inhibición de mullerian; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; una proteína microbial, tal como la beta-lactamasa; Dnasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF - vascular endotelial growth factor); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF - brain-derived neurotrophic factor), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-ß; cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardiaca) tales como la cardiotrofina-1 (CT-1 ); factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF - platelet-derived growth factor); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFG F y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF - epidermal growth factor); factor de crecimiento de transformación (TGF - transforming growth factor) tal como TGF-alfa y TGF-ß, incluyendo TGF-ß1 , TGF-ß2, TGF-ß3, TGF-ß4, o TGF-ß5; proteínas de unión de factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas de CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-1 9; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP - bone morphogenetic protein); un interferón tal como interferón-alfa, -beta, y -gamma; factores de estimulación de colonias (CSFs - colony stimulating factors), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquinas (ILs), por ejemplo, I L-1 a IL-1 0; anticuerpo de anti-HER-2; dismutasa de superóxido; receptores de células T; proteínas de membranas superficiales; factor de aceleración de retrasos; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura de SIDA; proteínas de transporte; receptores de dirección de objetivo; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos listados con anterioridad. En algunas modalidades, la proteína o péptido puede seleccionarse a partir de IL-1 , IL-1 a, IL-1 b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1 0, IL-1 1 , IL-12, IL-12elasti, IL-1 3, IL-15, IL-16, IL-18, lL-1 8BPa, IL-23, lL-24, VIP, eritroppoyetina, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), MSF, ligante FLT-3, EGF, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF; por ejemplo, aFGF (FGF-1 ), ßFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, o FGF-7), factores de crecimiento de tipo insulina (por ejemplo, IGF-1 , IGF-2); factores de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF, Linfotoxina), factores de crecimiento nervioso (por ejemplo, NGF - nerve growth factors), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); interferones (por ejemplo, IFN-a, IFN-ß, IFN-?); factor inhibidor de leucemia (LIF - leucemia inhibitory factor); ciliary neurotrophic factor (CNTF - ciliary neurotrophic factor); oncostatina M; factor de células germinales (SCF - stem cell factor); factores de crecimiento de transformación (por ejemplo, TGF- a, TGF-ß1 , TGF-ß2, TGF-ß3); superfamilia de TNF (por ejemplo, LIGHT/TNFSF14, STALL-1 /TNFSF1 3B (BLy5, BAFF, THANK), TNFalfa/TNFSF2 y TWEAK/TNFSF12); o quimioquinas (BCA-1/BLC-1 , BRAK/Kec, CXCL16, CXCR3, ENA-78/LIX, Eotaxina-1 , Eotaxina-2/MPI F-2, Exodus-2/SLC, Fractalquina/Neurotactina, GROalfa/MGSA, HCC-1 , l-TAC, Linfotactina/ATAC/SCM, MCP-1 /MCAF, MCP-3, MCP-4, MDC/STCP-1 /ABCD-1 , M I P- 1 D , M I P- 1 D , M I P-2G/GRO? , MIP-3a/Exodus/LARC, MIP-3/Exodus-3/ELC, MIP-4/PARC/DC-CK1 , PF-4, RANTES, SDF1 , TARC, o TECK). En una modalidad de la presente invención, se proporciona la producción de proteínas o péptidos de multi-subunidad recombinantes por una célula huésped de la especie Pseudomonas. Las proteínas de multisubunidad que pueden expresarse incluyen proteínas homoméricas y heteroméricas. Las proteínas de multisubunidad pueden incluir dos o más subunidades, que pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, la proteína puede ser una proteína homomérica que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12 o más subunidades. La proteína también puede ser una proteína heteromérica que incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, o más subunidades. Las proteínas de multisubunidad a manera de ejemplo incluyen: receptores que incluyen receptores de canal de ion; proteínas de matriz extracelular que incluyen condroitina; colágeno; inmunomoduladores que incluyen proteínas de MHC, anticuerpos de cadena completa, y fragmentos de anticuerpos; enzimas que incluyen polimerasas de ARN , polimerasas de ADN; y proteínas de membrana. En una modalidad de la presente invención, se proporciona la producción de proteínas de sangre por la célula huésped. Las proteínas de sangre expresadas en esta modalidad incluyen pero no se limitan a proteínas portadoras, tales como albúmina, incluyendo albúmina humana y bovina, transferina, medias moléculas de transferina recombinante, haptoglobina, fibrinógeno y otros factores de coagulación, componentes complementarios, inmunoglobulinas, inhibidores enzimáticos, precursores de substancias tales como angiotensina y bradiquinina, insulina, endotelina, y globulina, incluyendo alfa, beta, y gamma-globulina, y los demás tipos de proteínas, péptidos, y fragmentos de los mismos encontrados básicamente en la sangre de mamíferos. Se han reportado secuencias de aminoácidos para numerosas proteínas de sangre (ver, S. S. Baldwin (1993) Comp. Biochem. Physiol. 1 06b:203-218), incluyendo la secuencia de aminoácidos para la albúmina de suero humano (Lawn, L. M. , et al. (1981 ) Nucleic Acids Research, 9:61 03-61 14) y la transferina de suero humano (Yang, F. et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :2752-2756). En una modalidad de la presente invención, se proporciona la producción de enzimas recombinantes o co-factores por una célula huésped de la especie Pseudomonas fluorescens. Las enzimas y co-factores expresados en esta modalidad incluyen pero no se limitan a las aldolasas, oxidasas de amina, oxidasas de aminoácidos, aspartasas, enzimas dependientes de B12, carboxipeptidasas, carboxiesteresas, carboxilasas, quimiotripsina, enzimas que requieren CoA, sintetasas de cianohidrina, cintasas de cistationa, descarboxilasas, deshidrogenadas, deshidrogenadas de alcohol, deshidratasas, diaforasas, dioxigenasas, reductasas de enoato, hidrasas de epóxido, fumerasas, oxidasas de galactosa, isomerasas de glucosa, oxidasas de glucosa, glicosiltransferasas, metiltransferasas, hidrasas de nitrilo, fosforilasas de nucleósidas, oxidoreductasas, oxinitilasas, peptidasas, glicosiltransferasas, peroxidasas, enzimas fusionadas con un polipéptido terapéuticamente activo, activador de plasminógeno de tejido; uroquinasa; reptilasa, estreptoquinasa; catalasa, dismutasa de superóxidos; Dnasa, hidrolasas de aminoácidos (por ejemplo, asparaginasa, amidohidrolasas); carboxipeptidasas; proteasas, tripsina, pepsina, quimiotripsina, papaína, bromelaína, colagenasa; neuraminidasa; lactasa, maltasa, sucrasa, y arabinofuranosidasas. En una modalidad de la presente invención, la producción de cadena individual recombinante, se proporcionan los fragmentos de Fab y/o anticuerpos de cadena completa o fragmentos o porciones de los mismos por una célula huésped de la especie Pseudomonas fluorescens. Un anticuerpo de cadena individual puede incluir las regiones de unión de antígeno de anticuerpos en una cadena individual de polipéptidos plegada establemente. Los fragmentos de Fab pueden ser una pieza de un anticuerpo particular. El fragmento de Fab puede contener el sitio de unión de antígeno. El fragmento de Fab puede contener 2 cadenas: una cadena ligera y un fragmento de cadena pesada. Estos fragmentos pueden vincularse mediante un enlazador o un enlace de bisulfuro. La secuencia de codificación para la proteína o péptido recombinante puede ser una secuencia de codificación nativa para el polipéptido seleccionado como objetivo, si se encuentra disponible, pero más preferentemente será una secuencia de codificación que se ha seleccionado, mejorado, u optimizado para su uso en la célula huésped expresión seleccionada: por ejemplo, sintetizando el gen para reflejar la inclinación del uso de codón de una especie de Pseudomonas tal como P. fluorescens. El(los) gen(es) resultante(s) se habrán construido dentro de o se insertarán en uno o más vectores, los cuales se transformarán después en la célula huésped de expresión. El ácido nucleico o un polinucleótido por proporcionarse en una "forma expresable" se refiere a un ácido nucleico o un polinucleótido que contiene al menos un gen que puede expresarse por la célula huésped de expresión bacterial. En algunas modalidades, la proteína de interés es substancialmente homologa a, una proteína nativa, tal como una proteína nativa de mamífero o de ser humano. En estas modalidades, la proteína no se encuentra en forma concatamérica, sino que solamente se encuentra vinculada a una señal de secreción y opcionalmente una secuencia de etiqueta para purificación y/o reconocimiento. En otras modalidades, la proteína de interés es una proteína que se encuentra activa a una temperatura desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 42°C. En una modalidad, la proteína se encuentra activa a temperaturas fisiológicas y se encuentra desactivada cuando se calienta a temperaturas altas o extremas, tal como temperaturas superiores a los 65°C. En una modalidad, la proteína de interés es una proteína que se encuentra activa a una temperatura desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 42°C y/o se encuentra desactivada cuando se calienta a temperaturas altas o extremas, tal como temperaturas superiores a 65°C; es, o substancialmente homologa a una proteína nativa, tal como una proteína nativa de mam ífero o de ser humano y no se expresa a partir de los ácidos nucleicos en forma concatamérica; y el activador no es un activador nativo en P. fluorescens sino que se deriva de otro organismo, tal como E. coli. En otras modalidades, cuando se produce la proteína incluye también una secuencia adicional de selección como objetivo, por ejemplo, una secuencia que selecciona como objetivo la proteína al medio extracelular. En una modalidad, la secuencia adicional de selección como objetivo se encuentra vinculada operativamente al término de carboxi de la proteína. En otra modalidad, la proteína incluye una señal de secreción para un autotransportador, un sistema de secreción de dos asociados, un sistema de ramificación terminal principal o una porina acomodadora fimbrial.
EJEMPLOS Eiemplo 1 . Caracterización de péptidos de señal de secreción de sistema de Sec Los péptidos de señal de secreción de sistema de Sec de
Pseudomonas fluorescens se caracterizaron por la formación y expresión de una fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) que codifica las fusiones de ADN de secuencia genómica. Las identidades de seis de las fusiones expresadas se caracterizaron adicionalmente. El sitio de segmentación para las secuencias de señal para los genes segregados identificados como fusiones PhoA se dedujeron por comparación con las proteínas homologas derivadas de otras Pseudomónadas, por el programa SPScan (Menne et al (2000) Bioinformatics 16: 741 -742). El sitio de segmentación de la lipoproteína putativa se dedujo por comparación con las posiciones de enlace de macromoléculas de la peptidasa I I de señal; la peptidasa II de señal segmenta específicamente las secuencias de señal de lipoproteínas. Se analizaron los seis péptidos de señal utilizando SignalP (un programa de software para el análisis de los péptidos de señal putativa; disponibles por el Center for biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmark (Centro para el Análisis de Secuencias biológicas de la Universidad Técnica de Dinamarca), en http://www.cbs .dtu.dk/services/SignalP.) Ver también, H Nelson et al. (1997) Protein Engineering 10: 1 -6. En algunos casos, se utilizó una fuente complementaria para caracterizar adicionalmente la identidad del péptido de señal. En caso de una pbp, se obtuvo información de segmentación por análisis de MALDI-TOF de una proteína de fusión procesada (ver el Ejemplo 5 a continuación). Esta información se encuentra presente en la Tabla 6.
Análisis de Western de las proteínas de fusión phoA Para analizar si se produjeron proteínas de fusión, se realizó el análisis de Western con anticuerpos para la fosfatasa alcalina en cultivos separados por centrifugación en un fragmento totalmente celular (citoplasma y periplasma) y el fragmento de caldo sin células. De cinco cepas para las cuales se determinó el sitio de inserción, cuatro secuencias de señal (azurina putativa, proteína putativa de unión de fosfato, lipoproteína B putativa periplásmica, proteína putativa de unión de Fe(l ll)) produjeron una proteína aproximadamente 40 kD más pequeña que la pronosticada, y una (proteína putativa de unión de Lys- Arg-Orn) produjo una proteína aproximadamente 20 kD más pequeña que lo pronosticado. El análisis de Western y el análisis de actividad de PhoA indican que las secuencias de señal transportaron la proteína PhoA heteróloga al periplasma de P. fluorescens.
Eiemplo 2. Construcción, expresión, v caracterización de fusión de pbp-scFv La secuencia de señal putativa de 24 aminoácidos de la proteína de unión de fosfato (es decir, incluye Metí ) se fusionó con el gen scFv de gaI2 (gal2) para producir los NOs DE ID DE SEC 15 y 16 (ver la tabla) y se probó la secreción con el periplasma y/o el sobrenatátil de cultivo. Las fusiones se construyeron como se describe a continuación.
Fusión de etigueta de líder-ga!2-His de secreción de proteína de unión de fosfato Secuencia de ácido nucleico (NO DE ID DE SEC: 15) atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcc gcc cag gtg cag ctg cag gag tgc ggc cea gga ctg gtg aag ect tcg gag acc ctg tcc etc acc tgc act gtc tet ggt ggt tcc ate agt agt tat cae tgg age tgg ate cgg cag ecc cea ggg aag gga ctg gag tgg att ggg tat ate tat tac agt ggg age acc aac tac aac ecc tcc etc aag aat cga gtc acc ata tet gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg aac ctg agg tet gtg acc gct gca gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg cga gga acg tat ggc cea gcc gga gat gct ttt gat ate tcg ggg caá ggg acc acg gtc acc gtc tcg agt ggt gga ggc . ggt tea ggc gga ggt ggc age ggc ggt ggc gga tcg gac ate cag atg acc cag tet ect tcc acc ctg tet gca tet att gga gac ag a gtc acc : ate acc tgc cgg gcc agt gag ggt att tat cae tgg ttg gcc tgg tat cag cag aag cea ggg aaa gcc ect aaa etc ctg ate tat aag gcc tet agt tta gcc agt ggg gcc cea tea agg ttc age ggc agt gga tet ggg acá gat ttc acl etc acc ate age age ctg cag ect gat gat ttt gca act tat tac tgc caá caá tat agt aat tat ceg etc act ttc ggc gga ggg acc aag ctg gag atec aaa cgt gcg gcc gca cat cae cat cat cae cat taa Secuencia de Aminoácidos (NO DE ID DE SEC: 16) Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val
Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
Ser Me Ser Ser Tyr His Trp Me Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp e Gly Tyr Me Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
Arg Val Thr e Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser l _eu Asn Leu
Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Tyr
Gly Pro Ala Gly Asp Ala Phe Asp Me Trp Gly Gln Gly Gly Thr Thr Val Thr
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Asp Mr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Me Gly Asp Arg
Val Thr Me Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Me Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Me Tyr Lys Ala Ser Ser
Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
Phe Thr Leu The Me Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
Glu Me Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Construcción de vectores de pbp-scFv: Las secuencias de señal putativa de proteína de unión de fosfato (pbp) y P. fluorescens oprF se fusionaron en porciones de la secuencia de codificación Gal2 en la posición +2 utilizando empalmes por PCR de extensión sobrepuesta (SOE). La PCR se realizó utilizando los imprimadores sig_pbp_for (gctctagagg aggtaactta tgaaactgaa acg; NO DE ID DE SEC: 17) y pbp_gal2SOE_rev (ctgcacctgg gcggccaccg cgtt; NO DE ID DE SEC: 1 8) (incluyendo un complemento inverso de pbp_gal2SOE_for (aacgcggtgg ccgcccaggt gcag; NO DE ID DE SEC: 19)), utilizando el péptido de señal de secreción de P. fluorescens pbp como plantilla. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de oligonucleótido que contiene la secuencia de codificación de péptido de señal de pbp y una secuencia de codificación para el extremo 5' del anticuerpo de cadena individual gal2 (scAb o scFv). También se simplificó la gal2 ORF. Se llevó a cabo la PCR utilizando los imprimadores pbp_gal2SOE_for (NO DE ID DE SEC: 19) y scFv2rev (acgcgtcgac ttattaatgg tgatgatggt gatgtgcggc cgcacgttg ate; NO DE ID DE SEC: 20), y utilizando un polinucleótido de codificación de gaI2 como plantilla. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de polinucleótido con contenido de una secuencia de codificación para el extremo 3' del péptido de señal pbp y el marco de lectura abierta (ORF - open reading frame) de gal2. El aminoácido -1 pronosticado de la secuencia de señal (el último aminoácido previo al sitio de segmentación propuesto) se fusionó con el aminoácido +2 de gal2 scFv (Ala). Esta función correspondió con la del péptido de señal de proteína de unión de fosfato en que el aminoácido inmediatamente después del sitio de segmentación de peptidasa de señal recombinante (+1 ) es un Ala, justo como es el residuo de aminoácido correspondiente en la proteína de pbp nativa. La fusión resultante se clonó en el vector pMYC1 803 de P. fluorescens bajo control del activador Ptac para producir el plásmido pDOW1 123 (pbp:gal2). El plásmido se transformó en la cepa MB1 01 de P. fluorescens que lleva el plásmido pCN51 -lacl (incluyendo un represor de lac), dando como resultado una cepa de DC217. El plásmido también se transformó en la cepa JM1 09 de E. coli.
Construcción de clones de scFv para la secreción en E. coli: El ORF de gal2 se ligó al pET27b(+) de manera tal que la secuencia de señal pelB se fusiona al residuo de alanina en la posición +2 de Gal2. Los clones correctos se transformaron en BL21 (DE3)Gold (Stratagene) para el análisis de expresión.
Secreción de scFv de Gal2 en P. fluorescens vs. E. coli: Como se describió con anterioridad, la señal de secreción de pelB para la expresión/secreción de E. coli, junto con dos señales de secreción putativas de P. fluorescens se fusionaron al marco de lectura abierta de gal2 en la posición +2, es decir, la metionina terminal en N de Gal 2 fue eliminada en la fusión y se reemplazó con la secuencia de señal indicada (Figura 2) . Se probó la capacidad de las secuencias de señal de la proteína de unión de fosfato (pbp) y de la porina F de membrana exterior (oprF) para segregar una proteína heteróloga al periplasma y/o el medio de cultivo. Se descubrió que tanto las construcciones de secuencia líder de pbp como de oprF se expresan y procesan en P. fluorescens en la escala de 20L. Ambas construcciones produjeron -9-10 g/L de proteína, cuya mayor parte se encontró en el fragmento insoluble (Figura 3B). Aproximadamente se procesó 50% de la secuencia de señal de oprF, mientras que se procesó -100% de la señal de pbp (Figura 3A y 3B). Además, una pequeña cantidad (<1 %) del Gal2 procesado a partir de la fusión de pbp:gal2 parece haberse segregado al medio de cultivo (Figura 3B). Similar a la secuencia de señales de oprF, la señal de pelB no parece ser procesada (Figura 4). La fusión pelB-gal2 expresada en E. coli produjo -1 .6 g/L de proteína con -54% procesado. De ello, 1 1 % se encontró en la fracción soluble. Aunque se encontró un mayor porcentaje del total de proteína en el fragmento soluble para la construcción de E. coli, en comparación con la construcción de pbp:gal2 de P. fluorescens, el rendimiento total en P. fluorescens de la proteína procesada fue significativamente mayor.
Análisis de actividad de scFv: Se desarrolló una prueba inmunoabsorbente de enzima enlazada (ELISA - enzyme linked immuno- assay) para medir la actividad de scFv purificada de anti-ß- galactosidasa de Gal3 y Gal2 purificada. Se añadieron cantidades variables de scFv purificada a las cavidades de microplacas recubiertas con ß-galactosidasa. Se detectó el anticuerpo unido utilizando un anticuerpo de etiqueta de anti-His y un anticuerpo de anti-ratón conjugado con la fosfatasa alcalina (Figura 5A). Se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo contra ß-galactosidasa como control positivo. Como se ilustra en la Figura 6B, el anticuerpo Gal2 purificado a partir de experimentos de expresión a pequeña escala mostraron actividad significativa. Estos resultados mostraron un anticuerpo activo renaturalizante y aislado derivado de los cuerpos de inclusión (Gal2).
Ejemplo 3: Secreción de scFv de anti-diqoxina en E. coli vs. P. fluorescens. Se clonó scFv de anti-digoxina en el vector pET27d para la expresión segregada en E. coli. El scFv de anti-digoxina se fusionó traduccionalmente en el líder pelB, dando como resultado en pDOW1 153. En P. fluorescens, el scFv de anti-digoxina se fusionó traduccionalmente a la secuencia de señal de secreción de proteína de unión de fosfato, dando como resultado en pDOW1 142. SDS-PAGE (Figura 6) y el análisis de Western (Figura 7) muestran que la scFv de anti-digoxina expresada tanto en P. fluorescens como en E. coli es insoluble. El clon de E. coli produjo 60 ug/ml de proteína después de una inducción de 3 horas y el líder de secreción de pelB no pareció ser procesado. El clon pDOW1 142 de P. fluorescens produjo ~20X más proteína que pDOW1 153, con 1 .23 mg/ml de proteína expresada como se determinó por densitometría de un SDS-PAGE en comparación con las normas de BSA (Figura 8). Se encontró que la expresión de scFv de anti-digoxina por P. fluorescens que llevan pDOW1 142 es de -15-20 g/L como se determinó por densitometría en la escala de 20L (datos no mostrados). Como se observa a escala de frasco de agitación, toda la proteína pareció procesada apropiadamente.
Análisis de actividad de scFv de anti-digoxina purificada. La scFv de anti-digoxina se purificó a partir tanto de construcciones de P. fluorescens como de E. coli. Se evaluó la actividad utilizando la prueba inmunoabsorbente de enzima enlazada (ELISA). Como se muestra en la Figura 9, se encontró que la scFv de anti-digoxina aislada de P. fluorescens que lleva la construcción segregada pDOW1 142 estuvo activa como lo estuvo el control de anticuerpos policlonal. Sin embargo, aunque se encontró que la construcción citoplásmica pDOW1 152 de E. coli contenía scfV de anti-digoxina activa, la proteína purificada a partir de E. coli que lleva la construcción pDOW1 153 de scFv de anti-digoxina segregada estuvo inactiva y en su mayor parte sin procesar (Figura 10). Los resultados muestran que P. fluorescens produjo 1 9x más proteína que las construcciones segregadas de E. coli. Además, pareció que la señal de secreción de pelB utilizada en la construcción de E. coli no se procesó eficazmente como la señal de secreción de proteína de unión de fosfato en P. fluorescens. La proteína fue casi exclusivamente insoluble tanto en P. fluorescens como en E. coli. Sin embargo, la proteína purificada P. fluorescens segregada, junto con la proteína citoplásmica purificada de E. coli, se encontró activa.
Eiemplo 4 - Análisis de MALDI-TOF para caracterización de pbp:ga!2 Se utilizó el análisis de espectrometría de masa de tiempo de vuelo de desabsorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF - matrix-assisted láser desorption/ionization time-of-flight) para caracterizar la composición de aminoácidos de la proteína madura segregada pbp:gal2 para verificar que la segmentación de peptidasa de señal putativa había ocurrido en el sitio de segmentación de peptidasa de señal putativa para el péptido de señal de pbp. Para este análisis, se obtuvieron huellas digitales de masa de péptido para pbp:gaI2 y estos datos se compararon con las huellas digitales de masa de péptido teóricas de las secuencias de aminoácidos deducidos. Para generar estas huellas digitales de masa de péptido, la proteína se asimiló con Lys-C de endoproteinasa y se determinaron las masas de los péptidos resultantes. La secuencia de péptidos terminal en N se determinó por descomposición post-fuente (MALDI-PSD - MALDI-post-source-decay). No se observaron las masas de péptido correspondientes a las proteínas no procesadas. Los resultados fueron como se pronosticó (datos no mostrados).
Eiemplo 5: Construcción, expresión, y caracterización de una fusión de pbp-hGH El líder de secreción de proteínas de unión de fosfato de P. fluorescens se fusionó con el término N del dominio maduro del gen de la hormona del crecimiento humano (hGH) y se probó la secreción al periplasma. La región de codificación de secuencia de señal de pbp se amplificó por PCR a partir de un clon de la secuencia de señal de pbp de P. fluorescens como plantilla, utilizando sig_pbp_for los imprimadores (NO DE ID DE SEC: 17) y pbp_hgh (gggaatggtt gggaaggcca ccgcgttggc; NO DE ID DE SEC: 21 ), después se purificaron con gel. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de oligonucleótido con contenido de la secuencia de codificación de péptido de señal pbp y la secuencia de codificación para el extremo 5' del dominio maduro de hGH.
Un cADN que codifica la hormona del crecimiento humano se amplificó por PCR a partir de una biblioteca de cADN pituitaria humana (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando los imprimadores ELVIfor (agagaactag taaaaaggag aaatccatgg ctacaggctc ccggacgtcc; NO DE ID DE SEC: 22) y ELVIfor (agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccac; NO DE ID DE SEC: 23), que se diseñaron para amplificar solamente el dominio maduro de hGH, y se clonaron en pMYC1 803/Spel Soy, formando pDOW2400. El gen hGH maduro se amplificó a partir de pDOW2400, utilizando los imprimadores pbp_hgh_revcomp (gccaacgcgg tggccttccc aaccattccc; NO DE ID DE SEC: 24) y hgh_rev (agagactcga gtcattagaa gccacagctg ccctccacag agcggcac; NO DE ID DE SEC: 25), después se purificó con columnas de Strataprep (Stratagene) para eliminar los imprimadores y otros componentes de reacción. Para que el polinucleótido codifique la fusión de pbp-hGH, se combinaron las dos reacciones de PCR y se amplificaron nuevamente con sig_pbp_for (NO DE ID DE SEC: 17) y hgh_rev (NO DE ID DE SEC: 25) con objeto de enlazar las dos piezas. El fragmento se ligó a pDOW1269 para formar pDOW1323-10, colocando pbp-hGH bajo control del activador de tac. La mezcla de ligación se transformó en P. fluorescens. El ADN y la secuencia de aminoácidos de esta fusión se presenta en (NO DE ID DE SEC: 26) y (NO DE ID DE SEC: 27), respectivamente.
Secuencia de ácido nucleico (NO DE ID DE SEC: 26) de fusión de líder de secreción de proteína de unión de fosfato - hormona de crecimiento humano atg aaa ctg aaa cgt ttg atg gcg gca atg act ttt gtc gct gct ggc gtt gcg acc gcc aac gcg gtg gcg ttc cea acc att ecc tta tcc agg ect ttt gac aac gct atg etc cgc gcc cat cgt ctg cae cag ctg gcc ttt gac acc tac cag gag ttt gaa gaa gcc tat ate cea aag gaa cag aag tat tea ttc ctg cag aac ecc cag acc tcc etc tgt ttc tea gag tet att ceg acá ecc tcc aac agg gag gaa acá caá cag aaa tcc aac cta gag ctg etc cgc ate tcc ctg ctg etc ate cag tcg tgg ctg gag ecc gtg cag ttc etc agg agt gtc ttc gcc aac age ctg gtg tac ggc gcc tet gac age aac gtc tat gac etc cta aag gac cta gag gaa ggc ate caá acg ctg atg ggg agg ctg gaa gat ggc age ecc cgg act ggg cag ate ttc aag cag acc tac age aag ttc gac acá aac tea cae aac gat gac gca cta etc aag aac tac ggg ctg etc tac tgc ttc agg aag gac atg gac aag gtc gag acá ttc ctg cgc ate gtg cag tgc cgc tet gtg gag ggc age tgt ggc ttc taa Secuencia de aminoácidos (NO DE ID DE SEC: 27) Met Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly Val
Ala Thr Ala Asn Ala Val Ala Phe Pro Thr Me Pro Leu Ser Arg Pro Phe
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Me Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe
Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Me Pro Thr Pro
Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln GIn Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Me
Ser Leu Leu Leu Me Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
Val Phe Ala Asn Ser Le Uval Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Me Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln e Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe
Asp Thr Asn Ser His As n Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu
Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Gl u Thr Ph< 3 Le u Arg e
Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
Las cepas resultantes se probaron primeramente a escala de frasco de agitación. Se detectaron bandas inducidas del tamaño esperado para la proteína procesada y no procesada (22.2 kDa y 24.5 kDa, respectivamente) por SDS-PAGE. Se procesó aproximadamente la mitad de la proteína (indicando la localización al periplasma), y de la procesada casi la mitad fue un fragmento soluble y la mitad en el fragmento insoluble (datos no mostrados). Los estudios de expresión se escalaron en reactores de 20-L. La densitometría de los geles de SDS-PAGE teñidos de Coomassie mostró que 18% del hGH total producido se procesó y fue soluble. La cepa produjo 3.2 g/L de todas las formas de hGH; se procesó y el hGH soluble fue de 0.6 g/L.
Eiemplo 6: Expresión de proteína chaperona Skp en P. fluorescens La proteína Skp de E. coli con su secuencia líder nativa se expresó en P. fluorescens (Figura 10). Después de 24 horas de crecimiento, se indujo Skp por la adición de 5 mM de benzoato (el activador de benzoato se describe en la Publicación de PCT WO 04/005221 ). 12 horas después de la inducción, las muestras de proteínas inducidas y no inducidas se separaron en fragmentos solubles e ¡nsolubles por centrifugación a 20,000 g. Las proteínas se separaron en un regulador de NuPAGE con MES al 4-12%. La proteína Skp de E. coli se observó a un peso molecular de aproximadamente 17 kDa en la muestra soluble e inducida solamente (indicada por una flecha en la Figura 1 0). La proteína se identificó como Skp por descomposición postfuente (SPD) de MALDI. Se prepararon los productos de digestión de quimiotripsina de la banda de proteínas de 17 kDa. Se observaron dos fragmentos de quimotripsina, que corresponden a los tamaños pronosticados derivados de los productos de digestión teóricos de Skp (Tabla 8). El péptido terminal en N putativo con un ¡ón de masa a 1378.7 m/z fue analizado adicionalmente por MALDI-PSD, lo cual reveló la secuencia de aminoácidos terminal en N esperada de ADKIAIVNMGSLF, indicando que la secuencia líder se ha eliminado como se esperaba, correspondiendo al sitio procesado entre Ala20 y Ala21 (Figura 1 1 ).
Este fragmento se analizó adicionalmente por MALDI-SPD.
Eiemplo 7: Expresión de las secuencias de señal P. fluorescens en E. coli Las secuencias de señal derivadas de P. fluorescens son funcionales en E. coli permitiéndole a la proteína Pbp:Gal2 procesarse y segregarse al periplasma. La cepa JM 1 09 de E. coli (Promega) se transformó sea con pDOW1 123 (fusión de pbp:gal2) o pDOW1 141 (fusión de oprF:gal2). JM109, transformado con pDOW1 123, que codifica Pbp:Gal2, mostró la expresión de la proteína de Gal2 después de la inducción con 0.4 mM y 0, 1 mM de IPTG cuando se desarrolló a 37°C (Figura 12). El cultivo inducido con 0.01 mM de IPTG exhibió una expresión comparable con el control positivo (DC265, pbp;gal2 expresado en P. fluorescens). Las dos bandas observadas en la región de 28 kDa en la
Figura 12 representan Gal2 antes de y después del procesamiento celular (segmentación) de la secuencia de señal. Estas dos bandas se observaron en el fragmento insoluble por SDS-PAGE, y co-migraron con Gal2 procesada y no procesada producida por DC245 (Figura 13). La secuencia terminal en N de las bandas respectivas por MALDl-PSD confirmaron que la banda inferior fue Gal2 y se procesó como se pronosticó (FPTIPLSRPF). La banda superior contuvo secuencias de Gal2 no procesada. En un gel de SDS-PAGE, la muestra periplásmica reveló una banda consistente en tamaño a un Gal2 procesado (Figura 14). Se realizaron Western blots en los fragmentos solubles, insolubles y periplásmicos de la muestra JM 1 09/pDOW1 123 inducida con 0.01 mM de IPTG y se desarrolló a 37°C. Los resultados mostraron la proteína de Gal2 procesada se encontraron en los tres fragmentos (Figura 15).
Claims (1)
- REIVINDICACIONES 1 . Una secuencia de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de codificación de señales de secreción para un péptido de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionado a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp), una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE), una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (lll) y una señal de secreción de lipoproteína B, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de codificación. 2. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de pbp. 3. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la secuencia es al menos 80% o al menos 85% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2. 4. El ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la secuencia es al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2. 5. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia hibridiza a una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir de una secuencia que codifica una señal de secreción de pbp, una secuencia del NO DE ID DE SEC: 2, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2, una secuencia que es al menos 85% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2, una secuencia que es al menos 90% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2 y una secuencia que es al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2. 6. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , que comprende una secuencia del NO DE ID DE SEC: 2, ajustado para reflejar la preferencia de codón de un organismo huésped seleccionado para expresar la secuencia de ácido nucleico. 7. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de OprE. 8. El ácido nucleico según la reivindicación 7, donde la secuencia es al menos 80%, o al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE I D DE SEC: 4. 9. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 1 0. El ácido nucleico según la reivindicación 9, donde la secuencia es al menos 80%, o al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 6. 1 1 . El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de azurina, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 12. El ácido nucleico según la reivindicación 1 1 , donde la secuencia es al menos 80%, o al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 8. 13. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l ll) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 14. El ácido nucleico según la reivindicación 13, donde la secuencia es al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 1 0. 15. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia codifica una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 16. El ácido nucleico según la reivindicación 15, donde la secuencia es al menos 80%, o al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% idéntica al NO DE ID DE SEC: 12. 17. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , donde la secuencia hibridiza una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE I D DE SEC: 4, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE I D DE SEC: 6, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 8, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 10 y una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 12. 18. El ácido nucleico según la reivindicación 1 , que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en el NO DE ID DE SEC: 4, NO DE ID DE SEC: 6, NO DE I D DE SEC: 8, NO DE I D DE SEC: 10 y el NO DE I D DE SEC: 12, ajustado para reflejar la preferencia de codón de un organismo huésped seleccionado para expresar la secuencia de ácido nucleico. 19. El ácido nucleico según la reivindicación 5 a 17, donde la hibridación se da bajo condiciones severas. 20. El ácido nucleico según la reivindicación 1 9, donde la hibridación se encuentra a 68°C. 21 . Un vector recombinante que comprende una secuencia de señal de secreción de ácido nucleico que codifica un péptido de secreción de sistema de Sec Pseudomonas fluorescens seleccionado a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (ll l) y una señal de secreción de lipoproteína B; una secuencia que es substancialmente homologa al secuenciador de señal de secreción; o una secuencia que hibridiza a la secuencia de señal de secreción. 22. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción se selecciona a partir del grupo que consiste en el NO DE ID DE SEC: 2, NO DE ID DE SEC: 4, NO DE ID DE SEC: 6, NO DE ID DE SEC: 8, NO DE ID DE SEC: 10, NO DE ID DE SEC: 12 y NO DE ID DE SEC: 12, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de secreción. 23. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de pbp. 24. El vector según la reivindicación 23, donde la secuencia de señal de secreción es al menos 80% o al menos 85% idéntica al NO DE ID DE SEC: 2. 25. El vector según la reivindicación 23, donde la secuencia de señal de secreción es al menos 90% o al menos 95% idéntico al NO DE I D DE SEC: 2. 26. El vector según la reivindicación 23, que comprende una secuencia de señal de secreción del NO DE ID DE SEC: 2, ajustado para reflejar la preferencia de codón de un organismo huésped seleccionado para expresar la secuencia de ácido nucleico. 27. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 28. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 29. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de azurina, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 30. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 31 . El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción codifica una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 32. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción hibridiza una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 4, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE I D DE SEC: 6, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE I D DE SEC: 8, una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 10 y una secuencia que es al menos 80% idéntica al NO DE ID DE SEC: 12. 33. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción se selecciona a partir del grupo que consiste en el NO DE ID DE SEC: 4, NO DE ID DE SEC: 6, NO DE ID DE SEC: 8, NO DE ID DE SEC: 10 y el NO DE ID DE SEC: 12, ajustado para reflejar la preferencia de codón de un organismo huésped seleccionado para expresar la secuencia de ácido nucleico. 34. El vector según la reivindicación 21 , que comprende una secuencia que hibridiza a la secuencia de señal de secreción. 35. El vector según la reivindicación 34, donde la hibridación se da bajo condiciones severas. 36. El vector según la reivindicación 35, donde la hibridación se encuentra a 68°C. 37. El vector según la reivindicación 21 , donde la secuencia de señal de secreción se vincula operativamente a una secuencia que codifica una proteína o péptido recombinante de interés. 38. El vector según la reivindicación 37, donde la proteína o péptido recombinante es nativo al huésped. 39. El vector según la reivindicación 38, donde la proteína o péptido recombinante es nativa(o) a P. fluorescens. 40. El vector según la reivindicación 37, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de una proteína o péptido que no es nativa(o) a un organismo huésped. 41 . El vector según la reivindicación 37, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo que no es un Pseudomónada. 42. El vector según la reivindicación 37, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo eucariótico. 43. El vector según la reivindicación 37, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo mamífero. 44. El vector según la reivindicación 37, que comprende además una secuencia de enlace entre la secuencia de péptido de señal y la proteína o péptido de secuencia recombinante. 45. El vector según la reivindicación 44, donde la secuencia de enlace se segmenta por una peptidasa de señal. 46. El vector según la reivindicación 37, donde la secuencia de proteína o péptido recombinante es se vincula operativamente a una segunda secuencia de señal. 47. El vector según la reivindicación 46, donde la segunda secuencia de señal comprende una secuencia seleccionada como objetivo a una señal de secreción de membrana exterior. 48. El vector según la reivindicación 21 , donde el vector comprende además un activador. 49. El vector según la reivindicación 48, donde el activador es nativo a una célula huésped bacterial. 50. El vector según la reivindicación 48, donde el activador no es nativo a una célula huésped bacterial. 51 . El vector según la reivindicación 48, donde el activador es nativo a una E. coli. 52. El vector según la reivindicación 48, donde el activador es un activador inducible. 53. El vector según la reivindicación 48, el activador es un activador de lac o un derivado de un activador de lac. 54. Una célula recombinante que comprende una secuencia de señal de secreción de ácido nucleico que codifica un péptido de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionado a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l ll) y una señal de secreción de lipoproteína B; una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de secreción; o una secuencia que hibridiza a la secuencia de señal de secreción, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de codificación. 55. La célula recombinante según la reivindicación 54, donde la secuencia de señal de secreción se encuentra en un vector de expresión. 56. La célula recombinante según la reivindicación 54, donde la secuencia de señal de secreción es una secuencia de pbp. 57. La célula recombinante según la reivindicación 54, donde la secuencia de señal de secreción es una secuencia de OprE. 58. La célula recombinante según la reivindicación 54, donde la secuencia de señal de secreción se vincula operativamente a una proteína o péptido recombinante de interés. 59. La célula recombinante según la reivindicación 54, donde la célula expresa una proteína o péptido de interés vinculada operativamente a un péptido de señal de secreción codificado por el ácido nucleico. 60. La célula según la reivindicación 59, donde la proteína o péptido se expresa en un compartimiento periplásmico de la célula. 61 . La célula según la reivindicación 54, donde una enzima en la célula segmenta el péptido de señal a partir de la proteína o péptido de interés. 62. La célula según la reivindicación 54, donde la célula se deriva de un huésped bacterial. 63. La célula según la reivindicación 62, donde el huésped es un Pseudomónada. 64. La célula recombinante según la reivindicación 63, donde el huésped es un P. fluorescens. 65. La célula recombinante según la reivindicación 62, donde el huésped es un E. coli. 66. Un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que codifica un péptido de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionado a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l) y una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 67. El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de proteína de unión de fosfato (pbp) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de pbp. 68. El péptido según la reivindicación 66, donde la secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a los aminoácidos 2-24 del NO DE ID DE SEC: 1 . 69. El péptido según la reivindicación 66, donde la secuencia de aminoácido es al menos 95% idéntica a los aminoácidos 2- 24 del NO DE ID DE SEC: 1 . 70. El péptido según la reivindicación 66, donde la secuencia de aminoácido es al menos 98% idéntica a los aminoácidos 2-24 del NO DE ID DE SEC: 1 . 71 . El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de Porina E de Membrana Exterior (OprE) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal de OprE. 72. El péptido según la reivindicación 66, donde la secuencia de aminoácido es al menos 90% idéntica a los aminoácidos 2- 21 del NO DE ID DE SEC: 3. 73. El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 74. El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de azurina, o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 75. El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de proteína de unión de hierro (lll) o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 76. El péptido según la reivindicación 66, donde el péptido de secreción comprende una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 77. El péptido según la reivindicación 66 vinculado operativamente a una proteína o péptido recombinante de interés. 78. El péptido según la reivindicación 77, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo que no es un organismo P. fluorescens. 79. Un sistema de expresión para la expresión de una proteína o péptido recombinante que comprende: a. una célula huésped: y b. un vector que comprende una proteína o péptido recombinante vinculada operativamente a una señal de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionada a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l) y una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal. 80. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una secuencia de pbp. 81 . El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una secuencia de OprE. 82. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn. 83. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una señal de secreción de azurina. 84. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l). 85. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción es una señal de secreción de lipoproteína B. 86. El sistema según la reivindicación 79, donde la secuencia de señal de secreción se vincula operativamente a una proteína o péptido recombinante de interés. 87. El sistema según la reivindicación 79, donde la célula expresa una proteína o péptido de interés vinculada operativamente a un péptido de señal de secreción codificado por el ácido nucleico. 88. El sistema según la reivindicación 87, donde la proteína o péptido se expresa en un componente periplásmico de la célula. 89. El sistema según la reivindicación 87, donde una enzima en la célula segmenta al péptido de señal a partir de la proteína o péptido de interés. 90. El sistema según la reivindicación 79, donde la célula se deriva de un huésped bacterial. 91 . El sistema según la reivindicación 90, donde el huésped es una Pseudomónada. 92. El sistema según la reivindicación 91 , donde el huésped es un P. fluorescens. 93. El sistema según la reivindicación 90, donde el huésped es un E. coli. 94. El sistema según la reivindicación 79, que comprende además un medio de fermentación. 95. El sistema según la reivindicación 94, donde el medio de fermentación comprende un inductor químico. 96. Un proceso para la expresión de una proteína o péptido recombinante en una célula huésped que comprende proporcionar una célula que comprende un vector que codifica una proteína o péptido recombinante vinculado operativamente a una señal de secreción de sistema de Sec de Pseudomonas fluorescens seleccionada a partir del grupo que consiste en una señal de secreción de pbp, una señal de secreción de OprE, una señal de secreción de proteína de unión de Lys-Arg-Orn, una señal de secreción de azurina, una señal de secreción de proteína de unión de hierro (lll) y una señal de secreción de lipoproteína B o una secuencia que es substancialmente homologa a la secuencia de señal, y desarrollar la célula bajo condiciones que produzcan la expresión de la proteína o péptido recombinante. 97. El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción es una señal de secreción de pbp. 98. El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción es una señal de secreción de OprE. 99. El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción es una señal de secreción de proteína de unión de Lys- Arg-Orn. 100. El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción es una señal de secreción de proteína de unión de azurina. 101 . El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción es una señal de secreción de proteína de unión de hierro (l l l). 102. El proceso según la reivindicación 96, donde la secuencia de señal de secreción es una señal de secreción de lipoproteína B. 103. El proceso según la reivindicación 96, donde la célula se desarrolla en un medio de sales minerales. 104. El proceso según la reivindicación 96, donde la célula se desarrolla a una alta densidad celular. 105. El proceso según la reivindicación 104, donde la célula se desarrolla a una densidad celular de al menos 20 g/L. 1 06. El proceso según la reivindicación 96, que comprende adicionalmente purificar la proteína recombinante. 107. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína recombinante se purifica por cromatografía de afinidad. 108. El proceso según la reivindicación 96, donde el enlace operativo de la proteína recombinante y la señal de secreción se segmenta por una enzima nativa a la célula huésped. 109. El proceso según la reivindicación 96, donde la señal de secreción se segmenta a partir de la proteína recombinante durante la expresión. 1 10. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de una proteína o péptido que es nativa(o) a un organismo huésped. 1 1 1 . El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de una proteína o péptido que es nativa(o) a un organismo P. fluorescens. 1 12. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de una proteína o péptido que no es nativa(o) a un organismo huésped. 1 13. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo que no es un Pseudomónada. 1 14. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo eucariótico. 1 15. El proceso según la reivindicación 96, donde la proteína recombinante comprende una secuencia que incluye al menos dos residuos de cisteína. 1 16. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos un enlace de bisulfuro se forma en la proteína recombinante en la célula. 1 17. El proceso según la reivindicación 96, que comprende además una secuencia de enlace entre la secuencia de péptido de señal y la secuencia de proteína o péptido recombinante. 1 18. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 50% de la proteína recombinante comprende un término amino nativo. 1 19. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 80% de la proteína recombinante comprende un término amino nativo. 120. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 90% de la proteína recombinante comprende un término amino nativo. 121 . El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 50% de la proteína recombinante se encuentra activo. 122. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 80% de la proteína recombinante se encuentra activo. 123. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 50% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico. 124. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 75% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico. 125. El proceso según la reivindicación 96, donde al menos 90% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico. 126. El proceso según la reivindicación 96, donde la célula es una célula de Pseudomónada. 127. El proceso según la reivindicación 126, donde la célula es una célula de P fluorescens. 128. El proceso según la reivindicación 96, donde la célula es una célula de E. coli. 129. Un proceso para la expresión mejorada de una proteína recombinante en una célula huésped de P. fluorescens que comprende proporcionar una célula de P. fluorescens que comprende un vector que codifica una proteína o péptido recombinante vinculada(o) operativamente a una secuencia de señal de secreción de sistema de Sec recombinante, y desarrollando la célula bajo condiciones que producen la expresión de la proteína o péptido. 130. El proceso según la reivindicación 129, donde la secuencia de señal proviene de una genoma de P. fluorescens. 131 . El proceso según la reivindicación 129, donde la secuencia de señal no se deriva de un genoma de P. fluorescens. 132. El proceso según la reivindicación 129, donde la secuencia de señal se deriva de una genoma de E. coli. 133. El proceso según la reivindicación 129, donde la célula se desarrolla en un medio de sales minerales. 134. El proceso según la reivindicación 129, donde la célula se desarrolla a una alta densidad celular. 135. El proceso según la reivindicación 134, donde la célula se desarrolla a una densidad celular de al menos 20 g/L. 136. El proceso según la reivindicación 129, que comprende adicionalmente purificar la proteína recombinante. 137. El proceso según la reivindicación 136, donde la proteína recombinante se purifica por cromatografía de afinidad. 138. El proceso según la reivindicación 129, donde el enlace operativo de la proteína recombinante y la señal de secreción se segmenta por una enzima nativa a la célula huésped. 139. El proceso según la reivindicación 138, donde la señal de secreción se segmenta de la proteína recombinante durante la expresión. 140. El proceso según la reivindicación 129, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo de Pseudomónada. 141 . El proceso según la reivindicación 129, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo que no es un Pseudomónada. 142. El proceso según la reivindicación 129, donde la proteína o péptido recombinante se deriva de un organismo eucariótico. 143. El proceso según la reivindicación 129, donde la proteína recombinante comprende una secuencia que incluye al menos dos residuos de cisteína. 144. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos se forma un enlace de bisulfuro en la proteína recombinante en la célula. 145. El proceso según la reivindicación 129, que comprende además una secuencia de enlace entre la secuencia de péptido de señal y la secuencia de proteína o péptido recombinante. 146. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 50% de la proteína recombinante comprende un término amino nativo. 147. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 80% de la proteína recombinante comprende se encuentra activo. 148. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 90% de la proteína recombinante comprende se encuentra activo. 149. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 50% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico. 150. El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 75% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico. 151 . El proceso según la reivindicación 129, donde al menos 90% de la proteína recombinante se expresa en un compartimiento periplásmico.
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