DD226012A1 - Verfahren zur herstellung von bacillus-beta-1,3-1,4-glucanase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bacillus-b-1,3-1,4-Glucanase durch Anwendung gentechnischer Methoden und den Einsatz der dieser Art gentechnisch manipulierten Mikroorganismen fuer die Herstellung von Bacillus-b-1,3-1,4-Glucanase (im folgenden b-Glucanase) durch submerse Fermentation. Ziel der Erfindung ist es, die Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung dieses Enzymes zu verbessern. Aufgabe der Erfindung ist es, ein gentechnisches Verfahren fuer die Klonierung von b-Glucanase zu entwickeln und durch den Einsatz gentechnisch manipulierter Mikrobenstaemmen eine Erhoehung der b-Glucanaseproduktion zu erreichen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die DNA eines aktiven b-Glucanasebildners isoliert und durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym fragmentiert wird, die DNA-Fragmente mit der DNA eines Vektorphagen gemischt und ligiert werden, die resultierende rekombinante DNA in geeignete Wirtszellen gebracht wird, so dass Phagenklone, die das b-Glucanasegen enthalten, selektiert werden koennen. Nachfolgend werden Subklonierungen des bGlucanasegens auf Plasmidvektoren in verschiedenen Wirtsspecies durchgefuehrt, durch die eine hohe Expression des b-Glucanasegenprodukts erreicht wird und die eine oekonomisch vorteilhafte Produktion dieses Produkts ermoeglichen.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von

Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase durch Anwendung von Methoden

der Gentechnik und den Einsatz der dieser Art gentechnisch manipulierten Mikroorganismen für die Herstellung von Bacillus-ß-1 ,3-1,4-Glucanase (im folgenden ß-Glucanase) durch submerse Fermentation. Das Enzym kann bei der Herstellung von nahrungsmitteln, Genußmitteln und Getränken sowie als Hilfsmittel für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung eingesetzt werden, wenn eine hydrolytische Spaltung der ß-glykosidischen Bindungen von ß-1,3-1, 4-Glucanen.--beabsichtigt wird.

Das Haupteinsatzgebiet der ß-Glucanase ist die Brauereiindustrie, in der durch den Einsatz von Pflanzenglucan-hydrolysierenden Enzymen, die Verarbeitung größerer Rohfruchtmengen, z.B. Gerste, anstelle von Malz ermöglicht wird, ohne daß die sonst üblichen Schwierigkeiten bei der Filtration und Läuterung der Maische infolge ungenügend abgebauter viskositätserzeugender Glueanverbindungen auftreten.

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Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Klonierung von Bacillus-Exoenzymgenen durch Einsatz gentechnischer Methoden, d.h. durch Einsatz von in vitro-Techniken zur Herstellung rekombinanter DNA bestehend aus der DNA des Donor-Organismus und der DNA eines Vektors (z.B. Plasmid oder Phage), ist mehrfach beschrieben worden (Cornells, P., Dignette, CS., WuIn, R.W.C: European Patent Application 0034470 v. 12.02.1981); Yoneda, Y., Graham, S.O., Young, P.E.: Biochem, Biophys. Res. Commun. £1 (1979), 1556-1564, Palva, I.: Gene 19 (1982) 81-87). Dabei fanden Methoden Anwendung wie sie z.B. bei A. Fühler u. W. Heumann in: H.J. Rehm u. G. Reed (Hrsg.) Biotechnology, vol. χ, Verl. Chemie Weinheim 1981, pp 331-354 dargestellt sind. Der Einsatz gentechnischer Methoden zur Konstruktion von Produzentenstämmen mit amplifizierten Exoen— zymgenen beschränkte sich bisher jedoch auf die Klonierung der Bacillus-Alpha-Amylase. Andere Exoenzyme von wirtschaftlicher Bedeutung wie Proteasen oder ß-Glucanase konnten aufgrund der Schlechten Selektierbarkeit der Ezoenzym kodierenden Gene bisher nicht kloniert werden.

Bisher wurde ß-Glucanase durch die submerse Fermentation verschiedener Mikrobenspecies, die unter Einsatz konventioneller genetischer Methoden von Mutation und Selektion für die industrielle Herstellung dieses Enzyms geeignet gemacht wurden, hergestellt (siehe DDH 161 o72) . Jedoch die Leistungsfähigkeit auch der besten darin beschriebenen Produzentenstämme, z.B. des Bacillus amyloliquefaciens ZIEET iO639 ist durch das Vorliegen nur einer - chromosomal determinierten - Genkopie natürlich begrenzt und befriedigt daher die an die industrielle Produktion der ß-Glucanase gesetzten Erwartungen nicht mehr.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung von ß-Glucanase über das durch DDR·-Patent 161 o?2 bekannte Niveau zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisches Verfahren für die Klonierung des ß-Glucanasegens zu entwik-. kein und weiterhin durch den Einsatz gentechnisch bearbeiteter Mikroorganismen, die das ß-Glucanasegen in amplifizierter Form besitzen, eine Erhöhung der ß-Glucanaseproduktion zu erreichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klonierung von Bacillusß-1,3-1,4-Glucanasegenen besteht darin, daß die primäre Klonierung des ß-Glucanasegens - isoliert von der DHA eines hochaktiven Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanaseproduzenten-Stammes in einem Phagen-Vektor-Systern unter Einsatz eines neuen Nachweissystems, das die leichte Selektion von ß-Glueanasegenenthalt enden Phagenklonen gestattet, erfolgt und die nachfolgende Subklonierung des Glucanasegens in einem Plasmid-Vektor-System in verschiedenen Wirtsstämmen durchgeführt wird.

Als Donoren für das zu isolierende Glucanasegen v/erden Stämme der Gattung B. amyloliquefaciens verwendet, da durch diese Species die größten Enzymmengen gebildet werden (Borriss, R. et al., ZbI. Bakt. II Abt. JJ3£ (1980), 435-442). Vorteilhaft wird B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639, ein Stamm, der zur industriellen Herstellung von ß-Glucanase benutzt wird (DDR-Fatent 161 o72) , eingesetzt.

Vorteilhaft für die Selektion des klonierten Gens ist dabei der Einsatz eines Vektorphagen, der relativ große DHA-Fragmente des Donorstammes in sein Genom inserieren kann, so daß sich der Aufv/and für die Überprüfung rekombinanter Klone während des "screenings" nach das Glucanasegen enthaltenden Phagen deutlich vermindern läßt. Als geeignete Vektorphagen stehen dabei sogenannte Insertions- und Replacement-r-Vektorphagen - Derivate des E.coli-Phagen Lambda - zur Verfügung (Blattner, F.R. et al., Science 196 (1977) 166 und Murray, N.E., Brammer, W.J., und Murray, K., Mol.Gen.Genet. 150(1977) 53). So kann der erfindungsgemäß eingesetzte Charon 4a Fremd-DNA-Fragmente in einer Größe von 8-22 kb, d.h. 3-5mal größere Fragmente als sie von Plasmidvektoren aufgenommen werden, zusammen mit den Fragmenten phageneigener DlIA in seinen Kopf-

teil einbauen. Die Bedingungen für die partielle Restriktionsverdauung der DUA des Donorstammes mit Eco HI oder einen anderen Restriktionsenzym werden so gewählt, daß überwiegend Fragmente in der Größenordnung von 15-20 kb gebildet wurden.

Die Expression des Bacillus-ß-Glucanasegens in der Wirtszelle des rekombinanten E.coli-Phagen kann mit dem erfindungsgemäßen nachweissystem demonstriert werden. Für den Nachweis der ß-Glucanase eignet sich das Enzymsubstrat Lichenin, das im Testagar z.T. ungelöst vorliegt und zu einer erheblichen Trübung führt. Infolge der Einwirkung der extrazellulär vorliegenden ß-Glucanase kommt es zu einer hydrolytischen Spaltung des ß-Glucans und damit zu einer Klärung "des" Agärs""~ in der Umgebung der glucanaseproduzierenden Zellen« Dieser Test eignet sich für den qualitativen ß-Glucanasenachweis bei glucanasepositiven und glucanasenegativen Stämmen, ist in dieser Form aber für den Nachweis der Bildung von ß-Glucanase in Wirtszellen, die mit dem rekombinanten das Glucanasegen enthaltenden Phagen infiziert wurden, ungeeignet: Durch den dichten Bakterienrasen-werden· Klarzonen in der Umgebung des Phagenplaques überdeckt. Daher wurde nach der Ausbildung von Plaques, eine Überschichtung der gesamten Petrischale mit 96%igem Äthanol durchgeführt, Infolge der Einwirkung des Alkohols kam es gleichzeitig zu einer Lyse des störenden Bakterienrasens und zu einer weiteren Ausfällung bisher gelöster Licheninmoleküle. Dadurch wurde der Kontrast zwischen Klarzone und umgebenden licheninagar weiter verstärkt. Die von rekombinanten glucanasebildenden Klonen erzeugten Klärungszonen erlaubten eine schnelle Identifizierung der gesuchten Klone.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus dem Einbringen der rekombinanten Phagen-DHA in die Wirtszelle via Transition oder durch das effektivere, von uns bevorzugte "in vitro Terpackungsverfahren" (B Hohn u.K.Murray, Proc.liatl.Acad.Sci. U.S.A., 2± (1977), 325) und der Expression des Bacillus-Gens in der Wirtszelle. Each Überschichtung des Lichenin-Agars mit Äthanol werden Phagenklone mit dem ß-Glucanasegen von der parallel angelegten "Master" -

platte selektiert. Unter den erfindungsgemäßen Bedingungen

wurden unter 750 rekombinanten Phagenklonen zwei Phagenklone, die das ß-Glucanasegen besai3en, selektiert.

Für die Produktion von ß-Glucanase ist die Subklonierung des ß-Glucanasegens auf einem bakteriellen Vektorplasmid vorteilhaft. Dazu wird die, die Bacillus-DHA enthaltende, DM des rekombinanten Phagen mit geeigneten Restriktionsenzymen vollständig verdaut und in kleinere Fragmente (geringer als 5kb), die in bakterielle Plasmide eingebaut werden können, zerlegt. Fach Mischung und Ligation mit der Vektor-Plasmid-DHA werden die resultierenden rekombinanten Plasmide durch Transformation in die Wirtszelle übertragen und das ß-Glucanasegenprodukt zur Expression gebracht. Klone mit rekombinanter, das ß-Glucanasegen enthaltender DHA werden durch

r\ die Ausbildung einer Lysezone um die betreffende Kolonie bei Wachstum auf Licheninagar identifiziert. Pur die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erwies sich der Einsatz eines E.coli Plasmids, z.B. pBR322, als Vektor und die Verwendung eines gut transformierbaren E.coli-Stainmes, z.B. 101 (Boyer, H.W., Roulland-Dussoix, D.J. Mol. Biol. H, 1969, 459-472) als vorteilhaft. Es konnte ein Fragment der Bacillus-DHA, das nur 1/5-der Größe der gesamten auf dem Vektorphagen primär klonierten Premd-DNA betrug und das ß-Glucanasegen enthielt, isoliert werden. Das rekombinante Plasmid bestehend aus dem pBR322-Vektorplasmid und einem 3·5 kb großen Bacillus-DHA-Pragment (pEG-1) wurde am 26.5.1983 in der zentralen Stamm-

(_; Sammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) hinterlegt. E.coli-Zellen, die das betreffende rekombinante Plasmid enthalten, sind zur Expression der ß-Glucanase fähig. Allerdings liegt der größere Teil des gebildeten ß-Glucanaseenzyms intrazellulär bzw. membrangebunden vor, so daß die Isolierung des gewünschten Genprodukts stark erschwert wird. Daher wird im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Reklonierung des ß-Glucanasegens in Bacillus subtilis, der über ein leistungsfähiges Proteinexportsystem verfügt, durchgeführt. Es ist möglich, neben B. subtilis auch andere Bacillus-Species zu verwenden. Dabei sind an den Wirtsorganismus folgende Anforderungen zu stellen:

Der zu transformierende Stamm darf nicht zur Bildung von ß-Glucanase vor Einführung des rekombinanten Plasraids befähigt sein (glucanasenegativ); solche Stämme können nach Mutagenbehandlung von B, subtilis in einer Häufigkeit von

-5

isoliert werden, wenn die Mutagenese nach den von

Balassa, G. MoleoGen.Genetics, 104 (1969), 73-103 angegebenen Bedingungen durchgeführt wird (Borriss, R. u. Hofemeister, J. in Vorb.).

2. Die Bacillus-Wirtsstamm-DNA darf nicht homolog mit dem auf dem Plasmid lokalisierten ß-Glucanasegen sein, da es sonst zur rec-genabhängigen Integration des P-Glucanasegens in das Bakterienchromosom kommen würde und damit ein Gendosis-Effekt-verursacht durch¹ das Vorhandensein mehrerer Genkopien - nicht mehr gewährleistet wäre.

Derivate von B. subtilis 168 (Burkholder & Giles), defekt hinsichtlich der Bildung von ß-Glucanase werden vorteilhaft verwendet: B. subtilis C-5-21 (pur A, bgl 35), B. subtilis EM 125 (r~m~, leu, bgl 35) und B.subtilis ts1(trpC2, bgl ts1). Als Vektorplasmide werden vorteilhaft Staphylokokken-Hybrid-Plasmide, z.B. pBD64 bzw. Streptokokkenplasciide, z.B. pDB101 verwendet. Das rekombinante Plasmid, bestehend aus der Vektor-DHA und dem ß-Glucanasegen, wurde mit den in der Gentechnik üblichen Methoden konstruiert. Die Transformation in den Bacillus-Wirtsstamm erfolgt durch Verwendung kompetenter B.subtilis-Zellen, präpariert nach Anagnostopoulos, Cu. Spizizen, J., J. Bacteriol. 81, (1961), 74-76 oder mittels der Protoplastenmethode nach Chang, Sh. u. Cohen, St.1., Molec.Gen.Genet. 168 (1979), 111-115· Transformierte Zellen weisen neben der, durch das Vektorplasmid determinierten, Antibiotikaresistenz auch eine starke Produktion extrazellulärer ß-Glucanase auf und sind auf antibiotikahaltigem Licheninagar leicht selektierbar.

Diese Stämme besaßen rekombinante Plasmide, die das aus B. amyloliquefaciens isolierte ß-Glucanasegen trugen. Der Nachweis erfolgte durch gelelektrophoretische Methoden. Beispiele sind die Hybridplasmide pBG 2-3 (pBD64x3-5 kb DHA), hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut für

ο 1 7 1 : >

Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) am 26.5.1983 und pBG7 (pDB1O1x3.5 kb DlTA).

Die rekombinanten Bacillus-Plasmide der o.g. Art werden in Bacillus-Stämme mit gegenüber B.subtilis 168 trpC2, erhöhter ß-Glucanaseaktivität transformiert. Vorteilhaft ist es Stämme der B.subtilis 168-Serie, die ein pleiotrop wirkendes Gen wie amyB oder sacU tragen, zu verwenden. Solche Stämme, wie QB 1097, QB 112 wurden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben (Steinmetz, M., F. Kunst u. R. Dedonder. Molec.Gen.Genet. JJS (1976) 281) und sind der Öffentlichkeit zugänglich. Ebenso ist es möglich andere Bacillus-Isolate, die sich durch eine erhöhte Exoenzymbildung auszeichnen, zu verwenden. Ein Beispiel für einen Stamm mit sehr hoher <X-Amylase u. ß-Glucanaseaktivitat ist Bacillus spec.ZF178. Dieser Stamm kann jedoch nur mit dem rekombinanten Streptokokken- · plasmid pBG-7 transformiert werden.

Die Stämme B.subtilis QB112-pBG 2-3 und ZFi78-pBG-7 wurden in der zentralnen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) am 13.6.83 hinterlegt.

Die Überprüfung der mittels des erfindungsgeiaäßen Verfahrens konstruierten mikrobiellen Glucanaseproduzenten ergibt bei submerser Fermentation eine im Vergleich zum als Donorstamm für das klonierte ß-Glucanasegen verwendeten B.amyloliquefaciens ZIMET 10 639 .am dem Faktor 3-10 erhöhte Enzym_. produktion. Gegenüber dem Wirtsstamm für das rekombinante Plasmid B. s.ubtilis 168 wird eine 100-200-fache Steigerung der ß-Glucanasebildung Erreicht· Im Wirtsstamm ist eine 10-12 fache (im Falle von pBG 2-3) bzw. 6-fache (im Falle von pBG-7) Amplifikation des rekombinanten ß-Glucanaseplasmids nachweisbar.

Überraschend wurde gefunden, daß das rekombinante Plasmid pBG-7 in dem Wirtsstamm auch in Abwesenheit des Antibiotikums eine außerordentliche Stabilität aufweist. So verbleibt das Plasmid pBG-7 auch nach mehl· als 30 Passagen ohne Selektionsdruck in dem Wirtsstamm ZF 178. Die dabei gebildete ß-Glucanaseaktivitat liegt etwa 5x höher als sie unter vergleichbaren Bedingungen von industriellen Produktionsstämmen wie B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639 erreicht wird. Weitere Angaben über die Expression des ß-Glucanasegens v.B. amylo-

Λ »Ι Λ

liquefaciens in den verschiedenen Wirts-Vektorsystemen sind der Tabelle 1 zu entnehmen.

Ausführungsbeispiele

Di e_Erfindung soll an nachstehenden Beispielen näher erläutert werden, ohne daß dabei die Erfindung auf die hier aufgeführten Beispiele begrenzt werden soll.

Beispiel 1

Klonierung eines ß-Glucanasegens aus Bacillus amyloliquefa-

Methodische Hilfsmittel:

Restriktionsendonuklease Eco RI, isoliert aus Escherichia ;coli RV 13, spaltet DNA in folgender Weise:

5'... G A A T A C ... 3^f 3'·*. C T T A A G ... 5^f

T4 DJHA Ligase, isoliert aus Escherichia coli 1100, katalysiert die Bildung von Phosphordiesterbingungen zwischen den.nebeneinanderliegenden 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxy1-Enden von doppelsträngiger DSA

Donor Müäraorganismus für DHA-Is öl at en : B. amyloliquefaciens ΖΙΜΞΤ 10639 (DDR-Patent 161 ο72) , hinterlegt am 28.11.1980 in der zentralen Stammsammlung des ZIMET, Jena Phagen Vektor: /t-Charon 4a, Ecο-Replacement Vektor, Klone mit rekombinanter DSA können durch Plattierung auf einen S* coli Wirt auf Laktose-Hachweismedien (z.B. Mc Conkey, EMB, oder X-gal) identifiziert werden (Maniatis et al., Cell 15, 687-701, (1978) Plasmid Vektoren: pBr 322, Ap^R, Tc^E (P. Bolivar et al., Gene 2, 95-113, 1977) '

pBD 64, Km , Cm (T.Gryczan, A.G. Shivakumar, D. Dubnau,

J. Bacteriol 141, 246-253, 1980)

pDB 101, Em^E (D. Behnke, I.P. Perretti, Plasmid £, 130- - 138, 1980) Indikatorstamm für Phagen-Vektor: E. coli DP 50 (P"dapDB lacY~ gal UVR B A thyA nail hs ds sull)

nr

Wirtsstamm für pBr 322: E. eoli HB 101 (hs ds leu pro Iac gal strA thi reoA, H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J.Mol. Biol. ü, 459-472, 1969)

A In vitro Rekombination zwischen Lambda und B. amyloliquefaciens DIiA

Chromoscmale DIIA v.B. amyloliquefaciens ZIMET 10639 wurde nach der Methode von Harris-Warrick, 1975 (R.M. Harris-Warrick et al., Proc. ITatl.Acad.Sci. USA JTJk 2207-2211, 1975) isoliert und durch Zentrifugation im CsCl-Gradienten gereinigt. Aus 500 ml HBY-KuItür (O.D. bei 600 nm: 2.0) wurden 0.5 mg gereinigte DITA erhalten. Für die Partialverdauung der DHA mit der Restriktionsendonuklease Ecο RI erwiesen sich folgende Bedingungen als geeignet: Variante A: 150,ug DHA in 0.6 ml Eco-RI-Puffer (10OmM ITaCl, 50 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol) werden mit 10 Einheiten Eco RI bei 37° 1 Stunde inkubiert. Stop der Reaktion durch Zugabe von 0.5M EDTA (Bndkonzentration im Ansatz: 10 mM) und Abkühlen im Eisbad.

Variante B: 150/Ug DHA werden unter gleichen Bedingungen mit 5 Einheiten Eco RI inkubiert.

Beide Reaktionsansätze werden vereinigt und in einem Saccharosegradienten (15-30$) durch Ultrazentrifugation nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Größe der, in den Fraktionen des Gradienten enthaltenen, DHA-Fragmente wurde durch Elektrophorese in 0.6%iger Agarose bestimmt. Fraktionen mit einem Molekulargewicht zwischen 15-20 kb wurden gesammelt und gegen TE-Puffer dialysiert. Anschließend wurde die Probe durch Ausfällung mit 2,5 Volumenteilen Äthanol konzentriert und das Sediment erneut in TE-Puffer aufgenommen (Endkonzentration: 300-500/Ug/ml). Ligation mit Lambda DHA: 2,5/Ug Lambda Charon 4A DUA-isoliert nach Spaltung mit Eco RI (Größe der "Arme": 19 u. 11 kb) - wurden mit 1.0/Ug Bacillus-DHA (Größe der Fragmente : 15-20 kb) gemischt, in einem Gesamtvolumen von 10/ul Ligationspuffer + 2 mM ATP unter Zusatz von 0.1 E T4-Ligase 16 h bei 10° ligiert.

Die "in vitro" Verpackung der rekombinanten ΠΕΤΑ-Moleküle erfolgte nach Hohn u. Murray, 1877 (B. Hohn u. K. Murray, Proc.Hatl.Acad.Sci. USA, J^_x 3259-3263, 1977) mit 3/Ul des Ligationsgemisches und einer Mischung von zwei komplementären defektiven Phagenextrakten (Gesamtvolumen 30/ul). Die "in vitro" rekonstituierten Ehagenr~treintLälten rekombinante. DHA - bestehend aus Lambda-DUA mit cos-Enden und Bacillus-DHA-iFragmenten- und waren biologisch aktiv, d.h. zur Infektion des E.coli-Wirtsstammes DP 50 und zur Ausbildung von Plaques im Bakterienrasen fähig. Die Effizienz der zur Herstellung rekombinanter Phagen angewandten Methoden wurde folgendermaßen überprüft:

1. Elektrophorese in 0.6%iger Agarose von folgenden Ligations-Ansätzen Je 7/Ul) (a) Phagenextrakte für Verpackung, (b) Phagenextrakte

;. + Phagen-DMA-Arme, Cc) E. eoli-DNA, (d) E. cοIi-DHA + · Phagen-DNA-Arme + Phagenextrakte _r (e) Bacillus-D3ÜA-i5-2O kb zur überprüfung der Ligasewirkung.

2. Phagentiterbestijamung: Die Titerbestimmung erfolgte mit E. coli DP 50 auf 50-Agar (BBY-Agar + 5 mM MgCl₂ + 40 /Ug/ml ghymidin, + 40/Ug/ml Diaminopimelinsäure und 0.5 % Glukose). Durch den Zusatz von Bacillus-DBA im Ligationsgemisch wurde eine signifikante Erhöhung des Phagentiters erreicht: .

Ca) - 10² Cb) 4.2 χ 10³ (c) - 10¹ (d) 9 χ 10⁶/yUg DSA (E.coli) (e) - 3.x 1O⁵ZyUg DHA CBacillus)

3. Test auf X-Gal-Agar: 10yul· einer x-gal-Stammlösung (2%) wurden,:bei 50° in 5 ml DP-50-Grundagar eingemischt. Mehr als 95 % der von Variante e (Bacillus DlTA) gebildeten Plaques waren weiß, stellten also rekombinante Klone dar.

Isolierung von rekombinanten Phagen mit Bacillus-ß-Glucanas e ge η- Ins e r t

20 ml DP 50-Agar wurde mit 200 mg Lichenin 20 min. aufgekocht (1 % Lichenin im Grundagar). In den Überschichtagar 3 ml (1:1 verdünnter DP-56-Agar) wurden 0.5 ml des Indidakatorstammes DP 50 gegeben. Hach Erstarren des Weichagars wurden je 150, der von den rekombinanten Phagen gebildeten, Plaques übertragen und über Uacht bei 37° bebrütet. Paral-

IeI wurde jeder Plaque auf eine zweite Agarplatte übertragen. Nach Ausbildung der Plaques im Bakterienrasen wurde mit Äthanol überschichtet und 1 Stunde bei 4°"entwickelt". Phagenklone mit dem Glucanasegen waren von einer klaren Lysezone, die im trüben Licheninagar deutlich sichtbar wurde, umgeben. Unter 750 Plaques waren zwei glucanasepositive Plaques (G1 und G2) nachweisbar. Einer der beiden Phagenklone (G2) wurde isoliert und für die Herstellung von Einzelplaques verwendet·

Charakterisierung; der G 2 - DNA

Die Isolierung rekombinanter Phagen-DNA erfolgte in folgender Weise-: flach Vereinzelgng des primären glucanasepositiven Klons wurde der Plaque ausgestochen und 5 Stunden in 0,5 ml PSB-Puff er (1C^mM Tris-HCl pBB, 100 mH ITaCl, 1OmM MgCl₂ und 0.05% Gelatine) bei 4° vorsichtig geschüttelt. Wichtig für eine gute elektrophoretische Auftrennung der DNA ist die Verwendung von Agarose in Grund- und VfeLchagar. 0.3 ml des Phagenlysats werden mit 0.3 ml des Wirtsstammes (z.B. DP oder E. coll LE 392) in 10 mM MgCl₂ + 1OmM CaCl₂ gemischt und 0,6 ml des Gemisches werden in 3 ml Weichagar (mit Agarose

anstelle von Agar) über Kacht inkubiert. Unter diesen Bedin-

gungen wird eine nahezu konfluente Lyse des Bakterienrasens erreicht. Pro Petrischale werden 6 ml PSB-Puffer zugesetzt und die Weichagarschicht mit dem Puffer vermischt. Der Puffer mit den Phagen wird durch Zentrifugation bei 5000 U/min., 10 min. von den Zellen des Wirtsstamines befreit. Der Überstand wird 30 min. mit RHase und DBase (je 1yug/ml) bei behandelt. Danach erfolgt die Zugabe von 20 % PEG (5ml) in 2 M UaCl, 10 mM Tris, 100 mM MgCl₂ und 0,05% Gelatine. Hach einer Aufbewahrung von 1 h im Eisbad wird 30 min. bei 6000 U/min, zentrifugiert. Die sedimentierten Phagen werden in 0.5 ml PSB aufgenommen und die Trübung in einer Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert (5', 12000 U/min.). Durch die Zugabe von 5/ul 10 % SDS in 0,5 M EDTA zu 0,5 ml Phagenlysat wird die Phagen-DHA nach 15 min. Inkubation bei 68° freigesetzt. Das weiße Proteinpräzipitat wird nach Phenol-

12.1

"behandlung entfernt. Anschließend wird die DNA mit 1 VoIumenteil Isopropanol bei -70° ausgefällt und nach Zentrifugation in 40/Ul TES-Puffer gelöst. Pur die Restriktionsverdauung der Phagen-DNA werden eingesetzt: 5/Ul RNase (1 ug/ul)," 2,5/Ul Eco-R1 und 13,5 ul Wasser. Nach 4 h bei 37° wird der Ansatz durch Elektrophorese in Q.5%iger Agarose geprüft'. Folgende Fragmente werden erhalten: 2 kb (A), 2,6 kb (B), 3.6 kb (C), 15 kb (4 kb D-Fragment + 11 kb Phagenarm), 19 kb (19 kb Phagenarm) und 34 kb (15 kb- + 19 kb-Fragment). Insgesamt beträgt die Größe der in den Phagen eingebauten Bacillus DIiA 12,2 kb. 3 Schnittstellen für Eco R1 waren nachweisbar. Die anschließend durchgeführte Subklonierung im E.coli-Plasmid pBr 322 ergab, daß sich das Glucanasegen im 3,6 kb großen G-Fragment befindet.

B Reklonierung des Glueanase-Gens in das Plaamid pBR 322

Ligation von Eco R1 verdauter G2-Phagen-DNA mit Eco-R1-verdautem pBR 322: Das Plasmid pBR 322 wird nach Birnboim u. DoIy (H.C. Birnboim, J. DoIy, Hucl.Acid.Res 2» 1513-1523' (1980) isoliert und mit Eco R1 gespalten. Eco RI verdaute Phagen-G2-DNA (4/Ug)werden mit Eco RI verdäutelT~P11äsmi~d^ DUA (T ug) gemischt und ligiert (wie bei A beschrieben). Diese Präparation wurde zur Transformation von E.coli HB T01 ( Kushner, 1978 ) benutzt. Selektion transformierter Klone auf HBY-Agar + 30/Ug Ampicillin. Unter 500 transformierten ApR-Klonen befanden sich drei Kolonien mit niedriger ß-Glucanaseaktivität pEG 2, pSG 3 und ρ EG 4 und ein hoch produzierender ß-Glucanaseklon ρ EG 1. Die Kolonien werden isoliert, gereinigt und zur Gewinnung der rekombinanten Plasmide nach der Methode von Birnboim u. DoIy, 1979 (H.G. Birnboim u. J. DoIy, Uucl.Acids Res. χ, 1513-1523, 1979) in SBY-KuItür angezogen.

Charakterisierung der klonierten Bacillus-DHA

Nach Verdauung mit dem Restriktionsenzym Eco R1 wurde die Größe des klonierten Bacillus-DITA-Fragments in den Plasmiden pEG1 - 4 mit 3»5 - 3?6 kb - übereinstimmend mit dem C-Frag-

ment des rekombinanten Phagen G2 - bestimmt. Durch Doppelver dauung mit den Restriktionsenzymen 3cο R1 und Hinc II wurden neben den zu pBR 322 gehörenden Fragmenten von 0.65 und 0.45 kb zwei Fragmente mit 1,85 kb ("B") und 1,75 kb ("A") erhalten. Die Einzelverdauung mit Hinc II ergibt für die Plaamide pEG 1 und 2 unterschiedliche Ergebnisse:

- pEG1: 2,50 kb ("B" + 0.65) und 2,20 kb ("A" + 0,45)

- pEG2: 2,40 kb (M"-;-+ 0.65) und 2,30 kb ("B" + 0,45)

Diese Ergebnisse weisen auf eine unterschiedliche Orientierung des klonierten Bacillus DHA in den beiden rekombinanten Plasmiden pEG1 und pEG2 hin.

Das Plasmid pEG 1 wurde in der zentralen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und exxperimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) unter der Bezeichnung am 26.05.83 hinterlegt.

C Reklonierung des Glucanase-Gens in die Plasmide pBD 64 und pDB 101

Ligation von 0,5/Ug Eco RI verdautem pBD 64 bzw. pDB 101, 1,5/Ug isoliertes 3,6 kb-Fragment mit dem ß-Glucanasegen von B. amyloliquefaciens in 20 /Ul Ligationspuffer wie bei A beschrieben. Die Transformation der Bacillusstämme erfolgte nach der Protoplasten-Transformationsmethode von Chang u. Cohen, 1979· Als Wirtsstämme für das Ligationsgemisch fanden zunächst glucanasenegative Bacillus subtilis-Stämme, die durch Mutagenbehandlung von B. subtilis 168 bzw. B. subtilis QB 112 (R. Borriss u. J. Hofemeister , in Vorbereitung für Publ.) Verwendung:

1. B. subtilis RM 125 (arg", bgl")

2. B. subtilis C-5-21 (purA~, bgl")

3. B.. subtilis ts1 (trpC2, bgl tsi).

Pro 100 ng eingesetztem Eco-3,5 kb Fragment wurden in Abhängigkeit von den verwendeten Stämmen 20 - 200 antibiotikare-

sistente, d.h. transformierte Klone erhalten. Etwa 10 % die-

R R ser Km - bzw. Em -Kolonien waren zur Expression des ß-Glucanaseenzyms fähig. Die Anwesenheit rekombinanter Plasmide in diesen Stämmen wurde durch Agarose-Gelelektrophorese der iso lierten Plasmide (T.J. Gryczan, S. Contente u. D. Dubnau, J.

ι ο ni/HGQ^I ¹M

-H-

Bacteriol. 134, 318-329, 1973) und Retransformation in die gleichen Wirtsstamme bestätigt. Beispiele für die in dieser Art erhaltenen DITA-Hybridmoleküle sind: pBG 2-3 bestehend aus pBD 64 und 3,6 kb Bacillus-DNA und pGB 7 bestehend aus" pDB 101 und 3,6 kb Bacillus-DHA,

In beiden Plasmiden erfolgte der Einbau der Premd-DIIA am Eco R1-0rt. Das Plasmid pBG 2-3 wurde in der Stammsammlung des Zentralinstituts für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDE, Jena am 26.05.83 unter der Bezeichnung hinterlegt.

Um eine noch höhere Expression des Glucanasegens in Bacillus subtilis zu erhalten, wurden die rekombinanten Plasmide pBG 2-3 und pBG 7-3 durch die Protoplastentransformationsmethode in folgende weitere Stämme transformiert:

4. B. subtilis QB 1097 Camy B⁺, bgl⁺)

5. B. subtilis QB 112 (pap, bgl⁺)

6. B. spec. ZP 178 (prototroph, bgl⁺).

Beispiel 2

Expression der klonierten ß-Glucanase in verschiedenen Bacillus subtilis-Stämmen

Die Expression der auf den Yektorplasmiden pBD 64 (pBG2-3) und pDB 101 (pBG7) klonierten B. amyloliquefaciens-ß-Glucanase in verschiedenen B. subtilis-Wirtsstämmen wurde überprüft. Die Kultivierung erfolgte in Laborschüttelkultüren (Volumen: 50 ml) bei 37° in ABY-Medium folgender Zusammensetzung: 10 g/l Bouillon, 4g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 4 g/l Kochsalz und 100 g/l Maisstärke (verflüssigt mit 1 ml Bg^terien-Amylase, 30 min. bei 60°). Die Dauer der Schüttelkultur betrug 64 h. Die Aktivität'der J3-Glucanase in der Kulturflüssigkeit wurde nach dem .Fachbereichsstandard DDR-TGL 29166/02 mit Lichenin als Substrat bestimmt. Eine Bnzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die eine Freisetzung von reduzierender Substanz, äquivalent einem /uMol Glukose, bewirkt. Stämme mit den rekombinanten Plasmiden wiesen gegenüber dem Donorstamm B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639 eine bis zu 5-fache (pBG 7) bzw. 10 fache (pBG 2-3)

λ — ι * -r J

A ο Λ -1 1 D

Steigerung der ß-Glucanaseaktivität auf. Im Vergleich zum Wirts3tamm B. subtilis 168 wurde eine mehr als 100-fache Steigerung erreicht. Beispiele für die erhaltenen Ergebnisse sind zusammenfassend in der Tabelle 1 dargestellt.

Beispiel 3

Expression der klonierten ß-Glucanase auf dem Plasmid pBG 7

Zur Überprüfung der Stabilität des Plasmids pBG 7 im Stamm B. subtilis ΖΈ 178 wurde folgende Versuchsanordnung durchgeführt: Der das rekonbinante Plasmid pBG 7 enthaltende Stamm wurde in so geringer Zelldichte in das antibiotikafreie Hährmedium (ITBY) eingeimpft, daß bis zum Erreichen der stationären Phase 10 Zellteilungen durchgeführt wurden. Diese Prozedur wurde nochmals zweimal wiederholt, so daß insgesamt 30 Generationen in der Vorkultur ohne Selektionsdruck wuchsen. Die Stabilität des Plasmids wurde anschließend in folgender Weise überprüft: Die Kultur wurde in geeigneter Verdünnung auf ITähragar ausplattiert, so daß 100 200 Kolonien auf einer Petrischale wuchsen. Anschließend wurde auf antibiotikahaltigen Licheninagar (5/Ug/ml) Erythromycin) und Uähragar überstempelt. Auf beiden Medien wuchsen die gleiche Anzahl Kolonien, die alle auf Licheninagar eine gleich gnSe Lysezone ausbildeten. Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn als Y/irtsstamm für das Plasmid pBG 7 der Stamm B. subtilis RM 125 bgl*" (ohne Plasmid glucanasenegativ) eingesetzt wurde: Auch von diesem Stamm wurden nach 30 Generationen Wachstum in erythromycinfreien Medium nur glucanasepositive Kolonien erhalten. Nach 30 Generationen Wachstum in antibiotikafreiem Medium wurden 0,5 ml dieser Vorkultur in 50 ml ABY-Medium, wie in Beispiel 2 beschrieben, überimpft und bei 37° 64 h kultiviert. Parallel dazu wurde eine Kultur, die in einer erythromycinhaltigen Vorkultur angezogen worden war, ebenfalls in ABY + 5/Ug/ml Erythromycin übertragen und kultiviert. Bach Abschluß der Schüttelkultur wurde die ß-Glucanaseaktivität in beiden Kulturen bestimmt und folgendes Ergebnis erhalten:

Kultur A (Anzucht ohne Selektionsdruck, Hauptkultur ABY):

500 B/ml (Stamm: ZP'178 mit pBG.7) Kultur B (Anzucht in IiBY + Erythromycin, Hauptkultur: ABY + Erythromycin): 450 E/ml.

Beispiel 4

Isolierung der von B. subtilis QB 112 (mit Plasmid pBG 2-3) gebildeten B. amyloliquefaciens ß-Glucanase

B. subtilis QB 112 χ pBG 2-3 wurde 64 h bei 37° in ABY unter Schütteln (220 rpm/min.) kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugiert. In 200 ml - Kultürlösung (spezifische Aktivität:lOOOE/ml war die Gesamtaktivität 200 000 Ξ (Aktivitätsbestimmung nach Fachbereichstandard DDR TGL 29 166/02). Das in der Kulturlösung enthaltene Protein wurde mit Ammoniumsulfat bei 80%iger Sättigung gefällt, in 20 ml Aceiatpuffer pH 6 (0.03 M) aufgenommen und gegen den gleichen Puffer 48 h dialysiert. Anschließend wurde gefriergetrocknet. Es wurden insgesamt 620 mg mit einer spezifischen Aktität von 200 E ß-Glucanase/mg erhalten. Dieses Ergebnis entspricht einer Ausbeute von 62 %.

ν u ο · υ/ *|· - 20 -

Tabelle 1 : Expression von ß-Glucanase in Schüttelkultur von B. subtilis mit rekombinanten Plasmiden pBG-2-3 und pBG 7 (ABY-Medium) ^x'

Anzahl Stamm Plasmid Kopien ABY ABY+Ab.

B.	subtilis	168	_	2-3	1	3-4E/ml	nicht gern«
B.	subtilis	EM125-bgl~	-	7	-	QE/ml	nicht gem.
		HM125-bgl~	pBG		12	100 "	200 E/ml
		RM125-bgl~	pBG	2-3	6	20 "	20 "
B.	subtilis	QB112-bgl+	-	7	1	20 "	nicht gem.
		QB112-bgl+	pBG		12	500 "	800 S/ml
		QB112-bgl+	pBG	7	6	210 "	160 "
B.	subtilis	ZP178	-		1	90 "	nicht gem.
		ZP178	pBG		6	540 »	500 E/ml ·
B.	amyloliquefaciens xs:)
			1	90 "	nicht gem.
ZIMET 10639

ri

AnribiOtikakonzentration

oder

: 5/VLg/ml Kanamycin (pBG 2-3) 5/Ug/ml Erythromycin (pBG 7)

xx)

Donorstamm für kloniertes ß-Glucanasegen

. „ _,, τ λ

Claims (20)

Erfindungaanspruch

1. Verfahren zur Herstellung von Bacillus-ß-1,3-1»4-Glucanase, gekennzeichnet dadurch, daß die DHA hochaktiver Produzenten von Bacillus-ß-1,3-1_}4-Glucanase isoliert, durch partielle Restriktionsenzymbehandlung verdaut und die entstandenen Fragmente in die DNA eines Vektorphagen ligiert. und in dem Wirtastamm des Vektorphagen zur Expression gebracht wird, daß die solcherart primär klonierte DHA durch vollständige Restriktionsenzymverdäuung weiter fragmentiert, die erhaltenen Pragmente in ein bakterielles Vektorplasmid ligiert und in dem Wirtsstamm des rekombinanten Plasmids das Glucanasegen zur Expression gebracht wird und daß die solcherart gentechnisch manipulierten Bakterienstämme für die Produktion von ß-Glucanase durch submerse Fermentation eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Donor für die Klonierung des ß-Glucanasegens Stämme der Art B. amyloliquefaciens eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Donor für die Klonierung des ß-Glucanasegens der Stamm B. amyläliquefaciens ΖΙΜΞΤ 10 639 eingesetzt wird.

4. Verfahren—aac-h--Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die DHA des Donorstammes durch partielle Verdauung mit dem Restriktionsenzym Eco RI so zerlegt wird, daß ein großer Anteil der DNA-Pragmente in der Größe zwischen 15-20 kb vorliegt und diese Pragmente mit der DHA des Vektorphagen gemischt und ligiert werden.

5. Verfahren nach Punkt 1 und 4» gekennzeichnet dadurch, daß als Vektorphagen für die primäre Klonierung Derivate des S. coli-Phagen Lambda, die zur Aufnahme von Premd-DHA als Replacement oder Insertions-Vektoren befähigt sind, eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Punkt 1,4 und 5, gekennzeichnet dadurch« daß als Vektorphage für die primäre Klonierung der Lamda-Phage Charon 4A eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Phagen-DHA in die Wirtszelle des Vektorphagen transfor-

miert wird, und die das ß-Giucanasegen enthaltenden Klone dadurch nachgewiesen werd-en, daß nach Lyse der phageninfizierten Wirtszellen auf einem ß-Glucan-haltigem Agar, z.B. Licheninagar eine Überschichtung mit Alkohol erfolgt, so daß der Sakterienrasen in der Umgebung der Phagen-Plaques aufgehellt v/ird und dadurch Klärungszonen in der Umgebung der glucanaseproduzierenden Phagen-Plaques sichtbar gemacht werden.

8. Verfahren nach Punkt 1 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Transformation der E.coli-Wirtszelle durch die Phagen-DIA durch in vitro-Verpackung bzw. Transfektion erfolgt.

9. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die primär klonierte MA mit dem ß-Glucanasegen durch vollständige Restriktions-verdauung weiter fragmentiert, die DHA-Fragmente in einem .Plasmidvektor ligiert und das rekombinante Plasmid mit dem ß-Glucanasegen in einen bakteriellen Wirt transformiert und daß ß-Glucanaseprodukt gebildet wird. '

10. Verfahren nach Punkt 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die primär klonierte DNA auf einem E.coli-Plasmidvektor ligiert und in einem E.coli-Wirtsstamm transformiert und ezprimiert wird.

11. Verfahren nach Punkt 1,9 und 10, gekennzeichnet dadurch_? daß die primär klonierte DHA in ein S.coli-Vektorplasmid ligiert und in E.coli transformiert und exprimiert wird.

12. Verfahren nach Punkt 1 und 9» gekennzeichnet dadurch, daß die primär oder sekundär klonierte DHA mit dem ß-Glucanasegen in einem. Plasmid, das in Bacillus repliziert wird, ligiert und in einem Bacillus-V/irtsstamin transformiert und ezprimiert v/ird.

13· Verfahren nach Punkt 1,9 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß die primär oder sekundär klonierte DHA mit dem GIucanasegen in einem Plasmid, das in Bacillus subtilis repliziert wird, ligiert und in einem Bacillus subtilis Wirtsstamm durch Anwendung der Protoplastentransformationsmethode bzv/. der Plasmid-Transformation in kompetente Zellen transformiert und zur Expression gebracht wird.

YD 5.0/4./83/7 - 19 -

14. Verfahren nach Punkt 1,9,12 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß die primär oder sekundär klonierte DHA mit dem Glucanasegen in das Vektorplasmid pDB 64 ligiert und in glucanasenegativen B. subtilis-Mutantenstämmen RM 125 x pBG 2-3, C-5-21 x pBG 2-3 und ts1 χ pBG 2-3 zur Expression gebracht wird.

15. Verfahren nach Punkt 1,9,12,13 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß die primär oder sekundär klonierte DHA mit dem Glucanasegen in das Streptokokken-Vektorplasmid pDB 101 ligiert und in den glucanasenegativen Bacillus-Stämmen RM 125 und ts1 zur Expression gebracht wird.

16. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß für die Produktion von ß-Glucanase in submerser Fermenta-, tion B. subtilis-Stämme mit rekombinanten Plasmiden bestehend aus der in Bacillus subtilis replizierbaren Vektor-DNA und dem DHA-Fragment mit dem ß-Glucanasegen aus dem Bacillus-Donorstamm eingesetzt werden.

17· Verfahren nach Punkt 1 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß für die Produktion von Bacillus-ß-1,3-1»4-Glucana- _.ae durch submerse Fermentation die rekombinanten Plasmide pBG 2-3, pBG-7 in B. subtilis Wirtszellen zum Einsatz . kommen.

18. Verfahren nach Punkt 1 und 16, gekennzeichnet dadurch daß für die Produktion von Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase durch submerse Fermentation Bacillus subtilis-Wirtsstämme mit pleiotrop auf die Exoenzymbildung wirkenden Genen zum Einsatz kommen.

19. Verfahren nach Punkt 1,16 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß für die Produktion von Bacillus-ß-1 ,3-1,4-Glucanase durch submerse Fermentation Bacillus subtilis QB 112 als Wirtsstamm für pBG2-3 zum Einsatz kommt,

20. Verfahren nach Punkt 1,16 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß für die Produktion von Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase durch submerse Fermentation Bacillus ZF 178 als Wirtsstamm für pBG7 zum Einsatz kommt.

Tabellen