EA032045B1 - ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОМОТОР manP ИЛИ manR ОПЕРОНА МАННОЗЫ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к вектору, способному экспрессироваться в прокариотной клетке-хозяине, содержащему индуцируемый маннозой промотор manP или manR оперона маннозы из Bacillus subtilis, оперативно связанный с транскрипционной единицей, кодирующей гетерологичный полипептид. Также изобретение относится к прокариотной клетке-хозяину, трансформированной заявленным вектором, и ее использованию в способе получения полипептида.

Description

Изобретение относится к векторам, способным экспрессироваться в прокариотных клеткаххозяевах, содержащим способный индуцироваться маннозой промотор для гетерологичной экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих, например, полипептиды, такие как рекомбинантные белки.

В частности, настоящее изобретение относится к новым векторам для гетерологичной экспрессии в хозяине, содержащем область промотора оперона маннозы, соединяемую оперативным путём с транскрипционной единицей, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является гетерологичной к указанному хозяину, в то время как экспрессия указанной нуклеотидной последовательности управляется указанной промоторной областью оперона маннозы.

Было описано много систем для гетерологичной экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих, например, полипептиды (структурные гены) в прокариотных системах. Для этой цели хозяина трансформируют с помощью вектора, содержащего нуклеотидную последовательность нужного структурного гена, соединяемого оперативным путем с промотором, который представляет собой такую нуклеотидную последовательность, которая позволяет транскрипцию указанного структурного гена. Этот промотор активируется с помощью должной индукции и обеспечивает транскрипцию этого структурного гена. Индукция может быть под отрицательным или положительным управлением.

При индукции с отрицательным управлением репрессор связывается с промотором и предотвращает транскрипцию структурного гена. Если присутствует подходящий индуктор, то этот репрессор деактивируется, и транскрипция становится возможной.

При индукции с положительным управлением промотор активируется после связывания активатора, при этом связывание активатора с промотором проходит при посредничестве подходящего индуктора.

Типичные индукторы могут представлять собой субстраты, которые требуются для метаболизма прокариотных хозяев, такие как, например, различные типы сахаров.

Настоящее изобретение относится к системам с положительной индукцией, в которых в присутствии подходящего субстрата, т.е. индуктора, активатор связывается с промотором, который инициирует транскрипцию генов, соединяемых оперативным путем с указанным промотором.

До настоящего времени большинство гетерологичных систем экспрессии генов в системах с прокариотным хозяином основывалось на ограниченном наборе бактериальных промоторов. Следовательно, также ограничен и круг субстратов, которые могут использоваться в качестве индукторов.

Кроме этого, выход гетерологичной системы экспрессии зависит от числа доступных трансформируемых прокариотных хозяев. Таким образом, требуются системы с такими прокариотными хозяевами, которые способны расти до высокой клеточной плотности, то есть которые позволяют быструю пролиферацию без потери данного вектора при делении клеток.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, данные и иные цели в том виде, как они предстанут в нижеследующем описании, были достигнуты в результате создания новых векторов, содержащих промоторную область оперона маннозы, соединяемую оперативным путем с транскрипционной единицей, содержащей нуклеотидную последовательность, которая является гетерологичной по отношению к данному носителю, тогда как экспрессия указанной нуклеотидной последовательности управляется указанной промоторной областью оперона маннозы.

Также описывается использование указанного нового вектора для регулируемой гетерологичной экспрессии нуклеотидной последовательности в прокариотном хозяине; нуклеотидная последовательность изолированных и очищенных нуклеиновых кислот, способная экспрессироваться в хозяине, содержащем промоторную область оперона маннозы; прокариотный хозяин, трансформируемый названным вектором или указанной нуклеотидной последовательностью изолированных и очищенных нуклеиновых кислот; способ получения полипептида в хозяине с использованием названного вектора или указанной нуклеотидной последовательности изолированных и очищенных нуклеиновых кислот; а также использование прокариотного хозяина, трансформируемого названным вектором или указанной нуклеотидной последовательностью изолированных и очищенных нуклеиновых кислот в процессе ферментации, в частности при ферментации с высокой клеточной плотностью.

Другие объекты и преимущества станут очевидными для специалистов в данной области при ознакомлении с нижеследующим подробным описанием со ссылкой на сопровождающие иллюстративные материалы и с прилагаемой патентной формулой.

Краткое описание чертежей

Ниже представлены:

на фиг. 1 - нуклеотидная последовательность из B.subtilis, используемая при картировании сайта инициации транскрипции промотора manP с сайтом инициации транскрипции на аденин-нуклеотиде, который приведён выделенным, при этом отслеживаемые блоки -35 и -10 приводятся курсивом, окончание manR и начало гена lys отмечаются стрелками, а сайты рестрикции Bg/II, XbaI, Af/II и NdeI подчеркнуты;

на фиг. 2 - нуклеотидная последовательность промоторной области, содержащей промотор manR с сайтом инициации транскрипции на гуанинуклеотиде, который выделен, отслеживаемые блоки -10 и -35

- 1 032045 при этом приводятся курсивом, начало гена manR отмечается стрелкой, а сайт рестрикции Hind/II и предполагаемая последовательность cre подчеркнуты;

на фиг. 3 - нуклеотидная последовательность, полученная из B.subtilis, содержащая промоторную область промотора manR, такого, какой содержится в pSUN 291, pSUN 384.1 и pSUN 385.2, соответственно, при этом начало IacZ указывается стрелкой, а сайты рестрикции подчеркнуты;

на фиг. 4 - плазмидная карта вектора экспрессии pSUN279.2, согласно настоящему изобретению;

на фиг. 5 - все виды β-галактозидазной активности у B.subtilis 3NA, содержащей плазмиды pSUN 279.2, pSUN 284.1 и pSUN 291, соответственно, согласно настоящему изобретению;

на фиг. 6 - нуклеотидная последовательность, полученная из B.subtilis, содержащая промоторную область промотора manP из B.subtilis, включая С-терминальное окончание у manR, межгенную область между manR и manP, в данном случае замещаемую информационным геном IacZ, с сайтом начала транскрипции, при этом блоки -35 и -10 отражены жирным шрифтом, окончание manR и начало IacZ указываются стрелкой, а сайты рестрикции подчеркнуты;

на фиг. 7 - все виды β-галактозидазной активности у B.subtilis 3NA, содержащей плазмиду pSUN 279.2, также как и другие плазмиды, содержащие фрагменты различной длины нуклеотидной последовательности, изображенной на фиг. 6;

на фиг. 8 - все виды β-галактозидазной активности у B.subtilis 3NA, содержащей векторы pSUN 291, pSUN 384 и pSUN 345.2 с нуклеотидными последовательностями, изображенными на фиг. 3;

на фиг. 9 - плазмидное картирование вектора экспрессии pMW 168.1, согласно настоящему изобретению;

на фиг. 10 - схема с результатом теста плазмидной стабильности у pMW 168.1 в B.subtilis 3NA с процентной долей клеток, содержащих плазмиду, за которой ведется наблюдение в течение целого ряда поколений;

на фиг. 11-14 - схемы, отражающие в виде логарифмов концентрацию сухой биомассы, которая отражается в виде графиков в течение всей длительности процессов ферментации в ходе опытов 1-4, и схемы с сигналом флуоресценции (RFU), которые отображаются в виде графиков в течение всей длительности процессов ферментации в ходе опытов 1-4; и на на фиг. 15 и 16 - схемы сигнала флуоресценции, которые отображаются в виде графиков в течение всей длительности процессов ферментации в ходе опытов 5 и 6;

на фиг. 17 - схематическая структура области, инициирующей промотор, в том её виде, как было получено согласно эксперименту 4а построение плазмиды pMW 168.1;

н фиг. 18 - технологическая схема построения плазмиды pMW 168.1; и на фиг. 19 - страница додецилсульфатнатрия (SDS).

Подробное описание изобретения

Приведены нижеследующие определения используемых в тексте терминов с целью облегчения понимания настоящего изобретения.

Вектор, экспрессируемый в хозяине или вектор экспрессии представляет собой конструкцию на основе полинуклеиновых кислот, получаемую рекомбинантным путем или путём синтеза, с помощью ряда специфических элементов полинуклеиновых кислот, которые позволяют транскрипцию конкретной последовательности нуклеиновых кислот в клетке-хозяине. Обычно этот вектор включает в себя транскрипционную единицу, содержащую подлежащую транскрипции конкретную нуклеотидную последовательность, соединяемую оперативным путем с каким-то промотором. Вектор, экспрессируемый в хозяине, может представлять собой, например, автономно или самостоятельно реплицируемую плазмиду, космиду, фаг, вирус или ретровирус.

Термины хозяин, клетка-хозяин и рекомбинатная клетка-хозяин в данном тексте используются взаимозаменяемо для обозначения прокариотной клетки, в которую были введены один или несколько векторов или нуклеотидных последовательностей изолированных и очищенных нуклеиновых кислот согласно изобретению. Следует понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клеткесубъекту, но и к потомству или к потенциальному потомству такой клетки. В связи с тем, что в последующих поколениях могут произойти некоторые изменения из-за мутации либо из-за влияния окружающей среды, такое потомство на практике может не быть идентичным клетке-родителю, однако они всё ещё входят в рамки данного термина в том его смысле, какой используется в данном тексте.

Термин содержать обычно используется в смысле включать в себя, то есть позволять присутствие одного или нескольких дополнительных признаков или компонентов.

Промотор в том виде, как он используется в данном тексте, относится к нуклеотидной последовательности, которая управляет экспрессией транскрипционной единицы. Промоторная область - это регуляторная область, способная связывать полимеразу РНК в клетке и инициирующая транскрипцию кодирующей последовательности в прямом направлении (направление 3'). Внутри этой промоторной области находятся белок-связывающие домены (согласованные последовательности), ответственные за связывание РНК-полимеразы, такие как предполагаемый блок -35 и блок Прибнова (блок -10). Кроме того, данная промоторная область может содержать названный сайт инициации транскрипции и сайты

- 2 032045 связывания для белков-регуляторов.

Оперон маннозы обозначает оперон маннозы Bacillus subtilis. В этом опероне маннозы были идентифицированы три гена (авторы Kunst F.N. и др., Полная геномная последовательность грамположительной бактерии Bacillus subtilis , Nature 390, стр. 249-256(1997)).

Первый ген manP кодирует маннозоспецифичный энзимный компонент (переносчик), который относится к семейству фруктозопермеазы. Второй ген - manA кодирует маннозо-6-фосфат-изомеразу, в то время как функция третьего гена -yjdF неизвестна. В обратном направлении и в той же самой ориентации с этими тремя генами расположен ген-регулятор - manR, который кодирует ManR - активатор оперона маннозы.

Оперон маннозы, состоящий из этих трёх генов manP-manA-yjdF (далее по тексту в общем обозначаемых manP), находится под управлением промотора manP, который сам регулируется позитивно. Другой промотор - промотор manR отвечает за экспрессию manR, что является основным для маннозозависимой индукции промотора manP.

Область промотора manR дополнительно содержит сайт связывания белка-регулятора катаболита (катаболит-чувствительный элемент (cre)) гена manR.

Последовательность cre относится к нуклеотидной последовательности, идущей в обратном направлении (направление 5') от катаболических генов. Последовательность cre связывает катаболический управляющий белок (ССР), предотвращающий экспрессию этого катаболического гена при подавлении углеродного катаболита (CCR).

Под промоторными областями оперона маннозы подразумеваются те промоторные области, которые регулируют экспрессию manP, также как и manR, при наличии или отсутствии последовательности cre.

Промотор manP в том смысле, который подразумевается в данном тексте, содержит, кроме области -35, блок Прибнова и сайт связывания ManR.

Промотор manR в том смысле, который подразумевается в данном тексте, содержит, кроме предполагаемой области -35, блок Прибнова, сайт связывания ManR и факультативно последовательность cre.

D-манноза, также приведенная здесь как манноза, представляет собой 2-эпимер глюкозы и присутствует в маннан- и гетероманнан-полисахаридах, гликопротеинах и во многих других гликоконъюгатах.

CcpA обозначает катаболический управляющий белок А, который представляет собой общий белок-регулятор и может активировать или подавлять активацию некоторых катаболических оперонов. В случае оперона маннозы CcpA играет роль подавления путем связывания с последовательностью cre.

Энхансер - это нуклеотидная последовательность, которая действует в направлении обеспечения возможности транскрипции транскрипционной единицы, независимо от идентичности этой транскрипционной единицы, положения этой последовательности относительно данной транскрипционной единицы или ориентации данной последовательности. Векторы согласно настоящему изобретению факультативно могут включать в себя энхансеры.

Транскрипционная единица в том смысле, который подразумевается в данном тексте, относится к такой нуклеотидной последовательности, которая обычно транскрибируется в одиночную молекулу РНК. Эта транскрипционная единица может содержать один ген (моноцистронный) или два (дицистронных) или более генов (полицистронных), которые кодируют молекулы функционально родственных полипептидов.

Нуклеотидная последовательность является оперативно соединенной, когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновых кислот. Например, какой-то промотор оперативным путем соединен с какой-то кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию этой последовательности; или же какая-то область инициации транскрипции, такая как сайт связывания рибосом, оперативным путем соединена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей, например, какой-то полипептид, если он позиционируется таким образом, чтобы облегчить трансляцию этого полипептида. Соединение может быть осуществлено легированием на подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с обычной практикой.

Нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, или изолированная или очищенная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность, согласно изложенному в настоящем изобретении, может представлять собой ДНК, РНК или гибрид ДНК/РНК. В случае, если нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность располагается на векторе, то обычно это ДНК. ДНК, на которую делается ссылка по всему данному тексту, может представлять собой любую полидезоксинуклеотидную последовательность, включая, например, двухнитевую ДНК, однонитевую ДНК, двухнитевую ДНК, в которой одна или обе нити состоят из двух или более фрагментов, двухнитевую ДНК, в которой одна или обе нити имеют непрерывный скелет сложного фосфодиэфира, ДНК, содержащую один или более однонитевых участков и один или более двухнитевых участков, двухнитевую ДНК, в которой нити ДНК являются целиком комплементарными, двухнитевую ДНК, в которой нити ДНК комплементарны только частично, кольцевую ДНК, ковалентно-замкнутую ДНК, линейную ДНК, ковалентно пере- 3 032045 крестно сшитую ДНК, сДНК, химически синтезированную ДНК, полусинтетическую ДНК, биосинтетическую ДНК, природою выделенную ДНК, ДНК, полученную с помощью ферментов, фрагментированную ДНК, меченую ДНК, такую как меченая радиоактивным изотопом ДНК и флуорохром-меченая ДНК, ДНК, содержащую один или более видов нуклеиновой кислоты, не встречающихся в природе. Последовательности ДНК могут синтезироваться стандартными химическими технологиями, например, с помощью метода фосфотриэфиров или через методы автоматического синтеза и методы полимеразноцепной реакции. Нуклеотидная последовательность очищенной и изолированной ДНК также может быть получена с помощью ферментной технологии.

РНК, на которую здесь делается ссылка, может представлять собой, например, однонитевую РНК, сРНК, двухнитевую РНК, в которой одна или обе нити состоят из двух или более фрагментов, двухнитевую РНК, в которой одна или обе нити имеют непрерывный скелет сложного фосфодиэфира, РНК, содержащую один или более однонитевых участков и один или более двухнитевых участков, двухнитевую РНК, в которой нити РНК являются целиком комплементарными, двухнитевую РНК, в которой нити РНК комплементарны только частично, ковалентно перекрестно сшитую РНК, РНК, полученную с помощью ферментов, фрагментированную РНК, мРНК, химически синтезированную РНК, полусинтетическую РНК, биосинтетическую РНК, природою выделенную РНК, меченую РНК, такую как меченая радиоактивным изотопом РНК и флуорохром-меченая РНК, РНК, содержащую один или более видов нуклеиновой кислоты, не встречающихся в природе.

Под вариантами или вариантами последовательности подразумевается такая нуклеотидная последовательность, которая отличается от базовой последовательности с помощью умеренных замещений нуклеиновых кислот, посредством чего одна или несколько нуклеиновых кислот замещаются другой, с такими же характеристиками. Варианты заключают в себе также вырожденные последовательности, последовательности с делециями (утратами) и вставками, до тех пор, пока такие модифицированные последовательности будут демонстрировать ту же самую функцию (будут функционально эквивалентны), что и базовая последовательность.

Термины полипептид, пептид, белок, полипептидный и пептидный в том их смысле, какой применяется в настоящем тексте, используются взаимозаменяемо для обозначения целого ряда аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями между альфа-аминогруппами и карбоксильными группами смежных остатков.

Термин нуклеотидная последовательность выделенных и очищенных нуклеиновых кислот относится к состоянию, в котором эта нуклеотидная последовательность будет соответствовать настоящему изобретению. Эта нуклеотидная последовательность будет свободна или практически свободна от материала, с которым они связаны в природе, такого, как другие нуклеиновые кислоты, с которыми они встречаются в своём природном окружении, или же от среды, в которой их получают (например, клеточная культура), когда такое их получение осуществляется с помощью рекомбинантной технологии, реализуемой ин витро или ин виво.

Термины трансформация, трансформированный или введение какой-то нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина обозначают любой процесс, в ходе которого экстраклеточная нуклеиновая кислота, представляющая собой вектор, с присутствием или в отсутствие сопровождающего материала, вводится в клетку-хозяина. Термин клетка трансформированная или трансформированная клетка подразумевает клетку или её потомство, в которую ранее была введена эта экстраклеточная нуклеиновая кислота и которая таким образом заключает в себе эту экстраклеточную нуклеиновую кислоту. Эта нуклеиновая кислота может быть введена в эту клетку так, что эта нуклеиновая кислота может реплицироваться в качестве неотъемлемой хромосомной части целого или в качестве дополнительного хромосомного элемента. Трансформация соответствующих клеток-хозяев, например, вектора экспрессии, может осуществляться с помощью хорошо известны методик, таких как микроинъекция, электропорация, бомбардирование частицами, или с помощью химических методов, таких как фосфорно-кислый кальций - опосредованная трансформация, описанная, например, авторами Maniatis et al., 1982, Клонирование молекул, Лабораторная инструкция, Лаборатория Коулд Спринг Харбор, или в работе авторов Ausbel et al., 1994, Текущие протоколы в молекулярной биологии, изд. Джон Уилей энд Санз.

Гетерологичная нуклеотидная последовательность или нуклеотидная последовательность, гетерологичная к хозяину означают такую нуклеотидную последовательность, которая кодирует, например, продукт экспрессии, такой как полипептид, который чужероден этому хозяину (гетерологичная экспрессия или гетерологичный продукт), т.е. нуклеотидная последовательность, получаемая от донора, иного, чем этот хозяин, или же химически синтезированная нуклеотидная последовательность, которая кодирует, например, продукт экспрессии, такой как полипептид, который является чужим для этого хозяина. В случае, если хозяин относится к специфическому прокариотному виду, то эта гетерологичная нуклеотидная последовательность предпочтительно происходит от иного рода или семейства, и более предпочтительно от иного отряда или класса, в частности, от иного типа (раздела), и наиболее предпочтительно от иного домена (области) организмов.

Гетерологичная нуклеотидная последовательность, происходящая от донора, иного, чем этот хозяин, может быть модифицирована, до её введения в клетку-хозяина, с помощью мутаций, инсерций, деле

- 4 032045 ций или замещений, или одиночных нуклеиновых кислот, или части гетерологичной нуклеотидной последовательности до тех пор, пока такие модифицированные последовательности будут проявлять ту же самую функцию (функциональный эквивалент), что и базовая последовательность. Гетерологичная нуклеотидная последовательность в том смысле, какой придается в данном тексте, также заключает в себе нуклеотидные последовательности, происходящие от разного домена (области) организмов, такого как эукариоты (эукариотного происхождения), такие как, например, человеческие антитела, которые давно используются в библиотеках демонстрации фагов и одиночные нуклеиновые кислоты или часть нуклеотидной последовательности которых были модифицированы в соответствии с практикой применения кодонов прокариотного хозяина.

В рамках понимания смысла согласно настоящему изобретению термин гетерологичная нуклеотидная последовательность или нуклеотидная последовательность, гетерологичная к хозяину заключает в себе также такую нуклеотидную последовательность, которая происходит от этого хозяина и кодирует полипептид, естественным путем экспрессируемый в этом хозяине, где данная нуклеотидная последовательность вводится в вектор согласно настоящему изобретению и под управлением промоторной области оперона маннозы согласно настоящему изобретению.

Область инициации транскрипции представляет собой сигнальную область, которая способствует инициации транскрипции и которая включает в себя последовательность для сайта связывания рибосом, такую как последовательность Shine Dalgarno.

Обычно область инициации транскрипции располагается в прямом направлении к сайту инициации транскрипции и оперативным путем соединяется с генами, которые должны экспрессироваться.

Область окончания транскрипции относится к последовательности, которая вызывает завершение транскрипции РНК-полимеразы. Область окончания транскрипции обычно является частью транскрипционной единицы, которая может предотвратить нежелательную транскрипцию других расположенных рядом генов или транскрипцию от других потенциальных промоторов и может повысить стабильность мРНК.

Антитело относится к классу белков плазмы, продуцируемых В-клетками иммунной системы после стимуляции антигеном. Антитела млекопитающих (т.е. человека) - это иммуноглобулины класса Ig G, M, A, E или D. Термин антитело, используемый для целей данного изобретения, включает, не будучи этим ограничен, поликлональные антитела, моноклональные антитела, антиидиотипические антитела и аутоантитела, присутствующие в аутоиммунных заболеваниях, таких как диабет, рассеянный склероз и ревматоидный артрит, также как и химерные антитела.

С одной стороны, предметом настоящего изобретения является вектор, способный экспрессироваться в хозяине, имеющем промоторную область оперона маннозы, соединенную оперативным путем с транскрипционной единицей, содержащей нуклеотидную последовательность, которая гетерологична к этому хозяину, в то время как экспрессия указанной последовательности нуклеиновых кислот управляется указанной промоторной областью оперона маннозы.

Вектор согласно изобретению предпочтительно представляет собой плазмиду, реплицирующуюся автономно или самостоятельно, космиду, фаг, вирус или ретровирус. При экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно данному изобретению может широкое разнообразие комбинаций хозяин/вектор.

Полезные векторы экспрессии, например, могут состоять из сегментов хромосомных, нехромосомных и/или синтетических нуклеотидных последовательностей. Пригодные векторы включают в себя векторы со специфическим диапазоном хозяина, такие как векторы, специфичные, например, к B.subtilis и E.coli, соответственно, также как и векторы с широким кругом хозяев, такие как векторы, полезные для грам-положительных бактерий и для грамотрицательных бактерий.

Могут использоваться плазмиды со слабой репликацией, со средней репликацией, также как и с высокой степенью репликации.

Например, в Bacillus subtilis плазмида со слабой репликацией - это pAMbeta1, плазмиды со средней репликацией - это производные pBS72, а плазмида с высокой степенью репликации - это pUB110.

Согласно данному изобретению, промоторная область оперона маннозы содержит промоторную область manR и промоторную область manP, соответственно.

Нуклеотидная последовательность из В.биЫШб, заключающая в себе С-терминальное окончание от manR, межгенную область между manR и manP, с последующим геном лизостафина lys в качестве информационного гена, приведена на фиг. 1.

Нуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению, содержащая промоторную область от manP, предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность с фиг. 1 от bp-80 до стартового кодона lys (SEQ ID NO: 1-последовательность с идентификационным № 1) и более предпочтительно нуклеотидную последовательность с фиг. 1 от bp-80 и включая bp-1, т.е. в обратном направлении относительно сайта инициации транскрипции А на bp+1 (SEQ ID NO: 2).

Нуклеотидная последовательность из В. subtilis, содержащая промоторную область от manR, сайт инициации транскрипции G на bp+1, предположительную последовательность cre, область инициации транскрипции между bp+1 и manR, также как и часть manR, приводится на фиг. 2 и на фиг. 3, где manR

- 5 032045 замещен на IacZ. Нуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению, содержащая промоторную область от manR, предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность с фиг. 2 от bp-122 до стартового кодона IacZ (SEQ ID NO: 3), более предпочтительно нуклеотидную последовательность с фиг. 2 от bp-122 и bp+7, т.е. включая предположительную последовательность cre, (SEQ ID NO: 4), и, в частности, нуклеотидную последовательность с фиг. 2 от bp-122 и bp-1, т.е. в обратном направлении относительно сайта инициации транскрипции G на pb+1 (SEQ ID NO: 5).

Обе промоторных области manP и manR содержат сайты связывания для ManR. Настоящее изобретение также охватывает последовательность, комплементарную к любой из SEQ ID NO: 1-5 и их вариантов.

Промоторные области оперона маннозы, такие как промоторная область manP, промоторная область manR (с последовательностью cre или без неё), также как и промоторные области в соответствии с последовательностями SEQ ID NO: 1-5, их комплементарная последовательность или их варианты, используемые в настоящем изобретении, обычно берут от оперона маннозы от B.subtilis или от промоторной области, являющейся функциональным эквивалентом, от других прокариотных организмов, в частности, организмов семейства bacteriaceae. Функциональный эквивалент - промоторная область других прокариотных организмов заключает в себе промоторную область, которая способна индуцироваться Dманнозой, т.е. промоторную область, имеющую более высокую активность экспрессии в присутствии маннозы по сравнению с её отсутствием.

Во многих прокариотных организмах, таких как Firmicutes, разновидности B.subtilis, в метаболизме D-маннозы задействован оперон маннозы.

B.subtilis может использовать много различных сахаров в качестве источника углерода. Гексозы, такие как глюкоза и D-манноза, потребляются главным образом через посредство системы фосфоенолпируват: углеводная фосфотрансфераза (PTS). В этой PTS соответствующая гексоза одновременно фосфорилируется и переносится в клетку во время потребления. Потребление и использование субстрата со специфическим сахаром подвержены подавлению углеродным катаболитом (CCR). В присутствии глюкозы -предпочтительного сахарного субстрата для B.subtilis подавляется транскрипция генов для потребления и использование других субстратов, таких как оперон маннозы.

Механизм зависимого от глюкозы подавления углеродным катаболитом (CCR) широко изучен и известен в данной области (авторы Stulke J. et al., Регуляция катаболизма углерода в видах Bacillus, в Annu. Rev. Microbiol. 54,2000, страницы 849-880).

Транскрипционная единица согласно настоящему изобретению обычно дополнительно содержит область инициации транскрипции в обратном направлении относительно точки инициации (стартовый кодон) транскрипции указанной транскрипционной единицы, тогда как область инициации транскрипции соединяется оперативным путем с этой последовательностью нуклеиновых кислот. Область инициации транскрипции обычно располагается в обратном направлении, в непосредственной близости от точки инициации транскрипции транскрипционной единицы, которая может представлять собой ATG, GTG или TTG.

Область инициации транскрипции может представлять собой область инициации транскрипции транскрипционной единицы гена manP или manR в опероне маннозы.

Область инициации транскрипции гена manP или гена manR оперона маннозы может быть частично или полностью замещена другой областью инициации транскрипции. Например, могут использоваться области инициации транскрипции tufA (фактор элонгации Tu) и gsiB (стрессовый белок; авторы Jurgen et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258, 538-545), оба из B.subtilis.

Соответствующие нуклеотидные последовательности из tufA и gsiB показаны ниже со стартовым кодоном жирным шрифтом, с подчеркнутыми сайтами рестрикции и с выделенной последовательностью Shine-Dalgarno.

tufA:

5’- ctt^^O№~TTTAGAATGGCTAAAGAAAAATTCaaatcc -3’ Aflll SD Startcodon BamHI gsiB:

5·- cttaaaAATTM—AATTCAAAATGGCAGACAATAACAAAflflalge -3’

J/Jll SD Стартовый кодон ВатШ

Стабильность mPHK можно улучшить с помощью правильного выбора области инициации транскрипции, что является важным признаком для экспрессии генов. Стабильность мРНК характеризуется её специфическим временем полураспада.

В дополнение к области инициации транскрипции можно заменять и точку инициации транскрипции, также как и факультативно ряд кодонов гена, следующего за точкой инициации, например, примерно 5-6 кодонов, например, как показано в нуклеотидной последовательности из tufA и gsiB, соответст

- 6 032045 венно.

Область инициации транскрипции может дополнительно содержать последовательность, кодирующую сигнальную последовательность, соединяемую оперативным путём с гетерологичной нуклеотидной последовательностью согласно изобретению. Сигнальная последовательность обычно располагается в прямом направлении, в непосредственной близости от точки инициации транскрипции, которая может представлять собой ATG, GTG или TTG транскрипционной единицы.

В случае использования дицистронной или полицистронной транскрипционной единицы, можно применить разные или идентичные сигнальные последовательности, соединенные оперативным путем с каждым из цистронов. Предпочтительно в таком случае использовать разные сигнальные последовательности. Используемая сигнальная последовательность может представлять собой прокариотную или эукариотную сигнальную последовательность. Обычно применяют прокариотные сигнальные последовательности.

ДНК-последовательности, кодирующие сигнальные последовательности, которые используются в векторах экспрессии согласно настоящему изобретению, могут быть закуплены на рынке или получены методами химического синтеза. Например, сигнальные последовательности могут быть синтезированы в соответствии со способом фосфорамидит-триэфира в твердой фазе, описанным, например, в работе авторов Beaucage & Caruthers, 1981, Tetrahedron LeHs.22, 1859-1862, согласно описанному в статье Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). Очистка олигонуклеотидов может быть произведена либо электрофорезом с нативным акриламидным гелем или с помощью анионообменной ВЭЖХ, согласно описанному в статье авторов Pearson & Reamer, J.Chrom.255:137-149(1983).

Обычно транскрипционная единица дополнительно содержит область окончания транскрипции.

Предпочтительно использование прочных областей окончания транскрипции для предотвращения сплошного считывания промотором за пределами транскрипционной единицы вплоть до расположенной сбоку последовательности плазмид, также как и от других промоторов плазмид в транскрипционную единицу. Кроме того, в присутствии такой области окончания транскрипции отмечали стабилизацию мРНК.

В подходящем примере прочной области окончания транскрипции имеется нуклеотидная последовательность 5'-CGAGACCCCTGTGGGTCTTCG-3 из 3'-области tufA из B.subtilis 168, который имеется в продаже на рынке.

Гетерологичная нуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению кодирует продукт экспрессии, который чужероден для этого хозяина. В случае, когда хозяин относится к прокариотному виду, такому как B.subtilis или E.coli, представляющая интерес нуклеотидная последовательность может быть более предпочтительна из другого класса, такого как гамма-протеобактерии, такие как, например, из вида Burkholderia sp., в частности, из другого типа, такого как аркебактерии, и наиболее конкретно из эукариотного организма, такого как млекопитающие, в частности от человека. Однако, гетерологичная нуклеотидная последовательность могла бы быть модифицирована в соответствии с практикой использования кодонов хозяина. Гетерологичная нуклеотидная последовательность согласно настоящему изобретению обычно является геном, представляющим собой интерес. Ген, представляющий собой интерес, предпочтительно заключает в себе гетерологичный полипептид, такой как структурный, регуляторный или терапевтический белок, или N- или С-терминальные продукты слияния структурного, регуляторного или терапевтического белка с другими белками (Метки), такими как зеленый флуоресцирующий белок или другие слитые белки. Гетерологичная нуклеотидная последовательность могла бы также кодировать транскрипт, который может использоваться в форме РНК, такой, как, например, антисмысловая РНК.

Этот белок может вырабатываться как нерастворимый агрегат или как растворимый белок, который присутствует в цитоплазме или в периплазмическом пространстве клетки-хозяина, и/или в экстраклеточной среде. Предпочтительно этот белок вырабатывается в виде растворимого белка, который присутствует в периплазмическом пространстве клетки-хозяина, и/или в экстраклеточной среде.

Гетерологичный белок, представляющий собой интерес, может происходить от человека, млекопитающих или прокариотов. Другие белки - это антигены, такие как гликопротеиды и углеводы из микробных патогенов, как вирусных, так и антибактериальных, и из опухолей. Другие белки - это ферменты, такие как химозин, протеазы, полимеразы, дегидрогеназы, нуклеазы, глюканазы, оксидазы, альфаамилазы, оксидоредуктазы, липазы, амидазы, нитрилгидратазы, эстеразы или нитрилазы.

В данном изобретении могут варьироваться порядок и расстояние, которые используются для размещения сигнальной последовательности и гетерологичных нуклеотидных последовательностей внутри векторов экспрессии. В предпочтительных вариантах осуществления сигнальная последовательность располагается в 5' (в обратном направлении) относительно нуклеотидной последовательности, кодирующей, например, представляющий интерес полипептид. Сигнальная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая, например, представляющий интерес полипептид, может быть разделена аминокислотами в количестве от нуля до 1000. В предпочтительных вариантах осуществления сигнальная последовательность и нуклеотидная последовательность, кодирующая, например, представляю- 7 032045 щий интерес полипептид, непосредственно соседствуют друг с другом, т.е. разделены нулевым количеством нуклеиновых кислот.

Предпочтительно, вектор согласно настоящему изобретению содержит нуклеотидная последовательность в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID NOS: 1-5, с их комплементарной последовательностью и с их вариантами.

В состав настоящего изобретения также включается использование вектора согласно изобретению для управляемой гетерологичной экспрессии нуклеотидной последовательности в прокариотном хозяине.

Экспрессия запускается добавлением соответствующего индуктора. Индуктор для оперона маннозы - это манноза или её дериват, способный индуцировать промоторную область manR или промоторную область manP этого оперона маннозы. Эта экспрессия может регулироваться объемом имеющегося индуктора для прокариотного хозяина.

В рамках ещё одного аспекта предметом данного изобретения является нуклеотидная последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты, содержащая промоторную область оперона маннозы. Предпочтительно, эта последовательность очищенной и изолированной нуклеиновой кислоты содержит промотор manP и/или промотор manR этого оперона маннозы. Более предпочтительно, эта последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты содержит любую из последовательностей SEQ ID NOS: 1-5. Эта нуклеотидная последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты, содержащая промоторную область этого оперона маннозы, может быть соединена оперативным путем с транскрипционной единицей, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, при этом экспрессия этой нуклеотидной последовательности, кодирующей этот полипептид, находится под управлением промоторной области этого оперона маннозы.

Эта нуклеотидная последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может содержать полную или частичную последовательность регуляторного гена manR.

По крайней мере, эта нуклеотидная последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты промотора manR может содержать последовательность cre.

Эта нуклеотидная последовательность изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может изолироваться согласно стандартным протоколам полимеразно-цепной реакции PCR и методикам, хорошо известным в данной области. Эта последовательность очищенной и изолированной ДНК согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать одну или более регуляторных последовательностей, как это известно в данной области техники, например, энхансер, обычно применяемый для экспрессии продукта, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью.

В целях выбора клеток-хозяев, успешно и стабильно трансформируемых этим вектором или нуклеотидной последовательностью изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в клетки-хозяева вместе с этой представляющей интерес последовательностью нуклеиновых кислот может вводиться ген, который кодирует подбираемый маркер (например, резистентный к антибиотикам). Ген, который кодирует подбираемый маркер, может располагаться на векторе или на нуклеотидной последовательности изолированной и очищенной нуклеиновой кислоты или же может факультативно вводиться совместно в отдельном виде, например, на отдельном векторе. Могут использоваться различные подбираемые маркеры, включая такие, которые придают устойчивость к антибиотикам, таким как спектиномицин, гигромицин, ампициллин и тетрациклин. Объем этого антибиотика можно подобрать по желанию в целях создания селективных условий. Обычно используется один подбираемый маркер.

В случае, когда этот вектор является шаттл-вектором, то можно выбрать маркер, общий для этих подходящих хозяев. Например, в случае, когда этот вектор является шаттл-вектором, реплицируемым как в E.coli, так и в B.subtilis, то может использоваться ген-маркер устойчивости, кодирующий спектиномицин-аденилтрансферазу из Enterococcus faecalis, который сообщает устойчивость к спектиномицину.

Наряду с этим, с целью определения эффективности трансформации, в клетки-хозяева можно вводить информационные гены, такие как флуоресцирующие белки, вместе с представляющей интерес нуклеотидной последовательностью.

Подходящими информационными генами являются, например, такие, которые кодируют усиленный зеленый флуоресцирующий белок (eGFP) и IacZ, кодирующий β-галактозидазу. Оба информационных гена имеются в продаже на рынке и широко применяются.

Другим аспектом настоящего изобретения является получение прокариотного хозяина, трансформируемого вектором согласно настоящему изобретению, где данный вектор содержит промоторную область оперона маннозы. Предпочтительно это вектор содержит любую из последовательностей SEQ ID NOS: 1-5, их комплементарную последовательность или их варианты.

Широкий ряд клеток прокариотного хозяина пригоден для трансформирования с помощью индуцируемой маннозой промоторной области оперона маннозы согласно настоящему изобретению. Эти хозяева могут включать в себя штаммы грамположительных клеток, таких как Bacillus и Streptomyces, или

- 8 032045 грамотрицательных клеток, таких как E.coli и Pseudomonas. Предпочтительно, клетка хозяина является грам-положительной клеткой, в частности, от типа Firmicutes, более предпочтительно клетка-хозяин - это

Bacillus.

Bacillus, которые могут использоваться, - это, например, штаммы B.subtilis, B.amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.natto, B.megaterium и т.д. Предпочтительно, клетка-хозяин - это B.subtilis, такая как B.subtilis 3NA и B.subtilis 168.

E.coli, которая может использоваться, - это, например, штаммы TG1, W3110, DH1, XL1-Blue и Origami, которые имеются в продаже на рынке.

Подходящие клетки-хозяева доступны на рынке, например, из коллекций культур, таких как DSMZ (Компания Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Брауншвейг, Германия).

Например, Bacillus можно получить из Генетического Центра хранения Bacillus.

Клетка-хозяин может или не может метаболизировать маннозу. Клетка-хозяин, которая обычно способна потреблять и метаболизировать маннозу, как В. subtil is, может быть модифицирована так, что она будет лишена одной или более функций, относящихся к потреблению и/или метаболизму маннозы. Дефицит одной или нескольких функций, относящихся к потреблению и/или метаболизму маннозы, можно получить, например, подавлением или блокированием экспрессии гена, кодирующего какой-то белок, такого как ген manA, кодирующий маннозо-6-фосфат-изомеразу. Это можно выполнить с помощью известной технологии, такой как транспозонный мутагенез на носителе или ударная мутация.

Обычно прокариотный хозяин соответствует выбранным сигнальным последовательностям, например, в случае использования сигнальных последовательностей Bacillus, клетка-хозяин обычно является членом той же самой семьи bacillacea, более предпочтительно клетка-хозяин является штаммом Bacillus.

Предпочтительно используется такой хозяин, который содержит систему фосфоенолпируват:углевод-фототрансфераза (PTS). В частности, хозяин, имеющий систему PTS, - это микроорганизм отряда Bacillales, в частности, рода Bacillus и более предпочтительно вида Bacillus subtilis или микроорганизм отряда Enterobacteriales, предпочтительно рода Escherichia, и более предпочтительно вида E.coli.

Первичный элемент подавления углеродным катаболитом CCR - это белок А управления катаболитом (CcpA), который способен связываться с cre-последовательностью, такой как предположительная cre последовательность в SEQ ID NOS: 3 и 4. При связанном состоянии CcpA подавляется транскрипция соответствующего гена - здесь это manR.

При отсутствии глюкозы и в присутствии индуктора, такого как D-манноза, отсутствует подавление из-за связывания CcpA, и транскрипция генов оперона маннозы инициируется связыванием белкарегулятора (ManR) с соответствующими сайтами связывания промоторных областей оперона маннозы.

С удивлением авторы настоящего изобретения обнаружили, что ManR - это не только белокрегулятор для промоторной области у manR, но и саморегулятор для самого manR.

Ещё одним предметом настоящего изобретения является способ получения полипептида в клеткехозяине, содержащий этапы:

а) построение вектора,

б) трансформирование прокариотного хозяина с помощью указанного вектора,

в) обеспечение экспрессии указанного полипептида в системе для культивирования клеток при соответствующих условиях,

г) извлечение указанного полипептида из этой системы для культивирования клеток.

Используемый вектор, также как и его построение и трансформация прокариотного хозяина, определены выше в данном тексте, тогда как гетерологичная нуклеотидная последовательность, входящая в состав этого вектора, кодирует полипептид.

В качестве системы для культивирования клеток можно использовать непрерывное или прерываемое культивирование, такое как периодическое культивирование без подпитки или периодическое культивирование с подпиткой в пробирках с культурой клеток, во встряхиваемых колбах или в ферментерах для культивирования бактерий.

Для культивирования клеток хозяина могут использоваться обычные среды, известные в данной области техники, такие как комплексные питательные среды типа питательная среда-бульон для дрожжей, являющаяся глицерин-содержащей средой, как описано авторами Kotz et al., 1995, J.Biotechnol. 39, 59-65, среды с минеральными солями, описанные авторами Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol., 135,1, дозированная порционная среда E.coli для ферментации, описанная авторами Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103, или LB-среда, описанная авторами Bertram et al., 1051, J.Bacteriol. 62, 293-300. Эта среда содержит соответствующий источник углерода, например, в качестве сахара -глюкозу, в качестве субстрата для выращиваемой клетки-хозяина. Используемый в качестве субстрата источник углерода отличается от индуктора.

Эта среда может быть модифицирована при необходимости, например, добавлением дополнительных ингредиентов, таких как буферы, соли, витамины, аминокислоты, антибиотики или другие микроэлементы, какие обычно известны специалистам в данной области техники.

Во время выращивания этих клеток также могут использоваться разные среды или комбинации сред.

- 9 032045

Предпочтительно используемая в качестве базовой среда не должна содержать индуктора, с целью обеспечения строгого регулирования промоторных областей маннозы. Добавление индуктора может начинаться после достижения культурой определяющих параметров. Примерами таких определяющих параметров являются оптическая плотность (ОП), указывающая концентрацию клеток в культуре, или концентрация источника углерода, который отличен от индуктора.

Например, в данном процессе индуктор может добавляться после достижения культурой должного уровня ОП, зависящего от конкретной системы культивирования. Для периодического культивирования во встряхиваемых колбах типичное значение ОП_6Оо в качестве определяющего параметра составляет примерно 0,3 или выше.

Обычно количество индуктора, такого как манноза, в среде для культивирования прокариотного хозяина регулируется на уровне примерно 10 г/л, предпочтительно примерно 5 г/л и более предпочтительно примерно 2 г/л.

Однако, количество добавляемого индуктора может адаптироваться к требованиям конкретного процесса ферментации.

Режим добавления индуктора (режим индукции) может выбираться в соответствии с конкретной системой культивирования.

С помощью режима добавления можно дополнительно регулировать скорость роста и скорость экспрессии клеток-хозяев.

Например, маннозу можно добавлять периодически или непрерывно в течение соответствующих промежутков времени. При прерывистом режиме добавление может производиться только один раз в момент индукции (ударная индукция), или дважды, или даже несколько раз с соответствующими интервалами. Подходящий режим зависит от системы культивирования, и его можно легко установить для специалистов из данной области техники.

Например, при непрерывном режиме маннозу можно добавлять с постоянным расходом или со снижающимся/увеличивающимся расходом.

При этом непрерывное добавление может осуществляться в течение выбранного времени культивирования, например, выбранного интервала времени в ходе экспоненциального роста культуры. Наряду с этим, возможна комбинация прерывистого и непрерывного режимов индукции.

В соответствии с одним вариантом осуществления периодического культивирования с подпиткой согласно настоящему изобретению, на этапе периодического культивирования клетки выращивают до клеточной плотности между 20 и 30 ед. ОП₆₀₀, и затем культивирование переключают на фазу подпитки с добавлением смеси первичного источника углерода и маннозы. При фазе подпитки соотношение первичного источника углерода и маннозы может варьироваться, подходящие соотношения составляют от 3:1 до 1:3. Благодаря изменению соотношения первичного источника углерода к маннозе, можно регулировать скорость экспрессии.

Подходящие диапазоны pH составляют, например, 6-8, предпочтительно 7-7,5, подходящая температура культивирования находится в пределах от 10 до 40°C, предпочтительно в пределах от 30 до 37°C.

Клетки инкубируются обычно в течение такой продолжительности времени, пока не будет накоплен максимальный объем продукта экспрессии и/или биомассы, предпочтительно от 1 ч до 20 дней, более предпочтительно от 5 ч до 3 дней.

Как и выход биомассы, объем экспрессируемого продукта зависит от используемой системы культивирования.

При культивировании во встряхиваемой колбе обычно может быть получен продукт экспрессии в количестве 0,5 г/л культуральной среды, при трансформации хозяина вектором согласно настоящему изобретению. При использовании культивирования в ферментере в режиме периодического культивирования без подпитки и периодического культивирования с подпиткой можно получать продукт экспрессии в объеме обычно выше 0,5 г/л культуральной жидкости, предпочтительно более 1 г/л, более предпочтительно выше 1,3 г/л.

Кроме того, в ходе ферментационного процесса согласно настоящему изобретению с использованием клеток-хозяев согласно настоящему изобретению, можно получать высокие величины плотности клеток от не менее чем 10 до 30 ед. ОП₆₀₀, в частности не менее 50 ед. ОП₆₀₀, предпочтительно, примерно 250 ед. ОП600 или более, намного более предпочтительно не менее 500 ед. ОП600 и наиболее предпочтительно, не менее 1000 ед. ОП600. В частности, в ходе процесса периодического культивирования с подпиткой согласно настоящему изобретению можно получать плотности клеток в пределах от 50 ед. ОП₆₀₀ до более чем 1000 ед. ОП600.

Для иллюстрации, 1 ед. ОП₆₀₀ соответствует в среднем примерно 0,322 г сухой массы на литр. Соответственно, значение ед. ОП₆₀₀, равное 100, соответствует 32,2 г сухой массы на литр, а 500 ед. ОП₆₀₀ соответствует 161 г сухой массы на литр.

И, наконец, клетки-хозяева согласно настоящему изобретению позволяют высокую скорость дупликации без утраты вектора.

После экспрессии в клетке-хозяине продукт экспрессии, такой как представляющий интерес полипептид, может быть затем извлечен из культуры клеток-хозяев. С целью достижения максимального вы- 10 032045 хода продукта экспрессии, клетки обычно собирают по окончании культивирования и подвергают разрушению с помощью обработки лизоцимом, с помощью ультразвука или Французского пресса. Таким образом, полипептиды вначале получают в виде сырого лизата клеток-хозяев. Затем они могут очищаться стандартными процедурами очистки белков, известными в данной области техники, которые могут включать в себя дифференциальное осаждение, хроматографию на молекулярных ситах, ионообменную хроматографию, изоэлектрическую фокусировку, гель-электрофорез, аффинную и иммуноаффинную хроматографию. Эти хорошо известные и широко применяемые на практике методики описаны, например, авторами Ausubel et al., см. выше, и Wu et al. (изд.), Academic Press Inc., Нью-Йорк, Иммунохимические методы в клеточной и молекулярной биологии. Например, для очистки иммуноглобулинов, полученных рекомбинантными методами, можно использовать иммуноаффинную хроматографию с пропусканием через колонку, содержащую смолу, которая привязывает к себе целевые молекулы, с которыми могут специфично связываться иммуноглобулины - продукт экспрессии.

Настоящее изобретение также относится к методам и средствам для внутриклеточной гетерологичной экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих, например, полипептид в прокариотном хозяине. В частности, настоящее изобретение относится к векторам и к использованию таких векторов для внутриклеточной экспрессии гетерологичного полипептида в прокариотном хозяине с использованием вектора согласно настоящему изобретению. При внутриклеточной экспрессии этот полипептид экспрессируется внутри цитоплазмы и не переносится из цитоплазмы в нецитоплазматические места. Этот полипептид будет экспрессироваться внутри цитоплазмы в виде тел включения или в растворимой форме. Также хорошо известны процедуры изолирования и очистки полипептидов из клетки, в частности из клеточного экстракта.

Промоторы маннозы согласно настоящему изобретению выгодны тем, что они могут строго регулироваться, индуцироваться обычным и нетоксичным - и поэтому промышленно применимым - соединением.

Кроме того, промоторы маннозы согласно настоящему изобретению, также как и векторы, содержащие эти промоторы маннозы, стабильны в клетках и не теряются даже после многочисленных дупликаций этих клеток. Таким образом, возможна ферментация с высокой клеточной плотностью с клеткамихозяевами, трансформированными согласно настоящему изобретению.

Специалисты в данной области техники оценят тот факт, что описываемое в данном тексте изобретение способно подвергаться изменениям и модификациям, иным, чем конкретно описанные. Следует понимать, что данное изобретение включает в себя все такие варианты и модификации, не выходящие за рамки духа его основных признаков. Данное изобретение также включает в себя все этапы, признаки, составы и соединения, относящиеся к нему или указанные в данном описании, по отдельности или совместно, и любая комбинация и все комбинации или любые два или более из указанных этапов или признаков. Поэтому настоящее описание следует рассматривать как проиллюстрированное во всех аспектах и не носящее ограничительного характера, при этом рамки изобретения обозначены прилагаемой патентной формулой, и все изменения, которые выполняются в рамках смысла и пределов эквивалентности, подразумеваются как включенные в его состав. По всему данному описанию цитируются различные ссылки, каждая из которых включается в него путем отсылки как к целому.

Вышеприведенное описание станет более понятным после ознакомления с нижеследующими примерами. Такие примеры, однако, представляют собой примеры методов практического осуществления настоящего изобретения, и не предназначены для ограничения рамок данного изобретения.

I) Изолирование и идентификация промоторных областей промотора manR и промотора manP оперона маннозы.

Если не указано иное, то были использованы нижеследующие материалы и методы.

Бактериальные штаммы и условия роста

В качестве главных хозяев для клонирования и экспрессии были использованы Е. coli JM109 (авторы Yanisch-Perron С. Et al., Gene 33,1985, 103-119) и Bacillus subtilis 3NA (Michel J.F. et al., J. Appl. Bacteriol. 33, 1970, 220-227). E.coli выращивали в жидкой среде LB (авторы Luria S.E. et al., Virology 12,1960, 348-390) и в агаровых чашках LB, в которые введено 10 мкг/мл ампициллина или спектиномицина при 37°C. B.subtilis выращивали в жидкой среде LB и минимальной среде С или S при 37°C (авторы MartinVerstraete I. et al., J. Mol.Biol. 214, 1990, 657-671). В жидкие среды и в агаровые чашки добавляли 100 мкг/мл спектиномицина, 10 мкг/мл канамицина или 5 мкг/мл эритромицина, соответственно. Для индуцирования промотора маннозы добавляли стерильную фильтрованную или автоклавированную Dманнозу до конечной концентрации 0,2% (вес./об.).

Материалы

Все химикаты были получены от компании Сигма-Олдрич (Тауфкрихен, Германия), компании Флука (Бухс, Германия) или Мерк (Дармштадт, Германия). Синтетические олигонуклетотиды ДНК приобретали в компании Eurofins MWG Operon (Эберсберг, Германия). Ферменты рестрикции и ферменты, модифицирующие ДНК, приобретали в компании Roche Applied Science (Мангейм, Германия) или в компании New England Biolabs (Франкфурт-на-Майне, Германия). Эксперименты по стандартным протоколам PCR проводили с полимеразой высокодостоверной ДНК от компании Fermentas (Ст. Леон-Рот,

- 11 032045

Германия) на миниреакторе MiniCycler от компании Биоцим.

Подготовка ДНК и трансформация

Выделение ДНК из E.coli и B.subtilis или из агарозного геля проводили с наборами компании Qiagen для подготовки ДНК (Хильден, Германия) или компании Roche (Мангейм, Германия), в соответствии с описанием изготовителя. Во всех примерах использовали стандартные молекулярные методики.

E.coli трансформировали плазмидой ДНК согласно описанию авторов Chung С.Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,1989, 2172-2175. Bacillus.subtilis трансформировали плазмидой ДНК согласно модифицированной Парижской методике (автор Harwood C.R. Молекулярные биологические методы для бацилл, 1990, Джон Уилей энд Санз Лтд., Англия).

Измерение β-галактозидазной активности

0,1 мл исследуемых клеток в 0,9 мл Z-буфера обрабатывали 10 мкл толуола в течение 30 мин при 37°C. β-галактозидазную активность определяли с помощью o-нитрофенил-β-галактозидазы при 22°C согласно методу Миллера (Miller J.H., 1972, Эксперименты в молекулярной генетике, изд. Коулд Спринг Харбор, Нью-Йорк).

Таблица 1. Используемые олигонуклеотиды

Олигонуклеотид	Последовательность	Цель
S4693	5’-ААА AAA ACG CGT GTT ТА A ACT GAA ТТТ CTG CTG ААТ АТА СА-3’	PCR-Амплификация manR из B.Subtilis
S4694	5’-ААА AAA ТСТ AGA AAG TGT GAA ТА А TAA GAT СТТ G-3’	PCR-Амплификация manR из B.Subtilis
S4802	5’-ААА AAA ACT AGT GTT ТАА АСА GGG AAA AAT GCC ТТТ АТТ AC-3’	Прямой праймер для аМПЛИфИКаЦИИ РщапРЛЗ
S4833	5’-AAA AAA GTT TAA ACC CCT GGC GAA TGG CGA T-3’	Амплификация spc из плазмиды PDG1730
S4835	5’-AAA AAA GAA TTC ATT AGA ATG AAT АТТ ТСС CAA AT-3’	Амплификация spc из плазмиды PDG1730
S4956	5’-AAT TGC GTC GAG ACC CCT GTG GGT CTC GTT TTT TGG АТС CGG CGC CCA CGT GGC TAG CC-3’	Инсерция терминатора tufA
S4957	5’-TTA AGG СТА GCC ACG TGG GCG CCG GAT CCA AAA AAG GAG ACC CAC AGG GGT CTC GAC GC-3’	Инсерция терминатора tufA
S5006	5’-Cy5-TAG CCT ТТТ TTA TAG TTG TTC AGC CAC TGT-3’	Меченый праймер для удлинения праймера
S5007	5’-Cy5-ATC CAC GCC ATA ATG CAT GCC GCC АТТ AAT-3’	Меченый праймер для удлинения праймера
S5097	5’-Cy5-CACTGTACCCTATCTGCGAAA-3’	Меченый праймер для удлинения праймера
S5098	5 ’-Cy5-ATTG AG ATA ATCCTCG АТС ACTT-3 ’	Меченый праймер для удлинения праймера
S5203	5 ’-G ATATCCTGC ACC ATCGTC-3 ’	Обратный праймер для амплификации Pman/> ДОЯ изучения промотора
S5208	5 ’-GGTACCATTTCTTGCTGA ATA-3 ’	Амплификация области Pma„R' из pSUN279.2
$5209	5’-CTTAAGCCTGTCAGTATCTACTTGAG-3’	Амплификация области Рттр из pSUN279.2
S5262	5’-AAAAAAGCTAGCGTTTAAACAAAAAGCGATT TTAATGAGCTG-3 ’	Прямой праймер д ля амплификации Ртапрл4

Эксперимент 1.

Выделение фрагмента ДНК, несущего промоторные области оперона маннозы, и определение сайтов инициации транскрипции промотора manR и промотора manP.

Хромосомную ДНК из Bacillus subtilis 168 выделяли с использованием Комплекта DNeasy для крови и тканей компании Qiagen (Хильден, Германия).

Фрагмент ДНК размером примерно 2,3 kb с целым manR с промотором предположительного manR и с межгенной областью между manR и manP амплифицировали из полученной ДНК с использованием процедуры PCR с применением праймера s4693/s4694.

Полученный фрагмент ДНК размером примерно 2,3 kb использовали для эксперимента по удлинению праймера для определения сайтов инициации транскрипции промотора manR и промотора manP.

Для выделения мРНК с целью удлинения праймера строили шаттл-фактор из вектора pIC20HE E.coli (авторы Altenbuchner et al., 1992, Methods Enzymol. 216, 457-466) и из вектора pUB110 В^ЫШв (MacKenzie et al., 1986, Plasmid 15, 93-103). Этот вектор содержал ген lys в качестве информационного гена, который кодирует зрелую форму лизостафина из Staphylococcus simulans (авторы Recsai et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1127-1131).

Фрагмент ДНК 2,3 kb клонировали в этот дериват pUB110 с копией высокого качества в обратном направлении к гену лизостафина. Полученной плазмиде присвоили имя pSUN178.4 и ввели в Bacillus subtilis 3NA.

- 12 032045

Bacillus subtilis 3NA с плазмидой pSUN178.4 выращивали в среде LB с канамицином. На экспоненциальной фазе роста культуру индуцировали с помощью 0,2% маннозы. Спустя 1 ч после начала роста при 37°C, индуцированные и неиндуцированные клетки собирали. Общую РНК выделяли с помощью

Миникомплекта RNeasy компании Qiagen.

Использовали праймеры s5006, s5007, s5097 и s5098, меченые с Cy5 на окончании 5'.

Праймеры s5006 и s5007 гибридизировали соответственно от +21 до +50 и от +76 до +105 по отношению к стартовому кодону гена лизостафина. Праймеры s5097 и s5098 гибридизировали соответственно от +81 до +101 и от +131 до +153 по отношению к стартовому кодону из manR.

Те же самые праймеры использовали для реакции секвенирования плазмиды ДНК от pSUN178.4, которая служила в качестве стандарта. Для обратной транскрипции и секвенирования ДНК использовали AMV-обратную транскриптазу и Т7-ДНК полимеразу от компании ROCHE. Продукты обратной транскрипции и секвенирования анализировали на денатурирующем полиакриламидном геле для секвенирования (поставщик GE healthcare). Все другие использованные реагенты поставлялись от компании Амершам Фармация Биотех в комплекте для секвенирования Autoread.

Сайт инициации транскрипции у промотора manP определяли с использованием праймера s5006. Реакции последовательности ДНК плазмиды pSUN 178.4 с тем же самым праймером готовили и проводили на том же самом денатурирующем геле для сравнения. На фиг. 1 показана последовательность ДНК вокруг промотора manP с выделенным сайтом инициации транскрипции в точке А (адинин-нуклеотид). При этом отслеживаемые блоки -10 и -35 приводятся курсивом, окончание manR и начало гена lys отмечаются стрелками, а сайты рестрикции для Bg/II, XbaI, Af/II и NdeI подчеркнуты.

Сайт инициации транскрипции промотора manR определяли при выполнении выделения РНК и секвенирования ДНК согласно вышеописанному в отношении промотора manP, за исключением того, что использовался праймер s5098, который связывается в гене manR.

На фиг. 2 и 3 последовательность ДНК промоторной области manR показана с выделенным сайтом инициации транскрипции в G (гуанин-нуклеотид), отслеживаемые блоки -10 и -35 приводятся курсивом, а начало гена lys и начало гена manR соответственно отмечаются стрелкой. Сайты рестрикции и предположительная последовательность cre подчеркнуты.

Транскрипция из промотора manR и в частности из промотора manP была существенно увеличена при индуцировании этих клеток маннозой, как это было отмечено более сильными сигналами в эксперименте по удлинению праймера.

Использованные праймеры показаны в вышеприведенной табл. 1.

Эксперимент 2.

Эксперимент по удлинению праймера согласно эксперименту 1 определил местоположение сайта инициации транскрипции промотора manR вблизи окончания 3' межгенной области между manR и началом manP. Для более точного определения промоторной области manP, фрагмент ДНК 2.3 kb укорачивали пошагово с помощью амплификации по процедуре PCR, при этом на полученных фрагментах последовательностей различной длины проводили обратное клонирование до того же самого базового вектора экспрессии и исследовали экспрессию.

а) Построение базового вектора экспрессии.

Конструировали вектор экспрессии с промотором IacZ в качестве информационного гена. Этот вектор экспрессии был создан в качестве шаттл-вектора, способного реплицироваться как в B.subtilis, так и в E.coli, и был назван pSUN272.1.

Информационный ген IacZ вырезали с помощью Ndel и Xmal из pLA2 (авторы Haldimann A. et al., 2001, J. Bacteriol. 183, 6384-6393) и соединяли в pJOE5531.1, являющимся дериватом индуцируемого рамнозой вектора экспрессии pWA21 (авторы Wegerer et al., 2008, ВМС. Biotechnol. 8, 2), который содержал терминатор транскрипции tufA из B.subtilis на сайте Xmal. В эту плазмиду вводили пару олигонуклеотидов s4956/4957 между сайтами рестрикции AfIII/MunI с целью добавления того же самого терминатора транскрипции tufA в обратном направлении от IacZ. Поэтому сплошное считывание от плазмидных промоторов в IacZ, также как и сплошное считывание из IacZ в расположенные по бокам плазмидные последовательности предотвращалось этими терминаторами. Ген spc устойчивости к спектиномицину как для E.coli, так и для B.subtilis, амплифицировали из плазмиды pDG1730 (авторы Geurout-Fleury et al., 1996, Gene 180, 57-61) с олигонуклеотидами s4833/4835 и вводили в полученную выше плазмиду. В дополнение к этому, часть вектора E.coli была укорочена путем удаления фрагмента BspHI/HindIII. Таким образом, фрагмент EcoRI/SphI с областью репликации от B.subtilis pMTLBS72 (авторы Lagodich et al., 2005, Mol. Biol. (Mosk) 39, 345-348) был лигирован в эту плазмиду.

Фрагмент ДНК на 2.3 kb, полученный в ходе эксперимента 1, был введен в pSUN272.1 напротив IacZ путем разложения с помощью AfIII и NheI и лигирования, в результате чего получали вектор экспрессии pSUN279.2 с плазмидной картой, что отображено на фиг. 4.

Используемые праймеры показаны в вышеприведенной табл. 1.

б) Определение эффективности экспрессии вектора pSUN279.2.

Плазмиды pSUN279.2 и pSUN272.1, полученные в вышеприведенном разделе а), вводили в B.subtilis 3NA. Последний служил в качестве контроля фона. Штаммы B.subtilis 3NA, несущие ту или

- 13 032045 другую плазмиду, выращивали в среде LB со спектиномицином, и в ходе экспоненциальной фазы роста к культурам для индуцирования добавляли либо 0,2% маннозы, 0,2% маннозы плюс 0,2% глюкозы, или же не добавляли никакого сахара (неиндуцированный контроль). После часа индуцирования определяли βгалактозидазную активность клеток с помощью метода Миллера. Результаты приведены на фиг. 5 и 7.

Неиндуцированная культура B.subtilis, содержащая pSUN279.2, уже демонстрировала довольно высокий базовый уровень β-галактозидазной активности. Присутствие маннозы приводило к дальнейшему 4-х-кратному росту β-галактозидазной активности, тогда как активность с маннозой и глюкозой была снижена, но была всё ещё значительно выше указанного базового уровня. Эти результаты ясно показывают, что активность промотора, отмеченная в pSUN279.2, могла бы происходить из области между manR и manP, из области в обратном направлении к manR или из обеих областей.

Таким образом, область в обратном направлении к manR, также как и наибольшая часть manR, были обе удалены из pSUN279.2 путем отсекания фрагмента ДНК на 2.3 kb от pSUN279.2, как показано на фиг. 4 между SfoI и NruI, в результате чего получена плазмида pSUN284.1.

Полученная нуклеотидная последовательность от pSUN284.1 показана на фиг. 6.

B.subtilis 3NA трансформировали с помощью этой плазмиды pSUN284.1, и эффективность экспрессии определена согласно вышеописанному. Результат показан на фиг. 5. Как следует из фиг. 5, этот вектор pSUN284.1 с удаленным manR в B.subtilis 3NA демонстрировал только примерно половину базового уровня β-галактозидазной активности по сравнению с pSUN279.2 в B.subtilis 3NA, что представляет в равной степени более значительное увеличение с помощью индукции маннозой и вновь более значительное уменьшение в присутствии глюкозы. Эти результаты доказывают, что промотор manP располагается между manR и manP, и показывают, что хромосомная копия manR достаточна для регулирования копий промотора manP на плазмидах с низшей степенью копирования.

в) Определение местонахождения промоторной области manP.

Для локализации промоторной области manP в дополнение к укороченному фрагменту ДНК от pSUN284.1, из фрагмента ДНК на 2.3 kb готовили дополнительные фрагменты с укороченной последовательностью путем отсекания в различных положениях в обратном направлении к сайту инициации транскрипции промотора manP на сайтах рестрикции и с помощью ферментов рестрикции, как показано на фиг. 6.

Делеция вплоть до bp-81 и bp-80 в обратном направлении к сайту инициации транскрипции у manP приводила к получению второй последовательности делеции, содержащей последовательность SEQ ID NO: 1. Дополнительная делеция была проведена вплоть до bp-41 и bp-40 в обратном направлении к сайту инициации транскрипции у manP (третья последовательность делеции).

Плазмиды, содержащие вторую последовательность делеции - pSUN290, и третью последовательность делеции - pSUN297.5, были построены сходным образом, что и плазмида pSUN284.1 в вышеописанном разделе 2б), путем введения продуктов PCR, амплифицированных праймерами s4802/s5203 и s5262/s5203, соответственно, в pSUN272.1 через ферменты рестрикции EcoRV и NheI.

Эти плазмиды вводили в B.subtilis 3NA и культивировали согласно вышеизложенному в разделе б). Спустя 1 ч после индуцирования определяли β-галактозидазную активность клеток согласно изложенному выше в разделе б). Результаты показаны на фиг. 7.

Как показано на фиг. 7, ни один из штаммов с pSUN290 и pSUN284.1 не демонстрировал заметной разницы в отношении индукции IacZ маннозой. Однако, в B.subtilis 3NA, содержащей pSUN297.5 с третьей последовательностью делеции, индукция маннозой была устранена полностью, и базовый уровень экспрессии был примерно равен 0. Из этих результатов следует, что сайт связывания ManR у промоторной области маннозы manP расположен между bp -80 и -35 по отношению к сайту инициации транскрипции manP.

Эксперимент 3. Определение промотора manR.

а) Идентификация последовательности cre.

Так как наибольшая часть подавления углеродного катаболита (CCR) осуществляется через посредство катаболического управляющего белка А (CcpA), то поиск соответствующих сайтов связывания (последовательность cre) проводили во всём опероне маннозы с использованием функции выстраивания в линию ДНК в программе управления клонами. Для выравнивания в линию использовали согласованную последовательность 5’-WWTGNAARCGNWWWCAWW-3’.

Только в промоторной области manR была найдена одна предположительная последовательность cre, как показано на фиг. 2 и 3, которая расположена в прямом направлении к блоку -10.

Последовательность SEQ ID NO: 3 согласно настоящему изобретению заключает в себе область, начинающуюся от bp-122, и идущую далее к стартовому кодону у IacZ, последовательность SEQ ID NO: 4 заключает в себе область, начинающуюся от bp-22 и до bp +7 (включительно), и последовательность SEQ ID NO: 5 согласно настоящему изобретению заключает в себе область, начинающуюся от bp-122 и идущую до bp-1 (включительно) у последовательности, показанной на фиг. 3.

б) Оценка эффективности экспрессии промотора manR.

Для оценки эффективности экспрессии промотора manR, конструировали вектор экспрессии, такой

- 14 032045 как pSUN284.1, в соответствии с изложенным выше, и ему было дано название pSUN291. Для этого фрагмент ДНК, включающий в себя предположительный промотор manR и расположенный примерно в

600 bp в обратном направлении от manR амплифицировали праймером s5208/s5209 и линеаризованной плазмидой ДНК pSUN279.2 как матрицей, и вводили напротив IacZ в плазмиде pSUN272.1, путем разложения с помощью KpnI и Af/III и лигирования.

Эта последовательность ДНК показана на фиг. 3.

Плазмиду pSUN291 вводили в B.subtilis 3NA, и измеряли β-галактозидазную активность согласно изложенному выше в экспериментах 2б).

Результат приведен на фиг. 5. Здесь базовая экспрессия была уже относительно высокой, и она была дополнительно увеличена примерно в 4 раза путем добавления 0,2% маннозы. Добавление глюкозы вело к подавлению β-галактозидазной активности практически до базового уровня экспрессии.

Результат показал, что промотор manR - не просто слабый образующий промотор, а промотор, испытывающий регулирующее воздействие от маннозы и от подавления углеродного катаболита CCR.

в) Определение местоположения промоторной области manR.

Как и в эксперименте 2в), для дальнейшего определения местоположения промоторной области последовательности ДНК manR, приготовляли ДНК-фрагменты различной длины из последовательности ДНК, содержащейся в pSUN291, путем отрезания в различных положениях в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции промотора manR на сайтах рестрикции и с помощью ферментов рестрикции, как показано на фиг. 3.

Первую последовательность делеции получали отсечением последовательности, показанной на фиг. 3, вплоть до bp-100 и bp-99 в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции G, вторую последовательность делеции получали отрезанием вплоть до bp-83 и bp-82 в обратном направлении по отношению к сайту инициации транскрипции G.

Аналогично эксперименту 2в), полученные первую и вторую последовательности делеции вводили в pSUN272.1, и полученным плазмидам присваивали названия pSUN384.1 и pSUN385.2, соответственно.

Каждую плазмиду вводили в B.subtilis 3NA и культивировали согласно изложенному в эксперименте 2б. Спустя час после индукции определяли β-галактозидазную активность клеток согласно изложенному в эксперименте 2б. Результаты показаны на фигуре 8. Нет значительной разницы между индукцией IacZ маннозой от pSUN384.1 по сравнению с pSUN291. Однако, в B.subtilis 3NA, содержащей pSUN385.2 со второй последовательностью делеции, индукция маннозой была полностью устранена, и базовый уровень экспрессии был почти равен 0. Из этих результатов следует, что сайт связывания ManR промоторной области manR располагается между bp-99 и bp-35 по отношению к сайту инициации транскрипции от manR.

II. Использование промоторных областей оперона маннозы в процессе ферментации с высокой клеточной плотностью.

Эксперимент 4. Трансформация.

Модель хозяина, несущего промоторную область согласно настоящему изобретению, тестировали на его способность к выращиванию и к экспрессии. При использовании нуклеотидной последовательности в соответствии с промоторной областью manP, в том виде, как она введена в плазмиду pSUN284.1, какая показана на фиг. 6 и в том виде, как она используется в эксперименте 2в, плазмиду pMW 168.1 конструировали согласно изложенному ниже и вводили в B.subtilis 3NA как в хозяина, путем трансформации.

а) Конструирование плазмиды pMW168.1.

Шаттл-вектор, реплицируемый как в E.coli, так и в B.subtilis, строили согласно изложенному в Эксперименте 2а), за исключением того, что eGFP использовали в качестве информационнгого гена вместо IacZ. Также область инициации транскрипции у manP была заменена областью инициации транскрипции гена gsiB (стрессовый белок; авторы Jurgen et al., см. выше).

Кроме того, стартовый кодон от eGFP и 6 кодонов, следующих за стартовым, были заменены.

Схематическая структура полученных промоторной области и области инициации транскрипции показана на фиг. 17.

Показано расположение генов (стрелки) и областей (блоки) с соответствующими сайтами рестрикции.

В общем плазмиду pMW 168.1 получали так, как показано в технологическом процессе в соответствии с фиг. 18.

На схеме технологического процесса используемые здесь названия ДНК-векторов, ДНК-вставок и комплементарных олигонуклеотидов представлены согласно указанному в блоках; что касается продуктов полимеразно-цепных реакций (PCR), то эти праймеры и матрицы ДНК были такими, какие представлены в скобках, используемые ферменты рестрикции указывались на соответствующих сайтах.

Этапы клонирования выполнялись с использованием E.coli JM109.

Используемые плазмиды - это были pUC 18 - позитивный вектор селекции и клонирования для продуктов PCR с устойчивостью к ампициллину (авторы Yanosch-Perron et al., см. выше); pWA21 - вектор

- 15 032045 экспрессии и клонирования для E.coli с устойчивостью к ампициллину (Wegerer et al., 2008, ВМС Biotechnol. 8,2); pSUN202.4 -дериват pUB 110 c промоторной областью manP и с устойчивостью к ампициллину и кап, представляющий собой шаттл-вектор для E.coli и B.subtilis; и pSUN266.1 -дериват pUC18 с сайтом интеграции между трет-последовательностями и с устойчивостью к spc и к ампициллину.

Последовательность используемых праймеров была следующей:______________________

Наименование	Последовательность 5' —> 3’	Описание
S5019	ttaagCTCTTAAGGAGGATTTTAGAATGGCTAAAGAAAAATTCg	TI-Область tufA
S5020	ttaagGAATTTTTCTTTAGCCATTCTAAAATCCTCCTTAAGAGg	TI-Область tufA (компл.)
S5139	aaaaaatgatcaTTACTTGTACAGCTCGTC	f-праймер PmanP- eGFP
S5156	aaaaaatgatcaccggtCGATTGCCACACATTAAAGG	г-праймер PmanP- eGFP
S5234	aaaaaaccgCTCGTCGTCCTAAGCATCCT	замещен, f-праймер (pUBUO)
S5235	aaaaaagaatTCGAGATCAGGGAATGAGTTT	замещен, г-праймер (pUBUO)
S5236	ttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAAATGGCAGACAATAACAAAg	TI-Область gsiB
S5237	gatccTTTGTTATTGTCTGCCATTTTGAATTCCTCCTTTAAATTc	TI-Область gsiB (компл.)

Замещение области инициации транскрипции (TI), включающей стартовый кодон и кодоны, следующие за стартовым кодоном, было произведено с использованием комплементарных олигонуклеотидов и через одиночные сайты рестрикции Bg/II, Af/II и BamHI. Конструирование вектора начинали с замещения области инициации транскрипции гена Т7 10 вектора pWA21 (авторы Wegerer et al., см. выше) областью инициации трансляции от tufA из B.subtilis через комплементарные олигонуклеотиды s5019 и s5020, соответственно. При последующих этапах клонирования эту область инициации транскрипции замещали областью от gsiB. Конечная плазмида pMW 168.1 содержала замещающий (rep) ген, включающий в себя ori⁺ от pUB110.

Плазмидная карта от pMW 168.1 показана на фиг. 9.

б) Определение структурной стабильности и расщепление.

B.subtilis 3NA трансформировали вектором pMW168.1, и определяли структурную стабильность, также как и стабильность распространения этого вектора на цитокинез (расщепление).

B.subtilis 3NA, трансформированную с помощью pMW 168.1, предварительно культивировали в среде LBSpc, а затем переносили в среду LB0 без давления отбора.

Инкубирование проводили при 37°C. По окончании фазы экспоненциального роста каждую культуру инокулировали в свежую среду LB₀. Эту процедуру повторяли до получения 100 поколений, рассчитываемых на основе замеров значений оптической плотности, получаемых при переносе в свежую среду в соответствии с модифицированным методом авторов Harwood et al., 1990, Молекулярно-биологические методы для Bacillus, изд. Джон Уилей энд Санз Лтд.

Результат показан на фиг. 10.

После получения примерно 15 поколений свыше 99,9% клеток и даже после 20 поколений примерно 90% клеток всё ещё содержали этот вектор. Только начиная примерно с 25-го поколения, всё большее число клеток теряло этот вектор.

Для определения структурной стабильности этой плазмиды из 20 колоний плазмиду выделяли через 15 поколений. Примерно 0,5 мкг от каждой выделенной плазмиды сравнивали с pMW168.1, выделенной из E.coli в качестве контроля, с помощью электрофореза на агарозном геле. При проведении серий опытов с этими плазмидами и с контролем не было отмечено различий, указывающих на возникновение структурного изменения.

Эти результаты показывают, что плазмида pMW 168.1 не только обладает высокой структурной стабильностью, но и стабильным расщеплением, что и требуется при ферментации.

Эксперимент 5. Ферментация.

Было проведено 6 серий опытов по ферментации с B.subtilis 3NA, трансформированной плазмидой pMW168.1, содержащей информационный ген eGFP, при разных режимах индукции и под непрерывным отслеживанием сигнала флуоресценции eGFP.

В качестве ферментационной среды использовали хорошо известную среду для ферментации с высокой плотностью клеток E.coli в соответствии с описанным в работе авторов Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103, и как это показано ниже.

Материалы и методы.

В общем, и для экспериментов по ферментации использовали стандартные молекулярные технологии, если не указано иное.

Оптическая плотность.

Для определения оптической плотности (ОП) использовали спектрофотометр Ultrospec 1100pro компании Амершам Биосайенс Компани, на 600 нм, согласно протоколу данного изготовителя.

Определение концентрации сухой биомассы.

- 16 032045

Для определения концентрации сухой биомассы c_x, использовали измеритель влажности MB 835

Halogen Компании Охаус.

Спектрофотометрическое измерение флуоресценции.

Экспрессию и флуоресценцию, соответственно, в отношении eGFP анализировали с помощью многофункционального считывателя GENios компании ТЕКАН с использованием программного обеспечения считывателя X Fluor 4 (версия V4.11) со следующими параметрами измерения:

Параметр измерения	величина
Фильтр возбуждения	485 нм
Эмиссионный фильтр	535 нм
Коэффициент усиления (ручной режим)	60
Время интеграции	20 мкс
Число вспышек	3
Режим считывания	Сверху

Измерение флуоресценции в ферментёре в реальном времени.

В процессе ферментации экспрессию eGFP отслеживали в реальном времени с использованием датчика флуоресценции (Micropack HPX-2000, ксеноновый источник света большой мощности компании Оушен Оптике Инк.; спектрофотометр на волоконной оптике S2000).

Параметры измерения были следующими: фильтр возбуждения 485 нм, эмиссионный фильтр 535 нм, фильтр 0,6). Для регистрации и хранения данных использовали программное обеспечение SpectraSuite компании Оушен Оптике.

Флуоресценция индицируется в относительных единицах флуоресценции (RFU).

Незадолго до получения 4.000 ед. RFU время интеграции 50 мс меняли на 25 мс, а затем на 10 мс. В этих случаях измеряемые величины умножали на коэффициент 2 и 5, соответственно.

Культивирование предварительных культур.

Одиночную колонию помещали в чашку с агаром LB и оставляли расти на всю ночь в 5 мл минимальной среды Спициценса (SMM), включающей в себя 0,02% (вес./об.) казаминовых кислот (СА) и антибиотик. 1 мл выращенной за ночь культуры добавляли к 20 мл SMM с 0,02% (вес/объем) СА и антибиотика и инкубировали 5-6 ч при 37°C в сосуде Эрленмейера на 250 мл (предварительная культура 1).

мл предварительной культуры 1 добавляли к 200 мл дозированной среды, включающей в себя 5 г/л глюкозы, и инкубировали до 8 ч при 37°C в сосуде Эрленмейера на 1л (предварительная культура 2). Для инокуляции ферментеров использовали предварительную культуру 2 с ОП600 в пределах от 1,2 до 2,2.

Ферментация.

В общем ферментацию проводили в соответствии с принципами авторов Wilms et al., 2001, Biotechnol. Bioeng. 73, 95-103.

Как только источник углерода - глюкоза - будет полностью потреблен, то периодический режим без подпитки переводился в периодический режим с подпиткой.

При экспоненциальном введении растворов в ходе периодического режима с подпиткой можно добиться постоянной скорости роста μ=0,10 ч^-1, и одновременно предотвращается подавление катаболита глюкозой из-за непосредственного потребления глюкозы клетками.

Анализ белков.

Сырые белковые экстракты выращенных в культуре клеток анализировали с помощью SDSэлектрофореза на полиакриламидном геле, при этом полиакриламидный гель состоял из 3% концентрирующего геля и 12% сепарирующего геля со следующим составом:

Компонент	концентрирующий гель (3%)	сепарирующий гель (12%)
Деионизированная Н2О	3,00 мл	6,70 мл
TRIS 0,5М pH 6,8	1,25 мл	-
TRIS 1,5МрН 8,8	-	5,00 мл
SDS 10% (вес/объем)	0,05 мл	0,20 мл
Акриламид 30% (вес/объем)	0,67 мл	8,00 мл
APS 10% (вес/объем)	0,05 мл	0,10 мл
TEMED	0,005 мл	0,01 мл

Использовали двойную миникамеру для геля компании Биометра.

Для денатурации смешивали 12 мкл сырого экстракта белковой смеси с 3 мкл 5x буфера для внесения SDS и инкубировали в аппарате Thermomixer 5438 компании Эппендорф в течение 5 мин при 95°C. После охлаждения до комнатной температуры образцы сепарировали центрифугированием и полностью наносили на этот гель.

Во время разделения в концентрирующем геле ток составлял 10 мА, и его повышали до 20 мА по- 17 032045 сле того, как граница бромфенола достигала концентрирующий гель. Для разделения использовали 1х буфер на основе SDS и эталон длин Марки ROTI® компании Рот. Электрофорез прекращали, как только граница бромфенола полностью выходила из этого геля. Для обнаружения иных окрашенных полос белка, гель инкубировали с окрашивающим раствором кумасси в течение 30 мин при комнатной температуре и затем обрабатывали снимающим окраску раствором в течение ещё 30 мин при комнатной температуре. Для удаления остающегося голубоватого фона из геля, последний инкубировали в течение нескольких часов в 7,5% уксусной кислоте.

Состав буферных растворов и растворов для окрашивания, также как и растворов для снятия окраски, был следующим:__

Буфер/раствор	Компоненты	Концентрация
Окрашивающий раствор кумасси	Кумасси R250 Кумасси G250 EtOH MeOH ледяная уксусная кислота деионизированная Н2О	2,0 г 0,5 г 425 мл 50 мл 100 мл до 1,0 л
Раствор для снятия окрашивания	EtOH ледяная уксусная кислота деионизированная Н2О	450 мл 100 мл 450 мл
5х буфер для нанесения	TRIS/HC1 (2М, pH 6,8) ЭДТА SDS (40% вес/объём) В-меркаптоэтанол (чистый) Глицерин (86% (объём/объём) Бромфенол синий деионизированная Н2О	6,25 мл 0,246 г 6,25 мл 2,50 мл 29,00 мл 0,05 г До 50 мл
10х рабочий буфер	TRIS глицин SDS (20% вес/объём) деионизированная Н2О	30 г 144 г 50 мл до 1,0 л

Где TRIS - трис(гидроксиметил)аминометан;

SDS - додецилсульфат натрия;

APS - персульфат аммония;

TEMED - ММИ,И-тетраметилендиами11;

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота.

Индукция экспрессии генов.

Для индукции экспрессии генов оценивали различные формы добавления раствора индуктора (режим индукции):

1. Добавление единичной порции в заданный момент времени (импактная индукция),

2. Импактная индукция в сочетании с последующей индукцией в течение определенного интервала времени, при которой дальнейшее добавление производили с постоянной скоростью с пошагово возрастающими объёмами или дальнейшее добавление производили с экспоненциально возрастающим расходом.

3. Начало добавления раствора индуктора после достижения заданного уровня плотности клеток.

Таблица 2. Используемые среды

среда	компонент	концентрация
Среда LB0 (pH 7,2)	Триптон	10,0г
	дрожжевой экстракт	5,0 г
	NaCl	5,0 г
	Деионизированная НгО	До 1,0 л
Минимальная среда Спициценса (SMM)	(NH4)2SO4	2,0 г
	КН2РО4	6,0 г
	Иаз-Цитрат	14,0г
	MgSO4	0,2 г
	D-Глюкоза*	5,0 г
	Деионизированная Н2О	До 1,0 л
Дозируемая среда для ферментации B.subtilis	(ХН4)2Н-цитрат	1,0 г/л
	Na2SO4	2,68 г/л
	(NH4)2SO4	0,50 г/л
	nh4ci	0,50 г/л
	КН2РО4	14,60 г/л
	NaH2PO4xH2O	4,00 г/л
	D-Глюкоза*	25,00 г/л
	MgSO4(l Μ)*	2,00 мл/л
	TES* (указан ниже)	3,0 мл/л

*подлежит раздельному автоклавированию

- 18 032045

Раствор микроэлементов (TES)	СаС12х2Н2О	0,50 г/л
	FeCl3 х 6 Н2О	16,70 г/л
	Na2-3flTA	20,10 г/л
	ZnSO4 х 7 Н2О	0,18 г/л
	MnSO4 х Е[2О	0,10 г/л
	CuSO4 х 5 Н2О	0,16 г/л
	СоС12 х 6 Н2О	0,18 г/л

Величину pH регулировали с помощью раствора 2М NaOH и 1М HCl, соответственно. В чашки с агаром дополнительно добавляли 15 г/л Евроагара компании BD. Все среды автоклавировали при 121°C в течение примерно 30 мин.

Опыт 1 ферментации. Ударная индукция.

Опыт 1 по ферментации проводили в 30-литровом реакторе (D598 и D596 компании Биоэнджиниринг). Дозированный объем порции составлял 8 л. В зависимости от ОП₆₀₀, инокулировали 200-400 мл предварительной культуры 2 для регулирования стартовой ОП₆₀₀ до 0,1.

Во время этапа периодического культивирования температура была 30°C всю ночь, и спустя 12 ч её повышали до 37°C. Добавлением 24% (объём/объём) NH₄OH, pH доводили примерно до 7,0 в течение всего процесса ферментации. Скорость аэрации можно было регулировать до 30 л/мин. В начале этапа периодического культивирования скорость аэрации составляла 10л/мин.

Состав питательных сред I и II приведен в нижеследующей табл. 3.

Таблица 3, Состав питательных сред I и II.

Питательная среда I	Питательная среда II
Компонент	Концентрация	Компонент	Концентрация
Глюкоза * Н2О	654,76 г/л	(NH4)2HPO4	396,00 г/л
MgSO4 * 7 Н2О	25,50 г/л	pH отрегулирована до 7,0
*TES	120,00 мл/л	Общий объем 1,0 л
Деионизированная Н2О	До 4,2 л	Деионизированная Н2О	до 1,0 л

*раствор микроэлементов pH 7,0.

Среды I и II добавляли пропорционально их общим объемам, т.е. 4,2:1,0 (что соответствует 80,8% среды I и 19,2% среды II от общей порции питательных веществ F).

Для индукции в начале фазы периодического культивирования с подпиткой, в одной порции добавляли 0,2% (вес/объем) раствор маннозы.

Концентрация сухой биомассы и отслеживаемый сигнал флуоресценции показаны на фиг. 11а и 11b, соответственно.

На фигуре концентрация сухой биомассы c_x вычерчивается в виде кривой логарифмически в течение всей продолжительности культивирования. Фазы периодического культивирования без подпитки и периодического культивирования с подпиткой разделены перпендикулярной линией.

Отслеживаемый сигнал флуоресценции на длине волны эмиссии 535 нм отражается в виде диаграммы в течение всего периода культивирования. Стрелки обозначают точку индукции.

Из фиг. 11а следует, что была получена максимальная концентрация сухой биомассы (DM) в 82,75 г сухой массы /л, что соответствует примерно 970 г DM при реакционном объеме в 11,7 л.

Всего было потреблено 71,5 г индуктора D-маннозы, при 16 г в ходе первого добавления.

Удельная скорость роста μ составила 0,10 /ч в течение всей фазы периодического культивирования с подпиткой.

Как показано на фиг. 11b, сигнал флуоресценции значительно увеличивался после первого добавления D-маннозы до максимума примерно в 2.200 ед. RFU в течение первых пяти часов фазы периодического культивирования с подпиткой. Затем сигнал постепенно уменьшался. Предполагается, что это снижение скорости экспрессии вызвано потреблением индуктора и/или эффектом экранирования, вызванным увеличением клеточной массы. Добавление дополнительно раствора маннозы 0,5% (вес./об.) через 37 ч привело к новому увеличению сигнала флуоресценции до величины в 2.100 ед. RFU.

Опыт 2 ферментации: сочетание индукции с постоянным расходом.

Повторяли ту же самую процедуру, что и в опыте 1, за исключением того, что режим добавления индуктора был изменен. Как и в опыте 1, 0,2% (вес./об.) раствора D-маннозы добавляли в виде одиночной порции в начальной точке фазы периодического культивирования с подпиткой. Добавление второй порции индуктора начинали как только достигалась поворотная точка кривой сигнала флуоресценции в ходе опыта 1, что составляло 1500 единиц RFU.

Во время второго этапа добавления 20%-й (вес./об.) раствор маннозы добавляли с постоянным расходом при пошагово возрастающих количествах, со средним расходом 0,39 г/мин до введения всей второй порции.

- 19 032045

Результаты показаны на фиг. 12а и 12b, отображающих концентрацию сухой биомассы и кривую сигнала флуоресценции, при этом пояснения такие же, что и на фиг. 11а и 11b. На фиг. 12b точки добавления первой порции и начало и конец добавления второй порции указаны стрелками.

Как следует из фиг. 12а, максимальная концентрация сухой биомассы составляла 67,6 г сухой массы/л, что соответствует примерно 804 г сухой массы при реакционном объеме в 11,9 л. Всего было добавлено (в ходе первого и второго добавления) 70 г D-маннозы.

Выход биомассы снизился на 17% по сравнению с опытом 1. Это коррелируется с более низкой удельной скоростью роста р=0,09/ч в ходе фазы периодического культивирования с подпиткой, в то время как удельная скорость роста в ходе фазы периодического культивирования без подпитки составляла 0,43/ч.

Как следует из фиг. 12b, максимальный сигнал флуоресценции был достигнут примерно при 4.900 ед. RFU спустя 25 часов, и он постоянно уменьшался до примерно 2500 ед. RFU.

По сравнению с опытом 1, в ходе опыта 2 скорость экспрессии могла быть увеличена на 120% при небольшом снижении концентрации биомассы.

Опыты 3 и 4 по ферментации: комбинированная индукция с экспоненциальным расходом В ходе ферментационных опытов 3 и 4 использовался малый лабораторный ферментер на 3,7 л (Kleinlaborfermenter Компании Биоэнжиниринг Компани). Объем порции периодического культивирования (порция среды для периодического культивирования плюс инокулят) составляла в общем 1,5 л. В зависимости от ОП600, инокулировали 100-200 мл предварительной культуры 2 для подстройки стартовой ОП600 до примерно 0,1. Температура как на фазе периодического культивирования без подпитки, так и на фазе периодического культивирования с подпиткой составляла 37°C. Во время ферментации pH регулировали до 7,0 с помощью 24%-ного (об./об.) NH4OH. Скорость аэрации постоянно составляла 2 л/мин в процессе ферментации. Ввод кислорода регулировали скоростью вращения мешалки. Давление в ферментёре вначале составляло 1,3 бар, и затем его повышали до 1,5 бар с целью улучшения ввода кислорода при необходимости. После полного потребления углерода из источника глюкозы режим периодического культивирования без подпитки переключали на режим периодического культивирования с подпиткой.

В противоположность опыту 2, в ходе опытов 3 и 4 раствор индуктора вводили с экспоненциально возрастающим расходом. Кроме того, глюкоза, содержащая среду I, вводилась совместно с индуктором, содержащим среду II. Состав вводимых питательных сред I и II был таким, как показано ниже в табл. 4:

Таблица 4. Состав вводимых питательных сред I и II.

Питательная среда I	Питательная среда II
Компонент	Концентрация	Компонент	Концентрация
D-Глюкоза	200 г/л	D-манноза	200 г/л
TES	40 мл/л	TES	40 мл/л
MgSO4 * 7 Н2О	3,85 г/л	MgSO4 * 7 Н2О	3,85 г/л
(NH4)HPO4	63,36 г/л	(NH4)2HPO4	63,36 г/л
Деионизированная Н2О	до 1,0 л	Деионизированная Н2О	до 0,25 л (опыт 3) до 1 л (опыт 4)

Все компоненты вводимых питательных сред I и II автоклавировали раздельно.

Величину pH регулировали до 3,3 с помощью 85%-ной Н3РО4 в обеих средах из-за растворимости компонентов.

Суммарный объем введенной питательной среды F за время t рассчитывали по следующей формуле:

F(0= [ “ + « где m - коэффициент поддержания (0,04 г/г-Н);

Yx/s - коэффициент удельного выхода биомассы по отношению к субстрату (0,5 для глюкозы);

Cx0 - концентрация биомассы в начале фазы периодического культивирования с подпиткой;

Vo - объем реактора в начале фазы периодического культивирования с подпиткой (=объему порции);

Cs0 - концентрация глюкозы в растворе питательной среды.

Для расчета принимали, что D-маннозу потребляли B.subtilis со сравнительным коэффициентом выхода Yx/s глюкозы.

В малом лабораторном ферментере KLF среды I и II могли подаваться раздельно, и пропорциональное соотношение могло быть изменено.

а) Опыт 3 ферментации.

Концентрация биомассы и отслеживаемый сигнал флуоресценции показаны на фиг. 13а и 13b, с указанием на этих фигурах, что они такие же, что и в ходе опыта 1.

В начале фазы периодического культивирования с подпиткой добавляли порцию раствора 0,2%-ной

- 20 032045 (вес/объем) маннозы (всего 16 г маннозы) и начинали экспоненциальный ввод питательных сред I и II с соотношением 50:50 (интервал I). При опускании кривой ту порцию маннозы, которая содержала среду II, увеличивали до 60%, а суммарный ввод F (среды I и II) до 125% для поддержания роста на основе глюкозы (интервал II). Примерно через 2 ч вновь отмечали снижение кривой, и порцию среды II увеличивали до 66,6% с одновременным увеличением суммарного ввода F до 150% (интервал III). После потребления всей среды II ферментацию продолжали с подачей питательной среды I в суммарной подаче в 100% (не показано на фиг. 10).

Ход опыта 3 и данные по нему сведены в нижеследующую табл. 5.

Таблица 5

Интервал (ч)	Среда 1:11 (%)	F (%)	ppiac'1]	ед.кги	Сухая биомасса (г сух.массы/л)
0-12			0,52	-
I 12-17	50:50	100	0,09	7000
II17-19	50:75	125	0,08	9000
III19-22	50:100	150	0,09	11000	22

Всего добавляли 50 г маннозы.

Каждые 12 ч, 20 ч и 24 ч отбирали пробу для анализа экспрессии на геле с додецилсульфатом натрия, основанном на растворимых белковых фракциях общего количества клеток при 10 ед. ОП₆₀₀.

Страница с полученным результатом по додецилсульфату натрия SDS показана на фиг. 19:

Слева показано: (М) стандарт длины (Марка ROTI®), (1) спустя 12 ч - не индуцировано; (2) спустя 20 ч - индукция в течение 8 ч; (3) спустя 24 ч - индукция в течение 12 ч.

Спустя 20 ч и 24 ч появляется светлая полоса примерно на 27 килодальтон, указывающая на экспрессию eGFP (стрелка).

б) Опыт 4 ферментации.

Повторяли ту же самую процедуру, что и в опыте 3, за исключением того, что вводимый объем питательной среды II (маннозы) был суммарно увеличен до 1,0 л.

Концентрация сухой биомассы и сигнал флуоресценции показаны на фиг. 14а и 12b, с такими же пояснениями, что и в ходе опыта 1. Ход опыта и данные по нему сведены в нижеследующую табл. 6.

Таблица 6

Интервал (ч)	Среда 1:11 (%)	F (%)	р[час‘’]	ед. RFU	Сухая биомасса (г сух.массы/л)
0-15			0,40
I15-22	50:50	100	0,09	3500
II 22-38	50:75	120	0,08	10000- 7800
III 38-39	50: 100	150	0,09	8900	40,4

Всего добавляли 200 г маннозы.

Для компенсации отмечаемой нехватки азота спустя примерно 15 ч продолжительности ферментации, (NH₄)₂HPO₄ вводили дополнительно с постоянным расходом.

В момент интервала II был достигнут максимум в 10000 ед. RFU, который в течение интервала III снизился до 7800 ед. RFU.

а) Опыты 5 и 6 ферментации. Без ударной индукции.

Оба ферментационных процесса проводились в 30-литровом ферментере.

В течение обоих опытов клетки выращивали до высокой клеточной плотности с экспоненциально возрастающим расходом глюкозы, которую, по достижении высокой клеточной плотности, заменяли постоянным расходом маннозы.

Использованные питательные среды I, II и III показаны в приведенной ниже табл. 7.

Таблица 7

Питательная среда I Питательная среда II Питательная среда III

Компонент	Концентрация	Компонент	Концентрация	Компонент	Концентрация
D-глюкоза *Н2О	654,76 г/л	(NH4)2HPO4	396,00 г/л	D-манноза	400,00 г/л
MgSO4*7H2O	23,50 г/л			MgSO4 * 7 Н2О	23,50 г/л
TES	120,00 мл/л			SEL	120,00 мл/л
де ио н изированная Н2О	до 4,2 л	деионизир.Н2О pH	до 1,0 л 7,0	деионизированная Н2О	до 1,0 л

- 21 032045

Опыт 5 ферментации.

Питательные среды I и II добавляли пропорционально их общим объёмам 4,2:1,0 с экспоненциально возрастающим расходом. При достижении высокой клеточной плотности питательную среду, состоящую из сред I и II, заменяли питательной средой, состоящей из сред II и III в пропорциональном соотношении 20:80 при постоянном объеме, соответствующем объему последнего экспоненциального расхода подачи питательных сред I и II.

Сигнал флуоресценции показан на фиг. 15 с пояснениями, аналогичными пояснениям из опыта 1.

Предполагается, что минимальное увеличение сигнала флуоресценции на фиг. 15 после примерно 15ч ферментации было вызвано кратковременной утечкой питательной среды III.

Ход опыта и данные по нему сведены в нижеследующую табл. 8.

Таблица 8

Фаза периодического культивирования с подпиткой(ч)	Среды (%) 1:П:Ш	Макс. ед. RFU	Удельная скорость роста (час'1)	Сухая биомасса (г сухой массы/л)	Всего маннозы (г)
15-35	80,8 : 19,2 : - -20 : 80	-	0,1
35-39		2.800		80	150

б) Опыт 6 ферментации.

Повторяли ту же самую процедуру, что и в опыте 5, за исключением того, что всего добавляли 600 г маннозы с ударной индукцией 0,2 (вес/объем) раствора маннозы (всего 16 г маннозы) до постоянной подачи питательной среды, состоящей из сред I и II, после достижения высокой клеточной плотности.

Сигнал флуоресценции показан на фиг. 16 с пояснениями, аналогичными пояснениям из опыта 1. Ход опыта и данные по нему сведены в нижеследующую табл. 9.

Таблица 9

Фаза периодического культивирования с подпиткой(ч)	Среды (%) 1:11:111	Макс. ед. RFU	Удельная скорость роста (час1)	Сухая биомасса (г сухой массы/л)	Всего маннозы (г)
20-40	80,8 : 19,2 : -	-			-
40	0,2%-ный (вес/объем) раствор маннозы				16
42-53	- 80 :20	14000		82	600

Оценка опытов 1-6.

Для оценки в момент максимальной флуоресценции, в нижеследующей табл. 10 определены и сведены вместе концентрация сухой биомассы с_х, объемы реактора V_R, потребление маннозы и продолжи тельность с момента запуска индукции.

Таблица 10

Xs опыта ферментации	Макс, флуоресценция, ед. RFU	сх, г сухой биомассы/л	VR, л	Индуктор, г маннозы	Длительность экспрессии, час
1	2200	16	8,2	16	5
2	4900	22	8,3	70	8
3	11000	22	1,6	50	10
4	10000	17	1,7	60	13
5	1700	80	12,0	150	5
6	14000	82	14,7	600	12

На базе данных процессов, приведенных в табл. 10 для каждого опыта, вычисляли производительность с точки зрения максимальной флуоресценции в ед. RFU на литр в час. Кроме того, эффективность экспрессии отображалась в виде относительной флуоресценции, рассчитываемой из максимальной флуоресценции на базе абсолютного веса биомассы (г сухой массы) и концентрации индуктора (г маннозы/л).

Результаты показаны в нижеследующей табл. 11.

Таблица 11

Xs опыта ферментации	Производительность, ед. RFU/л/час	Относительная флуоресценция, ед. RFU /г сухой массы	Относительная флуоресценция, ед. RFU /г маннозы/л
1	53,7	16,8	1127,5
2	73,8	26,8	581,0
3	687,5	312,5	352,0
4	452,5	346,0	283,3
5	28,3	1,8	136,0
6	79,4	11,6	343,0

- 22 032045

Эти результаты ясно показывают, что настоящее изобретение, в котором используются плазмиды, несущие промотор маннозы, может успешно применяться в ферментационных процессах с высокой клеточной плотностью и при положительно регулируемой экспрессии путем добавления индуктора Dманнозы.

Кроме того, путем подбора режима индукции можно варьировать важнейшие параметры ферментации, добиваясь максимального выхода с точки зрения биомассы, продукта экспрессии и потребления индуктора, соответственно, в зависимости от необходимости.

В целях облегчения проведения всего процесса особенно выгоден режим индукции с комбинированием ударной индукции и экспоненциальной подачи согласно опыту 3.

В данном случае высокое соотношение создаваемого продукта экспрессии и биомассы обеспечивает более высокую эффективность последующих этапов процесса, таких как этапы очистки и прочие этапы, и, таким образом, экономию времени и затрат.

Перечень последовательностей <110> Лонца АГ <120> Вектор, содержащий промотор manP или manR оперона маннозы <130> 12ЕА-1 <140> ЕА 201200186/28 <141> 2010-08-02 <160> 5 <170> Patentin version 3.3 |<210> 1 <211> 143 <212> ДНК <213> Bacillus subtilis <400> 1 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac aagatcttat tattcacact ttctagaaat aattttctta 120 agaaggagat atacatatga cac 143 <210> 2 <211> 80 <212> ДНК <213> Bacillus subtilis <400> 2 tagggaaaaa tgcctttatt accggaacct atggtaaaaa aagcgatttt aatgagctga 60 tttcggtata cagttgagac 80 <210> 3 <211> 195 <212> ДНК <213> Bacillus subtilis <400> 3 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac120 ggtttcttat atagtatact tatactatca atttgctcaa gtagatactg acaggcttaa180 gaaggagata tacat195

- 23 032045 agtataaaaa tcgctttttt <210> 4 <211> 128 <212> ДНК <213> Bacillus subtilis <400>

tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac

120 ggtttctt

128 <210> 5 <211> 121 <212> ДНК <213> Bacillus subtilis <400> 5 tgaatttctg ctgaatatac attacatagc aaactcaaag agtataaaaa tcgctttttt60 ccggaagctt cggtaaaaaa cgaaactttt gtctctatga ttttgtttta taatgtaaac120

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Вектор, способный экспрессироваться в прокариотной клетке-хозяине, включающий в себя способный индуцироваться маннозой промотор manP или manR оперона маннозы из Bacillus subtilis, который оперативно связан с транскрипционной единицей, содержащей гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, причем промотор manP содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, комплементарных им последовательностей и их вариантов, промотор manR содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, комплементарных им последовательностей и их вариантов, при этом вектор также содержит область инициации транскрипции и последовательность терминации транскрипции, расположенную в прямом направлении относительно промотора.
2. 2. Вектор по п.1, который дополнительно содержит полную или частичную последовательность гена-регулятора manR.
3. 3. Вектор по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно содержит катаболитчувствительный элемент, расположенный в обратном направлении относительно гетерологичной нуклеотидной последовательности.
4. 4. Вектор по любому из предшествующих пунктов, в котором указанная последовательность терминации транскрипции является последовательностью 3'-области гена tufA из Bacillus subtilis.
5. 5. Вектор по любому из предшествующих пунктов, который представляет собой шаттл-вектор, реплицируемый в Escherichia coli и в Bacillus subtilis.
6. 6. Вектор по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно содержит точку репликации плазмиды pUC18 и/или репликон pBS72 или ген rep вместе с точкой репликации плазмиды pUB110.
7. 7. Вектор по любому из предшествующих пунктов, который включает гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент.
8. 8. Вектор по любому из предшествующих пунктов, в котором область инициации транскрипции представляет собой область инициации транскрипции гена manP или гена manR.
9. 9. Вектор по любому из пп.1-7, в котором область инициации транскрипции представляет собой область инициации транскрипции гена tufA или гена gsiB.
10. 10. Прокариотная клетка-хозяин, трансформированная вектором по любому из пп.1-9.
11. 11. Прокариотная клетка-хозяин по п.10, которая подвергнута углеродной катаболитной репрессии и содержит систему фосфоенолпируват:углевод-фосфотрансфераза.
12. 12. Прокариотная клетка-хозяин по п.10 или 11, которая является грамположительной.
13. 13. Прокариотная клетка-хозяин по любому из пп.10-12, которая относится к типу Firmicutes.
14. 14. Способ получения полипептида в прокариотной клетке-хозяине, включающий стадии построения вектора по любому из пп.1-9, трансформации прокариотной клетки-хозяина с помощью указанного вектора и выращивания указанной трансформированной клетки-хозяина в среде для культивирования клеток.
15. 15. Способ по п.14, в котором клетку-хозяина вначале выращивают в присутствии источника углерода, отличающегося от индуктора экспрессии, а затем в присутствии индуктора экспрессии, при этом индуктор экспрессии представляет собой маннозу или ее производное, способное индуцировать промоторную область manP или промоторную область manR оперона маннозы.