DE69636475T2 - Alkalische verflüssigende alpha-amylase codierendes gen - Google Patents

Alkalische verflüssigende alpha-amylase codierendes gen Download PDF

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Description

  • Fachgebiet:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gen, das alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, und dessen Fragmente und rekombinante DNA sowie eine Transformante, die das Gen oder Fragmente des Gens trägt.
  • Hintergrund:
  • Alpha-Amylase wurde lange auf einer Vielzahl von Gebieten verwendet. Zum Beispiel wurde sie für die Verzuckerung von Getreide und Kartoffeln in der Fermentationsindustrie, als Stärkepastenentferner in der Textilindustrie, als Verdauungsmittel in der pharmazeutischen Industrie und zur Herstellung von dickflüssigen Malzsirupen in der Lebensmittelindustrie verwendet. Alpha-Amylase ist ein Enzym, das auf stärkeverwandte Polysaccharide wie Amylose und Amylopektin wirkt und einzig die α-1,4-Glucosidbindung des Polysaccharidmoleküls hydrolysiert. Seit 1833, als Payen und Persoz das Enzym zuerst entdeckten, wurden kristalline oder elektrophoretisch homogene Proben von α-Amylase aus einer Reihe unterschiedlicher Quellen, einschließlich Bakterien, Pilze, Pflanzensamen und tierischer Verdauungsdrüsen erhalten.
  • Die Erfinder haben kürzlich entdeckt, dass die Effizienz von Spül- und Waschmitteldetergenzien, besonders für Stärkeschmutz, stark verbessert werden kann, wenn in diesen Detergenzien α-Amylase und ein Debranching-Enzym enthalten sind (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) No. 2-132192). Allerdings zeigen die meisten der zuvor in der Natur gefundenen α-Amylasen maximale und stabile enzymatische Aktivitäten in den neutralen bis sauren pH-Bereichen, arbeiten aber in einer alkalischen Lösung von pH 9-10 kaum. Es existiert nur eine geringe Anzahl von Amylaseenzymen, von denen bekannt ist, dass sie maximale Aktivitäten im alkalischen pH-Bereich zeigen (sogenannte alkalische α-Amylasen und alkaliresistente α-Amylasen). Diese alkalischen α-Amylasen und alkaliresistenten α-Amylasen schließen ein von Bacillus sp. A-40-2 hergestelltes Enzym (Horikoshi, K. et al., Agric. Biol. Chem. 35 (1971), 1783), ein von Bacillus sp. NRRL B-3881 hergestelltes Enzym (Boyer, E., J. Bacteriol. 110 (1972), 992), ein von Streptomyces sp. KSM-9 hergestelltes Enzym (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 61-209528), ein von Bacillus sp. H-167 hergestelltes Enzym (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 62-208278), ein von Bacillus alkalothermophilus A3-8 hergestelltes Enzym (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 2-49584) und ein von Natronococcus sp. Ah-36 hergestelltes Enzym (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai) Nr. 4-211369) ein.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „alkalische α-Amylase" auf α-Amylasen, deren pH-Optima innerhalb des alkalischen pH-Bereichs liegen, während sich der Begriff „alkaliresistente α-Amylase" auf α-Amylasen bezieht, die pH-Optima innerhalb des neutralen bis sauren Bereichs aufweisen, aber deren Aktivitäten im alkalischen Bereich vergleichbar mit denen sind, die bei optimalem pH-Wert erhalten werden, und die außerdem ihre Stabilitäten im alkalischen Bereich bewahren. Mit dem Begriff „neutraler Bereich" ist der pH-Bereich von nicht weniger als 6 und weniger als 8 gemeint und der Begriff „alkalisch" bezeichnet einen pH-Wert, der höher ist als der „neutrale Bereich".
  • Die meisten dieser alkalischen α-Amylasen und alkaliresistenten Amylasen sind sogenannte verzuckernde α-Amylasen, die Stärke oder stärkeverwandte Polysaccharide zu Glucose, Maltose oder Maltotriose abbauen. Als solche verursachen diese Enzyme Probleme, wenn sie als Enzyme für Detergenzien verwendet werden, obwohl sie bei der Herstellung von Zucker vorteilhaft verwendet werden. Also besteht eine Notwendigkeit für sogenannte alkalische verflüssigende α-Amylasen, die Resistenz gegenüber grenzflächenaktiven Mitteln, die in Detergenzien verwendet werden, zeigen und die Stärke oder stärkeverwandte Polysaccharide auf hoch zufällige Weise abbauen. Die hier genannten Erfinder führten eine umfangreiche Suche nach Mikroorganismen fort, die eine alkalische verflüssigende α-Amylase herstellen, die als Detergenskomponente geeignet ist, und sie entdeckten, dass ein alkalophiler Bacillus sp. KSM-AP1378-Stamm, dessen optimaler pH-Wert zum Wachstum im alkalischen Bereich liegt, ein Enzym herstellt, das die Aktivität einer alkalischen verflüssigenden α-Amylase zeigt. Sie klärten auf, dass dieses Enzym als ein Zusatz in Detergenszusammensetzungen zum Waschen von Geschirr und Küchenutensilien und für Detergenszusammensetzungen für Kleidung verwendet werden kann (WO94/26881).
  • Die Mengen des hergestellten Enzyms können durch Verbessern eines Verfahrens zum Züchten eines alkalische verflüssigende α-Amylase herstellenden Mikroorganismus, Bacillus sp. KSM-AP1378, oder durch Ausnutzen von Mutation wirksam erhöht werden. Allerdings muss, um das Enzym vorteilhaft im industriellen Maßstab herzustellen, ein anderer Ansatz gewählt werden.
  • Mengen eines hergestellten Enzyms können unter Verwendung eines gentechnischen Ansatzes erhöht werden und außerdem können die katalytischen Eigenschaften des Enzyms unter Verwendung eines proteintechnischen Ansatzes durch Veränderung des Gens, welches das Enzym codiert, gesteigert werden. Allerdings wurde das Gen, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, bisher nicht erhalten.
  • Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Gen, das alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, und dessen Fragmente, eine Transformante, die rekombinante DNA, umfassend das Gen, trägt, und ein Verfahren zum Herstellen einer alkalischen verflüssigenden α-Amylase unter Verwendung der Transformante bereitzustellen.
  • Die DNA, die das Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, kann außerdem genutzt werden, um Sonden herzustellen, die für die Isolierung zusätzlicher, homologer Gene für alkalische verflüssigende α-Amylase aus anderen Mikroorganismen, verwendet werden sollen. Also ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel der Suche nach und Isolierung von weiteren alkalischen verflüssigenden α-Amylase-Enzymen bereitzustellen.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die hier genannten Erfinder versuchten, aus der chromosomalen DNA eines alkalophilen Bacillus-Stammes ein DNA-Fragment zu isolieren, welches das Gen enthält, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, und waren als ein Ergebnis erfolgreich beim Isolieren eines schätzungsweise 1,8 kb-DNA-Fragmentes, das eine alkalische vergflüssigende α-Amylase codiert. Als sie einen Wirtsorganismus unter Verwendung dieses DNA-Fragmentes, welches mit einem geeigneten Vektor ligiert war, transformierten, wurde bestätigt, dass der resultierende rekombinante Mikroorganismus eine alkalische verflüssigende α-Amylase herstellte. Zudem wurde gefunden, dass sich die Aminosäuresequenz der codierten alkalischen verflüssigenden α-Amylase von denen zuvor bekannter Amylasen unterscheidet. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf diesem Ergebnis erreicht.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Fragment bereit, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine rekombinante DNA, umfassend das vorstehend beschriebene DNA-Fragment, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit, der die vorstehend beschriebene rekombinante DNA enthält, umfassend ein DNA-Fragment, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Herstellen einer alkalischen verflüssigenden α-Amylase durch Züchten des vorstehend beschriebenen transformierten Mikroorganismus und Sammeln des Enzyms bereit.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte eines Fragments des Gens, das eine alkalische verflüssigende Amylase codiert.
  • 2 ist ein Schaubild, das die Konstruktion von pAML100 unter Verwendung eines Fragments des Gens, das eine alkalische verflüssigende Amylase codiert, darstellt.
  • 3 zeigt die Nucleotidsequenzen der verwendeten Primer.
  • 4 ist ein pH-Profil einer von Bacillus sp. KSM-AP1378 produzierten alkalischen verflüssigenden α-Amylase.
  • Günstigste Methode zum Durchführen der Erfindung
  • In der vorliegenden Erfindung kann ein nützlicher Mikroorganismus, der als Donor für ein Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase dient, zum Beispiel Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048, hinterlegt am 24. Juli 1989 im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305 Japan) sein, der ein alkalophiler Bacillus-Stamm ist. Dieser Stamm wurde von den hier genannten Erfindern aus der Erde in der Umgebung der Stadt Tochigi in der Präfektur Tochigi, Japan, isoliert und als ein Stamm, der bedeutende Mengen alkalischer verflüssigender α-Amylase herstellt, identifiziert. Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (1-3; Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan) unter FERM BP-3048 am 8. August 1990 hinterlegt (ursprünglich hinterlegt als P-10886 am 24. Juli 1989).
  • Um chromosomale DNA eines Donor-Mikroorganismus zu erhalten, kann das von Marmur, J. vorgeschlagene Verfahren (J. Mol. Biol., 3 (1961),208) oder das von Saito, H. und Miura, K. vorgeschlagene Verfahren (Biochem. Biophys. Acta, 72 (1963), 619) verwendet werden. Andere ähnliche Verfahren können auch verwendet werden.
  • DNA-Fragmente, umfassend das Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase, werden durch Schneiden der so erhaltenen chromosomalen DNA unter Verwendung von Restriktionsenzymen hergestellt. Restriktionsenzyme, die verwendet werden können, sind nicht spezifisch eingeschränkt, sofern sie das Gen nicht zerstückeln. Das Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase kann auch mittels PCR (Mullis, K.B. und Faloona, F.A., Methods Enzymol., 155 (1987), 335; Saiki, R.K. et al., Science, 239 (1988), 487) erhalten werden. Zum Beispiel kann das Gen erhalten werden durch die Synthese von Primern, welche Sequenzen aufweisen, die denen stromaufwärts des 5'-Terminus und stromabwärts des 3'-Terminus des wesentlichen Bereichs, basierend auf der in Sequenz Nr. 2 beschriebenen Nucleotidsequenz, entsprechen, und nachfolgendes Durchführen der PCR unter Verwendung der chromosomalen DNA eines alkalische verflüssigende α-Amylase herstellenden Mikroorganismus als Matrize. Alternativ kann ein intaktes Gen erhalten werden, indem zuerst durch Verwendung irgendeines Verfahrens ein Fragment des Gens für alkalische verflüssigende α-Amylase aus einem alkalische verflüssigende α-Amylase herstellenden Mikroorganismus erhalten wird, gefolgt von einer PCR, bei der die stromaufwärtigen und stromabwärtigen Bereiche des Genfragments amplifiziert werden.
  • Das so hergestellte genetische Fragment wird dann einer Clonierung unterworfen. Wirt/Vektor-Systeme, die verwendet werden können, sind nicht speziell eingeschränkt, sofern die bakteriellen Wirtsstämme das erfindungsgemäße Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase exprimieren, die rekombinanten DNA-Moleküle in den Wirtsbakterien repliziert werden können und das integrierte Gen stabil beherbergt wird. Zum Beispiel können Mitglieder des EK-Systems, bei denen der Wirt E. coli K-12 ist, und Mitglieder des BS-Systems verwendet werden, bei denen der Wirt Bacillus subtilis Marburg ist. Die Verwendung des EK-Systems, das viele Arten von Vektoren umfasst und welches umfassend genetisch untersucht ist, liefert gute Ergebnisse und wird daher bevorzugt. Spezifische Beispiele für Wirtsbakterien schließen HB101, C600 und JM109 des EK-Systems und BD170, MI112 und ISW1214 des BS-Systems ein. Spezifische Beispiele für Vektoren schießen pBR322 und pUC18 für das EK-System und pUB110 und pHY300PLK für das BS-System ein.
  • Ein rekombinantes Plasmid-DNA-Molekül wird erzeugt durch Spalten eines Vektors mit einem Restriktionsenzym, gefolgt von der Ligierung mit dem vorstehend erwähnten chromosomalen oder PCR-amplifizierten DNA-Fragment. Die Ligierung kann zum Beispiel durch die Verwendung einer DNA-Ligase erreicht werden.
  • Verfahren zum Transformieren von bakteriellen Wirtsstämmen unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls sind nicht speziell eingeschränkt. Zum Beispiel kann im Falle von Wirten des EK-Systems ein Calciumchlorid-Verfahren (Mandel, M. und Higa A., J. Mol. Biol., 53 (1970),159) und im Falle von Wirten des BS-Systems ein Protoplasten-Verfahren (Chang, C. und Cohen, S.N., Mol. Gen. Genet., 168 (1978), 111) verwendet werden. Die Auswahl rekombinanter Mikroorganismen wird wie folgt durchgeführt. Zuerst werden unter Verwendung eines Merkmals, das durch Insertion exogener chromosomaler DNA-Fragmente nicht inaktiviert wird, wie eine Antibiotikumresistenz, die von der Vektor-DNA codiert wird, als Index Mikroorganismen ausgewählt, die mit DNA transformiert wurden, die ein aus einem Vektor hervorgegangenes DNA-Fragment enthält. Zum Beispiel wird in einem spezifischen Fall, in dem pBR322 des EK-Systems als Vektor verwendet wird und ein HindIII-Fragment aus chromosomaler DNA in die HindIII-Schnittstelle von pBR322 insertiert wird, das Tetracyclin-Resistenzgen inaktiviert, wodurch anhand des Wachstums der Transformanten, die Ampicillinresistenz verleihen, ohne eine HindIII-Schnittstelle im Ampicillingen aufzuweisen, eine erste Auswahl durchgeführt werden kann. Nachfolgend werden die ausgewählten Transformanten unter Verwendung von zum Beispiel eines Replikaverfahrens auf Agarplatten, die Stärke enthalten, überführt und dann so gezüchtet, dass sie Kolonien bilden. Durch Anfärbung der Stärke, die in den stärkehaltigen Agarplatten enthalten ist, unter Verwendung einer jodhaltigen Lösung, können rekombinante Zielmikroorganismen ausgewählt werden, da diese um die Kolonien Stärke abbauen.
  • Das in den so erhaltenen rekombinanten Mikroorganismen vorhandene rekombinante DNA-Molekül kann unter Verwendung von Standardverfahren zum Gewinnen von Plasmid- oder Phagen-DNA (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York) extrahiert werden. Wenn Schnittmuster, die durch die Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten werden, mittels Elektrophorese analysiert werden, wird bestätigt, dass das rekombinante DNA-Molekül ein Ligierungsprodukt des Vektor-DNA-Moleküls und eines DNA-Fragments, welches das Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase enthält, ist.
  • Das Gen, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, ist in einem DNA-Fragment von etwa 2,1 kb enthalten, das in der Restriktionsenzymkarte von 1 gezeigt ist, und ist in dem Segment von etwa 1,6 kb vorhanden, das durch den weißen Balken gezeigt ist. Das Gen hat eine als Sequenz Nr. 2 gezeigte Nucleotidsequenz. In dieser Sequenz entsprechen der 5'-Terminus und der 3'-Terminus der linken bzw. der rechten Seite des etwa 2,1 kb-Fragments, das als Sequenz 2 gezeigt ist. In dieser Sequenz wird ein offener Leserahmen (ORF) gefunden der bei Nucleotid 145 mit ATG beginnt und eine aus 516 Aminosäurenresten bestehende Sequenz codiert, die in Sequenz Nr. 1 beschrieben ist. 13 Basen (13 b) stromaufwärts des ORF existiert eine Sequenz AAGGAG, die hochkomplementär zur 3'-terminalen Sequenz der ribosomalen 16S-RNA von Bacillus subtilis ist (McLaughlin, J.R. et al., J. Biol. Chem., 256 (1981), 11283). In einer Region weiter stromaufwärts, die sich über die Nucleotide 9 bis 36 erstreckt, gibt es eine Sequenz TTGAAA ...... 16b ...... TATGGT, die eine hohe Homologie mit der Konsensussequenz eines σA-Typ-Promotors aufweist (Gitt, M.A. et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 7178). Ähnlich befindet sich eine andere σA-Typ-Promotersequenz im Bereich der Nucleotide 95 bis 125. Die Aminosäuresequenz der 10 Aminosäurereste auf der aminoterminalen Seite einer alkalischen verflüssigenden α-Amylase, die aus einer Kultur von Bacillus sp. KSM-AP1378 gereinigt wurde, deckt sich mit der Sequenz, die sich von der 37. Aminosäure erstreckt (Aminosäuren Nr. 37-46 in Sequenz Nr.2), die aus der Nucleotidsequenz des vorliegenden DNA-Fragments abgeleitet wurde.
  • Als die Nucleotidsequenz des erfindungsgemäßen Gens und eine abgeleitete Aminiosäuresequenz mit denen von bislang bekannten α-Amylasen verglichen wurden, wurde bestätigt, dass das vorliegende Gen eine neue Nucleotidsequenz einschließt, wobei die von dem Gen codierte, abgeleitete Aminosäuresequenz sich von denen anderer α-Amylasen wie einer von Bacillus amylolique hergestellten α-Amylase (Takkinen, K. et al., J. Biol. Chem., 258 (1983), 1007), einer von Bacillus stearothermophilus hergestellten verflüssigenden α-Amylase (Nakajima, R. et al., J. Bacteriol., 163 (1985), 401), einer von Bacillus licheniformis hergestellten verflüssigenden α-Amylase (Yuuki, T. et al., J. Biochem., 98 (1985), 1147) oder einer von Bacillus sp. 707 produzierten verflüssigenden α-Amylase (Tsukamoto, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151 (1988), 25) unterscheidet.
  • Ein Beispiel für ein bevorzugtes rekombinantes DNA-Molekül, das den vollständigen Bereich des Gens für alkalische verflüssigende α-Amylase enthält, ist Plasmid pAML100 (2). Dieses rekombinante Plasmid hat eine Größe von 4,4 kb und wird gebildet von einem Fragment, das ein 1,8 kb-Fragment enthält, welches das Gen für alkalische verflüssigende α-Amylase und pUC19 enthält. Ein Beispiel für einen bevorzugten rekombinanten Mikroorganismus, der das rekombinante DNA-Molekül trägt, ist ein E. coli HB101 (pAML100)-Stamm. Dieser Stamm wurde erhalten durch Transformieren des E. coli HB101-Stammes mit dem rekombinanten Plasmid pAML100 unter Verwendung eines Standard-Transformationsverfahrens. Wenn dieser Stamm unter Verwendung eines Mediums, das routinemäßig zum Züchten von E. coli eingesetzt wird, gezüchtet wird, stellt er eine alkalische verflüssigende α-Amylase her. Der optimale Reaktions-pH-Wert des so produzierten Enzyms ist pH 8-9. Dies stimmt gut überein mit dem Aktivitäts-pH-Wert-Beziehungsprofil, das für die alkalische verflüssigende α-Amylase, die von dem bakteriellen Gendonor Stamm Bacillus sp. KSM-AP1378 produziert wird, bestimmt wurde (4).
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sind nicht notwendigerweise nur auf die beschränkt, welche die Aminosäuresequenzen, die in dem nachstehend beschriebenen Sequenzprotokoll gezeigt sind, codieren, sofern sie ein Protein codieren, das die interessierende enzymatische Aktivität zeigt, und sie umfassen DNA-Fragmente, die eine Aminosäuresequenz codieren, in der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, addiert, deletiert, invertiert oder insertiert sind. Ein Beispiel für eine derartige DNA ist eine, die eine Aminosäuresequenz codiert, die äquivalent ist zu der in Sequenz Nr.1 beschriebenen Aminosäuresequenz, von der bis zu 32 Aminosäuren am N-Terminus deletiert wurden.
  • Um unter Verwendung des erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismus eine alkalische verflüssigende α-Amylase herzustellen, wird ein transformierter Mikroorganismus, der das zuvor beschriebene erfindungsgemäße DNA-Fragment trägt, der Züchtung unterworfen. Alternativ kann das DNA-Fragment in eine Reihe von Expressionsvektoren integriert werden, um transformierte Mikroorganismen mit verstärkter Expressionsfähigkeit zu erhalten, gefolgt vom Züchten der resultierenden Transformanten. Außerdem können die transformierten Mikroorganismen unter unterschiedlichen Bedingungen, abhängig von der Identität der Mikroorganismen, gezüchtet werden. So können Züchtungsbedingungen, die für den Wirt geeignet sind, verwendet werden. Um eine alkalische verflüssigende α-Amylase aus der resultierenden Kultur zu sammeln, kann ein Routineverfahren (wie das in WO94/26881 beschriebene Verfahren) verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente können außerdem als Sonden für die Isolierung von homologen Genen für alkalische verflüssigende α-Amylase aus anderen Organismen verwendet werden.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird als Nächstes anhand von Beispielen, die nicht als die Erfindung hierauf beschränkend verstanden werden sollten, detaillierter beschrieben. Konzentrationen in den Beispielen sind alle auf der Basis Gewichts-% angegeben.
  • Beispiel 1:
  • Bacillus sp. KSM-AP1378, der eine alkalische verflüssigende α-Amylase produziert, wurde in 5 ml Medium A (Tabelle 1) eingeimpft und für 24 Stunden einer Schüttelkultur bei 30°C unterworfen.
  • Ein ml der Kultur wurde in 100 ml des gleichen Mediums eingeimpft, gefolgt von einer Schüttelkultur bei 30°C für weitere 12 Stunden. Nachfolgend wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und etwa 1 mg chromosomale DNA wurde in Übereinstimmung mit einem von Saito und Miura vorgeschlagenen Verfahren (Saito, H. und Miura, K., Biochim. Biophys. Acta, 72 (1963), 619) erhalten. Tabelle 1 Zusammensetzung von Medium A
    Lösliche Stärke 1.0 %
    Polypepton 1.0 %
    Hefeextrakt 0.5 %
    KH2PO4 0.1 %
    Na2HPO4·12H2O 0.25 %
    MgSO4·7H2O 0.02 %
    CaCl2·2H2O 0.02 %
    FeSO4·7H2O 0.001 %
    MnCl2·4H2O 0.0001 %
    Na2CO3 1.0 % (getrennt sterilisiert)
  • Beispiel 2:
  • Es ist bekannt, dass viele Mitglieder der Amylase-Familie Regionen I-IV besitzen, in denen die Aminosäuresequenzen zu einem hohen Anteil konserviert sind (Nakajima, R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 23 (1986), 355). Daher wurden die Primer 1 und 2 (1 und 3) entsprechend den Regionen II und IV, basierend auf der Aminosäuresequenz von Region II und der Aminosäuresequenz von Region IV, welche besonders konservierte Regionen innerhalb der Regionen I bis IV bekannter alkalischer verflüssigender α-Amylasen darstellen, synthetisiert. Unter Verwendung der so synthetisierten Primer und von chromosomaler DNA aus KSM-AP1378 (die als Matrize diente) wurde eine PCR durchgeführt (ein Zyklus = 94°C × 1 min + 42°C × 1 min + 60°C × 2 min, 30 Zyklen). Es wurde ein Genfragment von schätzungsweise 0,3 kb (Fragment A), das in 1 gezeigt ist, erhalten und die Nucleotidsequenz dieses Fragments wurde bestimmt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass das vorliegende Fragment eine Aminosäuresequenz codiert, die einen nicht unerheblichen Anteil an Homologie mit der Aminosäuresequenz, welche sich von Region II durch Region IV bekannter verflüssigender Amylasen erstreckt, zeigte.
  • Beispiel 3:
  • Unter Verwendung von Fragment A als Sonde wurde chromosomale DNA von XbaI-gespaltenem KSM-AP1378 einer Southern-Hybridisierung unterworfen. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass es eine Bande gab, die an der Stelle von schätzungsweise 1,0 kb hybridisierte. Ein amplifiziertes Fragment von schätzungsweise 0,7 kb (Fragment B) wurde mittels eines inversen PCR-Verfahrens (Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res., 16 (1988), 81) unter Verwendung von Primern, die von den terminalen Sequenzen von Fragment A synthetisiert wurden (im Bereich von Region II: Primer 3; im Bereich von Region IV: Primer 4), und DNAs, die erhalten worden waren durch intermolekulares Ligieren von XbaI-gespaltener chromosomaler KSM-AP1378-DNA (1), als Matrize erhalten. Die Nucleotidsequenz von Fragment B wurde bestimmt, was zeigte, dass das vorliegende Fragment einen Abschnitt schätzungsweise 0,6 kb stromabwärts von Region IV enthielt. Das vorliegende Fragment enthielt ein Stoppcodon für den ORF, welcher als zugehörig zu alkalische verflüssigende α-Amylase abgeleitet wurde.
  • Beispiel 4:
  • Basierend auf der N-terminalen Aminosäuresequenz (7 Aminosäuren) von alkalischer verflüssigender α-Amylase aus dem Stamm KSM-AP1378 wurde ein Primer entworfen und synthetisiert (3). Unter Verwendung des resultierenden Primers (Primer 5) in Kombination mit dem vorstehend genannten Primer 3 (3) und chromosomaler KSM-AP1378-DNA als Matrize wurde eine PCR durchgeführt, um ein Fragment von schätzungsweise 0,7 kb (Fragment C, 1) zu erhalten, wobei dessen Nucleotidsequenz bestimmt wurde.
  • Beispiel 5:
  • Ein 21 Basen enthaltender Primer, der sich direkt stromabwärts von der Nucleotidsequenz erstreckt, welche die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten Enzyms codiert, wurde synthetisiert (Primer 6). Unter Verwendung der Primer 6 und 7 (1 und 3) und von DNAs, die erhalten worden waren durch intramolekulares Ligieren von HindIII-gespaltener chromosomaler KSM-AP1378-DNA (1), als Matrizen wurde ein inverses PCR-Verfahren durchgeführt, wodurch ein 1,2 kb-Fragment erhalten wurde, in dem stromaufwärts ein 0,8 kb-Fragment (Fragment D) und stromabwärts ein 0,4 kb-PstI-HindIII-Fragment an der HindIII-Schnittstelle ligiert worden waren. Die Nucleotidsequenz der Fragment D Region wurde bestimmt, was das Vorhandensein einer aus 31 Aminosäuren zusammengesetzten Signalsequenz, MKLHNRIISVLLTLLLAVAVLFPYMTEPAQA (von Nr. 1 bis Nr. 31 der Sequenz Nr. 2), einer abgeleiteten SD-Sequenz, zusammengesetzt aus AAGGAG (Nucleotide 127-132; McLaughlin, J.R. et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 7178), und von zwei Arten von abgeleiteten Promotorsequenzen (-35-Sequenz, TTGAAA; -10-Sequenz, TATGGT und -35-Sequenz, TTGACT; -10-Sequenz, TAAATT) offen legte.
  • Beispiel 6:
  • Unter Verwendung von Primer A, der schätzungsweise 0,1 kb stromaufwärts der Promotorsequenz lokalisiert ist, Primer B, der 79 b stromabwärts des Stoppcodons lokalisiert ist, und chromosomaler KSM-AP1378-DNA als Matrize wurde ein Abschnitt von schätzungsweise 1,8 kb zwischen den Primern mittels PCR amplifiziert. Das resultierende amplifizierte Fragment wurde in die SmaI-Schnittstelle von pUC19 inseriert und dann in E. coli HB101 eingebracht. Die Transformante wurde auf LB-Agar-Medium, das 0,4 % Stärkeblau und 15 μg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Kolonien, um die sich transparente Höfe gebildet hatten, wurden als E. coli-Stamm, der verflüssigende α-Amylase herstellte, isoliert. Aus dieser Transformante wurde ein rekombinantes Pasmid hergestellt und es wurde eine Restriktionskarte des Plasmids angefertigt. In der Karte wurde bestätigt, dass ein schätzungsweise 1,8 kb DNA-Fragment (Fragment E), das in 1 gezeigt ist, enthalten ist. Dieses rekombinante Plasmid wurde Plasmid pAML100 genannt (2).
  • Beispiel 7:
  • Der in Beispiel 6 erhaltene rekombinante E. coli wurde für 12 Stunden einer Schüttelkultur in 5 ml eines LB-Flüssigmediums, das 50 μg/ml Ampicillin enthielt, unterworfen. Ein (1) ml der Kultur wurde in 100 ml eines LB-Mediums (das Ampicillin enthielt) eingeimpft, gefolgt von Schüttelkultur bei 37°C für 24 Stunden. Durch Zentrifugationstrennung gesammelte Zellen wurden in Tris-HCl-Puffer (pH 8.0) suspendiert und mittels Ultraschall aufgeschlossen. Nachdem die Zellen ultraschallbehandelt waren, wurden Zelltrümmer mittels Zentrifugationstrennung entfernt und der resultierende Überstand wurde als zellfreier Extrakt verwendet. Als Kontrolle wurde auf ähnliche Weise zellfreier Extrakt des Stammes HB101(pUC19) hergestellt. α-Amylase-Aktivitäten in diesen Extrakten wurden gemessen, indem zuerst bei 50°C für 15 min in einem Reaktionsgemisch, das 50 mM Glycin-NaCl-NaOH Puffer (pH 10) und lösliche Stärke enthielt, eine Reaktion ausgelöst wurde und dann der hergestellte reduzierende Zucker durch das 3,5-Dinitrosalicylsäure-Verfahren quantitativ bestimmt wurde (WO94/26881). Eine Einheit enzymatischer Aktivität wurde definiert als die Proteinmenge, die pro Minute einen Anteil an reduzierendem Zucker, der äquivalent einem μMol Glucose ist, herstellt. Als ein Ergebnis wurde α-Amylase Aktivität in dem zellfreien Extrakt des Stammes HB101(pAML100) nachgewiesen. Es wurde gefunden, dass der optimale Wirkungs-pH-Wert für α-Amylase in den pH-Bereich zwischen 8 und 9 fällt. Dieses Ergebnis stimmt gut mit dem optimalen pH-Wert für verflüssigende α-Amylase überein, die von Bacillus sp. KSM-AP1378 hergestellt wird (4). Für die Messung enzymatischer Aktivitäten wurden die nachstehend in Tabelle 2 gezeigten Puffer verwendet (jeweils 40 mM). Tabelle 2
    Figure 00130001
  • Industrielle Anwendbarkeit:
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Gen, das eine alkalische verflüssigende α-Amylase codiert, die ihre maximale Aktivität im alkalischen pH-Bereich zeigt, sowie einen Mikroorganismus zu erhalten, der ein solches Gen trägt. Deren Verwendung erleichtert die Massenproduktion von alkalischer verflüssigender α-Amylase. Sequenzprotokoll
    Figure 00150001
    Figure 00160001
    Figure 00170001
    Figure 00180001
    Figure 00190001
    Figure 00200001
    Figure 00210001

Claims (7)

  1. DNA-Molekül, dass ein Protein mit der Aktivität der alkalischen verflüssigenden α-Amylase codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) DNA-Molekülen mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment davon, oder (b) DNA-Molekülen, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 codieren.
  2. DNA-Molekül wie in Anspruch 1 definiert, weiterhin umfassend eine Nucleotidsequenz zum Regulieren der Expression eines Gens.
  3. Rekombinante DNA, die das DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
  4. Transformierter Mikroorganismus, der die rekombinante DNA nach Anspruch 3 enthält.
  5. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der Aktivität der alkalischen verflüssigenden α-Amylase, umfassend das Züchten des transformierten Mikroorganismus nach Anspruch 4 und das Isolieren des Proteins mit der Aktivität der alkalischen verflüssigenden α-Amylase, das von dem Mikroorganismus produziert wird.
  6. Rekombinantes DNA-Plasmid pAML100, dass pUC19 ist, welches das wie in SEQ ID NO: 2 beschriebene DNA-Molekül trägt.
  7. Rekombinanter E. coli-Stamm HB101 (pAML100), der E. coli HB101 ist und der das Plasmid pAML100 nach Anspruch 6 enthält.
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