DD272102A1

DD272102A1 - Verfahren zur herstellung von thermostabiler bacillus-beta-1,3-1,4-glukanase

Info

Publication number: DD272102A1
Application number: DD31570688A
Authority: DD
Inventors: Rainer Borriss
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1988-05-12
Filing date: 1988-05-12
Publication date: 1989-09-27
Also published as: DD272102B5

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase die in der Brauindustrie zur Verarbeitung grosser Rohfruchtmengen eingesetzt werden kann, um die Viskositaet der Braumaische erhoehende Glukan-Verbindungen hydrolytisch zu spalten; diese Glukanase muss aber auch oberhalb von 60C ihre Funktionswirksamkeit beibehalten. Dazu wird ohne Antibiotika fuer die Expression eines geeigneten Gens in einem Mikroorganismus der Art Bacillus subtilis oder dgl. gesorgt. Das Gen wird dabei aus einem Donorstamm von Bacillus macerans gewonnen und mittels Vektorplasmid uebertragen. Die Ausbeute hat sich als fuer die industrielle Verwertung geeignet herausgestellt, insbesondere fuer die Brauindustrie. Fig. 3

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-I.S-M-Glukanaso, wobei ein geeignetes Gen für diese Glukanase isoliert und mittels eines Vektors in einem Mikroorganismus-Stamm exprimiert wird und wobei ferner eine stabile Expression dieses Gens gewährleistet ist, ohne daß Zusätze von Antibiotika gebraucht werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Glukanasen werden für die Herstellung verschiedener Nahrungs-, Genuß- und Futtermittel sowie als Hilfsstoffe in der biologischen Forschung eingesetzt, wenn die hydrolytische Spaltung der beta-glykosidischen Bindungen von beta-1,3-1,4-Glukanen beabsichtigt ist; vor allem in der Brauindustrie wird durch .Hen Einsatz solcher pflanzenglukan-hydrolisierender Enzyme die Verarbeitung größerer Rohfruchtmengen, zum Beispiel von Gerste anstelle von Malz, möglich, ohne daß dabei Schwierigkeiten bei der Filtration und Läuterung der Braumaische infolge ungenügend abgebauter, viskositäts-erhöhender Glukan-Verbindungen zu befürchten wären.

Es ist seit langem bekannt, die Viskosität der Brauwürze mit Hilfe von beta-Glukanasen mesophiler Bacillus-Stämme, wie von Bacillus amyloliquefaciens oder von Bacillus subtilis, herabzusetzen/1/. Auch die Verwendung gentechnisch manipulierter Stämme, die das beta-Glukanase-Gen von Bacillus amyloliquefaciens in amplifizierter Form auf einem Vektorplasmid enthalten, ist zur Verbesserung der Ausbeute von mesophiler Glukanase entsprechend einem älteren Vorschlag der gleichen Anmelderin bereits ins Auge gefaßt/2/.

Der Nachteil dieser vorbekannten Glukanasen liegt in ihrer Temperaturempfindlichkeit; sie werden nur in einer frühen Phase des Maischprozesses wirksam, oberhalb 60⁰C aber sind sie nicht mehr aktiv.

Es ist ferner bekannt, daß Bacillus macerans eine beta-Glukanase produziert, die demgegenüber auch über der angegebenen Temperatur noch ihre Wirksamkeit entfaltet/3/; wegen seiner geringen PRoduktivität ist ein solcher Mikroorganismus aber für eine wirtschaftliche Enzym-Produktion völlig ungeeignet.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, eine thermostabile Glukanase der eingangs näher bezeichneten Art in wirtschaftlicher industrieller Herstsllung zu gewinnen.

-ί 272 102 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen Nachteile zu vermeiden und gentechnisch eine Glukanase zu erzeugen, die ein thermostabiles Verhalten oberhalb 60⁰C mit einem produktiven Herstellungsverfahren verbindet. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Gen aus einem Donorstamm von Bacillus macerans gewonnen und unter Verwendung eines Mikroorganismus-Stammes zur Expression gebracht wird, der der Art Bacillus subtilis nahesteht oder angehört.

Die stabile Expression eines Gens, das nicht in der Umgebung von Bacillus subtilis angesiedelt ist, ist in einem Mikroorganismus dieser Art zunächst nicht ru erwarten. Bekanntlich wird die Produktion von Fremdprotein durch die Instabilität rekombinierter Plasmid-DNS in gram-positiven Bakterien und durch den protoolytiscben Abbau des kodierten Gen-Produktes negativ beeinflußt/4/. Wirtschaftlich nutzbar erschien bisher nur die Herstellung von Gen-Produkten mittels manipulierter Bazillen, wenn die verwendeten Gone ous Bacillus subtilis selbst oder einem nahe verwandten Mikroorganismus wie Bacillus amyloliquefaciens isoliert wurden/2/. Hingegen ist der erfindungi.gemäße Gebrauch von Bacillus macerans als Donorstamm unter Lieferung der gewünschten Ausbeute durchaus überraschend, weil Bacillus macerans taxonomisch deutlich von Bacillus subtilis und dessen verwandtem Umkreis abgegrenzt werden muß/5/.

Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Gen für die beta-Glukanase aus einem Donorstamm E138 von Bacillus macerans gewonnen wird. In bekannter Weise ist es zweckmäßig, daß als Vektor ein Vektorplasmid, beispielsweise ein Escherichia-coli-Plasmid pBR 322/6/ oder ein Streptokokken-Plasmid pDB 101 /7/, verwendet wird. Schließlich ist es besonders günstig, wenn die Expression des Gens mittels einer wäßrigen Lösung von Kongorot, mit der der Lichenin enthaltende Agar überflutet ist, nachgewiesen wird. Die von rekombinanten, glukanasebildenden Klonen erzeugten Hydrolyse-Zonen erlauben die schnelle Identifizierung der gesuchten Klone. Mittels dieses Verfahrens isolierte Transformanten von Escherichia coli enthaltenden Bacillus-DNS in einer Größe von 5000 Basenpaaren.

Durch die Subklonierung von Restriktionsfragmenten und die Durchführung unidirektionaler Delegationen mit dem Enzym Exonuklease III kann die das Gen für die beta-Glukanase umgebende Fremd-DNS in bekannter Weise weitgehend entfernt werden/8/. Nach einei Transformation in Escherichia coli kann man zeigen, daß ein DNS-Fragment von 900 Basenpaaren noch beta-Glukanase exprimiert und demzufolge das vollständige Gen für die beta-Glukanase enthalten muß. Die Expressionshöhe der beta-Glukanase ist bei verschiedenen Vektoren durchaus unterschiedlich; auffallenderweise erhält man bei Verwendung des Escherichia-coii-Plasmids pBR 322 und einem DNS-Fragment mit dem Gen für beta-Glukanase eine um etwa 40mal höhere Enzymaktivität, als sie mit dem Donorstamm E138 erzielt wird. Durch Transformation eines Escherichia-coli-Stammes mit einem rekombinanten Vektorplasmid pBR 12/2 (siehe Ausführungsbeispiel) erhält man otwa die gleiche Menge beta-Glukanase wie aus einem Produktionsstamm für mesophile beta-Glukanase von Bacillus amyloliquefaciens BE 20/78/9/. Gereinigte Enzympräparate, die aus dem Kulturfiltrat von Bacillus macerans und aus Escherichia-coli-Zellen mit dem Vektorplasmid pBR 12/2 isoliert werden, haben die gleichen Eigenschaften: bei 65°C und in Gegenwart von Kalziumionen werden 50% der Enzymaktivität nach 40minütiger Inkubation erreicht.

Überraschenderweise ist die Expression des Gens für beta-Glukanase aus einem Donorstamm von Bacillus macerans besonders hoch in einem Stamm von Bacillus subtilis und liegt eiwa 30mal höher als in dem Donorstamm E138 von Bacillus macerans selbst. Deshalb sind für eine wirtschaftliche industrielle Herstellung Mikroorganismus-Stämme besonders geeignet, die mit Bacillus subtilis oder Bacillus otnyloliquefaciens verwandt sind bzw. diese selbst, v.eil sie die beta-Glukanase in das Kulturmedium sekretieren und die mit dem Aufschluß der Zellen in der Praxis unvermeidlich auftretenden Schwierigkeiten wegfallen.

Besondere Sorgen bei der Anwendung gentechnisch manipulierter Mikroorganismus-Stämme bereitet ihre hohe Instabilität. Um ein rekombinantes Vektorplasmid in einer Zelle zu erhalten, ist die Zugabe von Antibiotika in das Kulturmedium eigentlich unumgänglich. Es ist bereits bekannt, daß das Streptokokken-Plasmid pDB 101 in Bacillus subtilis und in ähnlichen Mikroorganismus-Stämmen außerordentlich stabil ist; so wurde es erfolgreich für die Herstellung von bata-Glukanase aus Bacillus amyloliquefaciens in industriellen Mirkoorganismus-Stämmen eingesetzt/2/. Allerdings ist die Sequenz von beta-Glukanase aus Bacillus subtilis und von beta-Glukanase aus Bacillus amyloliquefaciens weitgehend homolog/8/, während sich die Sequenz von beta-Glukanase aus Bacillus macerans sehr deutlich von jenen unterscheidet. Es ist deshalb durchaus überraschend, daß ein DNS-Fragment mit dem Gen der beta-Glukanase aus Bacillus macerans ebenfalls—ohne Selektionsdruck durch ein Antibiotikum — im Kulturmedium stabil erhalten wird.

Für eine ausreichende Absenkung der Viskosität der Braumaische genügt dar Zusatz von erfindungsgemäß hergestellter beta-Glukanase von weniger als 50% der Aktivität mesophiler beta-Glukanasen.

Ausführungsbeispiele

In den folgenden drei Ausführungsbeispielen wird die Erfindung an Hand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: ein DNS-Fragment, Moniert aus Bacillus macerans, das das Gen für beta-Glukanase (abgekürzt: bgl) enthält, Fig. 2: die Struktur der Vektorplasmide pBR 11/4 und pBR 12/2 und die Konstruktion eines Plasmids pUC 19/1 (mit den

Abkürzungen Bl für BamHI, Sill für SaulllA, Pl für Pstl, El für EcoRI und BII für BgIII) und Fig. 3: die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids pBMG 1 aus dem Vektorplasmid pDB 101 und dem Plasmid pUC 19/1 (mit den Abkürzungen HpII für Hpall, HpI für Hpal, Hill für Hindill und IR für ,invertiert repetitive Sequenz').

Betspiel 1

Klonierung des Gens für thermostabile beta-Glukanase Chromosomale DNS von Bacillus macerans F. 138 wird mit einem Restruktionsenzym Sau3A partiell verdaut 20 Mit rogramm

dieser DNS werden mit 5 Mikrogramm des Vektorplasmids pBR 322 (linearisiert mit BamH 1) ligiert und in Esel ierichia-coli-DH5-

Zellen transformiert. Es entstehen etwa 20000 ampicillinresistente Transformanten; davon sind etwa 20% se isitiv gegenüber Tetrazyklin infolge der Inaktivierung des Resistenz-Gens durch inserierte Fremd-DNS. Die Anwesenheit des G ins für die beta- Glukanase wird durch Plattierung der tetrazyklin-empfindlichen Transformanten auf Lichenin-Agar geprüft. Nai h Überschichten

mit 0,1 %iger Lösung von Kongorot werden Kolonien gefunden, die einen Hydrolyse-Hof aufweisen. Ein Teil der ,leta-glukanasepositiven Klone wird isoliert und die Plasmid-DNS präpariert. Die DNS der Vektorplasmide pBR 11/4 ur.'o pBR IJ 72 wird mitverschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, und die erhaltenen DNS-Fragmente werden durch Agarose-Qol-E ektrophoreseanalysiert.

Beide Vektorplasmide haben eine homologe Region mit den Restriktionsorten Pst 1, EcoR 5 und Hpa 1. Zunächst wird eine Subklonierung des EcoR 1 -BgI 2-Fragmentes von pBR 12/2 in ein Vektorplasmid ρ DC19/10/ du rchgeführt, bei

der ein resultierender Klon pUC 19/1 erhalten wird, der eine lichenin-hydrolysierende Aktivität hat, ti'i durch ein ? 600-

Basenpaare-DNS-Fragment kodiert wird. Werden ferner verschiedene Tnile dieses DNC-Fragments weiter subklc niert, dann

ihiy'i sich, daß das Gen für die beta-Qiukanase auf einem 1800 Basenpaare langen Pst 1 -Bg112-Abschnitt des DNS -Fragmenteslokalisiert ist.

Eine unidirektionale Deletion des so gewonnenen Vektorplasmids pUC 19/A wird in folgender Weise durchgeführt.

4 Mikrogramm Plasmid-DNS werden mit den Restriktionsonzymen Kpn 1 und Sa11 verdaut. In einem Gesamtvolumen von10 Mikrogramm wird die Plasmid-DNS mit 1 Mikroliter Exonuklease III bis zu 5 Minuten bei 30"C inkubiert. Jeweils in 1 minütigen

Abständen werden 2 Mikroliter Aliquote aus dem Ansatz entfernt. Jede Probe wird bei 70⁰C mit 3 Mikroliter Wasser gemischt

und anschließend auf Eis gelagert. Zur Entfernung der einzelsträngigen DNS werden 3 Mikroliter S 1-Nuklease zusammen mit15 Mikroliter S1 -Puffer zu jeder Probe hinzugefügt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die

Reaktion durch Zugabe von 5 Mikroliter O,8M-Tris/HCL-Puffer pH 8 gestoppt. Die deletierten Vektorplasmide werden

rezirkularisiert und in Esch6richia coli transformiert. Außer für beta-Glukanase negativen Klonen werden auch dafür positivegefunden mit einem DNS-Insert von nur 850 Basenpaaren (s. Anlage 1). Damit kann das Gen für die beta-Glukanase innerhalbdes zugehörigen DNS-Fragmentes des Vektorplasmids pUC 19/A lokalisiort werden.

Das DNS-Fragment hat !Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Pvuli (Bp.34), Hinfl (Bp.92 und 146), Hpall (3p. 130), Acci

(Bp. 213 und 420), EcoRV (Bp. 376), Mbol (Bp. 505), Haell (Bp.701) und Dral (Bp.789). Subklonierungen mit verschiedenen

Restriktionsfragmenten zeigen, daß die genetische Information für die beta-Glukanase zwischen den Basenpaaren 34 und 789

lokalisiert ist, das heißt, 755 Nukleotide sind ausreichend für die Expression der beta-Glukanase aus Bacillus macerans {Fig. 1).

Nach einer SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese der gereinigten beta-Glukanase ergibt sich desssn Molekulargewicht zu

etwa 23kD. Antikörper, die mittels gereinigter beta-Glukanase von Bacillus amyloliquefaciens hergestellt werden, zeigen keineoder nur oine schwache Kreuzreaktion mit dem Bacillus-macerans-Enzym, ebenso wie Antikörper für beta-Glukanase von

Bacillus macerans nur sehr schwach reaktiv mit dem Bacillus-amyloliquefaciens-Enzym sind. Das Temperatur-Optimum der beta-Glukanase von Bacillus macerans liegt bei 60 bis 65⁰C und damit um etwa 10grd über dem

der mesophilen beta-Glukanäsen von Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens.

Beispiel 2 Expression des Gens für thermostabile beta-Glukanase in Escherichia coli

Zur Überprüfung der Bildungsrate an beta-Glukanase' önnen verschiedene Plasmide, die das Gen für die beta-Glukanase aus Bacillus macerans enthalten (Fig. 2). in Escherichia coli transformiert werden; die transformierten Stämme werden 24 Stunden in einem Glukose-Pepton-Medium — Kulturvolumen: 50ml — bei 37°C und 220min"¹ geschüttelt. Die Aktivität der beta-Glukanase in den durch Ultraschall-Behandlung hergestellten Zellextrakten wird in üblicher Weise mit Lichonin als Substrat bestimmt.

Das Ergebnis ist in Tabelle 1 festgehalten. Eine Enzym-Einheit ist dabei als diejenige Menge Enzym definiert, die eine Freisetzung von reduzierender Substanz — äquivalent einem Mikromol Glukose — bewirkt.

Tabelle 1: Vergleich der Bildung von beta-Glukanase mit verschiedenen Donostämmen und Vektorplasmiden

Donorstamm	Vektorplasmid	beta-Glukanase
		in E/ml h
Bac. macerans E138		0,49
Bac. amylotiquefa-	—	19,3
ciens BE 20/78
Escher, coli DH 5	pBR322	0
Escher, coli DH 5	pBR11/4	28,7
Escher, coli DH 5	PBR12/2	20,0
Escher, coli DH 5	pUC19/1	11,3

Zum Vergleich ist die Aktivität in der Kulturflüssigkeit des Donorstammes E138 von Bacillus macerans und eines zur industriellen Verwendung bestimmten Stammes BE 20/78 von Bacillus amyloliquefaciens/2/ angegeben, die unter gleichen Bedingungen erhalten wird. Es ist zu sehen, daß Stämme mit rekombinanten Vektorplasmiden eine bis zum 40fachen gesteigerte Produktion von beta-Glukanase erreichen im Vergleich zum Donorstamm. Das quantitative Niveau der von den transformierten Escherichiacoli-Stämmen gebildeten Aktivität liegt dabei in der Größenordnung industrieller Bacillus-Produktions-Stämme.

Beispiel 3

Expression des Gens für thermostabile beta-Glukanase in Bacillus subtiüs

Als Vektorplasmid für die Expressen in Bacillus wird das Streptokokken-Plasmid pDB 101 genutzt iFig.3). 0,5 Mikrogramm Plasmld-DNS werden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Hpall geschnitten. Ein DNS-Frngment mit dem Gen für die beta-Glukanase von Bacillus macorans wird durch Verdauung von 0,5 Mikrogramm des Plasmiües pUC 19/1 mit den Restruktionsenzymen EcoRI und Hpal erhalten. Das DNS-Fragment wird ligiert und das ügationsgemisch — das rekombinante Plasmid pBMG 1 — in kompetente Bacillus-subtilis-Zellen transformiert, die nach SPIZIZEN präpariert sind/11 /. Als Wirtsstamm wird ein glukanase-defizienter Stamm BQ314/12/ verwendet. Mit 0,1 Mikrogramm des Ligationsgemsiches werden etwa 100 Transformanten erhalten, von denen stets einige zur Produktion von beta-Glukanase befähigt sind. Die Isolate werrian zur Präparation von Plasmid-DNS verwendet und durch Retransformation und Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Zur Überprüfung der Stabilität der gewonnenen Vektorplasmide wird der Stamm BG 314, der mit einem der Vektorplasmide transformiert ist, 30 Generationen lang in erythromycin-freiem Kulturmedium (Glukose-Nährbouillon) ohne Selektionsdruck kultiviert. Anschließend wird die Kultur in geeignetere Verdünnung auf Nänr-Agar ausplattiert, so daß bis zu 200 Kolonien auf einer Petrischale wachsen. Anschließend wird auf antibiotikumhaltigem Lichenin-Agar — 5 Mikrogramm/ml Erythromyzin — und Nähr-Agar überstempelt. Auf beiden Kulturmedien wächst die gleiche Anzahl Kolonien, die alle auf Lichenin-Agar Lyse-Zonen ausbilden. Nach 30 Generationen Wachstum in antibiotikum-freien Kulturmedium werden 0,5ml in 5CmI Glukose-Nährbouillon überimpft und 24 h bei 37⁰C geschüttelt. Es zeigt sich, daß die Aktivität für beta-Glukanase im Kulturmedium etwa 3,0E/ml h beträgt, gleichgültig, ob dabei Erythromyzin zugesetzt wird oder nicht. Damit liegt aber die Aktivität etwa 6mal höher als in dem Donorstamm E318 von Bacillus macerans.

Literatur

1 Borriss, R., u. Schröder, K.-L, Zbl.Bakt. il. Abt., 136 (1981), S.324-329.

2 DD-PS 226012.

3 Borriss,R.,i-.Zemek,J.,Zbl.Bakt.Il Abt., 136(1981),S.63-69.

4 Borriss, R., Biotechnology Weinheim, 7a, S. 35-62.

5 Sergey's Miinual of Determinative Bacteriology, Baltimore 1974

6 Bolivar, F., et al., Gene 2 (1977), S. 95-113.

7 Behnke, D., u. Ferretti, J. F., Plasmid 4 (1980), S. 130-138.

8 Hofemeister, J., et al., Gene 49 (1986), S. 177-187.

9 Borriss, R., Bäumlein, H., u. Hofemeister, J., Appl. Microbiol. Biotechnol. 22 (1985), S.63-71.

10 Messing, J., Methods Enzymol. 101 (1983), S.20ff.

11 Anagnostopoulos, C./Spizizen, J.,J.Bacteriol. 81 (1961), S. 741-746.

12 Borris, R., et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), S.431-442.

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung von thermostabiler Bacillus-beta-1,3-1,4-Glukanase, wobei

— ein geeignetes Gen für diese Glukanase isoliert und

— mittels eines Vektors in einem Mikroorganismus-Stamm exprimiert wird und wobei ferner

— eine stabile Expression dieses Gens gewährleistet ist, ohne daß Zusätze von Antibiotika gebraucht werden,

dadurch gekennzeichnet, daß

— das Gen aus einem Donarstamm von Bacillus macerans gewonnen und

— unter Verwendung eines Mikroorganismus-Stammes zur Expression gebracht wird, der der Art Bacillus subtilis nahesteht oder angehört.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für die beta-Glukanase aus einem Donarstamm E138 von Bacillus macerans gewonnen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Vektorplasmid verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Escherichia-coü-Plasmid pBR322 verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektor ein Streptokokken-Plasmid pDB 101 verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Gens mittels einer wäßrigen Lösung von Kongorot, mit der der Lichenin enthaltende Agar überflutet ist, nachgewiesen wird.