DE10225380A1

DE10225380A1 - Produktion und Sekretion von Glucosyltransferasen

Info

Publication number: DE10225380A1
Application number: DE2002125380
Authority: DE
Inventors: Dieter Jahn; Marco Malten
Original assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Current assignee: Technische Universitaet Braunschweig
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2022-06-08
Also published as: DE10225380B4

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Produktion und Sekretion von Glucosyltransferase. Die Erfindung betrifft ferner ein rekombinantes Plasmid, das zur Expression von Glucosyltransferasen in prokariotischen Mikroorganismen befähigt ist sowie einen durch das Plasmid transformierten Mikroorganismus und die nach dem Verfahren hergestellten Glycosyltransferasen.

Description

Die Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, das zur Expression von Glucosyltransferasen in prokariotischen Mikroorganismen befähigt ist. Ferner betrifft die Erfindung einen durch das Plasmid transformierten Mikroorganismus, ein Verfahren zur Herstellung von Glucosyltransferasen unter Verwendung des transformierten Mikroorganismus und die nach dem Verfahren hergestellten Glucosyltransferasen.

Glucosyltransferasen sind wichtige Enzyme für die enzymatische Zuckersynthese, da sie Glucosereste direkt von Saccharose auf verschiedene Akzeptoren übertragen können. Diese Strategie der Zuckersynthese vermeidet den Einsatz teurer nukleotidaktivierter Zucker. Für den industriellen Einsatz der Enzyme ist die Verfügbarkeit eines rekombinanten Produktionssystems unumgänglich. Darüber hinaus können auch in ihrer Substrat- und Produktspezifität gentechnisch veränderte Glucosyltransferasen hergestellt werden.

Ein Expressionssystem soll nicht nur eine effiziente Produktion des rekombinanten Enzyms zulassen, sondern auch einen Export des Enzyms (Sekretion) aus dem Mikroorganismus in das Wachstumsmedium ermöglichen, um eine kostengünstige Reinigung des Proteins, die Etablierung einer kontinuierlichen Fermentation und die Entwicklung integrierter biotechnologischer Verfahren zu ermöglichen.

Als für Synthesezwecke besonders vielversprechendes Enzym hat sich die 1989 erstmals klonierte und sequenzierte Glucosyltransferase dsrS aus Leuconostoc mesenteroldes NRRL B-512F erwiesen (Wilke-Douglas M. Perchorowicz, J. T., Houck C. M., Thomas, B. R (1989) Methods and compositions for altering physical characterisitcs of fruit and fruit products; PCT patent WO 98/12386, auf die hier Bezug genommen wird). Dieses Protein wurde bisher entweder rekombinant in Escherichia coli produziert (Monchois V., Remaud- Simeon, M., Russell, R. R., Monsan P., Willemot, R. M. (1977), Characterization of Leuconostoc mesenteroldes NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification of aminoacid residues playing a key role in enzyme activity, Appl. Microbiol. Biotechnol. 48 (4), 465-72, auf die hier Bezug genommen wird) oder aus dem Überstand einer Leuconostoc mesenteroldes NRRL B-512F Kultur gereinigt (Bioeurope, France).

Beide Verfahren haben sich jedoch als nachteilig erwiesen. Bei der Produktion in Escherichia coli findet ein starker proteolytischer Abbau des Enzyms statt, der die präparative Ausbeute vermindert, die Aufreinigung des Enzyms erschwert und insgesamt zu hohen Kosten führt. Eine Sekretion der induzierten Glucosyltransferase in das Kulturmedium findet nicht statt. Auch dies erschwert die Aufreinigung des Produktes. Bei Produktion des Enzyms in Leuconostoc mesenteroldes NRRL B-512F erfolgt zwar eine Sekretion des Enzyms in das Kulturmedium, die Ausbeuten sind jedoch gering, was die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens stark beeinträchtigt. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht die zuckerpolymerfreie Gewinnung des Enzyms erlaubt. In Leuconostoc wird die Glucosyltransferaseproduktion durch Saccharose induziert. Die Saccharose wird von der produzierten Glucosyltransferase zu einem Zuckerpolymer umgesetzt, dass dann nicht mehr von dem Enzym abtrennbar ist. Das so enzymgebundene Zuckerpolymer verschlechtert die Einsatzmöglichkeiten des Enzyms erheblich. Bei Einsatz des Enzyms in katalytischen Synthesen stellt das direkt an das Enzym gebundene Zuckerpolymer einen konkurrierenden Akzeptor dar, mit der Folge, dass die Oligosaccharidverfahrensprodukte oftmals Verunreinigungen durch Zuckerpolymere aufweisen. Dadurch werden die Einsatzmöglichkeiten und der Wert des nach diesem Verfahren hergestellten Enzyms deutlich vermindert. Darüber hinaus kann Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F nicht als Expressionssystem zur Produktion genetisch veränderter Glucosyltransferase-Mutanten verwendet werden, weil die dazu benötigten genetischen Methoden in diesem Mikroorganismus nicht ausreichend entwickelt sind.

Bei der Verwendung von Streptokokken und Lactobacillen als Expressionssysteme zur Gewinnung anderer Glucosyltransferasen treten die oben genannten Nachteile in ähnlicher Form auf.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein effizientes Expressionssystem zur rekombinanten Herstellung von Glucosyltransferasen bereitzustellen, das die Produktion und Sekretion des Enzyms erlaubt und mit dem die Herstellung von Glucosyltransferasen bei hoher Ausbeute möglich ist.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein rekombinantes Plasmid gelöst, das umfasst

a) einen Shuttlevektor für Escherichia coli und Bacillus Spezies mit einer multiplen Klonierungsstelle zur Klonierung von Genen,
b) einen induzierbaren oder konstitutiven Promotor aus Bacillus Spezies,
c) ein Glucosyltransferasegen unter der Kontrolle des Promotors, ausgewählt aus
- 1. der in Fig. I gezeigten DNA-Sequenz,
- 2. DNA-Sequenzen, die mit der in c1) definierten Sequenz hybridisieren und für ein Polypeptid vom Glucosyltransferase-Typ codieren; und
- 3. DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in bezug auf die in c1) und c2) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für ein Polypeptid vom Glucosyltransferase-Typ codieren.

Somit sind einerseits rekombinante Plasmide Teil der Erfindung, die das genannte Glucosyl- Transferase-Gen als Wild-Typ umfassen. Andererseits beinhaltet die Erfindung aber auch rekombinante Plasmide, die Mutanten des oben genannten Glucosyl-Transferase-Gens umfassen.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid unter Verwendung des Shuttlevektors pMM1520 herzustellen. Dieser Vektor ging aus einer Verbesserung des bekannten Vektors pWH1520 (Rygus und Hillen, 1991) hervor. Die Optimierung des Vektors pWH1520 erfolgte durch die Elimierung eines bekannten "catabolite responsive elements" und der Einfügung einer geigneten multiplen Klonierungsstelle. Die Sequenz des pMM1520 Vektors ist in Fig. 2 gezeigt. Bei der Klonierung von dsrS wurde über die Primer eine optimierte Ribosomenbindestelle eingefügt, die aus der Komplementarität zur 16S-rRmA aus Bacillus megaterlum (Genbank AF142677, Kunnimalaiyaan et al., 2001) ermittelt wurde (siehe Fig. I). Expression und Sekretierung eines Proteins in einem Expressionssystem hängen oftmals in hohem Maße von der Verwendung des Promotors ab, unter dessen Kontrolle die Expression erfolgt. Besonders gute Ergebnisse wurden erfindungsgemäß mit dem Xylose-induzierbaren xylA-Promotor (Rygus, T., Hillen, W. (1991), Inducible High-Level Expression of heterologous Genes in Bacillus megaterlum Using the Regulatory Elements of the Xylose-Utilization Operon. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 594-599, auf die hier Bezug genommen wird) erzielt. Weitere besonders geeignete Promotoren aus Bacillus Spezies sind insbesondere die Bacillus megaterlum Promotoren GlucDH (Patent Meinhardt + Merck), spoIV (Wittchen et al. 1998), bgaM (Strey et al. 1999) oder der Bacillus subtilis Promotor P_spac.

Die Lösung der obigen Aufgabe erfolgt ferner durch mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmiden transformiertem Mikroorganismus. Dabei können prokaryotische Mikroorganismen verwendet werden. Als Mikroorganismus erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist Bacillus megaterium sowie andere Bacillus Species. So ist der Vektors pWH1520 auch in Bacillus subtlilis aktiv (Conrad et al., A T7 promotor-specific, inducible protein expression system for Bacillus subtilis, Mol Gen Genet (1996), 250: 230-236). Die vorteilhaftesten Ergebnisse wurden mit Bacillus megaterium-Stamm WH320 (Rygus und Hillen, 1991) erzielt.

Des weiteren wird die zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Glucosyltransferasen gelöst, bei dem die beschriebenen transformierten Mikroorganismen zum Einsatz kommen. Durch Kultivierung dieser Mikroorganismen in einem geeigneten Wachstumsmedium lassen sich Polypeptide mit der gesamten oder einem Teil der Primärstruktur und einer oder mehreren biologischen Eigenschaften von Glucosyl-Transferase herstellen. Das zu verwendende Wachstumsmedium und die exakten Kultivierungsbedingungen hängen dabei von dem verwendeten Mikroorganismus ab. Besonders gute Ergebnisse werden bei Kultivierung von erfindungsgemäß transformierten Bacillus megaterium erzielt.

Besonders vorteilhaft ist es, einen mit dem Plasmid pMM1520dsrS transformierten Bacillus megaterium-Stamm WH320 zu verwenden. Eine kontinuierliche Fermentation erscheint dabei als besonders geeignetes Kultivierungsverfahren.

Die Lösung der zugrundeliegenden Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß auch durch ein nach dem beschriebenen Verfahren hergestelltes Polypeptid. Das erfindungsgemäße Polypeptid weist die gesamte oder einen Teil der Primärstruktur und eine oder mehrere biologische Eigenschaften von Glucosyl-Transferase auf. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Polypeptid dadurch charakterisiert, dass es keine gebundenen Zuckerpolymere aufweist.

Die erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmide stellen neue Gen-Expressionsplasmide dar, die nach Transformation in prokaryotischen Organismen die Produktionen und den Export rekombinanter Proteine vom Glucosyl-Transferase-Typ ermöglichen. Die Kultivierung der so transformierten oder transfizierten Mikroorganismen erlaubt die Expression und Sekretion der Polypeptide vom Glucosyl-Transferase-Typ und führt so zu einem Expressionssystem, das hohe Ausbeuten und überlegene Wirtschaftlichkeit ermöglicht. Als zusätzlicher Vorteil hat sich erwiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren die zuckerpolymerfreie Gewinnung von Polypeptiden des Glucosyl-Transferase-Typs ermöglicht. Dadurch wird eine Nutzung der erfindunsgemäß hergestellten Enzyme in der Synthese möglich, die nicht zu einer Zuckerpolymer-Verunreinigung der Reaktionsprodukte führt.

Die oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung sollen im folgenden durch Beispiele noch näher erläutert werden.

Zunächst werden die in den Beispielen verwendeten Lösungen beschrieben:

Puffer und Lösungen Lösungen zur Protoplastentransformation von Bacillus megaterium SMMP-Puffer

Antibiotic Medium No. 3 (Difco)	17.5 g/l
Saccharose	500.0 mM
Na-Maleinat (pH 6.5)	20.0 mM
MgCl₂	20.0 mM
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung

PEGP-Lösung

PEG 6000	40.0% (w/v)
Saccharose	500.0 mM
Na-Maleinat (pH 6.5)	20.0 mM
MgCl₂	20.0 mM
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung

cR5 Top-Agar

Saccharose	300.0 mM
MOPS (pH7.3)	31.1 mM
NaOH	15.0 mM
L-Prolin	52.1 mM
D-Glucose	50.5 mM
K2SO₄	1.3 mM
MgCl₂ × 6 H₂O	45.3 mM
K₂PO₄	313.0 µM
CaCl₂	13.8 mM
Agar-Agar	4.0% (w/v)
Casaminoacids	0.2% (w/v)
Hefe-Extrakt	10.0% (w/v)
Titrationsreagenz war NaOH-Lösung

Lösungen zur Präparation von chromosomaler Leuconostoc mesenteroides DNA TE-Puffer

TRIS-HCl (pH 8.0)	50.0 mM
EDTA	1.0 mM

Weitere Lösungen

Saccharoselösung in TE-Puffer	6.7% (w/v)
SDS-Lösung in TE-Puffer	20.0% (w/v)
Lysozymlösung	10.0 mg/ml
RNase-Lösung	10.0 mg/ml
Proteinase K	17.0 mg /ml

PCIA-Phenolextraktion

Phenol	50.0% (v/v)
Chloroform	48.0% (v/v)
Isoamylalkohol	2.0% (v/v)

Waschlösung für Aktivitätsfärbung

Natriumacetat (pH5.4)	20.0 mM
Calciumchlorid	0.05 g/L
Triton X-100	0.1% (v/v)

High Molecular Weight Marker (Sigma) Der Marker enthält Markerproteine folgender Größen (M_r): 205.000, 116.250, 97.400, 84.000, 66.000, 55.000, 45.000, 36.000

Lösungen für Proteinproduktionssexperimente Aufschlusspuffer

Na₃PO₄ (pH5.4)	100.0 mM
Lysozym	5.0 mg/ml
Titrationsreagenz war H₃PO₄-Lösung

Harnstofflösung für unlösliche Proteine

Harnstoff in 50 mM TRIS-HCl, pH 5.4

8.0 M

Medien und Medienzusätze Vollmedium für Escherichia coli und Bacillus megaterium

Falls nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth (LB) wie bei Sambrook et. al (1989) beschrieben, gearbeitet. Für feste Medien wurden zusätzlich 15 g Agar pro Liter zugesetzt.

Vollmedium für Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F MRS-Medium pH 6.2-6.5

Casein Peptone	10.0 g
Fleischextrakt	10.0 g
Hefeextrakt	5.0 g
Tween 80	1.0 g
K₂HPO₄	2.0 g
Natriumacetat	5.0 g
Ammoniumcitrat	2.0 g
Magnesiumsulfat	0.2 g
Mangansulfat mit destilliertem Wasser auf 1 l auffüllen	0.05 g

Minimalmedien für Bacillus megaterium MOPSO-Minimalmedium

MOPSO (pH 7.0)	50.0 mM
Tricin (pH 7.0)	5.0 mM
MgCl₂	520.0 µM
K₂SO₄	276.0 µM
FeSO₄	50.0 µM
CaCl₂	1.0 mM
MnCl₂	100.0 µM
NaCl	50.0 mlvi
KCl	10.0 mM
K₂HPO₄	1.3 mM
(NH₄)₆Mo₇O₂₄	30.0 pM
H₃BO₃	4.0 nM
CoCl₂	300.0 pM
CuSO₄	100.0 pM
ZnSO₄	100.0 pM
D-Glucose	20.2 mM
NH₄Cl	37.4 mM
Titrationsreagenz war KOH-Lösung

Dextransucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F

Dextransucrase (DsrS) aus L. mesenteroides NRRL B-512F wurde von Bioeurope bezogen.
Referenznummer: DSB5112FSD9812231
Aktivität: 76.27 U/ml
Proteinkonzentration: 0.280 g/l
Spezifische Aktivität: 274 U/mg
Dextrankonzentration: < 0.010 g/l
Dextranase frei

Beipiel 1 Herstellen eines rekombinanten Exnressionsplasmids zur Exuression des dsrS-Gen in dem optimierten Expressionsplasmid pMM1520 unter der Kontrolle des xylA-Promotors Gentechnische Optimierung des Bacillus megaterium Plasmids pWH1520

Das Expressionsplasmid pWH1520 (Rygus und Hillen, 1991) weist für eine Routineanwendung noch deutliche Mängel auf. Im xylA-Leseraster von Base 23 bis 200 befindet sich eine cre-Sequenz (catabolite response element) (Rygus, T., Hillen, W. (1992). Catabolite repression of the xyl operon in Bacillus megaterlum. J. Bacteriol. 174(9), 3049-3055). Dieses cis-aktive Element ist zusammen mit einem trans-aktiven katabolitkontrollierten Protein (CcpA) essentiell für die Katabolitregulation in B. megaterlum. Da reprimierende Kohlenstoff und Energiequellen Bestandteil gebräuchlicher Vollmedien sind, ist es von Bedeutung, um eine effektive Transkription von klonierten Genen unter der Kontrolle des xylA- Promotors zu garantieren, die cre-Box in xylA zu eliminieren. Alternativ ist es schwierig Gene so in den Vektor pWH1520 zu klonieren, dass man die Funktion der cre-Box eliminiert, da nur eine SpeI Restriktionsschnittstelle vor der Region mit der cre-Box liegt und folglich die einzige Schnittstelle ist, die benutzt werden kann. Die vorhandene multiple Klonierungsstelle (Polylinker) beginnt aber erst bei Base 191 des xylA-Leserasters. Um den Vektor einer breiteren Anwendung zuzuführen, sollte deshalb eine multiple Klonierungsstelle (MCS) nah am Startcodon von xylA eingefügt werden. Dies ist auch günstig für die Konstruktion von Translationsfusionen. Besonders wenn Fusionsproteine mit Signalpeptiden erstellt werden sollen oder der N-Terminus eine wichtige Funktion im Protein einnimmt, sollten möglichst wenig Aminosäuren zusätzlich eingeführt werden.

Weiterhin bot sich eine Verkleinerung des Vektors durch die Entfernung jetzt funktionsloser Elemente an, wie dem Bruchstück eines Tetracyclinresistenzgens. Diese Elemente sind durch die Klonierungsstrategie zur Erstellung des Vektors im Plasmid verblieben.

Einfügen einer multiplen Klonierungsstelle in den Vektor pWH1520

Um die gentechnische Handhabung des Vektors pWH1520 (Rygus und Hillen, 1991) praktikabler zu gestalten wurde eine multiple Klonierungsstelle eingefügt. Eine neue MCS wurde aus Oligonukleotiden konstruiert, die möglichst viele einmalige Schnittstellen enthält, die nicht im pWH1520 vorkommen. In Fig. IV sind die beiden 48 Basen langen Oligos dargestellt, die bei MWG Biotech bezogen wurden.

Assoziation von Oligonukleotiden

Zur Herstellung einer multiplen Klonierungsstelle wurden je 2 nmol komplementärer Oligonukleotide (Schmelztemperaturen 81.5 und 81.9°C) zusammenpippetiert. Es folgte ein Temperaturprogramm zur Denaturierung von Sekundärstrukturen, Hybridisierung der Stränge bei der Schmelztemperatur und vollständiger Assoziation in der Abkühlungsphase:
3 min 95°C, 1 min 81°C, 1 min 55°C. Nach der Hybridisierung der komplementären Oligos entstehen überstehende Enden, die kompatibel zu mit SpeI bzw. NgoMIV geschnittener DNA sind.

Restriktion des Vektors

Das Plasmid pWH1520 wurde also mit BcuI (Fermentas), einem Isoschizomer von SpeI, und NgoMIV(New England Biolabs) geschnitten. Die Restriktion von DNA erfolgte mittels Restriktionsendonukleasen in den entsprechenden Restriktionspuffern und bei Inkubationstemperaturen nach Angaben der Vertreiberfirmen. Die Inkubationsdauer lag zwischen 3 und 5 Stunden. Sofern möglich wurden die Restriktionsendonukleasen hitzeinaktiviert. Die 300 Basen eines Fragmentes eines früheren Tetracyclinresistenzgens sind unbrauchbarer Ballast im Vektor, der dabei gleich entfernt wurde.

Ligation von Oligos und Vektor

Der so geschnittene Vektor und das Oligopaar wurden mittels T4-Ligase (Fermentas) ligiert. Pro 10 µl Ansatz wurden 100 bis 150 ng Vektor-DNA eingesetzt. Der entsprechende Ligationspuffer sowie zusätzlich 4.5 mM ATP wurden zugesetzt. Das Mengenverhältnis Insert zu Vektor, gemessen in pmol DNA-Termini, variiert meist zwischen 2 : 1 und 4 : 1. Im Falle der Oligos war aber ein Verhältnis von 10 : 1 erfolgreicher.

Transformation in Escherichia coli

Für die Transfomation wurde der E. coli Stamm ElectroMAX DH10B von Gibco Life Technol. eingesetzt. Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen wurden 500 ml Flüssigkulturen mit LB-Medium bis zu einer OD₅₇₈ von 0.5-1 kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (4000 × g; 15 min; 4°C). Das Zellsediment wurde in sterilem, deionisiertem Wasser gut resuspendiert, abzentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C), erneut mit sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C). Nach Waschen des Sediments mit 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung wurde abzentrifugiert (4000 × g; 8 min; 4°C) und das Sediment in so wenig wie möglich 10%iger (v/v) Glycerin-Lösung resuspendiert. Die kompetenten E. coli-Zellen können bei -80°C eingefroren werden.

Die Transformation erfolgte durch Elektroporation mit Hilfe eines Gene Pulsers mit angeschlossenem Pulse Controller (BioRad). Dazu wurden je 40 µl kompetente E. coli-Zellen und die Plasmid-DNA aus dem Ligationsansatz in eine Transformationsküvette überführt und im Gene Pulser einer Feldstärke von 12 kV/cm bei 25 µF und einem parallelen Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Zur anschließenden Regeneration wurden die transformierten Zellen sofort nach der Transformation in 1 ml LB-Medium eine halbe Stunde bei 37°C auf dem Thermoschüttler inkubiert. Von den Ansätzen wurden anschließend verschiedene Volumina auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikazusatz ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

So wurde der Ligationsansatz in E. coli transformiert. Gewünschte Plasmidkonstrukte wurden nach Minipräperation (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1999). In Molecular cloning; a laboratory manual. 3^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) aus dem E. coli Wirt durch Restriktionsendonukleaseverdau mit BstBI (New England Biolabs) identifiziert, da dieses Restriktionsenzym nur in der neuen multiplen Klonierungsstelle vorkommt. Ein so identifizierter positiver Klon wurde durch weitere Restriktionsendonukleaseverdaue mit Kpn2I (BspEI), Eco52I (EagI), XmaI und PaeI (SphI) getestet, die ebenfalls jeweils eine einmalige Schnittstelle in der MCS besitzen. Eine Bestimmung der DNA-Sequenz (MWG Biotech) der MCS des gefundenen Klons bewies die erfolgreiche Konstruktion des neubenannten Vektors pMM1520. Der in Fig. II dargestellte Vektor besitzt nun 13 einmalige Schnittstellen mit überstehenden Enden (sticky ends) und ist ca. 550 Basen kleiner als sein Vorgänger pWH1520. Die Schnittstellen befinden sich in einem offenen Leseraster mit der xylA-Sequenz. So sind Translations- und Transkriptionsfusionen möglich. Die vier einmaligen Schnittstellen SacI, BstBI, BspEI und EagI sind neu.

Klonierung des Gens dsrS für die Dextransucrase aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512 F in pMM1520

Die DNA-Sequenzinformation zu dsrS (Genbank U81374) enthält Informationen zu einem Promotor, einer Ribosomenbindestelle, dem eigentlichen Strukturgen dsrS und einer abschließenden AT-reichen Haarnadelschleife aus 32 Basen. Diese haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3'-nichtkodierenden-Bereich könnte als Terminator für die Transkription dienen. Das 4583 bp lange Gen kodiert für ein monomeres Enzym, das durch L. mesenteroldes sekretiert wird.

Optimierung der ribosomalen Bindestelle der dsrS-mRNA

Um die Originalaminosäuresequenz des Signalpeptids der L. mesenteroldes Dextransucrase nicht zu verändern wurde eine Transkriptionsfusion konstruiert, die das dsrS-Gen unter die Kontrolle des xylA-Promotors stellt. Dazu wurde das xylA-Leseraster mit einem Stop- Codon abgeschlossen. Weiterhin musste eine Ribosomenbindestelle (RBS) vor dem Dextransucrasegen eingeführt werden, die die Translation der zugehörigen mRNA ermöglicht. Da das Gen über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) aus dem Genom von L. mesenteroldes kloniert wurde, konnten diese Funktionselemente über die benutzten Primer in die DNA-Sequenz eingefügt werden. Die Sequenz der bereits vorhandenen RBS vor dem dsrS-Gen, wurde in die Strategie einbezogen.

Die RBS ist zentral für die Translation einer mRNA. Sie steuert die Effizienz des Prozesses durch die sequenzspezifische Kontrolle der Bildung des dazu nötigen Initiationskomplexes. Sie beinhaltet eine kanonische Sequenz, die auch Shine-Dalgarno-Sequenz genannt wird. Diese Basen der mRNA gehen Watson-Crick-Basenpaarung mit dem 3'-Ende der 16S rRNA ein und leiten so die Bindung des Ribosoms an die mRNA ein. In B. subtilis wurde der Einfluss der RBS auf die Expression von Genen intensiv untersucht (Vellanoweth, R. L. (1993). Translation and its regualtion in Bacillus subtilis and other Gram positive Bacteria, Sonenshein A. L. et al., American Society of Microbiology, Washington DC). Translation and its regualtion in Bacillus subtilis and other Gram positive Bacteria, Sonenshein A. L. et al., American Society of Microbiology, Washington DC). Es stellte sich heraus, dass die Komplementarität der Shine-Dalgarno-Sequenz eine bedeutendere Rolle spielt im Vergleich zu Gram-negativen Bakterien. So darf die freie Bindungsenergie der Basenpaarung zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und ribosomaler 16S rRNA nicht unter -12 kcal/mol sinken. Diese freie Bindungsenergie lässt sich über einen Bereich hinweg direkt mit der Translationseffizienz des nachfolgenden Genes korrelieren. Diese Korrelation findet sich so stringent in E. coli nicht. So steigert zum Beispiel eine Änderung der Shine-Dalgarno-Sequenz von AAGGA (-11.8 kcal/mol) in AAGGAGG (-19.8 kcal/mol) die Translation in E. coli nur 9-fach, in B. subtilis hingegen 114-fach. Optimale RBS haben 7 bis 10 Basen, die mit dem 3'-Ende der 16S rRNA paaren. Sie müssen die kanonische Sequenz GGAGG enthalten. Das Startcodon mit der höchsten Translationseffizienz ist AUG gefolgt von UUG und GUG. Der Zwischenraum von der RBS zum Startcodon muss mindestens 6 Basen betragen, wobei 7 bis 9 Basen optimal sind. Er sollte keine Cytosine und Guanine enthalten. Außerdem ist wichtig, dass die gesamte Region keine sekundäre Struktur bildet, um eine Bindung des Ribosoms nicht zu behindern.

Ausgehend von diesen Erkenntnissen aus Untersuchungen mit B. subtilis wurde die RBS vor dsrS aus L. mesenteroldes untersucht und optimiert. Um die Basenpaarung zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und ribosomaler 16S rRNA zu optimieren, muss die Sequenz des 3'-Endes der 16S rRNA bekannt sein, die mit der Shine-Dalgarno-Sequenz hybridisiert. Seit kurzem ist die Sequenz eines rRNA-Operons kodiert von einem Plasmid aus B. megaterlum QM B1551 bekannt (Genbank AF142677; Kunnimalaiyaan, M., Stevenson, D. M., Zhou, Y. and Vary, P. 5. (2001). Analysis of the replicon region and identification of an rRNA operon on pBM400 of Bacillus megaterlum QM B1551, Mol. Microbiol. 39(4), 1010-1021). Durch ein Alignment der 16S rRNA Sequenz von E coli (Genbank NC 000913: 223771-225312)) mit dem gesamten rRNA-Operon, konnte das 3'-Ende der 16S rRNA aus B. megaterlum ermittelt werden. Diese Region ist vollständig konserviert zwischen beiden 16S rRNA-Molekülen (Fig. V), mit Ausnahme des Adenins, das das 3'-Ende der 16S rRNA von E. coli bildet. Diese Base fehlt in der 16S rRNA von B. megaterlum oder ist durch ein Uracil ersetzt.

In Fig. VI ist dargestellt, wie durch den Austausch von vier Basen eine optimierte RBS konstruiert werden konnte. Vier zusätzliche Watson-Crick-Basenpaare der Shine-Dalgarno- Sequenz der dsrS-mRNA mit der 16S rRNA von B. megaterium wurden eingeführt, ohne dass der Mindestabstand von 6 Nukleotiden zum Startcodon unterschritten wurde. Diese RBS ähnelt der des spoVG-Gens von B. megaterium. Ein β-Galaktosidasegen wurde bereits unter der Kontrolle der spoVG-Gen-RBS erfolgreich auf hohem Niveau in B. megaterium exprimiert (Rygus und Hillen, 1991). Die erforderlichen vier Mutationen der Shine- Dalgarno-Sequenz konnten genauso wie eine SacI-Schnittstelle zur Klonierung und ein Stop-Codon für das xylA-Leseraster in den Primer für die PCR eingebaut werden.

Klonierung von Leuconostvc mesenteroides dsrS in den Expressionsvektor pMM1520 Gewinnung chromosomaler DNA

Zur Gewinnung von chromosomaler DNA wurden 150 ml MRS-Medium mit L. mesenteroldes NRRL B512-F bezogen von der Deutschen Smmlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig unter DSM20240 angeimpft und bei 30°C und 250 rpm inkubiert. Nach 4 Stunden wurde bei einer OD₅₇₈ von 0.54 30 ml der Kultur abgenommen und die Zellen geerntet (8000 × g; 10 min; 4°C). Das Bakterienpellet wurde nach einer Methode zur Gewinnung chromosomaler DNA aufgearbeitet, die bereits für die PCR von zahlreichen Leuconostoc Species verwendet wurde (Kim, J., Chun, J. und Han, H.-H. (2000). Leuconostoc kimchii sp. nov., a new species from kimchii. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1915-1919, Lee, H. J., Park, S. Y., Kim, J. (2000). Multiplex PCR-based detection and identification of Leuconostoc species. FEMS Microbiol. Lett. 193(2), 243-247). Das Sediment wurde in 3.8 ml Saccharoselösung resuspendiert. Nach Zusatz von 5 ml Lysozym und 50 µl RNaseA wurde eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zugabe von 545 µl SDS-Lösung lysiert und unter Zugabe von 200 µl Proteinase K bei 50°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde die chromosomale DNA mit Phenol (PCIA) extrahiert und anschließend mit Ethanol gefällt.

Polymerasekettenreaktion

Nach der Isolierung von genomischer DNA aus L. mesenteroldes wurde das Gen der Dextransucrase (dsrS) mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert.

Zur Amplifikation des dsrS aus dem L. mesenteroides-Chromosom wurden 20 µl PCR- Reaktionsansätze gefahren. Pro Ansatz verwendete man 2 µl 10fach-PCR-Puffer, 50 ng chromosomale DNA von L. mesenteroldes, 1.25 mM MgCl₂-Lösung und jeweils 0.4 µl dATP-, dCTP- dGTP- und dTTP-Mix (jeweils 10 mM). Dazu wurden jeweils 20 µmol der beiden Primer gegeben und auf 20 µl mit sterilem Wasser aufgefüllt. Der Deckel der PCR- Apparate wird auf 105°C beheizt, so dass ein Überschlchten mit Öl entfällt. Nach der quantitativen Denaturierung für 8 min bei 95°C wurde jeweils 1 U Taq-Polymerase zugegeben, um die PCR zu starten (Hot Start). Als optimale Temperatur wurden 62.9°C bestimmt durch parallele Erprobung mehrerer Temperaturen im Gradientencycler. Ausreichend PCR-Produkt für die Klonierung wurde in vielfachen Ansätzen im Thermocycler hergestellt. Temperaturprogramm der PCR

Primer für Klonierung des Dextransucrasegens (dsrS):
DsrS_SaoVG_A (50-mer)
5'-CGAGCTCCCGGGTAAGAATATAAGGAGGTGAAAATTTATGCCATTTAC-3'
DsrS_SpoVG_B (40-mer)
5'-AAGATCTGCATGCGAAAGCTTATGCTGACACAGCATTTC-3'

In die PCR-Primer wurden SacI- und SphI- Schnittstellen integriert. Sowohl die amplifizierte Gensequenz, als auch der Expressionsvektor pMM1520 wurden daraufhin jeweils mit den Restriktionsendonukleasen SacI und PaeI, dem Isoschizomer von SphI, geschnitten.

Reinigung von PCR-Amplifikaten

Für die Reinigung von PCR-Amplifikaten wurde der gesamte PCR-Ansatz elektrophoretisch durch ein Agarosegel aufgetrennt. Nach Ethidiumbromid-Färbung wurde das entsprechende DNA-Fragment aus dem Agarosegel ausgestochen und die DNA über ein DNA- Agarosegel-Extraktions Kit (E. Z. N. A.-Gel-Extraction-Kit) der Firma peQLab nach dem angegebenen Protokoll gereinigt.

Dephosphorylierung des Vektors

Zur Dephosphorylierung geschnittener Vektor-DNA wurde der gesamte gereinigte Ansatz mit 0.5 U alkalischer Phosphatase aus Garnelen (Fermentas) im entsprechenden Puffer für 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend für 15 min bei 65°C hitzeinaktiviert.

Ligation, Transformation und Isolation positiver Klone

Nach der Dephosphorylierung des Vektors wurden die so entstandenen kohäsiven Enden wie bereits beschrieben ligiert und die Ligationsansätze für eine Transformation per Elektroporation in kompetente Escherichia coli DH1 OB Zellen verwandt.

Es konnten Klone isoliert werden, die nach Verdau mit SacI und PaeI ein Insert der gewünschten Größe (4.6 kb) aufwiesen (Abb. 11). Die Integrität der Monierten DNA wurde durch eine partielle DNA-Sequenzbestimmung (MWG-Biotech) des klonierten Inserts überprüft. Der so erhaltene neue Vektor erhielt die Bezeichnung pMM1520-dsrS.

Beispiel 2 Protoplastenttransformation von Bacillillus mezaterium-Stamm DSM 509 und WH320 durch das in Beispiel 1 hergestellte Expressionsplasmid Protoplastenpräparation

50 ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium angeimpft und bei 37°C inkubiert. Bei einer OD₅₇₈ von 1 wurden die Zellen abzentrifugiert (10000 × g; 15 min; 4°C) und in 5 ml frisch hergestellten SMMP-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei 37°C inkubiert und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation (3000 × g; 8 min; Rt) wurde das Zellsediment vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations- und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte nun, nach Zugabe von 10% (v/v) Glycerin, portioniert und bei -80°C eingefroren werden.

Transformation

500 µl der Protoplastensuspension wurden mit 1 µg DNA des Expressionsplasmids pMM1520dsrS in SMMP-Puffer versetzt und 1.5 ml PEG-P-Lösung zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer hinzugefügt, vorsichtig gemischt und die Suspension zentrifugiert (3000 × g; 5 min; Rt). Sofort danach wurde der Überstand abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 µl SMMP-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden 50 -200 µl der transformierten Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar- Platten gegeben, die für die Selektion 10 µg/ml Tetracyclin enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach eintägiger Inkubation bei 37°C sichtbar.

Es wurden folgende Stämme transformiert:

Beispiel 3 Expression und Sekretion des dsrS-Gens in Bacillus megaterium Kultivierung, Probennahme und Zellaufschluss

150 ml gepuffertes LB-Medium (LB in 100 mM TRIS-HCl, pH 6.4) bzw. MOPSO- Minimalmedium wurden mit einer B. megaterium Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C aerob inkubiert. Expressionsplasmid pMM1520 bzw. pMM1520-dsrS enthaltende Bakterien wurden durch Tetracyclinzugabe (10 µg/ml) selektioniert. Nach Erreichen einer OD₅₇₈ von 0.3 wurde der xyl-Promotor des Expressionsplasmids durch Zugabe von 0.5% (w/v) Xylose zum Wachstumsmedium induziert (Rygus und Hillen, 1991). Vor der Induktion, sowie nach der Induktion, wurden jeweils Proben mit ca. 2 × 10⁹ Zellen abgenommen. Die entnommenen Proben wurden zentrifugiert (12 000 × g; 3 min; Rt) und der Überstand (zellfreies Kulturmedium) bei -20°C gelagert. Die sedimentierten Zellen wurden in 40 µl Aufschlusspuffer resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension 30 min bei 37°C inkubiert. 20 µl des Aufschlusses wurden mit 5 µl SDS-PAGE-Probenpuffer versetzt und nach 15 minütigem Kochen im Wasserbad 30 min bei 15000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine SDS-PAGE analysiert.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE wurde ausgeführt nach dem Protokoll von Lämmli, 1970 mit den Modifikationen von Righetti et. al, 1990 für eine diskontinuierliche SDS-PAGE unter Fokussierung der Proteine in einem großporigen Sammelgel und Auftrennung in einem kleinporigen Trenngel. Die zu analysierenden Proben wurden auf ein 6%iges Gel aufgetragen, das bei einem Stromfluss von 4 mA/cm gefahren wurde. Der Lauf wurde beendet, sobald der Bromphenolblaumarker das Gelende erreicht hatte. Als Molekularmassenstandard wurde der High Molecular Weight Marker von Sigma verwendet. Die Gele wurden für eine Färbung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 in der Färbelösung im Mikrowellenofen erhitzt und in der Lösung für ca. 5 min geschwenkt. Anschließend wurden sie bis zur völligen Entfärbung der proteinfreien Gelmatrix in Entfärbelösung geschwenkt, über Nacht in Fixierlösung fixiert, fotografiert (BioRad Geldokumentationsanlage) und zur Konservierung zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet.

Expression des Dextransucrasegens

Die Produktion der Dextransucrase mittels pMM1520-dsrS in den B. megaterlum Stämmen DSM509 und WH320 wurde sowohl bei einer Kultivierung der Stämme in LB-Medium, als auch in MOPSO-Minimalmedium untersucht. Da berichtet wird, daß die Dextransucrase im Alkalischen instabil ist, wurde das LB-Medium mit 100 mM TRIS-HCl-Puffer, pH 6.4 gepuffert (Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R. R., Monsan, P., Willemot, R. M. (1997). Characterization of Leuconostoc mesenteroldes NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification of amino-acid residues playing a key rote in enzyme activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48 (4), 465-72). Als Kontrolle diente jeweils der mit dem Plasmid (pMM1520) ohne Dextransucrasegen transformierte B. megaterium-Stamm. Die Geninduktion mittels Xylosezusatz erfolgte zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase bei einer OD₅₇₈ von 0.3. Vor und nach der Induktion wurden Proben der Bakterienkultur entnommen.

Die Proteinzusammensetzung der aufgeschlossenen Zellen wurde mittels einer SDS-PAGE überprüft. Beide Stämme DSM509 und WH320 transformiert mit pMM1520-dsrS zeigten eine deutliche Produktion der Dextransucrase (M_r = 200.000) in LB-Medium. Die Extrakte präpariert aus DSM509 und WH320 mit dem Vektor pMM1520 ohne dsrS wiesen bei der M_r von 200 000 keine Proteinbande auf. Da die Konzentration, sowie das zeitliche Auftreten der Dextransucrasebande für Extrakte präpariert aus beiden B. megaterium Stämmen WH320 und DSM509 gleich waren, ist hier nur die Proteinanalyse für Extrakte vom DSM 509 gezeigt (Fig. VII).

Die Produktion der Dextransucrase in B. megaterlum WH320 wurde vergleichend auch in MOPSO-Minimalmedium getestet (Fig. VIII). Eine sichtbare DsrS-Bildung trat bereits nach 20 Minuten auf. Die Proteinbande schien aber nach 4 Stunden an Intensität zu verlieren: Dies wird besonders deutlich in einer Probe, die nach einem Tag Kultivierung (1660 min) genommen wurde. Dies deutet auf einen schwachen proteolytischen Abbau des Enzyms oder auf eine Abnahme der DsrS-Produktion hin.

Aktivitätsnachweis

Der Nachweis der Aktivität konnte durch eine Aktivitätsfärbung im Gel erzielt werden. Nach der SDS-PAGE von Proben, die nicht gekocht wurden, wird das Gel dreimal je 20 min in der Waschlösung bei 4°C gewaschen. Trition X- 100 führt zu einem Auswaschen des SDS, so dass sich die Glukosyltransferasen zurückfalten. Nach einer Inkubation des Gels bei 37°C über Nacht in der Waschlösung mit 100 g/l Saccharose wird das produzierte Dextran als weißes Band sichtbar (Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R. R., Monsan, P., Willemot, R. M. (1997). Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B- 512F dextransucrase (DSRS) and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48 (4), 465-72). Die Intensität dieser Bande kann durch Waschen in 50% Ethanol erhöht werden, wobei das Gel stark einläuft.

Fig. IX zeigt, dass das Enzym nach Elektrophorese in einer SDS-PAGE aktiv war und die Bildung von Dextran aus Saccharose katalysierte. Im Zellextrakt ist eine Proteinbande sichtbar. Durch Kochen der Probe trat Teilabbau bzw. Inaktivierung des Enzyms auf, da kleinere Proteine mit Enzymaktivität sichtbar wurden und die Aktivität des Enzyms abnahm. Die anschließende Zentrifugation hatte keinen Einfluss auf die Proteinstabilität.

Nachweis der Sekretion der Glukosyltransferase ins Wachstumsmedium

Zur Analyse der Sekretion wurden Proben des Kulturmediums von B. megaterlum genommen und bei -20°C gelagert. Zum besseren Nachweis wurde 1.5 ml Kulturmedium 10 µl einer Lösung von 5% (w/v) Sephadex-G75 zugesetzt und 2 h Stunden bei 4°C bei 1000 rpm geschüttelt. Nach 5 min Zentrifugation (13 000 rpm) kann das Sephadex-Sediment mit SDS-Probenpuffer versetzt werden. Die Proben wurden per SDS-PAGE und Aktivitätsanalyse untersucht.

Die Kultur von B. megaterium WH320 mit pMM1520dsrS wurde mit 0.5% (w/v) Xylose behandelt und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Geninduktion die Dextransucraseaktivität im Medium per Aktivitätsfärbung analysiert (Fig. X). Eine Stunde nach Induktion fand sich DsrS ohne Signalpeptid (188 000) im Medium, begleitet von einer dünnen Bande pre-DsrS (200 000). Eine Stunde später war nur eine geringe Steigerung der Proteinmenge zu beobachten. Drei Stunden nach Induktion nahm die Menge von DsrS und pre-DsrS sprunghaft zu. Außerdem wurde eine kleinere aktivitätsgefärbte DsrS-Form (M_r = 165 000) beobachtet. Ein Auftreten von Vorläuferprotein im Kulturmedium wurde auch bei der Produktion von AmyQ in B. subtilis bei hohen Induktionskonzentration eine Stunde nach Induktion beobachtet und wurde auf Sekretionsstress und zunehmende Zelllyse zurückgeführt (Vitikainen, M., Pummi, T., Airaksinen, U., Wahlstrom, E., Wu, H., Sarvas, M., Kontinen, V. P. (2001). Quantitation of the capacity of the secretion apparatus and requirement for PrsA in growth and secretion of alpha-amylase in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183(6), 1881-90). Die Proteolyse zur DsrS-Form mit M_r von 165.000 kann aber auch im Medium durch die neutrale Protease (Meinhardt, F., Busskamp, M. and Wittchen, K. D. (1994). Cloning and sequencing of the leuC and nprM genes and a putative spoIV gene from Bacillus megaterium DSM319. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (3), 344-351) oder bei der Passage durch die Zellwand durch eine zellwandassoziierter Protease (wie WprA in B. subtilis) auftreten. Drei Stunden nach Induktion erreicht die DsrS-Aktivität ca. 0.005 U in 1.5 ml Medium. Das entsprach ca. 3 U/l. Glucosyltransferasen.WorkFile

Claims

1. Rekombinantes Plasmid, umfassend

a) einen Shuttlevektor für Escherichia coli und Bacillus Spezies mit einer multiplen Klonierungsstelle zur Klonierung von Genen,

b) einen induzierbaren oder konstitutiven Promotor aus Bacillus Spezies,

c) ein Glucosyltransferasegen unter der Kontrolle des Promotors, ausgewählt aus

1. der in Fig. I gezeigten DNA-Sequenz,

2. DNA-Sequenzen, die mit der in c1) definierten Sequenz hybridisieren und für ein Polypeptid vom Glucosyltransferase-Typ codieren; und

3. DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes in bezug auf die in c1) und c2) definierten DNA-Sequenzen degeneriert sind und für ein Polypeptid vom Glucosyltransferase-Typ codieren.

2. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Shuttlevektor pMM1520 ist.

3. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein xylA-Promotor ist.

4. Prokariotischer Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er durch ein rekombinantes Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche transformiert ist.

5. Mikroorganismus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Mirkoorganismus eine Bacillus Spezies ist.

6. Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Bacillus megaterlum ist.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Bacillus megaterlum Stamm WH320 ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der gesamten oder einem Teil der Primärstruktur und einer oder mehreren biologischen Eigenschaften von Glucosyltransferase, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen gemäß mindestens einem der Ansprüche 4 bis 7 in einem Wachstumsmedium kultiviert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als kultivierter Mikroorganismus ein transformierter Bacillus megaterium Stamm WH320 gemäß Anspruch 7 verwendet wird.

10. Polypeptid hergestellt nach einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 8 und 9.

11. Polypeptid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es keine gebundenen Zuckerpolymere aufweist.