DE69813185T2

DE69813185T2 - Klonierung und Expression eines neuen Glukoamylasegens aus endomyces fibuliger

Info

Publication number: DE69813185T2
Application number: DE69813185T
Authority: DE
Inventors: Raymond David Pridmore; Sunil Kochhar
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: DE69813185D1; EP0959130B1; ATE236982T1; DK0959130T3; EP0959130A1; EP0959130B9

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue rekombinante Glukoamylase von Endomyces fibuliger, ein Gen, das für dieses Enzym kodiert, rekombinante Zellen, die das Enzym exprimieren und ein Verfahren zum Hydrolysieren kohlenhydrathaltiger Materialien.
Hintergrund der Erfindung
Die Glukoamylase, beispielsweise die 1,4-,1,6-α-D-Glukanhydrolase, ist eine Exoglukosidase, die die fortschreitende Entfernung von Glukose von nicht-reduzierenden Enden von Stärke und verwandten Polysacchariden katalysiert. Dieses extrazelluläre Enzym hydrolysiert α-1,4-glykosidische Bindungen etwa 30 bis 50 mal wirksamer als α-1,6-glykosidische Bindungen (Wong, In Food enzymes: structure and mechanism. Chapman and Hall, New York). Andere Namen für diese Enzym schließen γ-Amylase, Amyloglukosidase, Glukamylase, Maltase und zuckerumwandelnde Amylase ein. Die Glukoamylase gehört zu einer Gruppe stärkeabbauender amylolytischer Enzyme einschließlich der α- und β-Amylasen, Pullunase und Cyclodextrin Glykosyltransferase. Das Endprodukt ist fast ausschließlich Glukose, der β-Konfiguration. Die Rückreaktion, insbesondere bei höheren Glukose-Konzentrationen, führt zu verschiedenen Oligosacchariden aus Glukose, wie Maltose und Isomaltose.
Die industrielle Herstellung von Glukoamylase begann zuerst 1959, als ein japanisches Unternehmen Glukose mit Hilfe von Rhizopus niveus erzeugte. In den frühen Anfängen wurde das Enzym aus Weizenkleie-Koji Kultur unter Verwendung der Stämme Rhizopus niveus und Endomyces sp. erzeugt. Neben Rhizopus sp. ist kommerziell-hergestellte Glukoamylase gegenwärtig auch aus Kulturen von Aspergillus sp. verfügbar und wird zur Verzuckerung von Stärke eingesetzt (Amylase Research Society Of Japan, 1988).
Die wichtigste Anwendung der Glukoamylase kann in der Herstellung kristallinen Glukose und hoch konzentrierten Glukose-Sirups, der aus 90 bis 97% D-Glukose besteht, gefunden werden. Die aus Stärke hergestellte Glukose wird als Substrat für die enzymatische Herstellung eines hoch konzentrierten Fruktose-Sirups verwendet. Eine steigende globale Nachfrage an Glukose- und hoch konzentrierter Fruktose-Sirup-Produktion läßt die Glukoamylase als eines der wichtigsten Enzyme erscheinen (Amylase Research Society of Japan, 1988). Auch die Nachfrage nach durch Fermentation hergestelltem Alkoholist ansteigend, mit Anforderungen als alternative Energiequelle, Getränk, Lösungsmittel und Rohmaterial in der chemischen Industrie.
Die Fähigkeit der Glukoamylase Glukose und Alkohol aus Stärke-enthaltendem Material herzustellen führte somit zu intensiven Untersuchungen von dieses Enzym herstellenden Organismen.
Glukoamylasen sind aus Mikroorganismen, wie Aspergillus, sp., Rhizopus sp., Endomyces sp., Monascus sp., Mucor rouxianus und Penicillium oxalicum isoliert worden. In einigen Fällen, wie in Aspergillus sp., Rhizopus sp., Endomyces sp., ist über mehrere Formen dieses Enzyms berichtet worden (Futatsugi et al., J. Ferment. Bioeng. 76_1993), 521–523). Verschiedene, aus jedem Stamm isolierte Formen können sich hinsichtlich der Spaltbarkeit von Rohstärke, der Temperaturstabilität, dem Molekulargewicht, der Aminosäure- und Kohlenhydrat-Zusammensetzung und der Hydrolyse-Kurven bei Glykogen unterscheiden. Die möglichen Vorteile der Herstellung verschiedener Formen ist unklar (Boel et al., EMBO J. 3_1984), 1097–1102). Posttranslationale Modifikationen und unterschiedliches mRNA-Spleißen, wie bei den zwei Glukoamylasen von Aspergillus sp. (Boel et al.) gezeigt, sind mögliche Mechanismen, die verschiedene Isoformen erzeugen. Es scheint, dass das Auftreten von Isoenzymen Pilzen gemeinsam ist, wobei die größeren dieser Formen im allgemeinen beim Abbau der Verzweigungen aktiver und bei der Adsorption und dem Abbau von Rohstärke stärker sind. Gemäß Tanaka et al. (Agric. Biol. Chem. 50_1986), 1737–1742) zeigen die anderen Formen gewöhnlich gegenüber löslichen Polysacchariden vergleichbare enzymatische Eigenschaften. Derartige, ähnliche Eigenschaften wurden für die zwei Formen der Glukoamylase von Aspergillus awamori (Nunberg et al., Mol. Cell. Biol. 4_51984), 2306-2315) und für die vier Isoformen von Aspergillus oryzae (Razzaque and Ueda, J. Ferment. Tech. 5651978), 296–302) gezeigt. Über einen Rhizopus sp. wurde berichtet, dass die drei Formen ähnliche enzymatische Eigenschaften, wie Inaktivierung durch Hitze und Empfindlichkeit gegenüber extremen pH-Werten, aufweisen (Takahashi et al., Biochem. 84_ (1978), 1183–1194).
Die Expression und Sekretion des Enzyms in S. cerevisiae ist mit Glukoamylase kodierenden Genen aus mehreren Mikroorganismen wie Rhizopus sp. (Ashikari et al., Agric. Biol. Chem. 50_(1984), 957–964; Tanaka et al.) und Schwanniomyces occidentalis (Dohmen et al., Gene, 95_51990), 111–121) erreicht worden.
In seiner Arbeit über extrazelluläre Amylasen von 1961, berichtete Hattori die Herstellung einer Glukoamylase aus einem Endomyces sp. (Agric. Biol. Chem. 25, 737–743 und 895-901). Die in der letzten Dekade hauptsächlich von Japanern und Tschechen durchgeführte Forschung legen das Vorhandensein von mehr als einer Form des Enzyms in E. fibuliger nahe. Heute werden hauptsächlich zwei Formen einer Glukoamylase aus E. fibuliger in der Literatur genannt, obwohl Gasperik et al. (Biologia. Bratisl., 43_1988), 673–680) drei Fraktionen einer Glukoamylase aus einem extrazellulären Amylase-Komplex erhalten hat. Seither gab es keinen weiteren Bericht über dieses dritte Isoenzym.
Der erste Bericht über die Isolierung des für die Glukoamylase I kodierenden Gens wurde von Yamashita et al., (Appl. Microbiol. Biotech., 23 (1985), 130–133) vorgestellt. Aus einer genomischen Bibliothek von E. fibuliger HUT7212 wurde ein DNA-Fragment kloniert und in S. cerevisiae transformiert, wobei die sich ergebenden Transformanden auf Platten löslicher Stärke (3% Gew./Vol.) trübe Ausfällungen erzeugten. Yamashita et al. untersuchte die von diesen Transformanden ins Kulturmedium sezernierte Glukoamylase weiter. Glukoamylase-Aktivität wurde durch Bestimmen der Menge hergestellter Glukose beim Umsetzen eines dialysierten Kulturüberstandes mit löslicher Stärke nachgewiesen. Die Aktivität betrug 5,2 Einheiten pro ml dialysierten Überstandes. Eine Einheit Enzymaktivität ist definiert durch die Menge an Enzym, die unter den gewählten Reaktionsbedingungen zur Herstellung von 1 mg Glukose aus Stärke erforderlich ist. Das von S. cerevisiae Transformanden sezernierte Enzym zeigte identische enzymatische Eigenschaften wie der elterliche E. fibuliger Stamm, wie beispielsweise die Abhängigkeit von der Temperatur und dem pH-Wert.
Itoh et al. (J. Bact., 169 (1987), 4171–4176) führte die Klonierungsarbeit von Yamashita et al. fort. Die vollständige Nukleotidsequenz des gleichen Glukoamylase-Gens von E. fabuliger wurde aufgeklärt. Dieses Gen wurde als GLUI bezeichnet. Das genomische Fragment, das vorangehend in S. cerevisiae exprimiert wurde, um Glukoamylase-Aktivität herzustellen, war 2.538 Nukleotide lang, und umfasste die 1.564 Bp des offenen Leserahmens von GLUI und ungefähr 1.000 Nukleotide flankierender DNA. Die GLUI-DNA hybridisiert an eine 2,1 kb polyadenylierte RNA. Der ORF entspricht einem Peptid von 519 Aminosäureresten. Am aminoterminalen Ende war ein hydrophobes Segment von 20 Aminosäuren vorhanden, das Signalsequenzen glich, die in vielen sezernierten Proteinvorläufern dokumentiert war. Ein Aminosäuresequenzvergleich mit Glukoamylasen von S. cerevisiae, R. niveus, A. niger und Saccharomyces diasticus enthüllte fünf stark homologe Regionen. Zur weiteren Charakterisierung wurde die Glukoamylase von den S. cerevisiae Transformanden über eine Säule chromatographisch aufgereinigt. Neben der Glykosylierungsanalyse bestimmten Itoh et al. durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Gel-Filtration auch das Molekulargewicht, das 55.000 beträgt.
Eine andere japanischen Gruppe berichtete über enzymatische Untersuchungen an der zweiten Glukoamylase von E. fibuliger IFO 0111. Zwei durch Säulenchromatographie aufgetrennte Glukoamylaseformen, die sich einander hinsichtlich der pH-Stabilität und dem Temperaturoptimum der Glukoamylase-Aktivität gegenüber löslicher Stärke (40°C) gleichen, wurden von Futatsugi et al. (J. Ferment. Bioeng. 761993), 521–523) berichtet. Die Enzyme wurden aus einem E. fibuliger Kulturüberstand erhalten, der durch dessen Fähigkeit durch Hydrolyse löslicher Stärke Glukose freizusetzen Glukoamylase-Aktivität aufwies. Diese Glukoamylase-Aktivität wurde in ähnlicher Art und Weise wie bei Yamashita et al.
(1985) und Dohmen et al. (1990) untersucht. Die Aktivität der Glukoamylase II war um 35% geringer als die der Glukoamylase I. Die Aktivitäten beider isolierter Isoformen wurden durch verschiedene Kationen, wie Mg²⁺, Ca²⁺, Fe³⁺, Zn²⁺ und Cu²⁺ und andere Reagenzien, wie Harnstoff, SDS, EDTA, Triton X-100 und Tween-20 nicht beeinflusst. Die Unterschiede zwischen den zwei Glukoamylasen schließen thermische Stabilität ein, und das Molekulargewicht der Glukoamylase II (57.000) ist größer als das der Glukoamylase I (55.000). Die relativen Mengen der Enzyme hängen von den Wachstums-Bedingungen und der -Dauer ab. Futatsugi et al. (1993) hat Glukoamylase schon früher in großem Maßstab unter aeroben Bedingungen in 20–1, 100–1, 200–1, und 4000–1 Fermentern erzeugt. Eine Liste der Eigenschaften dieser beiden Glukoamylasen sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
Interessant zu erwähnen ist, dass ein weiteres E. fibuliger Glukoamylase-Gen von Hostinova et al. (Biologia. Bratisl. 45 (1990), 301–306,; FEMS Lett. 83 (1991/1991), 103–108) isoliert und sequenziert wurde. Das als GLA1 bezeichnete 2,5 kb genomische Fragment aus E. fibuliger KZ wurde in S. cerevisiae kloniert und exprimiert. Positive Transformanden wurden durch. Bildung eines charakteristischen opaken Halos/Hofs auf Stärke-enthaltenden Platten aufgrund der sezernierten Glukoamylase ausgewählt. Das gesamte 2,5 kb Fragment wurde sequenziert. Beim Vergleich mit dem ORF der GLUI-Nukleotid- und seiner abgeleiteten Aminosäure-Sequenz (Itoh et al., 1987), wurde eine hohe, 98,5%-ige Aminosäuresequenz-Identität beobachtet. Drei Aminosäuren in der Signalpeptid-Region und acht Aminosäuren in dem reifen Protein waren die Hauptunterschiede, neben Unterschieden in den 5'- und 3'- flankierenden DNA-Regionen. Die Glukoamylase-Aktivität von GLA1 Transformanden wurde mittels des Standard Analysetests nachgewiesen wobei festgestellt wurde, dass sie dreifach geringer ausfiel als die der Glukoamylase von GLU1 Transformanden. Diese zwei Enzyme unterscheiden sich weiter hinsichtlich der Molekulargewichte und der Mobilität in Polyacrylamid-Gelen. Diese Unterschiede könnten Folgen der Unterschiede in der Primärstruktur des reifen Genproduktes (Hostinova et al., 1991) sein. Aufgrund der hohen Aminosäure-Homologie ist es möglich, dass der Grund der Unterschiede zwischen den GLA1- und GLU1-Gen darauf beruht, das GLA1 tatsächlich ein GLUI ist, das von einem anderen E. fibuliger Stamm isoliert wurde. Gasperik und Hostinova (Curr. Microbiol. 27 (1993), 11–14) untersuchten die Glukoamylasen aus diesen GLA1- und GLU1- Transformanden weiter. Aufgrund der Heterogenität der Glykosylierung wurden die Glukoamylasen eines jeden Gens isoliert und in zwei Formen gereinigt. Die zwei Formen eines jeden Gens waren in ihren katalytischen und physiko-chemischen Eigenschaften, wie beispielsweise der pH-Abhängigkeit und dem Temperaturoptimum ähnlich, unterschieden sich jedoch in ihrer thermischen Stabilität und der Fähigkeit zur Renaturierung nach Hitzedenaturierung.
Tabelle 1
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, das Gen einer neuen Glukoamylase von E. fibuliger bereitzustellen, das die Konstruktion neuer Mikroorganismen ermöglicht, die neue Hydrolyse-Spezifitäten gegenüber kohlenhydrathaltigem Material aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung eine neue rekombinante Glukoamylase von E. fibuliger, die die Annosäure-Sequenz ausgehend von einer der Aminosäuren 1–50 bis zu Aminosäure 963 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, oder funktionale Abkömmlinge davon, die mindestens 85% Identität dazu aufweisen.
In einer zweiten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein DNA-Molekül, das ein GLA2-Gen umfasst, das für das erfindungsgemäße Enzym kodiert.
In einer dritten Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zelle bereit, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Proteine mittels rekombinanter Technologie exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms bereit, welches Züchten der erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium unter Bedingungen umfasst, dass die Zellen das Enzym exprimieren, und wahlweise Isolieren des Enzyms in der Form eines Konzentrats.
In einer letzten weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins oder der erfindungsgemäßen Zellen bereit, um kohlenhydrathaltige Materialien zu hydrolysieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der nachfolgenden Beschreibung beziehen sich, wenn nicht anders erwähnt, die Prozentangaben auf das Gewichts und die als "SEQ ID Nr.:" bezeichneten Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenzen sind immer in den nachfolgenden Sequenzlisten angegeben.
In gleicher Weise schließt der Ausdruck funktionale Abkömmlinge eines Enzyms alle Aminosäuresequenzen ein, die sich durch Substitution, Deletion und Addition einiger Aminosäuren, beispielsweise von 1–20 Aminosäuren, unterscheiden, die jedoch ihre ur sprünglichen Aktivitäten oder Funktionen erhalten. Die Auswahl eines funktionalen Abkömmlings wird als dem Fachmann bekannt angesehen, da Varianten des GLA2-Proteins (das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist) leicht hergestellt werden können, indem dem Fachmann bekannte Methoden, beispielsweise die Methoden von Adams et al. ( EP 402 450 ; Genecor), von Dunn et al. (Protein Engineering 2_1988), 283–291), von Greener et al. (Strategies 7 (1994), 32–34) und/oder von Deng et al. (Anal. Biochem. 200 (1992), 81) leicht angepasst werden können.
Ein erfindungsgemäßes, funktionales, abgeleitetes Protein wird als ein Abkömmling eines anderen Proteins angesehen, wenn seine Sequenz beispielsweise mindestens zu 85%, vorzugsweise mindestens zu 95% mit dem Protein identisch ist. In der vorliegenden Offenbarung wird die Identität bestimmt durch das Verhältnis zwischen der Anzahl von Aminosäuren einer abgeleiteten Sequenz, die zu denen der GLA2, mit der Aminosäure Sequenz SEQ ID Nr. 2 identisch sind, und der Gesamtzahl der Aminosäuren der abgeleiteten Sequenz.
Zusätzlich bezeichnet der Ausdruck "Koji" das Produkt der Fermentation eines Gemisches bestehend aus einer Quelle aus Proteinen und einer Quelle aus Kohlenhydraten, speziell eines Gemisches einer zu den Leguminosen gehörenden Pflanze oder einer gekochten, ölhaltigen Pflanze und einer gekochten oder gerösteten Getreidequelle, beispielsweise einer Mischung aus Soja oder gekochten Bohnen und gekochtem oder geröstetem Weizen oder Reis mit einer Koji-Schimmelpilz-Kultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher das von Endomyces fibuliger stammende Glukoamylase-GLA2-Enrym, das die Aminosäure-Sequenz ausgehend von einer der Aminosäuren 1–50 bis zu der Aminosäure 963 von SEQ ID.Nr. 2 umfasst, oder funktionalen Abkömmlingen davon, die mindestens 85% Identität dazu aufweist.
Dieses Enzym kann funktionell an jedes Leader-Peptid fusioniert werden, welches dessen Sekretion in einem Wirt, in dem das Enzym exprimiert wird, fördert, wobei beispielsweise das Leader-Peptid von Endomyces fibuliger die Aminosäuresequenz ausgehend von Aminosäure 1 bis zu einer der Aminosäuren 15–30 von SEQ ID Nr. 2 aufweist, oder jedes der funktionalen Abkömmlinge davon; der mindestens 85% Identität dazu aufweist.
Ein GLA2-Gen, das für das erfindungsgemäße GLA2-Enzym kodiert, kann mindestens die kodierenden Teile der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, oder die funktionalen Abkömmlinge davon, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, umfassen.
Ein GLA2-Gen kann in einer im Wesentlichen gereinigten Form durch Anwendung der, in den folgenden Beispielen beschriebenen Methoden aus jedem Endomyces fibuliger Stamm erhalten werden, beispielsweise den Stämmen CNCM I-1991, ATCC 2082, ATCC 2080, ATCC 9947 oder ATCC 2088. Alternativ kann auch ein GLA2-Gen (1) aus anderen Gattungen oder Arten von Mikroorganismen, durch Verwendung von DNA-Proben in einer stringenten Hybridisierungsanalyse aufgefunden werden, die von der Nukleotid Sequenz SEQ ID Nr. 1 abgeleitet sind, und (2) wiedergewonnen werden durch die gut bekannte Reverse-PCR Methode unter Verwendung geeigneter Primer, beispielsweise Primern der SEQ ID Nr. 7 und 8. In einem weiteren Aspekt kann auch ein GLA2-Gen in vitro synthetisiert werden und dann beispielsweise durch die Polymerasenketten-Reaktion vervielfältigt werden.
Das erfindungsgemäße DNA-Molekül umfasst mindestens ein GLA2-Gen, das für das erfindungsgemäße GLA2-Enzym kodiert. Dieses Molekül kann in Form eines Vektors d.h., eines replikativen Plasmids oder eines integrativen zirkulären oder linearisierten, nichtreplikativen Plasmids vorkommen. Das DNA-Molekül kann daher funktional verbundene regulatorische Sequenzen umfassen, die nativ zu dem Organismus sind, von dem das Gen abstammt. Diese nativen regulatorischen Sequenzen können der Promotor, der Terminator und/oder eine DNA-Sequenz sein, die für eine Signalsequenz kodiert, die ursprünglich die Sekretion von dem GLA2-Gen regulierte, wie beispielsweise die Endomyces fibuliger Nukleotidsequenz, die für das GLA2-Signalpeptid kodiert. In einer anderen Ausführungsform können regulatorischen Sequenzen native Sequenzen sein, die in dem Ursprungsorganismus beispielsweise ein unterschiedliches Gen regulieren, oder die in einem fremden Organismus ein unterschiedliches Gen regulieren. Eine zu der nativen Sequenz unterschiedliche regulatorische Sequenz wird im allgemeinen für ihre hohe Effizienz oder gewünschten Eigenschaften ausgewählt, beispielsweise Induzierbarkeit eines Promotors oder einer Sequenz, die für ein Peptidsignal kodiert, das die Sekretion des Proteins gestattet.
Wird heterologe Expression bevorzugt, dann bedeutet dies, dass die erfindungsgemäßen Gene in einem zu dem Ursprungswirt unterschiedlichen Organismus (Stamm, Sorte, Art, Gattung, Familie, Ordnung, Klasse oder Abteilung) exprimiert werden, wobei die regulatorischen Sequenzen vorzugsweise von einem Organismus stammen, der ähnlich oder gleich dem des Expressionswirts ist. Wenn beispielsweise der Expressionswirt eine Hefezelle ist, dann werden die regulatorischen Sequenzen von einer Hefezelle stammen. Der für konstitutive Expression geeignete Promotor, vorzugsweise in einem Pilzwirt, kann ein Promotor der folgenden Gene sein: beispielsweise Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Phosphoglyceratkinase, Triose-phosphatisomerase und Azetamidase. Ein für induzierbare Induktion geeigneter Promotor, vorzugsweise in einem Pilzwirt, kann ein Promotor aus den folgenden Genen sein: Endoxylanase IIA, Glukoamylase A, Cellobiosehydrolase, Amylase, Invertase, Alkoholdehydrogenase und Amyloglukosidase. Die Wahl einer gewünschten regulatorischen Sequenz, die mit einer erfindungsgemäßen Sequenz funktionell verbunden ist und die Expression der Nukleotidsequenz bewirken kann, wird als für den Fachmann offenbar angesehen.
Das erfindungsgemäße DNA-Molekül kann auch einen Selektionsmarker umfassen, um die Wirtszellen, in die das rekombinante DNA-Material eingeführt wurde, von Zellen, die das rekombinante Material nicht enthalten, zu unterscheiden. Im Fall der bevorzugten Expression in Pilzen sind derartige Markergene beispielsweise die bekannten ga-2-, pyrG-, pyr4-, pyrA-, trpC-, amdS- oder argB-Gene. Das DNA-Molekül kann auch mindestens einen geeigneten Replikationsursprung umfassen. Geeignete Transformationsmethoden und geeignet Expressionsvektoren, die mit einem geeigneten Transkriptions-Promotor, geeigneten Transkrtptions-Terminationssignalen und geeigneten Marker-Genen zur Selektion transformierter Zellen ausgestattet sind, sind in der Literatur für viele Organismen, einschließlich verschiedener Bakterien, Pilz- und Pflanzenarten bereits bekannt. Ist eine Expression in Pilzen erforderlich, dann kann das Expressionssystem, das in EP 278 355 (Novartis) beschrieben ist, daher teilweise angepasst werden.
Rekombinante Zellen können durch jede Methode erhalten werden, mit der eine fremde DNA in eine Zelle eingeführt werden kann. Derartige Methoden schließen Transformation, Elektroporation oder jede andere, dem Fachmann bekannte Technik ein.
Die Erfindung umfasst daher eine rekombinante Zelle, die das erfindungsgemäße DNA-Molekül umfasst, wobei die Zelle das erfindungsgemäße GLA2 oder funktionale Abkömmlinge davon exprimieren kann. Diese Zellen können von einer Gruppe von Pilz-, Hefe-, Bakterien- und Pflanzen-Zellen abstammen. Vorzugsweise sind Hefezellen von der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula und Pichia, Bakterienzellen sind Gram negative oder positive Bakterien d.h. von der Gattung Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus und Staphylococcus, Pflanzenzellen sind aus der Gemüsepflanzen-Gruppe und Pilzzellen sind Zellen, die traditionell zur Herstellung eines Koji verwendet werden, wie Aspergillus, Rhizopus und/oder Mucor Arten, besonders Aspergillus soyae, Aspergillus oryzae (ATCC 20386), Aspergillus phoenicis (ATCC 14332), Aspergillus niger (ATCC 1004)., Aspergillus awamori (ATCC 14331), Rhizopus oryzae (ATCC 4858), Rhizopus oligosporus (ATCC 22959), Rhizopus japonicus (ATCC 8466), Rhizopus formosaensis, Mucor circinelloides (ATCC 15242), Mucor japanicus, Penicillium glaucum und Penicillium fuscum (ATCC 10447). Die Stämme, die sich auf eine ATCC-Bezeichnung beziehen sind über die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, USA erhältlich. Die Erfindung wird nicht begrenzt durch derartige Hinweise/Anzeichen, die dem Fachmann eher mitgeteilt wurden, um die Erfindung auszuführen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Zellen können das erfindungsgemäße DNA-Molekül stabil in die Chromosomen integriert oder auf einem replikativen Plasmid enthalten.
Vorzugsweise werden funktionale Kopien des GLA2-Gens an einem bestimmten Ort der chromosomalen DNA der Wirtszelle integriert.
Demgemäß kann das erfindungsgemäße DNA-Molekül um mindestens ein funktionales, nicht mit einem Promotor fusioniertes GLA2-Gen ist, in das Chromosom prokaryotischer Zellen funktional zu integrieren, unter Verwendung des in EP 564 966 beschriebenen Verfahrens integriert werden.

(1) Transformieren eines Wirtsstamm-Organismus mit einem Donor-Plasmid, das in dem Wirtsstamm nicht repliziert, wobei das Donor-Plasmid ein Vektorrückgrat und ein funktionell integriertes, erfindungsgemäßes GLA2-Gen ohne einen Promotor umfasst, in einen Bereich eines Operons des Wirtsstamm , wobei der Rahmen und die Funktion des genomischen Operons des Wirtsstamms aufrechterhalten bleibt; (2) Identifizieren kointegrierter Transformanden, in denen das vollständige Donor-Plasmid in das genomische Operon des Wirtsstamms integriert ist; und (3) Selektionieren eines integrierten Transformanden von den kointegrierten Transformanden, wobei das Genom des selektionierten integrierten Transformanden nicht das Vektorrückgrat des Wirtsplasmids, jedoch das GLA2-Gen enthält, das in das konservierte genomische Operon funktionell integriert ist und das stabil erhalten bleibt und exprimiert wird, aufgrund eines selektiven Drucks auf hinsichtlich des konekten Funktionierens des wesentlichen Cistrons beim Wachstum in einem Standardmedium.

Um in einer zweiten Ausführungsform nur eine funktionale GLA2-Sequenz, die an einen Promotor und einen Terminator fusioniert ist, die dem Wirtsorganismus nativ sind, stabil in das Chromosom eukaryotischer Zellen zu integrieren, kann das erfindungsgemäße DNA-Molekül durch einfaches Anpassen des Verfahrens von Ruiter-Jacobs, Y. M. J. T., Broekhuijsen et al. (A gene transfer system based on the homologous pyrG gene and efficient expression of bacterial genes in Aspergillus oryzae. Curr. Genet. 16 (1989), 159-163)integriert werden.

(1) Herstellen eines nicht-replikativen DNA Fragments durch Ligieren des GLA2, das mit einem zu dem Wirtsorganismus nativen Promotor und Terminator funktionell verbunden ist stromabwärts einer für ein essentielles Gen kodierenden DNA-Sequenz, wobei das essentielle Gen durch mindestens eine Mutation und/oder eine Deletion (dieses essentielle Gen kann ein in der Uracil-Biosynthese involviertes Gen sein, wie beispielsweise das pryG Gen im Fall von A. oryzae) inaktiviert ist; (2) Selektionieren eines Wirtsorganismus, der das essentielle Gen enthält, das jedoch durch eine weitere Mutationen) oder Deletion(en) inaktiviert ist; (3) Transformieren des Wirtsorganismus mit dem nicht-replikativen DNA-Fragment; (4) Identifizieren integrierter Transformanden, in denen das DNA-Fragment derart integriert ist, dass es die native Funktion des essentiellen Gens wiederherstellt; (5) Selektionieren eines integrierten Transformanden, in dem nur ein DNA-Fragment integriert ist.

Die Nachkommenschaft eines ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül enthaltenden Expressionswirts ist von der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingeschlossen. Demgemäß ist eine bevorzugte Ausführungsform auf eine Zelle gerichtet, die ein rekombinantes erfindungsgemäßes DNA-Molekül in jeder der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen umfasst, wobei die Zelle das GLA2 in die Zellwand oder Zellmembran integrieren kann oder das Enzym in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium sezernieren kann. Der durch das erfindungsgemäße rekombinante Protein zu beschreitende Sekretionsweg hängt von der ausgewählten Wirtszelle und der Zusammensetzung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA ab. Besonders bevorzugt jedoch wird das Protein in das Kulturmedium sezerniert. Schließlich kann die erfindungsgemäße Zelle ein rekombinantes GLA2-Gen umfassen, das zusätzlich funktionell mit einer DNA verbunden ist, die beispielsweise für eine fremde Leadersequenz (pre oder prepro) kodiert.
Die das erfindungsgemäße GLA2 überexprimierenden Zellen werden vorzugsweise gewählt, insbesondere Aspergillus-Zellen. Diese Zellen können durch Einbringen des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls in einen Expressionswirt erhalten werden, wobei das DNA-Molekül ein oder mehrere regulatorische Sequenzen umfasst, die dazu dienen, die Expressionsgrade des (der) erfindungsgemäßen Proteins (e) zu erhöhen.
Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen GLA2 gerichtet, das die Bereitstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium unter Bedingungen umfasst, dass die Zellen das GLA2 exprimieren, und optional Isolieren des rekombinanten Proteins/der rekombinanten Proteine in Form eines Konzentrats. Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Wahl des Expressionswirts basieren und/oder auf den regulatorischen Bedingungen des rekombinanten DNA-Materials basieren. Derartige Medien sind dem Fachmann bekannt.
Nach der Fermentation können die Zellen durch Zentrifugation oder Filtration aus der Fennentationsnährlösung entfernt werden. Abhängig davon, ob die Wirtszelle das erfindungsgemäße GLA2 in das Medium sezerniert hat, oder ob das GLA2 noch in irgendeiner Art und Weise mit der Wirtszelle verbunden ist, entweder im Zytoplasma, im periplasmatischen Raum oder angehängt/angebracht anoder in die Membran oder Zellwand, können die Zellen einer weiteren Behandlung unterworfen werden, um das rekombinante Protein zu erhalten. Wenn, wie im letzten Fall das rekombinante Enzym noch mit der Zelle verbunden ist, dann kann die Gewinnung durch Aufbrechen der Zellen, beispielsweise mittels hohem Druck, enzymatischer Verdauung oder einfach durch Autolyse mit nachfolgender Isolation des gewünschten Produktes erreicht werden. Das GLA2 kann von der Zellmasse durch verschiedene Verfahren, wie beispielsweise durch Ultrazentrifugation, abgetrennt und dann anschließend mit einer organischen Lösung ausgefällt werden. Das isolierte GLA2 kann weiterhin durch herkömmliche Verfahren, wie beispielsweise über Ausfällung und/oder Chromatographie, gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem die Verwendung des gereinigten GLA2 oder der vorstehend erwähnten Zellen, um kohlenhydrathaltige Materialien zu hydrolysieren, wie beispielsweise Gemische einer Quelle von Proteinen und einer Quelle von Kohlenhydraten, insbesondere eines Gemisches von einer zu den Leguminosen gehörenden Pflanze oder einer gekochten Leguminose und einer gekochten oder gerösteten Getreidequelle, beispielsweise eines Gemisches von Soja oder gekochten Bohnen und von gekochten oder geröstetem Weizen oder Reis.
Die Manipulation von DNA, die Klonierung und Transformation von Bakterienzellen ist mit Ausnahme werden, wenn nicht anders angegeben, gemäß dem Lehrbuch von Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) durchgeführt . Eine kurze Beschreibung der Zeichnungen geht diesen Beispielen voran. Die Stämme Endomyces fibuliger 8014, Saccharomyces cerevisiae YP107/pDP514, Aspergillus oryzae TK3 wurden nach dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.), 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris, Frankreich, am 17. März 1998, (E. fibuliger und S. cerevisiae) bzw. am 24. Juni 1997 hinterlegt, wo sie die Hinterlegungsnummern CNCM I-1991, CNCM I-1992 und CNCM I-1882 erhielten. Alle Beschränkungen, die die Verfügbarkeit dieser Hinterlegungen betreffen werden nach der ersten Publikation dieser Anmeldung oder einer anderen Anmeldung, die die Nutzung der Priorität dieser Anmeldung beansprucht, zurückgezogen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt das Plasmid pDP514, das verwendet wurde, um GLA2 in Saccharomyces cerevisiae zu klonieren.
2 zeigt das Plasmid pDP490, das verwendet wurde, um die mehreren Deletionen des Stamms YP107 zu ergänzen.
Beispiel 1 Klovierung von GLA2 durch PCR
Chromosomale DNA wurde von vegetativen Zellen vom Endomyces fibuliger Stamm 8014, auch Sacchromycopis fibuliger genannt, wie früher beschrieben (Nga et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, 101994), 465–471) hergestellt. Diese DNA wurde mit den Oligonukleotiden SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 für 30 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 40°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten in einem Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler amplifiziert. Das Produkt wurde elektrophoretisch aufgetrennt und das 470 Bp Amplikon wurde aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung, gemäß den Instruktionen, des QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kits (Kat. Nr. 28704), gereinigt. Das Amplikon wurde unter Verwendung des Promega pGEM^®-T Vektors (Kat. Nr. A3600) kloniert und in den elektro-kompetenten E. coli Stamm BZ234 elektro-transformiert. Ein Plasmid wurde unter Verwendung der Didesoxy-DNA-Sequenzierungs-Methode mit dem Amersham Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit (Kat. Nr.
RPN2536) sequenziert und die pUC19 Sequenzierungs-Primer wurden mit dem Fluoreszenzfarbstoff IRD-41 (MWG Biotech) markiert. Die Reaktionen wurden unter Verwendung des Li-cor dNA sequencer model 4000L analysiert und mit dem GCG suite of programms (Devereux et al., Nucleic Acids Res., 12_1984), 387–395) zusammengesetzt.
Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Sequenzlisten dargestellt. Die DNA-Sequenz SEQ ID Nr. zeigt keine signifikante Ähnlichkeit zu dem E. fibuliger GLU1 Gen (Itoh et al., J. Bact., 169_1987) 4171–4176), offenbart jedoch einen hohen Grad von Ähnlichkeit zu dem Schwanniomyces occidentalis Glukoamylase Gen GAMI (Straaser et al., Eur. J. Biochem., 184_1989), 699–706). Dieses neue Glukoamylase Gen von E. fibuliger wurde GLA2 genannt.
Um die geeignete genomische Sequenz von GLA2 aufzufinden, wurden die nachstehenden Analysen durchgeführt. Demgemäß wurde die chromosomale DNA von E. fibuliger 8014 mit ausgesuchten Restriktionsenzymen verdaut, die Fragmente entsprechend der Größe elektrophoretisch aufgetrennt und durch Kapillarkräfte auf eine Nylon-Membran übertragen. Das vorstehend genannte PCR-Amplikon wurde unter Verwendung des rediprime random primer labelling kit von Amersham (Kat. Nr. RPN1633) radioaktiv markiert und das Nylon-Filter wurde gemäß den Instruktionen hybridisiert. Nach dem Waschen und der Exposition wurde ein 10 kb EcoRI Restriktionsfragment für die Klonierung identifiziert. Zehn μg chromosomaler DNA wurden mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und die Fragmente entsprechend der Größe elektrophoretisch aufgetrennt. Die Region, die die 10 kb große Bande (8–12 kb) enthält, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wurde unter Verwendung des QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt. Das Reservoire von Fragmenten wurde, bevor es in den E. coli Vektor pK19 (Pridmore et al., Gene, 56 1987), 309–312) kloniert wurde, mit dem Restriktionsenzym. EcoR1 verdaut und dephosphoryliert. Das Ligationsprodukt wurde in den E. co1i Stamm BZ234 elektro-transformiert und die Transformanden wurden auf mit 50 μg/ml Kanamyzin, 150 μg/ml 5-Bromo-4-Ch1oro-3-Indolyl-b-D-Galactosidase (Xga1) und 30 μg/ml Isopropyl-b-Thiogalactopyranoside (IPTG) angereicheten LB-Platten, bei 37°C über Nacht inkubiert und selektioniert. Weiße, Insert-DNA enthaltende Kolonien wurden in Mikrotiter-Vertiefungen, die 150 μl mit 50 μg/ml Kanamyzin angereichertes LB Medium enthielten, überführt, und in Form von Mini-Kulturen bei 37 °C über Nacht inkubiert. Aliquots aus den 12 Mikrotiter-Vertiefungen der Reihen wurden vereinigt, wobei 1 μl Probe für eine PCR-Reaktion mit den vorstehend beschriebenen PCR-Oligonukleotiden eingesetzt wurde, um die einen positiven Klon enthaltende Mikrotiter-Reihe zu identifizieren. Die PCR wurde mit den individuellen Vertiefungen aus der positiven Reihe wiederholt, um einen Klon zu identifizieren, der das E. fibuliger GLA2-Gen trägt und pDP472 genannt wurde.
Eine Restriktionskarte des Plasmids pDP472 wurde unter Verwendung von Standardtechniken angefertigt. Von dieser wurde eine Auswahl von Einzel- und Doppel- Restriktionsverdauungen durchgeführt, wobei die sich ergebenden Fragmente entsprechend der Größe elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen wurden. Diese Membran wurde mit dem radioaktiv markierten GLA2 PCR-Produkt hybridisiert, um das GLA2-Gen auf einem 4,0 kb EioRI-HpaI Restriktions-Fragment innerhalb des 10 kb EioRI-Fragments von pDP472 zu lokalisieren. Dieses 4,0 kb EioRI-HpaI Restriktions-Fragment wurde in pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 1985), 103–119) subkloniert, um den Klon pUC19-Sf-GLA2 zu erhalten und die Insert-DNA wurde in seiner Vollständigkeit von beiden Strängen sequenziert. Die DNA-Sequenz zeigt die Anwesenheit eines Translations-Produktes von 963 Aminosäuren, mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 107.473 Dalton. Das E. fibuliger GLA2 Protein zeigt keine Ähnlichkeit zu dem E. fibuliger GLU1 oder GLA1 Protein, jedoch eine signifikante 82,5%ige Ähnlichkeit (71,5% Identität) zu dem S. occidentalis GAM1 Protein. Die DNA-Sequenz und die des Translationsprodukts des E. frbuliger GLA2 Proteins sind in der nachstehenden Sequenzliste gezeigt (siehe SEQ ID Nr. 1 und Nr. 2).
Beispiel 2 Expression des Endomyces frbuliger GLA2-Gens in Saccharomyces cerevisiae
Für die Expression des E. frbuliger GLA2-Gens in S. cerevisiae entschieden wir uns den starken Galaktose induzierbaren S. cerevisiae GAL1 Promotor aus folgenden Gründen zu verwenden: i) der native E. frbuliger Promotor ist in S. cerevisiae (Daten nicht gezeigt) nicht aktiv (oder nicht stark genug) und ü) durch ein Wachstum der Hefe auf Galaktose würden wir zukünftige Glukose-Analysen des Stärkeabbaus nicht stören.
Die E. frbuliger GLA2 kodierende Region wurde aus dem Plasmid pDP472 mit den Oligonukleotiden SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 unter Verwendung einer Hoch-Genauigkeits Pwo DNA-Polymerase von Boehringer Mannheim (Kat. Nr. 1644947) PCRamplifiziert, unter Verwendung der Amplifikationsbedingungen von 95°C für 30 Sekunden, 40°C für 30 Sekunden, 72°C für 3 Minuten und wiederholt für 30 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification kit (Kat. Nr. 28104) aufgereinigt, wobei ein Aliquot mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und das Fragment auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurde. Das entsprechende 2,9 kb Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt. Dieses Fragment, das vorher mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und dephosphoryliert wurde, wurde dann in das E. coli Plasmid pUC19 ligiert. Ein Insert-enthaltender, positiver Klon wurde in seiner Vollständigkeit sequenziert, um die Genauigkeit/Treue der Amplifikation zu bestätigen.
Der Hefe-Expressionsvektor pDP509 wurde verwendet. Dieses Plasmid besteht aus dem E. coli Vektor pK19, der Kanamyzin-Resistenz und Replikation zur Konstruktion und Plasmid-Amplifikation in E. coli verleiht. Der pDP509 enthält das natürliche 2 Mikron Plasmid der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Hartley et al., Nature, 286 1980), 860–864) für hohe Stabilität, hohe/niedrige Kopienzahl-Replikation in diesem Wirt und das URA3 Gen (Rose et al., Gene, 29 1984), 113–124) für die Selektion des Plasmids in dem geeigneten Wirt. Zu exprimierende Gene werden entweder in die BamHI oder Xho Restriktions-Stellen kloniert, wo die Expression unter der Kontrolle des Hefe GAL1 Galaktose induzierbaren Promotors (Johnston et al., Mol. Cell. Biol., 41984), 1440–1448,) und dem Hefe CYC1 Transkriptions Terminator (Osborne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 861989), 4097–4101) steht. Das Plasmid pDP509 wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut und dephosphoryliert sowie mit dem BamHI-Fragment des E. frbuliger GLA2-Gens ligiert. Das so erhaltene Plasmid wurde pDP514 genannt und ist in 1 gezeigt [gemäß der nachstehenden Methode ist dieses Plasmid von dem transformierten S. cerevisiae YP 107 Stamm (YP 107/pDP514) verfügbar, das bei der C.N.C.M. unter der Bezeichnung CNCM I-1992 hinterlegt wurde].
Der Expressionswirt S. cerevisiae YP107 ist ein diploider Bäcker-Hefe Stamm aus Indien. Dieser Stamm wurde für sein natürliches 2 Mikron-Plasmid nachbehandelt und die Wirts URA3, FURZ (Kern et al., Gene 881990), 149–157) und URKI (Kern et al., Nucleic Acids Res. 181990), 5279–5283) Gene schrittweise zerstört. Dieser Stamm ist nicht zur Uracil-Synthese oder zur Nutzung von Urtdin oder Cystidin aus dem Wachstumsmedium befähigt (Napp et al., Bioengineering 411993), 801–810). Die mehreren Deletionen dieses Stamms wurden durch das Plasmid pDP490 (siehe 2) ergänzt, einem Hefe Zentromer-Plasmid, dass das Hefe FUR1 Gen trägt, wodurch dem Stamm gestattet wird im Wachstumsmedium angereichertes Uracil zu gebrauchen. Dieser Stamm, YP 107 genannt, kann auch wirksam Galaktose fermentieren. Der Stamm YP 107 wurde mit dem Plasmid pDP514 elektrotransformiert (Gysler et al., Biotechnology Techniques, 41990), 285–290) und die Transformanden auf Minimal-Mediumplatten selektioniert (Selektion für das Plasmid URA3 Gen und die Synthese von Uracil durch den Wirt). Diese Transformanden wurden dann auf den gleichen Minimal-Mediumplatten "replica-streaked," die 5-Flururacil (Sigma Kat. Nr. F-6627) enthalten, eine Verbindung die gegenüber FUR1 positiven Stämmen letal selektioniert, folglich gegen die pDP490 tragende Hefe. Das Endergebnis ist der mit dem Plasmid pDP514 transformierte Hefestamm YP107, der bei allen Wachstumsbedingungen stabil ist (Stamm YP 107/pDP514).
Die Hefestämme YP107/pDP514 wurden auf Agarplatten, die 0,67% Stickstoffbase (Difco, Kat. Nr. 0919–15–3), 2% D-Galaktose (Difco, Kat. Nr. 0163–17–4) und 3% lösliche Stärke (Sigma, Kat. Nr. S–9765) enthielten, gelocht. Nach Inkubation für einige Tage bei 30 °C waren schwach sichtbare Halos zu sehen, die die Bereiche des Hefewachstums umgaben.
Die Glukoamylase-Aktivität wurde dann in Kulturüberständen von den S. cerevisiae Transformanden, die trübe Ausfällungen in Stärke-enthaltenden Platten erzeugten analysiert. Die Analyse wird durchgeführt, indem Kulturfiltrat mit löslicher Stärke zur Reaktion gebracht und die freigesetzte Glukose durch kommerziell erhältliche Kits bestimmt wird.
Beispiel 3 Aufreinigung des von Saccharomyces cerevisiae erzeugten Endomyces frbuliger GLA2 rekombinanten Proteins.
Die Hefe YP107/pDP514 aus Beispiel 2 wird in 1 1 Galaktose Minimalmedium (6,7 g Bacto-Hefe Stickstoffbase, 20 g Galaktose) mit Belüftung durch Batch-Kultur in einem Fermenter oder in einer Schüttelflasche bei 30°C gezüchtet bis sich eine starke Kultur entwickelt hat. Die Hefezellen werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und das Kulturmedium auf eine Spharose Q 16/200 Säule aufgetragen. Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen von 20 mM Tris HCl, pH 8,0 gewaschen und die Proteine werden dann in dem gleichen Puffer mit einem NaCl Gradienten von 0 bis 1 M, über 10 Säulenvolumen eluiert. Die Fraktionen werden analysiert durch Inkubation einer 100 μl Probe mit 1% löslicher Stärke, in einem Phosphatpuffer pH 8,0, für 1 St. bei 30 °C und die Freisetzung von Glukose wird mit dem TC D-Glukose Testkit von Boehringer Mannheim gemäß den beiliegenden Instruktionen gemessen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 dialysiert. Die Probe wird dann auf eine Sepharose Q 16/200 Säule in 20 mM Tris-HCl pH 8,0 aufgetragen und dann in dem gleichen Puffer mit einem NaCl-Gradienten von 0 bis 1 M über 20 Säulenvolumen eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wie vorstehend identifiziert und gesammelt. Festes Ammoniumsulfat wird zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben und die Probe wird dann auf eine Phenyl-Sepharose 10/10 Säule aufgetragen und in 50 mM Phosphatpuffer und einem Gradienten von 1 bis 0 M (NH₄)₂SO₄ über 10 Säulenvolumen eluiert. Die aktiven Fraktionen werden identifiziert, vereinigt und konzentriert. Die Probe wird schließlich auf eine Sepharose/Superose 6 16/500 Säule aufgetragen und mit 50 mM Phosphatpuffer pH 7,0 plus 200 mM KCl eluiert. Die aktiven Fraktionen werden identifiziert, vereinigt und bei –20 °C eingefroren.
Beispiel 4 Expression des Endomyces frbuliger GLA2-Gens in Aspergillus oryzae
Die Expression des Endomyces fibuliger GLA2-Gens in Aspergillus oryzae wurde durch Vermehrung der kodierenden Region des GLA2-Gens von Endomyces frbuliger und Klonieren des PCR-Produkts in den Expressions-Vektor pFBY182 erreicht. Das Plasmid pFBY 182, das das pepB Gen als ein EcoRI-XbaI-Fragment unter der Kontrolle des Aspergillus niger pkiA Promotors und Terminators enthält, wurde von Novartis, Schweiz, via Dr. Gabor Jarai, erhalten. Die Nukleotid Sequenz von pFBYl82 ist in der GenBank unter der Accession-Nummer 538698 verfügbar.
Die E. frbuliger GLA2 kodierende Region wurde aus dem Plasmid pDP472 mit den Oligonukleotiden SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 unter Verwendung einer Hoch- Genauigkeits Pwo DNA Polymerase von Boehringer Mannheim (Kat. Nr. 1644947) unter den Amplifikationsbedingungen von 95°C für 30 Sekunden, 40°C für 30 Sekunden, 72°C für 3 Minuten und wiederholt für 30 Zyklen, PCR-vermehrt. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des QIAquick PCR Purification kit (Kat. Nr. 28104) gereinigt, ein Aliquot wurde mit dem Restriktionsenzym EioRI und XbaI (EioRI-Stelle im 5'-Ende und eine XbaI-Stelle in dem 3'-Ende) verdaut, wodurch daher gerichtetes Klonieren in den EioRI-XbaI verdauten Pilz-Expressions-Vektor pFBYl82 gestattet und das Fragment auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wird.
Das entsprechende 2,9 kb Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt. Dieses Fragment wurde dann in das pFBYl82 Plasmid ligiert, das vorher mit dem Restriktionsenzym EioRI und XbaI verdaut und dephosphoryliert wurde.
In dem so erhaltenen Plasmid pDP800 steht die GLA2 Transkription unter der Kontrolle des A. niger pkiA Promotors und Terminators (Graaff Curr. Genet., 22 (1992), 21–27).
Das pDP800 wurde dann in A. oryzae NF1 (pyrG1) durch Ko-Transformation mit dem das A. oryzae pyrG Gen enthaltenden pNFF28 eingebracht. Aspergillus oryzae NF1 (pyrG1) ist ein Urtdin auxotropher Abkömmling von A. oryzae TK3, in dem das pyrG Gen, das für die Oritidin 5'-Phosphatdecarboxylase kodiert, durch gezielte Zerstörung inaktiviert wurde. Das Plasmid pNFF28 enthält das A. oryzae TK3 pyrG Gen. Die Nukleotidsequenz von pNFF28 ist unter der GenBank Acession Nummer Y13811 verfügbar.
Demgemäß wurde A. oryzae NF1 in MM mit 0,1% Hefeextrakt, 50 mM Glukose und 5 mM Glutamin (MM enthält pro Liter 1,5 g KH₂PO₄, 0,5 g MgSO₄× 7H₂O, 0,5 g KCl) gezüchtet. Das Pilzgeflecht wurde durch Sterilfiltration geerntet, einmal in sterilem doppeltdestilliertem Wasser und einmal mit K0,8MC (20 mM MES-HCl pH5,8; 0,8 M KCl; 50 mM CaCl₂) gewaschen. 1,5 g des Pilzgeflechts wurde in 20 ml einer Filter-sterilisierten 5 mg/ml Lösung von Novozym 234 in K0,8MC resuspendiert. Die Pilzgeflecht-Suspension wurde bei 30 °C für 2 Stunden mit leichter Bewegung (120 Upm) inkubiert. Die Protoplasten wurden durch vorsichtiges Resuspendieren mit einer Pipette vom Pilzgeflecht befreit, zweimal mit 20 ml von S1.OTC (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1M Sorbitol; 50 mM CaCl₂) gewaschen und in einer Endkonzentration von 10⁸/ml in S1.OTC resuspendiert. 20 μl DNA wurden mit 200 μl Protoplasten und 50 μl einer 25% PEG 6000 in 10 mM Trts-HCl pH 7,5; 50 mM CaCl₂ gemischt und für 20 min. auf Eis inkubiert. Zu dieser Mischung wurden 2 ml einer 25% PEG 6000 (BDH) in 10 mM Trts-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂ zugegeben, vorsichtig gemischt und für 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml von S 1.OTC wurden zugegeben und 1,0 ml Aliquots wurden mit 5 ml einer 2% niedrig-Schmelzpunkt Agarose (Sigma) in OFNB (osmotisch stabilisierte Pilz Stickstoffbase) gemischt und wurden auf OFNB Agar (Difco) mit 50 mM Glukose und 5 mM Glutamin ausgebracht.
Die so erhaltenen Transformanden wurden auf Minimalplatten (URA3 Selektion) durchmustert. Unter allen Transformanden zeigte Stamm B einen hohen Grad hydrolysierender Spezifität gegenüber Stärke-enthaltendem Material.
Beispiel 5 Funktionale Abkömmlinge der GLA2
Die funktionalen Abkömmlinge der rekombinanten Glukoamylase GLA2 von Endomyces frbuliger (SEQ ID Nr. 2) werden gemäß nach einer bei Adams et al. (EP402450; Genecor) beschriebenen, angepassten Methode hergestellt. In Kürze, die Expressions-Kassette pDP514, die das GLA2-Gen (SEQ ID Nr. 1) enthält, wurde einer chemischen in-vitro Mutagenese durch Hydroxylamin unterworfen. Gemäß Beispiel 2 wurde dann die mutagenisierte DNA verwendet, um S. cerevisiae YP107 zu transformieren. Die Transformanden wurden auf 0,67% Hefe Stickstoffbase (Difco, Kat. Nr. 0119–15–3), 2% D-Galaktose (Difco, Kat. Nr. 0163–17–4) und 3% löslicher Stärke (Sigma, Kat. Nr. S-9765) enthaltende Agarplatten gelocht. Nach Inkubation für einige Tage bei 30°C wurden schwach sichtbare Halos gesehen, die den Bereich des Hefewachstums umgeben. Die funktionalen Abkömmlinge der GLA2 wurden schließlich durch Vergleich der Größe der Halos mit dem durch einen YP 107/pDP514 (die Referenz) erzeugten aufgefunden. Funktionale Abkömmlinge, die größere Halos als die Referenz erzeugen wurden selektioniert. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab Modifikationen in dem ursprünglichen GLA2-Gen, wie beispielsweise eine Deletion, Addition und/oder eine Substitution einiger Aminosäuren. Die Aminosäure-Identität der GLA2 Abkömmlinge gegenüber der ursprünglichen GLA2 ist über 90%.
Beispiel 6
Zur Herstellung einer fermentierten Sojasauce wurde der Aspergillus oryzae Stamm B aus Beispiel 4 verwendet. Demgemäß wird ein Koji durch Mischen des Aspergillus oryzae Stamms B hergestellt, der vorher als eine Koji-Kultur wuchs, mit einer Mischung gekochten Sojas und geröstetem Weizen und Reis, wobei der Koji dann für 3 bis 8 Stunden, bei 45°C bis 60°C, in wässriger Suspension mit den Enzymen, die während der Fermentation der Aspergillus oryzae-Kultur erzeugt wurden hydrolysiert wird, ein Moromi wird hergestellt durch Zugabe einer geeigneten Menge von Natriumchlorid zu der hydrolysierten Koji-Suspension, wobei der Moromi dann fermentiert wird und dann gepresst und die erhaltene Flüssigkeit wird pasteurisiert und abgeklärt.
Beispiel 7
Zur Herstellung einer Geschmackstoff-Sauce wurde der Aspergillus oryzae Stamm B verwendet. Demgemäß wird eine wässrige Suspension einer Mischung aus gekochtem Soja und geröstetem Weizen und Reis hergestellt, wobei die Proteine durch Hydrolyse der Suspension mit einer Protease, bei pH 6,0 bis 11,0 löslich gemacht werden, die Suspension wird dann bei pH 4,6 bis 6,5 Hitze-behandelt und die Suspension wird mit Enzymen aus einer Koji-Kultur angesäuert, die durch Aspergillus oryzae Stamm B fermentiert wurde.
Sequenzliste

Claims

Rekombinante Glucoamylase aus Endomyces fibuliger, das die bei einer der Aminosäuren 1-50 bis zur Aminosäure 963 der Seq-ID Nr.2 startende Aminosäure-Sequenz, oder funktionale Derivate davon mit zumindest 85 % Identität umfasst.
Rekombinante Glycoamylase nach Anspruch 1, die an ein Leit-Peptid geschmolzen ist.
Rekombinante Glycoamylase nach Anspruch 2, die an das Leit-Peptid von Endomyces fibuliger geschmolzen ist, das die bei der Aminosäure 1 bis zu einer der Aminosäuren 15–30 der Seq-ID Nr.2 startende Aminosäure-Sequenz oder funktionale Derivate davon mit zumindest 85 % Identität aufweist.
Leit-Peptid von Endomyces fibuliger, das die bei der Aminosäure 1 bis zu einer der Aminosäuren 15–30 der Seq-ID Nr.2 startende Aminosäure-Sequenz aufweist.
DNA-Molekül, das ein GLA2-Gen umfasst, das das Enzym nach Anspruch 1 kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 5, das ein das GLA2-Gen umfassender Vektor ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 5, worin das GLA2-Gen mit zumindest einer Regulationssequenz funktionsfähig verbunden ist, die die Expression des Gens leiten kann.
DNA-Molekül nach Anspruch 7, worin die Regulationssequenz aus einem anderen Organismus hergeleitet ist als dem, von dem das GLA2 hergeleitet ist.
DNA-Molekül nach Anspruch 5, worin das GLA2-Gen die kodierenden Teile der Nucleotidsequenz Seq-ID Nr. 1 oder funktionale Derivate davon aufgrund der Degeneration des genetischen Codes umfasst.
Zelle, die die Proteine expremiert, nach den Ansprüchen 1–3 durch eine rekombinante Technologie.
Zelle nach Anspruch 10, die Sacchromyces cerrevisiae oder ein Koji-Pilz ist.
Zelle nach Anspruch 11, die die hinterlegte Zelle CNCM I-1992 ist.
Zelle nach Anspruch 10, die das Enzym über-expremieren kann.
Verfahren zum Herstellen des Enzyms nach Anspruch 1, welche umfasst, Kultivieren rekombinanter Zellen nach den Ansprüchen 10–13 in einem geeigneten Wachstumsmedium unter Bedingungen, dass die Zellen das Enzym expremieren, und wahlweise Isolieren des Enzyms in der Form eines Konzentrats.
Verwendung des rekombinanten Proteins nach den Ansprüchen 1–3 oder der Zellen nach den Ansprüchen 10–13, um die Kohlenhydrat-enthaltenden Materialen, vorzugsweise Reis-Kohlenhydrate enthaltende Materialien, zu hydrolysieren.