DD226012A1

DD226012A1 - PROCESS FOR PREPARING BACILLUS BETA-1,3-1,4-GLUCANASE

Info

Publication number: DD226012A1
Application number: DD25315583A
Authority: DD
Inventors: Rainer Borriss; Helmut Baeumlein; Juergen Hofemeister; Gerhard Steinborn; Reiner Grunow; Detlev Behnke
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1983-07-18
Filing date: 1983-07-18
Publication date: 1985-08-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Bacillus-b-1,3-1,4-Glucanase durch Anwendung gentechnischer Methoden und den Einsatz der dieser Art gentechnisch manipulierten Mikroorganismen fuer die Herstellung von Bacillus-b-1,3-1,4-Glucanase (im folgenden b-Glucanase) durch submerse Fermentation. Ziel der Erfindung ist es, die Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung dieses Enzymes zu verbessern. Aufgabe der Erfindung ist es, ein gentechnisches Verfahren fuer die Klonierung von b-Glucanase zu entwickeln und durch den Einsatz gentechnisch manipulierter Mikrobenstaemmen eine Erhoehung der b-Glucanaseproduktion zu erreichen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die DNA eines aktiven b-Glucanasebildners isoliert und durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym fragmentiert wird, die DNA-Fragmente mit der DNA eines Vektorphagen gemischt und ligiert werden, die resultierende rekombinante DNA in geeignete Wirtszellen gebracht wird, so dass Phagenklone, die das b-Glucanasegen enthalten, selektiert werden koennen. Nachfolgend werden Subklonierungen des bGlucanasegens auf Plasmidvektoren in verschiedenen Wirtsspecies durchgefuehrt, durch die eine hohe Expression des b-Glucanasegenprodukts erreicht wird und die eine oekonomisch vorteilhafte Produktion dieses Produkts ermoeglichen.The invention relates to a process for the preparation of Bacillus b-1,3-1,4-glucanase by the use of genetic engineering methods and the use of the genetically manipulated microorganisms of this type for the production of Bacillus-b-1,3-1,4- Glucanase (hereinafter b-glucanase) by submerged fermentation. The aim of the invention is to improve the economy of industrial production of this enzyme. The object of the invention is to develop a genetic engineering process for the cloning of b-glucanase and to achieve an increase in b-glucanase production through the use of genetically engineered microbial strains. The essence of the invention is that the DNA of an active b-glucanase-forming agent is isolated and fragmented by digestion with a restriction enzyme, the DNA fragments are mixed with the DNA of a vector phage and ligated, the resulting recombinant DNA is placed in suitable host cells, so that phage clones containing the b-glucanase gene can be selected. Subsequently, subcloning of the bGlucanase gene on plasmid vectors in various host species is carried out, by which a high expression of the b-glucanase gene product is achieved and which enable an economically advantageous production of this product.

Description

/j VD 5.0/4./83/7 / j VD 5.0 / 4. / 83/7

Title of the invention

Verfahren zur Herstellung von Bacillus-ß-1,3-1,4-GlucanaseProcess for producing Bacillus β-1,3-1,4-glucanase

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung vonThe invention relates to a process for the preparation of

Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanase durch Anwendung von MethodenBacillus β-1,3-1,4-glucanase using methods

der Gentechnik und den Einsatz der dieser Art gentechnisch manipulierten Mikroorganismen für die Herstellung von Bacillus-ß-1 ,3-1,4-Glucanase (im folgenden ß-Glucanase) durch submerse Fermentation. Das Enzym kann bei der Herstellung von nahrungsmitteln, Genußmitteln und Getränken sowie als Hilfsmittel für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung eingesetzt werden, wenn eine hydrolytische Spaltung der ß-glykosidischen Bindungen von ß-1,3-1, 4-Glucanen.--beabsichtigt wird.Genetic engineering and the use of this type genetically engineered microorganisms for the production of Bacillus ß-1, 3-1,4-glucanase (hereinafter ß-glucanase) by submerged fermentation. The enzyme can be used in the production of foods, stimulants and beverages as well as auxiliaries for basic and applied research, if a hydrolytic cleavage of the β-glycosidic bonds of β-1,3-1, 4-glucans .-- intends becomes.

Das Haupteinsatzgebiet der ß-Glucanase ist die Brauereiindustrie, in der durch den Einsatz von Pflanzenglucan-hydrolysierenden Enzymen, die Verarbeitung größerer Rohfruchtmengen, z.B. Gerste, anstelle von Malz ermöglicht wird, ohne daß die sonst üblichen Schwierigkeiten bei der Filtration und Läuterung der Maische infolge ungenügend abgebauter viskositätserzeugender Glueanverbindungen auftreten.The main area of use of β-glucanase is the brewing industry, where by using plant glucan-hydrolyzing enzymes, the processing of larger crude fruit quantities, e.g. Barley, instead of malt is made possible, without the usual difficulties in the filtration and refining of the mash due to insufficiently degraded viscosity-generating Glueanverbindungen occur.

VD 5.0/4./83/7VD 5.0 / 4. / 83/7

Characteristic of the known technical solutions

Die Klonierung von Bacillus-Exoenzymgenen durch Einsatz gentechnischer Methoden, d.h. durch Einsatz von in vitro-Techniken zur Herstellung rekombinanter DNA bestehend aus der DNA des Donor-Organismus und der DNA eines Vektors (z.B. Plasmid oder Phage), ist mehrfach beschrieben worden (Cornells, P., Dignette, CS., WuIn, R.W.C: European Patent Application 0034470 v. 12.02.1981); Yoneda, Y., Graham, S.O., Young, P.E.: Biochem, Biophys. Res. Commun. £1 (1979), 1556-1564, Palva, I.: Gene 19 (1982) 81-87). Dabei fanden Methoden Anwendung wie sie z.B. bei A. Fühler u. W. Heumann in: H.J. Rehm u. G. Reed (Hrsg.) Biotechnology, vol. χ, Verl. Chemie Weinheim 1981, pp 331-354 dargestellt sind. Der Einsatz gentechnischer Methoden zur Konstruktion von Produzentenstämmen mit amplifizierten Exoen— zymgenen beschränkte sich bisher jedoch auf die Klonierung der Bacillus-Alpha-Amylase. Andere Exoenzyme von wirtschaftlicher Bedeutung wie Proteasen oder ß-Glucanase konnten aufgrund der Schlechten Selektierbarkeit der Ezoenzym kodierenden Gene bisher nicht kloniert werden.The cloning of Bacillus exoenzyme genes by use of genetic engineering methods, i. the use of in vitro techniques for the production of recombinant DNA consisting of the DNA of the donor organism and the DNA of a vector (eg plasmid or phage) has been described several times (Cornells, P., Dignette, CS., WuIn, RWC: European Patent Application 0034470 v. 12.02.1981); Yoneda, Y., Graham, S.O., Young, P.E .: Biochem, Biophys. Res. Commun. £ 1 (1979), 1556-1564, Palva, I .: Gene 19 (1982) 81-87). Methods were used, such as e.g. at A. feeler u. W. Heumann in: H.J. Rehm u. G. Reed (ed.) Biotechnology, vol. Verl, Verl. Chemie Weinheim 1981, pp 331-354 are shown. However, the use of genetic engineering methods for the construction of producer strains with amplified exoenzym genes has hitherto been restricted to the cloning of Bacillus alpha-amylase. Other exoenzymes of economic importance such as proteases or β-glucanase could not be cloned due to the poor selectability of the genes coding for ezoenzyme.

Bisher wurde ß-Glucanase durch die submerse Fermentation verschiedener Mikrobenspecies, die unter Einsatz konventioneller genetischer Methoden von Mutation und Selektion für die industrielle Herstellung dieses Enzyms geeignet gemacht wurden, hergestellt (siehe DDH 161 o72) . Jedoch die Leistungsfähigkeit auch der besten darin beschriebenen Produzentenstämme, z.B. des Bacillus amyloliquefaciens ZIEET iO639 ist durch das Vorliegen nur einer - chromosomal determinierten - Genkopie natürlich begrenzt und befriedigt daher die an die industrielle Produktion der ß-Glucanase gesetzten Erwartungen nicht mehr.Heretofore, β-glucanase has been produced by the submerged fermentation of various microbial species which have been made suitable for the industrial production of this enzyme using conventional genetic methods of mutation and selection (see DDH 161 o72). However, the performance of even the best producer strains described therein, e.g. of the Bacillus amyloliquefaciens ZIEET iO639 is naturally limited by the presence of only one chromosomally determined gene copy and therefore no longer satisfies the expectations placed on the industrial production of β-glucanase.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, die Wirtschaftlichkeit der industriellen Herstellung von ß-Glucanase über das durch DDR·-Patent 161 o?2 bekannte Niveau zu erhöhen.The aim of the invention is to increase the cost-effectiveness of the industrial production of β-glucanase above the level known by DDR patent 161 o 2.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gentechnisches Verfahren für die Klonierung des ß-Glucanasegens zu entwik-. kein und weiterhin durch den Einsatz gentechnisch bearbeiteter Mikroorganismen, die das ß-Glucanasegen in amplifizierter Form besitzen, eine Erhöhung der ß-Glucanaseproduktion zu erreichen.The invention has for its object to develop a genetic engineering process for the cloning of the ß-glucanase gene. no further and by the use of genetically engineered microorganisms having the ß-glucanase gene in amplified form to achieve an increase in ß-Glucanaseproduktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klonierung von Bacillusß-1,3-1,4-Glucanasegenen besteht darin, daß die primäre Klonierung des ß-Glucanasegens - isoliert von der DHA eines hochaktiven Bacillus-ß-1,3-1,4-Glucanaseproduzenten-Stammes in einem Phagen-Vektor-Systern unter Einsatz eines neuen Nachweissystems, das die leichte Selektion von ß-Glueanasegenenthalt enden Phagenklonen gestattet, erfolgt und die nachfolgende Subklonierung des Glucanasegens in einem Plasmid-Vektor-System in verschiedenen Wirtsstämmen durchgeführt wird.The method according to the invention for cloning bacillus 1,3-1,4-glucanase genes consists in that the primary cloning of the β-glucanase gene - isolated from the DHA of a highly active Bacillus β-1,3-1,4-glucanase producer strain in a phage-vector system using a novel detection system allowing the easy selection of β-glucanase gene-containing phage cloning, and the subsequent subcloning of the glucanase gene in a plasmid vector system is performed in different host strains.

Als Donoren für das zu isolierende Glucanasegen v/erden Stämme der Gattung B. amyloliquefaciens verwendet, da durch diese Species die größten Enzymmengen gebildet werden (Borriss, R. et al., ZbI. Bakt. II Abt. JJ3£ (1980), 435-442). Vorteilhaft wird B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639, ein Stamm, der zur industriellen Herstellung von ß-Glucanase benutzt wird (DDR-Fatent 161 o72) , eingesetzt.Strains of the genus B. amyloliquefaciens are used as donors for the glucanase gene to be isolated since the largest amounts of enzyme are formed by these species (Borriss, R. et al., ZbI. Bakt. II Dept. JJ3 £ (1980), 435 -442). Advantageously, B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639 , a strain which is used for the industrial production of ß-glucanase (DDR-Fatent 161 o72) used.

Vorteilhaft für die Selektion des klonierten Gens ist dabei der Einsatz eines Vektorphagen, der relativ große DHA-Fragmente des Donorstammes in sein Genom inserieren kann, so daß sich der Aufv/and für die Überprüfung rekombinanter Klone während des "screenings" nach das Glucanasegen enthaltenden Phagen deutlich vermindern läßt. Als geeignete Vektorphagen stehen dabei sogenannte Insertions- und Replacement-r-Vektorphagen - Derivate des E.coli-Phagen Lambda - zur Verfügung (Blattner, F.R. et al., Science 196 (1977) 166 und Murray, N.E., Brammer, W.J., und Murray, K., Mol.Gen.Genet. 150(1977) 53). So kann der erfindungsgemäß eingesetzte Charon 4a Fremd-DNA-Fragmente in einer Größe von 8-22 kb, d.h. 3-5mal größere Fragmente als sie von Plasmidvektoren aufgenommen werden, zusammen mit den Fragmenten phageneigener DlIA in seinen Kopf-Advantageous for the selection of the cloned gene is the use of a vector phage, which can insert relatively large DHA fragments of the donor strain into its genome, so that the Aufv / and for the review of recombinant clones during the "screening" for the glucanase gene-containing phages significantly reduce. Suitable vector phages are so-called insertion and replacement r vector phages - derivatives of E. coli phage lambda - available (Blattner, FR et al., Science 196 (1977) 166 and Murray, NE, Brammer, WJ, and Murray, K., Mol. Gen. Gen. 150 (1977) 53). Thus, the Charon 4a used according to the invention can be foreign DNA fragments in a size of 8-22 kb, ie 3-5 times larger fragments than are taken up by plasmid vectors, together with the fragments phage own DlIA in his head

teil einbauen. Die Bedingungen für die partielle Restriktionsverdauung der DUA des Donorstammes mit Eco HI oder einen anderen Restriktionsenzym werden so gewählt, daß überwiegend Fragmente in der Größenordnung von 15-20 kb gebildet wurden.install part. The conditions for partial restriction digestion of the DUA of the donor strain with Eco HI or another restriction enzyme are chosen so that predominantly fragments of the order of 15-20 kb were formed.

Die Expression des Bacillus-ß-Glucanasegens in der Wirtszelle des rekombinanten E.coli-Phagen kann mit dem erfindungsgemäßen nachweissystem demonstriert werden. Für den Nachweis der ß-Glucanase eignet sich das Enzymsubstrat Lichenin, das im Testagar z.T. ungelöst vorliegt und zu einer erheblichen Trübung führt. Infolge der Einwirkung der extrazellulär vorliegenden ß-Glucanase kommt es zu einer hydrolytischen Spaltung des ß-Glucans und damit zu einer Klärung "des" Agärs""~ in der Umgebung der glucanaseproduzierenden Zellen« Dieser Test eignet sich für den qualitativen ß-Glucanasenachweis bei glucanasepositiven und glucanasenegativen Stämmen, ist in dieser Form aber für den Nachweis der Bildung von ß-Glucanase in Wirtszellen, die mit dem rekombinanten das Glucanasegen enthaltenden Phagen infiziert wurden, ungeeignet: Durch den dichten Bakterienrasen-werden· Klarzonen in der Umgebung des Phagenplaques überdeckt. Daher wurde nach der Ausbildung von Plaques, eine Überschichtung der gesamten Petrischale mit 96%igem Äthanol durchgeführt, Infolge der Einwirkung des Alkohols kam es gleichzeitig zu einer Lyse des störenden Bakterienrasens und zu einer weiteren Ausfällung bisher gelöster Licheninmoleküle. Dadurch wurde der Kontrast zwischen Klarzone und umgebenden licheninagar weiter verstärkt. Die von rekombinanten glucanasebildenden Klonen erzeugten Klärungszonen erlaubten eine schnelle Identifizierung der gesuchten Klone.The expression of the Bacillus β-glucanase gene in the host cell of the recombinant E. coli phage can be demonstrated with the detection system of the invention. For the detection of ß-glucanase, the enzyme substrate Lichenin suitable in the test agar z.T. is undissolved and leads to a considerable turbidity. As a result of the action of the extracellularly present β-glucanase, a hydrolytic cleavage of the β-glucan and thus a clarification of the "agar" "~ in the vicinity of the glucanase-producing cells" This test is suitable for the qualitative detection of ß-glucanases in glucanasepositiven and glucanase-negative strains, but is in this form unsuitable for detecting the formation of β-glucanase in host cells infected with the recombinant phage containing the glucanase gene. The dense bacterial lawn covers clearing zones in the vicinity of the phage plaque. Therefore, after the formation of plaques, a coating of the entire Petri dish with 96% ethanol was carried out. As a result of the action of the alcohol, there was a simultaneous lysis of the interfering bacterial lawn and a further precipitation of previously dissolved Licheninmoleküle. This further enhanced the contrast between Klarzone and surrounding licheninagar. The clarification zones generated by recombinant glucanase-forming clones allowed rapid identification of the clones sought.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht aus dem Einbringen der rekombinanten Phagen-DHA in die Wirtszelle via Transition oder durch das effektivere, von uns bevorzugte "in vitro Terpackungsverfahren" (B Hohn u.K.Murray, Proc.liatl.Acad.Sci. U.S.A., 2± (1977), 325) und der Expression des Bacillus-Gens in der Wirtszelle. Each Überschichtung des Lichenin-Agars mit Äthanol werden Phagenklone mit dem ß-Glucanasegen von der parallel angelegten "Master" -The method according to the invention consists of the introduction of the recombinant phage DHA into the host cell via transition or by the more effective, in our preferred "in vitro terpacking method" (B Hohn uK Murray, Proc. Ill. Acad. Sci. USA, 2 ± (1977) , 325) and the expression of the Bacillus gene in the host cell. Each overlay of the lichenin agar with ethanol becomes phage clones with the β-glucanase gene from the parallel "master"

platte selektiert. Unter den erfindungsgemäßen Bedingungenplate selected. Under the conditions of the invention

wurden unter 750 rekombinanten Phagenklonen zwei Phagenklone, die das ß-Glucanasegen besai3en, selektiert.Among 750 recombinant phage clones, two phage clones possessing the β-glucanase gene were selected.

Für die Produktion von ß-Glucanase ist die Subklonierung des ß-Glucanasegens auf einem bakteriellen Vektorplasmid vorteilhaft. Dazu wird die, die Bacillus-DHA enthaltende, DM des rekombinanten Phagen mit geeigneten Restriktionsenzymen vollständig verdaut und in kleinere Fragmente (geringer als 5kb), die in bakterielle Plasmide eingebaut werden können, zerlegt. Fach Mischung und Ligation mit der Vektor-Plasmid-DHA werden die resultierenden rekombinanten Plasmide durch Transformation in die Wirtszelle übertragen und das ß-Glucanasegenprodukt zur Expression gebracht. Klone mit rekombinanter, das ß-Glucanasegen enthaltender DHA werden durchFor the production of β-glucanase, subcloning of the β-glucanase gene on a bacterial vector plasmid is advantageous. For this, the recombinant phage DM containing Bacillus DHA is completely digested with appropriate restriction enzymes and broken down into smaller fragments (less than 5 kb) that can be incorporated into bacterial plasmids. Subject mixture and ligation with the vector plasmid DHA, the resulting recombinant plasmids are transferred to the host cell by transformation and the β-glucanase gene product is expressed. Clones with recombinant, the ß-glucanase gene containing DHA are performed by

r\ die Ausbildung einer Lysezone um die betreffende Kolonie bei Wachstum auf Licheninagar identifiziert. Pur die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erwies sich der Einsatz eines E.coli Plasmids, z.B. pBR322, als Vektor und die Verwendung eines gut transformierbaren E.coli-Stainmes, z.B. 101 (Boyer, H.W., Roulland-Dussoix, D.J. Mol. Biol. H, 1969, 459-472) als vorteilhaft. Es konnte ein Fragment der Bacillus-DHA, das nur 1/5-der Größe der gesamten auf dem Vektorphagen primär klonierten Premd-DNA betrug und das ß-Glucanasegen enthielt, isoliert werden. Das rekombinante Plasmid bestehend aus dem pBR322-Vektorplasmid und einem 3·5 kb großen Bacillus-DHA-Pragment (pEG-1) wurde am 26.5.1983 in der zentralen Stamm- r \ identifies the formation of a zone of lysis around the respective colony when grown on Licheninagar. The use of an E. coli plasmid, eg pBR322, as vector and the use of a well-transformable E. coli strain, eg 101 (Boyer, HW, Roulland-Dussoix, DJ Mol. Biol. H , 1969, 459-472) as advantageous. It was possible to isolate a fragment of Bacillus DHA, which was only 1/5 the size of the total Premd DNA primary cloned on the vector phage and contained the β-glucanase gene. The recombinant plasmid consisting of the pBR322 vector plasmid and a 3 × 5 kb Bacillus-DHA prism (pEG-1) was isolated on 26 May 1983 in the central parent

(_; Sammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) hinterlegt. E.coli-Zellen, die das betreffende rekombinante Plasmid enthalten, sind zur Expression der ß-Glucanase fähig. Allerdings liegt der größere Teil des gebildeten ß-Glucanaseenzyms intrazellulär bzw. membrangebunden vor, so daß die Isolierung des gewünschten Genprodukts stark erschwert wird. Daher wird im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Reklonierung des ß-Glucanasegens in Bacillus subtilis, der über ein leistungsfähiges Proteinexportsystem verfügt, durchgeführt. Es ist möglich, neben B. subtilis auch andere Bacillus-Species zu verwenden. Dabei sind an den Wirtsorganismus folgende Anforderungen zu stellen:(_) Collection of the GDR (Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the AdW of the GDR, Jena) deposited E. coli cells containing the recombinant plasmid in question are capable of the expression of ß-glucanase capable However, the greater part of the Therefore, in the course of the process according to the invention, recloning of the β-glucanase gene into Bacillus subtilis, which has a powerful protein export system, is carried out , in addition to B. subtilis, also other species of Bacillus, the following requirements being imposed on the host:

Der zu transformierende Stamm darf nicht zur Bildung von ß-Glucanase vor Einführung des rekombinanten Plasraids befähigt sein (glucanasenegativ); solche Stämme können nach Mutagenbehandlung von B, subtilis in einer Häufigkeit vonThe strain to be transformed must not be capable of producing ß-glucanase prior to the introduction of the recombinant plasride (glucanase negative); such strains can be obtained after mutagen treatment of B, subtilis at a frequency of

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isoliert werden, wenn die Mutagenese nach den vonbe isolated if the mutagenesis according to the

Balassa, G. MoleoGen.Genetics, 104 (1969), 73-103 angegebenen Bedingungen durchgeführt wird (Borriss, R. u. Hofemeister, J. in Vorb.).Balassa, G. MoleoGen.Genetics, 104 (1969), 73-103 (Borriss, R. and Hofemeister, J. in Vorb.).

2. Die Bacillus-Wirtsstamm-DNA darf nicht homolog mit dem auf dem Plasmid lokalisierten ß-Glucanasegen sein, da es sonst zur rec-genabhängigen Integration des P-Glucanasegens in das Bakterienchromosom kommen würde und damit ein Gendosis-Effekt-verursacht durch¹ das Vorhandensein mehrerer Genkopien - nicht mehr gewährleistet wäre.2. The Bacillus host strain DNA must not be homologous to the localized on the plasmid beta-glucanase, as it would otherwise come to the rec-genabhängigen integration of the P-glucanase in the bacterial chromosome and a gene dosage effect caused by ^1, the Presence of multiple gene copies - no longer guaranteed.

Derivate von B. subtilis 168 (Burkholder & Giles), defekt hinsichtlich der Bildung von ß-Glucanase werden vorteilhaft verwendet: B. subtilis C-5-21 (pur A, bgl 35), B. subtilis EM 125 (r~m~, leu, bgl 35) und B.subtilis ts1(trpC2, bgl ts1). Als Vektorplasmide werden vorteilhaft Staphylokokken-Hybrid-Plasmide, z.B. pBD64 bzw. Streptokokkenplasciide, z.B. pDB101 verwendet. Das rekombinante Plasmid, bestehend aus der Vektor-DHA und dem ß-Glucanasegen, wurde mit den in der Gentechnik üblichen Methoden konstruiert. Die Transformation in den Bacillus-Wirtsstamm erfolgt durch Verwendung kompetenter B.subtilis-Zellen, präpariert nach Anagnostopoulos, Cu. Spizizen, J., J. Bacteriol. 81, (1961), 74-76 oder mittels der Protoplastenmethode nach Chang, Sh. u. Cohen, St.1., Molec.Gen.Genet. 168 (1979), 111-115· Transformierte Zellen weisen neben der, durch das Vektorplasmid determinierten, Antibiotikaresistenz auch eine starke Produktion extrazellulärer ß-Glucanase auf und sind auf antibiotikahaltigem Licheninagar leicht selektierbar.Derivatives of B. subtilis 168 (Burkholder & Giles) defective in the formation of β-glucanase are advantageously used: B. subtilis C-5-21 (pur A, bgl 35), B. subtilis EM 125 (r ~ m ~ , leu, bgl 35) and B.subtilis ts1 (trpC2, bgl ts1). Staphylococcal hybrid plasmids, eg pBD64 or streptococcal plasmids, eg pDB101, are advantageously used as vector plasmids. The recombinant plasmid, consisting of the vector DHA and the β-glucanase gene, was constructed using methods commonly used in genetic engineering. The transformation into the Bacillus host strain is carried out by using competent B.subtilis cells prepared according to Anagnostopoulos, Cu. Spizizen, J., J. Bacteriol. 81, (1961), 74-76 or by the protoplast method of Chang, Sh. u. Cohen, St.1., Molec. Gen. Genet. 168 (1979), 111-115 · In addition to the antibiotic resistance determined by the vector plasmid, transformed cells also show a strong production of extracellular β-glucanase and are readily selectable on antibiotic-containing licheninagar.

Diese Stämme besaßen rekombinante Plasmide, die das aus B. amyloliquefaciens isolierte ß-Glucanasegen trugen. Der Nachweis erfolgte durch gelelektrophoretische Methoden. Beispiele sind die Hybridplasmide pBG 2-3 (pBD64x3-5 kb DHA), hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut fürThese strains had recombinant plasmids carrying the B. amyloliquefaciens isolated β-glucanase gene. The detection was carried out by gel electrophoresis methods. Examples are the hybrid plasmids pBG 2-3 (pBD64x3-5 kb DHA), deposited in the central strain collection of the GDR (Zentralinstitut für

ο 1 7 1 : >ο 1 7 1:>

Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) am 26.5.1983 und pBG7 (pDB1O1x3.5 kb DlTA).Microbiology and Experimental Therapy of the AdW of the GDR, Jena) on May 26, 1983 and pBG7 (pDB1O1x3.5 kb DlTA).

Die rekombinanten Bacillus-Plasmide der o.g. Art werden in Bacillus-Stämme mit gegenüber B.subtilis 168 trpC2, erhöhter ß-Glucanaseaktivität transformiert. Vorteilhaft ist es Stämme der B.subtilis 168-Serie, die ein pleiotrop wirkendes Gen wie amyB oder sacU tragen, zu verwenden. Solche Stämme, wie QB 1097, QB 112 wurden in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben (Steinmetz, M., F. Kunst u. R. Dedonder. Molec.Gen.Genet. JJS (1976) 281) und sind der Öffentlichkeit zugänglich. Ebenso ist es möglich andere Bacillus-Isolate, die sich durch eine erhöhte Exoenzymbildung auszeichnen, zu verwenden. Ein Beispiel für einen Stamm mit sehr hoher <X-Amylase u. ß-Glucanaseaktivitat ist Bacillus spec.ZF178. Dieser Stamm kann jedoch nur mit dem rekombinanten Streptokokken- · plasmid pBG-7 transformiert werden.The recombinant Bacillus plasmids of the above mentioned Species are transformed into Bacillus strains with B.subtilis 168 trpC2, increased β-glucanase activity. It is advantageous to use strains of the B.subtilis 168 series which carry a pleiotropic gene such as amyB or sacU. Such strains as QB 1097, QB 112 have been described in the scientific literature (Steinmetz, M., F. Kunst and R. Dedonder, Molec.Gen.Genet.JJS (1976) 281) and are open to the public. It is also possible to use other Bacillus isolates, which are characterized by an increased Exoenzymbildung. An example of a strain with very high <X-amylase u. β-glucanase activity is Bacillus spec. ZF178. However, this strain can only be transformed with the recombinant streptococcal plasmid pBG-7.

Die Stämme B.subtilis QB112-pBG 2-3 und ZFi78-pBG-7 wurden in der zentralnen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) am 13.6.83 hinterlegt.The strains B.subtilis QB112-pBG 2-3 and ZFi78-pBG-7 were deposited in the central strain collection of the GDR (Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy AdW of the GDR, Jena) on 13.6.83.

Die Überprüfung der mittels des erfindungsgeiaäßen Verfahrens konstruierten mikrobiellen Glucanaseproduzenten ergibt bei submerser Fermentation eine im Vergleich zum als Donorstamm für das klonierte ß-Glucanasegen verwendeten B.amyloliquefaciens ZIMET 10 639 .am dem Faktor 3-10 erhöhte Enzym_. produktion. Gegenüber dem Wirtsstamm für das rekombinante Plasmid B. s.ubtilis 168 wird eine 100-200-fache Steigerung der ß-Glucanasebildung Erreicht· Im Wirtsstamm ist eine 10-12 fache (im Falle von pBG 2-3) bzw. 6-fache (im Falle von pBG-7) Amplifikation des rekombinanten ß-Glucanaseplasmids nachweisbar.Examination of the microbial glucanase producers constructed by means of the method according to the invention gives, on submerged fermentation, B.amyloliquefaciens ZIMET 10 639 used as donor strain for the cloned β-glucanase gene. production. Compared with the host strain for the recombinant plasmid B. s.ubtilis 168, a 100-200-fold increase in β-glucanase formation is achieved. In the host strain, a 10-12-fold (in the case of pBG 2-3) or 6-fold ( in the case of pBG-7) amplification of the recombinant ß-glucanase plasmid detectable.

Überraschend wurde gefunden, daß das rekombinante Plasmid pBG-7 in dem Wirtsstamm auch in Abwesenheit des Antibiotikums eine außerordentliche Stabilität aufweist. So verbleibt das Plasmid pBG-7 auch nach mehl· als 30 Passagen ohne Selektionsdruck in dem Wirtsstamm ZF 178. Die dabei gebildete ß-Glucanaseaktivitat liegt etwa 5x höher als sie unter vergleichbaren Bedingungen von industriellen Produktionsstämmen wie B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639 erreicht wird. Weitere Angaben über die Expression des ß-Glucanasegens v.B. amylo-Surprisingly, it has been found that the recombinant plasmid pBG-7 has an extraordinary stability in the host strain even in the absence of the antibiotic. Thus, the plasmid pBG-7 also remains after flour · as 30 passages without selection pressure in the host strain ZF 178. The ß-glucanase activity formed is about 5 times higher than that achieved under comparable conditions of industrial production strains such as B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639. Further information on the expression of the ß-glucanase gene v.B. amylose

Λ »Ι Λ Λ »Ι Λ

liquefaciens in den verschiedenen Wirts-Vektorsystemen sind der Tabelle 1 zu entnehmen.liquefaciens in the various host-vector systems are shown in Table 1.

embodiments

Di e_Erfindung soll an nachstehenden Beispielen näher erläutert werden, ohne daß dabei die Erfindung auf die hier aufgeführten Beispiele begrenzt werden soll.The invention is to be explained in more detail by the following examples, without the invention being restricted to the examples listed here.

example 1

Klonierung eines ß-Glucanasegens aus Bacillus amyloliquefa-Cloning of a β-glucanase gene from Bacillus amyloliquefa-

Methodische Hilfsmittel:Methodological tools:

Restriktionsendonuklease Eco RI, isoliert aus Escherichia ;coli RV 13, spaltet DNA in folgender Weise:Restriction endonuclease Eco RI, isolated from Escherichia coli RV 13, cleaves DNA in the following manner:

5'... G A A T A C ... 3^f 3'·*. C T T A A G ... 5^f 5 '... GAATAC ... 3 ^f 3' · *. CTTAAG ... 5 ^f

T4 DJHA Ligase, isoliert aus Escherichia coli 1100, katalysiert die Bildung von Phosphordiesterbingungen zwischen den.nebeneinanderliegenden 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxy1-Enden von doppelsträngiger DSAT4 DJHA ligase, isolated from Escherichia coli 1100, catalyzes the formation of phosphodiester bonds between the 5'-phosphate and 3'-hydroxy1 ends of double-stranded DSA

Donor Müäraorganismus für DHA-Is öl at en : B. amyloliquefaciens ΖΙΜΞΤ 10639 (DDR-Patent 161 ο72) , hinterlegt am 28.11.1980 in der zentralen Stammsammlung des ZIMET, Jena Phagen Vektor: /t-Charon 4a, Ecο-Replacement Vektor, Klone mit rekombinanter DSA können durch Plattierung auf einen S* coli Wirt auf Laktose-Hachweismedien (z.B. Mc Conkey, EMB, oder X-gal) identifiziert werden (Maniatis et al., Cell 15, 687-701, (1978) Plasmid Vektoren: pBr 322, Ap^R, Tc^E (P. Bolivar et al., Gene 2, 95-113, 1977) 'Donor Müäraorganism for DHA-Is oil at: B. amyloliquefaciens ΖΙΜΞΤ 10639 (DDR patent 161 ο72), deposited on 28.11.1980 in the central strain collection of ZIMET, Jena phages Vector: / t-Charon 4a, Eco Replacement Vector, Clones with recombinant DSA can be identified by plating on a S * coli host on lactose Hachwe media (eg, McConkey, EMB, or X-gal) (Maniatis et al., Cell 15, 687-701, (1978) Plasmid vectors: pBr 322, Ap ^R , Tc ^E (P. Bolivar et al., Gene 2, 95-113, 1977).

pBD 64, Km , Cm (T.Gryczan, A.G. Shivakumar, D. Dubnau,pBD 64, Km, Cm (T.Gryczan, A.G. Shivakumar, D. Dubnau,

J. Bacteriol 141, 246-253, 1980)J. Bacteriol 141, 246-253, 1980)

pDB 101, Em^E (D. Behnke, I.P. Perretti, Plasmid £, 130- - 138, 1980) Indikatorstamm für Phagen-Vektor: E. coli DP 50 (P"dapDB lacY~ gal UVR B A thyA nail hs ds sull)pDB 101, Em ^E (D. Behnke, IP Perretti, Plasmid £, 130-138, 1980) phage vector indicator strain: E. coli DP 50 (P "dapDB lacY ~ gal UVR BA thyA nail hs ds sull)

nr No

Wirtsstamm für pBr 322: E. eoli HB 101 (hs ds leu pro Iac gal strA thi reoA, H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J.Mol. Biol. ü, 459-472, 1969)Host strain for pBr 322: E. coli HB 101 (hs ds leu per Iac gal strA thi reoA, H.W. Boyer, D. Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol., 459-472, 1969)

A In vitro Rekombination zwischen Lambda und B. amyloliquefaciens DIiAA In vitro recombination between lambda and B. amyloliquefaciens DIiA

Chromoscmale DIIA v.B. amyloliquefaciens ZIMET 10639 wurde nach der Methode von Harris-Warrick, 1975 (R.M. Harris-Warrick et al., Proc. ITatl.Acad.Sci. USA JTJk 2207-2211, 1975) isoliert und durch Zentrifugation im CsCl-Gradienten gereinigt. Aus 500 ml HBY-KuItür (O.D. bei 600 nm: 2.0) wurden 0.5 mg gereinigte DITA erhalten. Für die Partialverdauung der DHA mit der Restriktionsendonuklease Ecο RI erwiesen sich folgende Bedingungen als geeignet: Variante A: 150,ug DHA in 0.6 ml Eco-RI-Puffer (10OmM ITaCl, 50 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol) werden mit 10 Einheiten Eco RI bei 37° 1 Stunde inkubiert. Stop der Reaktion durch Zugabe von 0.5M EDTA (Bndkonzentration im Ansatz: 10 mM) und Abkühlen im Eisbad.Chromosome DIIA vB amyloliquefaciens ZIMET 10639 was isolated by the method of Harris-Warrick, 1975 (RM Harris-Warrick et al., Proc. ITatl. Acad. Sci. USA JTJk 2207-2211, 1975) and purified by centrifugation in the CsCl gradient , From 500 ml of HBY-KuI door (OD at 600 nm: 2.0) 0.5 mg of purified DITA were obtained. The following conditions proved to be suitable for the partial digestion of DHA with the restriction endonuclease Eco RI: Variant A: 150, μg of DHA in 0.6 ml of Eco-RI buffer (10 mM ITaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM dithiothreitol) are incubated with 10 units of Eco RI at 37 ° for 1 hour. Stop the reaction by adding 0.5M EDTA (Bndkonzentration in the batch: 10 mM) and cooling in an ice bath.

Variante B: 150/Ug DHA werden unter gleichen Bedingungen mit 5 Einheiten Eco RI inkubiert.Variant B: 150 / ug DHA are incubated under the same conditions with 5 units of Eco RI.

Beide Reaktionsansätze werden vereinigt und in einem Saccharosegradienten (15-30$) durch Ultrazentrifugation nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die Größe der, in den Fraktionen des Gradienten enthaltenen, DHA-Fragmente wurde durch Elektrophorese in 0.6%iger Agarose bestimmt. Fraktionen mit einem Molekulargewicht zwischen 15-20 kb wurden gesammelt und gegen TE-Puffer dialysiert. Anschließend wurde die Probe durch Ausfällung mit 2,5 Volumenteilen Äthanol konzentriert und das Sediment erneut in TE-Puffer aufgenommen (Endkonzentration: 300-500/Ug/ml). Ligation mit Lambda DHA: 2,5/Ug Lambda Charon 4A DUA-isoliert nach Spaltung mit Eco RI (Größe der "Arme": 19 u. 11 kb) - wurden mit 1.0/Ug Bacillus-DHA (Größe der Fragmente : 15-20 kb) gemischt, in einem Gesamtvolumen von 10/ul Ligationspuffer + 2 mM ATP unter Zusatz von 0.1 E T4-Ligase 16 h bei 10° ligiert.Both reactions are combined and separated in a sucrose gradient (15-30 $) by ultracentrifugation according to their molecular weight. The size of the DHA fragments contained in the fractions of the gradient was determined by electrophoresis in 0.6% agarose. Fractions of molecular weight between 15-20 kb were collected and dialyzed against TE buffer. The sample was then concentrated by precipitation with 2.5 volumes of ethanol and the sediment resuspended in TE buffer (final concentration: 300-500 / μg / ml). Ligation with lambda DHA: 2.5 / Ug Lambda Charon 4A DUA-isolated after cleavage with Eco RI (size of the "arms": 19 and 11 kb) - were incubated with 1.0 / ug Bacillus DHA (size of the fragments: 15- 20 kb), in a total volume of 10 / μl of ligation buffer + 2 mM ATP with addition of 0.1 E T4 ligase for 16 h at 10 °.

Die "in vitro" Verpackung der rekombinanten ΠΕΤΑ-Moleküle erfolgte nach Hohn u. Murray, 1877 (B. Hohn u. K. Murray, Proc.Hatl.Acad.Sci. USA, J^_x 3259-3263, 1977) mit 3/Ul des Ligationsgemisches und einer Mischung von zwei komplementären defektiven Phagenextrakten (Gesamtvolumen 30/ul). Die "in vitro" rekonstituierten Ehagenr~treintLälten rekombinante. DHA - bestehend aus Lambda-DUA mit cos-Enden und Bacillus-DHA-iFragmenten- und waren biologisch aktiv, d.h. zur Infektion des E.coli-Wirtsstammes DP 50 und zur Ausbildung von Plaques im Bakterienrasen fähig. Die Effizienz der zur Herstellung rekombinanter Phagen angewandten Methoden wurde folgendermaßen überprüft:The "in vitro " packaging of the recombinant ΠΕΤΑ molecules was carried out according to Hohn et al. Murray, 1877 (B. Hohn and K. Murray, Proc.Hatl.Acad.Sci., USA, J ^ _x 3259-3263, 1977) with 3 / UI of the ligation mixture and a mixture of two complementary defective phage extracts (total volume 30 / ul). The "in vitro" reconstituted Ehagenr ~ treintLälten recombinant. DHA - consisting of lambda DUA with cos-ends and Bacillus-DHA-i fragments and were biologically active, ie capable of infecting the E. coli host strain DP 50 and forming plaques in the bacterial lawn. The efficiency of the methods used to produce recombinant phage was checked as follows:

1. Elektrophorese in 0.6%iger Agarose von folgenden Ligations-Ansätzen Je 7/Ul) (a) Phagenextrakte für Verpackung, (b) Phagenextrakte1. Electrophoresis in 0.6% agarose from the following ligation mixtures: 7 / UI (a) phage extracts for packaging, (b) phage extracts

;. + Phagen-DMA-Arme, Cc) E. eoli-DNA, (d) E. cοIi-DHA + · Phagen-DNA-Arme + Phagenextrakte _r (e) Bacillus-D3ÜA-i5-2O kb zur überprüfung der Ligasewirkung.;. + Phage DMA arms, Cc) E. eoli DNA, (d) E. caiI-DHA + · phage DNA arms + phage extracts _r (e) Bacillus D3ÜA-i5-2O kb for assaying ligase activity.

2. Phagentiterbestijamung: Die Titerbestimmung erfolgte mit E. coli DP 50 auf 50-Agar (BBY-Agar + 5 mM MgCl₂ + 40 /Ug/ml ghymidin, + 40/Ug/ml Diaminopimelinsäure und 0.5 % Glukose). Durch den Zusatz von Bacillus-DBA im Ligationsgemisch wurde eine signifikante Erhöhung des Phagentiters erreicht: .2. Phagitis Determination: Titer determination was carried out with E. coli DP 50 on 50-agar (BBY agar + 5 mM MgCl ₂ + 40 / U g / ml ghymidine, + 40 / U g / ml diaminopimelic acid and 0.5% glucose). The addition of Bacillus DBA in the ligation mixture resulted in a significant increase in the phage titer:.

Ca) - 10² Cb) 4.2 χ 10³ (c) - 10¹ (d) 9 χ 10⁶/yUg DSA (E.coli) (e) - 3.x 1O⁵ZyUg DHA CBacillus)Ca) - 10 ² Cb) 4.2 χ 10 ³ (c) - 10 ¹ (d) 9 χ 10 ⁶ / yUg DSA (E. coli) (e) - 3.x 10 ⁵ ZyUg DHA CBacillus)

3. Test auf X-Gal-Agar: 10yul· einer x-gal-Stammlösung (2%) wurden,:bei 50° in 5 ml DP-50-Grundagar eingemischt. Mehr als 95 % der von Variante e (Bacillus DlTA) gebildeten Plaques waren weiß, stellten also rekombinante Klone dar.3. Test on X-gal agar: 10 μl of an x-gal stock solution (2%) were: mixed at 50 ° in 5 ml of DP-50 basic agar. More than 95% of the plaques formed by variant e (Bacillus DITA) were white, thus representing recombinant clones.

Isolierung von rekombinanten Phagen mit Bacillus-ß-Glucanas e ge η- Ins e r tIsolation of Recombinant Phage with Bacillus β-glucanase e η-ins e r t

20 ml DP 50-Agar wurde mit 200 mg Lichenin 20 min. aufgekocht (1 % Lichenin im Grundagar). In den Überschichtagar 3 ml (1:1 verdünnter DP-56-Agar) wurden 0.5 ml des Indidakatorstammes DP 50 gegeben. Hach Erstarren des Weichagars wurden je 150, der von den rekombinanten Phagen gebildeten, Plaques übertragen und über Uacht bei 37° bebrütet. Paral-20 ml of DP 50 agar was mixed with 200 mg of lichenin in 20 min. boiled up (1 % Lichenin in Grundagar). Into the overlay agar 3 ml (1: 1 diluted DP-56 agar) was added 0.5 ml of the indidator strain DP 50. After solidification of the soft agar, 150 plaques of the recombinant phage were transferred and incubated at 37 ° C. par-

IeI wurde jeder Plaque auf eine zweite Agarplatte übertragen. Nach Ausbildung der Plaques im Bakterienrasen wurde mit Äthanol überschichtet und 1 Stunde bei 4°"entwickelt". Phagenklone mit dem Glucanasegen waren von einer klaren Lysezone, die im trüben Licheninagar deutlich sichtbar wurde, umgeben. Unter 750 Plaques waren zwei glucanasepositive Plaques (G1 und G2) nachweisbar. Einer der beiden Phagenklone (G2) wurde isoliert und für die Herstellung von Einzelplaques verwendet·IeI, each plaque was transferred to a second agar plate. After formation of the plaques in the bacterial lawn was covered with ethanol and "developed" for 1 hour at 4 °. Phage clones with the glucanase gene were surrounded by a clear lysis zone, which became clearly visible in the murky licheninagar. Among 750 plaques, two glucanase-positive plaques (G1 and G2) were detectable. One of the two phage clones (G2) was isolated and used for the production of single plaques.

Characterization; the G 2 DNA

Die Isolierung rekombinanter Phagen-DNA erfolgte in folgender Weise-: flach Vereinzelgng des primären glucanasepositiven Klons wurde der Plaque ausgestochen und 5 Stunden in 0,5 ml PSB-Puff er (1C^mM Tris-HCl pBB, 100 mH ITaCl, 1OmM MgCl₂ und 0.05% Gelatine) bei 4° vorsichtig geschüttelt. Wichtig für eine gute elektrophoretische Auftrennung der DNA ist die Verwendung von Agarose in Grund- und VfeLchagar. 0.3 ml des Phagenlysats werden mit 0.3 ml des Wirtsstammes (z.B. DP oder E. coll LE 392) in 10 mM MgCl₂ + 1OmM CaCl₂ gemischt und 0,6 ml des Gemisches werden in 3 ml Weichagar (mit AgaroseIsolation of recombinant phage DNA was performed in the following manner: flat plating of the primary glucanase-positive clone was plaque excised and placed in 0.5 ml of PSB buffer (1C mM Tris-HCl pBB, 100 mM ITaCl, 10 mM MgCl _{2) for} 5 hours and 0.05% gelatin) shaken gently at 4 °. Important for a good electrophoretic separation of the DNA is the use of agarose in ground and VfeLchagar. 0.3 ml of the phage lysate are mixed with 0.3 ml of the host strain (such as E. coll or DP LE 392) in 10 mM MgCl ₂ + 1OmM _CaCl2 and 0.6 ml of the mixture are in 3 ml soft agar (agarose

anstelle von Agar) über Kacht inkubiert. Unter diesen Bedin-instead of agar) was incubated over Kacht. Under these conditions

gungen wird eine nahezu konfluente Lyse des Bakterienrasens erreicht. Pro Petrischale werden 6 ml PSB-Puffer zugesetzt und die Weichagarschicht mit dem Puffer vermischt. Der Puffer mit den Phagen wird durch Zentrifugation bei 5000 U/min., 10 min. von den Zellen des Wirtsstamines befreit. Der Überstand wird 30 min. mit RHase und DBase (je 1yug/ml) bei behandelt. Danach erfolgt die Zugabe von 20 % PEG (5ml) in 2 M UaCl, 10 mM Tris, 100 mM MgCl₂ und 0,05% Gelatine. Hach einer Aufbewahrung von 1 h im Eisbad wird 30 min. bei 6000 U/min, zentrifugiert. Die sedimentierten Phagen werden in 0.5 ml PSB aufgenommen und die Trübung in einer Eppendorf-Zentrifuge abzentrifugiert (5', 12000 U/min.). Durch die Zugabe von 5/ul 10 % SDS in 0,5 M EDTA zu 0,5 ml Phagenlysat wird die Phagen-DHA nach 15 min. Inkubation bei 68° freigesetzt. Das weiße Proteinpräzipitat wird nach Phenol-a nearly confluent lysis of the bacterial lawn is achieved. 6 ml of PSB buffer are added per Petri dish and the Weichagarschicht mixed with the buffer. The buffer with the phage is centrifuged at 5000 rpm, 10 min. freed from the cells of the host strain. The supernatant is 30 min. with RHase and DBase (each 1 μg / ml) at. This is followed by the addition of 20 % PEG (5 ml) in 2 M UaCl, 10 mM Tris, 100 mM MgCl ₂ and 0.05% gelatin. After a storage of 1 h in an ice bath is 30 min. at 6000 rpm, centrifuged. The sedimented phages are taken up in 0.5 ml PSB and the turbidity in an Eppendorf centrifuge centrifuged (5 ', 12000 U / min.). By adding 5 / μl 10 % SDS in 0.5 M EDTA to 0.5 ml phage lysate, the phage DHA is removed after 15 min. Incubation released at 68 °. The white protein precipitate is after phenol

12.112.1

"behandlung entfernt. Anschließend wird die DNA mit 1 VoIumenteil Isopropanol bei -70° ausgefällt und nach Zentrifugation in 40/Ul TES-Puffer gelöst. Pur die Restriktionsverdauung der Phagen-DNA werden eingesetzt: 5/Ul RNase (1 ug/ul)," 2,5/Ul Eco-R1 und 13,5 ul Wasser. Nach 4 h bei 37° wird der Ansatz durch Elektrophorese in Q.5%iger Agarose geprüft'. Folgende Fragmente werden erhalten: 2 kb (A), 2,6 kb (B), 3.6 kb (C), 15 kb (4 kb D-Fragment + 11 kb Phagenarm), 19 kb (19 kb Phagenarm) und 34 kb (15 kb- + 19 kb-Fragment). Insgesamt beträgt die Größe der in den Phagen eingebauten Bacillus DIiA 12,2 kb. 3 Schnittstellen für Eco R1 waren nachweisbar. Die anschließend durchgeführte Subklonierung im E.coli-Plasmid pBr 322 ergab, daß sich das Glucanasegen im 3,6 kb großen G-Fragment befindet.The DNA is then precipitated with 1 part by volume of isopropanol at -70 ° and, after centrifugation, dissolved in 40 μl of TES buffer, using the restriction digestion of phage DNA: 5 / Ul RNase (1 μg / μl), "2.5 / Ul Eco-R1 and 13.5 μl of water. After 4 h at 37 °, the batch is checked by electrophoresis in Q.5% agarose. The following fragments are obtained: 2 kb (A), 2.6 kb (B), 3.6 kb (C), 15 kb (4 kb D fragment + 11 kb phage arm), 19 kb (19 kb phage arm) and 34 kb ( 15 kb + 19 kb fragment). Overall, the size of the phage-incorporated Bacillus DIiA is 12.2 kb. 3 interfaces for Eco R1 were detectable. The subsequent subcloning in the E. coli plasmid pBr 322 revealed that the glucanase gene is located in the 3.6 kb G fragment.

B Recloning of the glueanase gene into the plaamide pBR 322

Ligation von Eco R1 verdauter G2-Phagen-DNA mit Eco-R1-verdautem pBR 322: Das Plasmid pBR 322 wird nach Birnboim u. DoIy (H.C. Birnboim, J. DoIy, Hucl.Acid.Res 2» 1513-1523' (1980) isoliert und mit Eco R1 gespalten. Eco RI verdaute Phagen-G2-DNA (4/Ug)werden mit Eco RI verdäutelT~P11äsmi~d^ DUA (T ug) gemischt und ligiert (wie bei A beschrieben). Diese Präparation wurde zur Transformation von E.coli HB T01 ( Kushner, 1978 ) benutzt. Selektion transformierter Klone auf HBY-Agar + 30/Ug Ampicillin. Unter 500 transformierten ApR-Klonen befanden sich drei Kolonien mit niedriger ß-Glucanaseaktivität pEG 2, pSG 3 und ρ EG 4 und ein hoch produzierender ß-Glucanaseklon ρ EG 1. Die Kolonien werden isoliert, gereinigt und zur Gewinnung der rekombinanten Plasmide nach der Methode von Birnboim u. DoIy, 1979 (H.G. Birnboim u. J. DoIy, Uucl.Acids Res. χ, 1513-1523, 1979) in SBY-KuItür angezogen.Ligation of Eco R1-digested G2 phage DNA with Eco R1-digested pBR 322: The plasmid pBR 322 is purified according to Birnboim et al. DoIy (HC Birnboim, J. DoIy, Hucl. Acid. Res 2, 1513-1523 '(1980) and digested with Eco R1 Eco RI digested phage G2 DNA (4 / Ug) are digested with Eco RI T ~ P11asmi This preparation was used to transform E. coli HB T01 (Kushner, 1978) Selection of transformed clones on HBY agar + 30 / ug ampicillin 500 transformed ApR clones were three colonies with low ß-glucanase activity pEG 2, pSG 3 and ρ EG 4 and a high-producing ß-Glucanaseklon ρ EG 1. The colonies are isolated, purified and to obtain the recombinant plasmids by the method of Birnboim and Doy, 1979 (HG Birnboim and J. Doyl, Uucl. Acids Res. , 1513-1523, 1979) are dressed in SBY cowhide.

Characterization of the cloned Bacillus DHA

Nach Verdauung mit dem Restriktionsenzym Eco R1 wurde die Größe des klonierten Bacillus-DITA-Fragments in den Plasmiden pEG1 - 4 mit 3»5 - 3?6 kb - übereinstimmend mit dem C-Frag-After digestion with the restriction enzyme Eco R1, the size of the cloned Bacillus DITA fragment in the plasmids pEG1-4 with 3 × 5 -3 × 6 kb was determined in accordance with the C-Frag

ment des rekombinanten Phagen G2 - bestimmt. Durch Doppelver dauung mit den Restriktionsenzymen 3cο R1 und Hinc II wurden neben den zu pBR 322 gehörenden Fragmenten von 0.65 und 0.45 kb zwei Fragmente mit 1,85 kb ("B") und 1,75 kb ("A") erhalten. Die Einzelverdauung mit Hinc II ergibt für die Plaamide pEG 1 und 2 unterschiedliche Ergebnisse:ment of the recombinant phage G2 - determined. By double digestion with the restriction enzymes 3cο R1 and Hinc II, two fragments with 1.85 kb ("B") and 1.75 kb ("A") were obtained in addition to the pBR 322 fragments of 0.65 and 0.45 kb. Single digestion with Hinc II gives different results for the plaamides pEG 1 and 2:

- pEG1: 2,50 kb ("B" + 0.65) und 2,20 kb ("A" + 0,45)pEG1: 2.50 kb ("B" + 0.65) and 2.20 kb ("A" + 0.45)

- pEG2: 2,40 kb (M"-;-+ 0.65) und 2,30 kb ("B" + 0,45)pEG2: 2.40 kb (M "-; - + 0.65) and 2.30 kb (" B "+ 0.45)

Diese Ergebnisse weisen auf eine unterschiedliche Orientierung des klonierten Bacillus DHA in den beiden rekombinanten Plasmiden pEG1 und pEG2 hin. These results indicate a different orientation of the cloned Bacillus DHA in the two recombinant plasmids pEG1 and pEG2.

Das Plasmid pEG 1 wurde in der zentralen Stammsammlung der DDR (Zentralinstitut für Mikrobiologie und exxperimentelle Therapie der AdW der DDR, Jena) unter der Bezeichnung am 26.05.83 hinterlegt.The plasmid pEG 1 was deposited in the central strain collection of the GDR (Central Institute for Microbiology and Exxperimental Therapy of the AdW of the GDR, Jena) under the designation on 26.05.83.

C Reklonierung des Glucanase-Gens in die Plasmide pBD 64 und pDB 101C Recloning the glucanase gene into plasmids pBD 64 and pDB 101

Ligation von 0,5/Ug Eco RI verdautem pBD 64 bzw. pDB 101, 1,5/Ug isoliertes 3,6 kb-Fragment mit dem ß-Glucanasegen von B. amyloliquefaciens in 20 /Ul Ligationspuffer wie bei A beschrieben. Die Transformation der Bacillusstämme erfolgte nach der Protoplasten-Transformationsmethode von Chang u. Cohen, 1979· Als Wirtsstämme für das Ligationsgemisch fanden zunächst glucanasenegative Bacillus subtilis-Stämme, die durch Mutagenbehandlung von B. subtilis 168 bzw. B. subtilis QB 112 (R. Borriss u. J. Hofemeister , in Vorbereitung für Publ.) Verwendung:Ligation of 0.5 / ug Eco RI digested pBD 64 or pDB 101, 1.5 / ug isolated 3.6 kb fragment with the B. glylganase gene of B. amyloliquefaciens in 20 / Ul ligation buffer as described in A. The transformation of the Bacillus strains was carried out according to the protoplast transformation method of Chang et al. Cohen, 1979 · Glucanase-negative Bacillus subtilis strains obtained by mutagenic treatment of B. subtilis 168 and B. subtilis QB 112 (R. Borriss and J. Hofemeister, in preparation for Publ.) Were used as host strains for the ligation mixture.

1. B. subtilis RM 125 (arg", bgl")1. B. subtilis RM 125 (arg ", bgl")

2. B. subtilis C-5-21 (purA~, bgl")2. B. subtilis C-5-21 (purA ~, bgl ")

3. B.. subtilis ts1 (trpC2, bgl tsi).3. B .. subtilis ts1 (trpC2, bgl tsi).

Pro 100 ng eingesetztem Eco-3,5 kb Fragment wurden in Abhängigkeit von den verwendeten Stämmen 20 - 200 antibiotikare-Depending on the strains used, 20-200 antibiotics were used per 100 ng Eco-3.5 kb fragment inserted.

sistente, d.h. transformierte Klone erhalten. Etwa 10 % die-sistente, i. obtained transformed clones. About 10% of

R R ser Km - bzw. Em -Kolonien waren zur Expression des ß-Glucanaseenzyms fähig. Die Anwesenheit rekombinanter Plasmide in diesen Stämmen wurde durch Agarose-Gelelektrophorese der iso lierten Plasmide (T.J. Gryczan, S. Contente u. D. Dubnau, J.R R ser Km or Em colonies were able to express the β-glucanase enzyme. The presence of recombinant plasmids in these strains was determined by agarose gel electrophoresis of the isolated plasmids (T. J. Gryczan, S. Contente, and D. Dubnau, J.

ι ο ni/HGQ^I ¹Mι ο ni / HGQ ^ I ¹ M

-H--H-

Bacteriol. 134, 318-329, 1973) und Retransformation in die gleichen Wirtsstamme bestätigt. Beispiele für die in dieser Art erhaltenen DITA-Hybridmoleküle sind: pBG 2-3 bestehend aus pBD 64 und 3,6 kb Bacillus-DNA und pGB 7 bestehend aus" pDB 101 und 3,6 kb Bacillus-DHA,Bacteriol. 134, 318-329, 1973) and retransformation into the same host strains. Examples of the DITA hybrid molecules obtained in this way are: pBG 2-3 consisting of pBD 64 and 3.6 kb Bacillus DNA and pGB 7 consisting of "pDB 101 and 3.6 kb Bacillus DHA,

In beiden Plasmiden erfolgte der Einbau der Premd-DIIA am Eco R1-0rt. Das Plasmid pBG 2-3 wurde in der Stammsammlung des Zentralinstituts für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der AdW der DDE, Jena am 26.05.83 unter der Bezeichnung hinterlegt.In both plasmids, the incorporation of the Premd-DIIA was carried out on Eco R1-0rt. The plasmid pBG 2-3 was deposited in the strain collection of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy AdW of the DDE, Jena on 26.05.83 under the name.

Um eine noch höhere Expression des Glucanasegens in Bacillus subtilis zu erhalten, wurden die rekombinanten Plasmide pBG 2-3 und pBG 7-3 durch die Protoplastentransformationsmethode in folgende weitere Stämme transformiert:In order to obtain an even higher expression of the glucanase gene in Bacillus subtilis, the recombinant plasmids pBG 2-3 and pBG 7-3 were transformed by the protoplast transformation method into the following further strains:

4. B. subtilis QB 1097 Camy B⁺, bgl⁺)B. B. subtilis QB 1097 Camy B ⁺ , bgl ⁺ )

5. B. subtilis QB 112 (pap, bgl⁺)5. B. subtilis QB 112 (pap, bgl ⁺ )

6. B. spec. ZP 178 (prototroph, bgl⁺).6. B. spec. ZP 178 (prototrophic, bgl ⁺ ).

Example 2

Expression der klonierten ß-Glucanase in verschiedenen Bacillus subtilis-StämmenExpression of the cloned β-glucanase in various Bacillus subtilis strains

Die Expression der auf den Yektorplasmiden pBD 64 (pBG2-3) und pDB 101 (pBG7) klonierten B. amyloliquefaciens-ß-Glucanase in verschiedenen B. subtilis-Wirtsstämmen wurde überprüft. Die Kultivierung erfolgte in Laborschüttelkultüren (Volumen: 50 ml) bei 37° in ABY-Medium folgender Zusammensetzung: 10 g/l Bouillon, 4g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 4 g/l Kochsalz und 100 g/l Maisstärke (verflüssigt mit 1 ml Bg^terien-Amylase, 30 min. bei 60°). Die Dauer der Schüttelkultur betrug 64 h. Die Aktivität'der J3-Glucanase in der Kulturflüssigkeit wurde nach dem .Fachbereichsstandard DDR-TGL 29166/02 mit Lichenin als Substrat bestimmt. Eine Bnzymeinheit ist als die Enzymmenge definiert, die eine Freisetzung von reduzierender Substanz, äquivalent einem /uMol Glukose, bewirkt. Stämme mit den rekombinanten Plasmiden wiesen gegenüber dem Donorstamm B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639 eine bis zu 5-fache (pBG 7) bzw. 10 fache (pBG 2-3)Expression of B. amyloliquefaciens β-glucanase cloned on the vector plasmids pBD64 (pBG2-3) and pDB101 (pBG7) in various B. subtilis host strains was examined. Cultivation was carried out in laboratory shake cultures (volume: 50 ml) at 37 ° in ABY medium of the following composition: 10 g / l bouillon, 4 g / l yeast extract, 20 g / l peptone, 4 g / l sodium chloride and 100 g / l corn starch ( liquefied with 1 ml of Bg esterase amylase, 30 min at 60 °). The duration of the shaking culture was 64 h. The activity of the J3-glucanase in the culture fluid was determined according to the field standard DDR-TGL 29166/02 with lichenin as substrate. A enzyme unit is defined as the amount of enzyme which causes a release of reducing substance equivalent to one mole of glucose. Strains with the recombinant plasmids had up to 5-fold (pBG 7) or 10-fold (pBG 2-3) compared to the donor strain B. amyloliquefaciens ZIMET 10 639

λ — ι * -r Jλ - ι * -r J

A ο Λ -1 1 D A ο Λ -1 1 D

Steigerung der ß-Glucanaseaktivität auf. Im Vergleich zum Wirts3tamm B. subtilis 168 wurde eine mehr als 100-fache Steigerung erreicht. Beispiele für die erhaltenen Ergebnisse sind zusammenfassend in der Tabelle 1 dargestellt.Increase in ß-glucanase activity. In comparison to the host strain B. subtilis 168, a more than 100-fold increase was achieved. Examples of the results obtained are summarized in Table 1.

Example 3

Expression der klonierten ß-Glucanase auf dem Plasmid pBG 7Expression of the cloned β-glucanase on the plasmid pBG 7

Zur Überprüfung der Stabilität des Plasmids pBG 7 im Stamm B. subtilis ΖΈ 178 wurde folgende Versuchsanordnung durchgeführt: Der das rekonbinante Plasmid pBG 7 enthaltende Stamm wurde in so geringer Zelldichte in das antibiotikafreie Hährmedium (ITBY) eingeimpft, daß bis zum Erreichen der stationären Phase 10 Zellteilungen durchgeführt wurden. Diese Prozedur wurde nochmals zweimal wiederholt, so daß insgesamt 30 Generationen in der Vorkultur ohne Selektionsdruck wuchsen. Die Stabilität des Plasmids wurde anschließend in folgender Weise überprüft: Die Kultur wurde in geeigneter Verdünnung auf ITähragar ausplattiert, so daß 100 200 Kolonien auf einer Petrischale wuchsen. Anschließend wurde auf antibiotikahaltigen Licheninagar (5/Ug/ml) Erythromycin) und Uähragar überstempelt. Auf beiden Medien wuchsen die gleiche Anzahl Kolonien, die alle auf Licheninagar eine gleich gnSe Lysezone ausbildeten. Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn als Y/irtsstamm für das Plasmid pBG 7 der Stamm B. subtilis RM 125 bgl*" (ohne Plasmid glucanasenegativ) eingesetzt wurde: Auch von diesem Stamm wurden nach 30 Generationen Wachstum in erythromycinfreien Medium nur glucanasepositive Kolonien erhalten. Nach 30 Generationen Wachstum in antibiotikafreiem Medium wurden 0,5 ml dieser Vorkultur in 50 ml ABY-Medium, wie in Beispiel 2 beschrieben, überimpft und bei 37° 64 h kultiviert. Parallel dazu wurde eine Kultur, die in einer erythromycinhaltigen Vorkultur angezogen worden war, ebenfalls in ABY + 5/Ug/ml Erythromycin übertragen und kultiviert. Bach Abschluß der Schüttelkultur wurde die ß-Glucanaseaktivität in beiden Kulturen bestimmt und folgendes Ergebnis erhalten:To check the stability of the plasmid pBG 7 in the strain B. subtilis ΖΈ 178, the following experimental arrangement was carried out: The strain containing the rekonbinante plasmid pBG 7 was inoculated so low cell density in the antibiotic-free Hährmedium (ITBY) that until reaching the stationary phase 10 Cell divisions were performed. This procedure was repeated twice more so that a total of 30 generations grew in the preculture without selection pressure. The stability of the plasmid was then checked in the following manner: The culture was plated at a suitable dilution on ITagagar so that 100-200 colonies grew on a petri dish. Subsequently, it was over-stamped on antibiotic-containing Licheninagar (5 / μg / ml) erythromycin) and Uähragar. The same number of colonies grew on both media, all of which formed an equal gnSe lysis zone on Licheninagar. A corresponding result was obtained when the strain B. subtilis RM 125 bgl * "(without plasmid glucanaseegativ) was used as the strain for the plasmid pBG 7: Also, from this strain only glucan-positive colonies were obtained after 30 generations of growth in erythromycin-free medium After 30 generations of growth in antibiotic-free medium, 0.5 ml of this preculture was inoculated in 50 ml of ABY medium as described in Example 2 and cultured at 37 ° C. for 64 h. In parallel, a culture grown in an erythromycin-containing preculture was grown Transferred and cultured also in ABY + 5 / ug / ml of erythromycin. [0116] At the end of the shake culture, the β-glucanase activity was determined in both cultures and the following result was obtained:

Kultur A (Anzucht ohne Selektionsdruck, Hauptkultur ABY):Culture A (cultivation without selection pressure, main culture ABY):

500 B/ml (Stamm: ZP'178 mit pBG.7) Kultur B (Anzucht in IiBY + Erythromycin, Hauptkultur: ABY + Erythromycin): 450 E/ml.500 B / ml (strain: ZP'178 with pBG.7) Culture B (culture in IiBY + erythromycin, main culture: ABY + erythromycin): 450 U / ml.

Example 4

Isolierung der von B. subtilis QB 112 (mit Plasmid pBG 2-3) gebildeten B. amyloliquefaciens ß-GlucanaseIsolation of B. amyloliquefaciens β-glucanase from B. subtilis QB 112 (with plasmid pBG 2-3)

B. subtilis QB 112 χ pBG 2-3 wurde 64 h bei 37° in ABY unter Schütteln (220 rpm/min.) kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugiert. In 200 ml - Kultürlösung (spezifische Aktivität:lOOOE/ml war die Gesamtaktivität 200 000 Ξ (Aktivitätsbestimmung nach Fachbereichstandard DDR TGL 29 166/02). Das in der Kulturlösung enthaltene Protein wurde mit Ammoniumsulfat bei 80%iger Sättigung gefällt, in 20 ml Aceiatpuffer pH 6 (0.03 M) aufgenommen und gegen den gleichen Puffer 48 h dialysiert. Anschließend wurde gefriergetrocknet. Es wurden insgesamt 620 mg mit einer spezifischen Aktität von 200 E ß-Glucanase/mg erhalten. Dieses Ergebnis entspricht einer Ausbeute von 62 %. B. subtilis QB 112 χ pBG 2-3 was cultured for 64 h at 37 ° in ABY with shaking (220 rpm / min.). The cells were centrifuged off. In 200 ml culture solution (specific activity: 10000 U / ml), the total activity was 200 000 Ξ (determination of activity according to the specialist area standard DDR TGL 29 166/02.) The protein contained in the culture solution was precipitated with ammonium sulfate at 80% saturation, in 20 ml acetic buffer pH 6 (0.03 M) and dialyzed against the same buffer for 48 h, followed by freeze-drying to obtain a total of 620 mg with a specific activity of 200 E β-glucanase / mg, which corresponds to a yield of 62 %.

ν u ο · υ/ *|· - 20 -ν u ο · υ / * | · - 20 -

Tabelle 1 : Expression von ß-Glucanase in Schüttelkultur von B. subtilis mit rekombinanten Plasmiden pBG-2-3 und pBG 7 (ABY-Medium) ^x' Table 1: Expression of B. glucanase in shake culture of B. subtilis with recombinant plasmids pBG-2-3 and pBG 7 (ABY medium) ^x '

Anzahl Stamm Plasmid Kopien ABY ABY+Ab.Number of strain plasmid copies ABY ABY + Ab.

B.B. subtilissubtilis 168168 __ 2-32-3 11 3-4E/ml3-4E / ml nicht gern«not pleased" B.B. subtilissubtilis EM125-bgl~EM125-bgl ~ -- 77 -- QE/mlQE / ml nicht gem.not acc. HM125-bgl~HM125-bgl ~ pBGpBG 1212 100 "100 " 200 E/ml200 U / ml RM125-bgl~RM125-bgl ~ pBGpBG 2-32-3 66 20 "20 " 20 "20 " B.B. subtilissubtilis QB112-bgl⁺ QB112-bgl ⁺ -- 77 11 20 "20 " nicht gem.not acc. QB112-bgl⁺ QB112-bgl ⁺ pBGpBG 1212 500 "500 " 800 S/ml800 S / ml QB112-bgl⁺ QB112-bgl ⁺ pBGpBG 77 66 210 "210 " 160 "160 " B.B. subtilissubtilis ZP178ZP178 -- 11 90 "90 " nicht gem.not acc. ZP178ZP178 pBGpBG 66 540 » 540 » 500 E/ml ·500 U / ml · B.B. amyloliquefaciens xs:)amyloliquefaciens xs :) 11 90 "90 " nicht gem.not acc. ZIMET 10639ZIMET 10639

riri

AnribiOtikakonzentrationAnribiOtikakonzentration

oderor

: 5/VLg/ml Kanamycin (pBG 2-3) 5/Ug/ml Erythromycin (pBG 7): 5 / μg / ml kanamycin (pBG 2-3) 5 / μg / ml erythromycin (pBG 7)

xx)xx)

Donorstamm für kloniertes ß-GlucanasegenDonor strain for cloned β-glucanase gene

. „ _,, τ λ , "_ ,, τ λ

Claims

Erfindungaanspruch

1. A process for the preparation of Bacillus β-1,3-1,4-glucanase, characterized in that the DHA isolated highly active producers of Bacillus β-1,3-1 _} 4-glucanase, digested by partial restriction enzyme treatment and the resulting fragments are ligated into the DNA of a vector phage. and expressing in the host phage of the vector phage that said primary cloned DHA is further fragmented by complete restriction enzyme digestion, the resulting progestins are ligated into a bacterial vector plasmid, and in the host strain of the recombinant plasmid the glucanase gene is expressed and engineered Bacterial strains can be used for the production of ß-glucanase by submerged fermentation.

2. Method according to item 1, characterized in that strains of the species B. amyloliquefaciens are used as donor for the cloning of the β-glucanase gene.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that the strain B. amyläliquefaciens ΖΙΜΞΤ 10 639 is used as donor for the cloning of the ß-glucanase gene.

4. Ver drive-aac-h - point 1, characterized in that the DHA of the donor strain is decomposed by partial digestion with the restriction enzyme Eco RI so that a large proportion of the DNA Pragmente is present in the size between 15-20 kb and these pragmas are mixed and ligated with the DHA of the vector phage.

5. The method according to item 1 and 4 », characterized in that are used as vector phages for the primary cloning derivatives of S. coli phage lambda, which are capable of receiving Premd-DHA as Replacement or insertion vectors are used.

6. Method according to item 1, 4 and 5, characterized in that vector Phage 4A is used as the vector phage for the primary cloning of the lambda phage.

7. Method according to item 1, characterized in that the phage DHA is transformed into the host phage of the vector phage.

and the clones containing the β-glucanase gene are detected by detecting, after lysis of the phage-infected host cells on a β-glucan-containing agar, e.g. Licheninagar is overlaid with alcohol, so that the Sakterienrasen be brightened in the vicinity of the phage plaques and thereby clarification zones are made visible in the vicinity of the glucanase-producing phage plaques.

8. The method according to item 1 and 7, characterized in that the transformation of the E. coli host cell by the phage DIA is carried out by in vitro packaging or transfection.

9. The method according to item 1, characterized in that the primary cloned MA further fragmented with the ß-glucanase gene by complete restriction digestion, the DHA fragments ligated in a .Plasmidvektor and the recombinant plasmid with the ß-glucanase gene in a bacterial host transformed and that ß-Glucanaseprodukt is formed. '

10. The method according to item 1 and 3, characterized in that the primary cloned DNA is ligated on an E. coli plasmid vector and transformed into an E. coli host strain and ezprimiert.

11. Method according to item 1,9 and 10, characterized by _? that the primary cloned DHA is ligated into a S. coli vector plasmid and transformed into E. coli and expressed.

12. The method according to item 1 and 9 », characterized in that the primary or secondary cloned DHA with the ß-glucanase gene in a. Plasmid, which is replicated in Bacillus, ligated and transformed into a Bacillus Vts / Irtsstamin and ezprimiert v / ird.

The method according to items 1,9 and 12, characterized in that the primary or secondary cloned DHA is ligated with the glucanase gene in a plasmid which is replicated in Bacillus subtilis and in a Bacillus subtilis host strain using the protoplast transformation method bzv /. the plasmid transformation is transformed into competent cells and brought to expression.

YD 5.0 / 4. / 83/7 - 19 -

14. The method according to item 1, 9, 12 and 13, characterized in that the primary or secondary cloned DHA is ligated with the glucanase gene into the vector plasmid pDB 64 and into glucanase-negative B. subtilis mutant strains RM 125 x pBG 2-3, C- 5-21 x pBG 2-3 and ts1 χ pBG 2-3 is brought to expression.

15. The method according to item 1, 9, 12, 13 and 14, characterized in that the primary or secondary cloned DHA is ligated with the glucanase gene into the streptococcal vector plasmid pDB 101 and brought into the glucanaseegative Bacillus strains RM 125 and ts1 for expression becomes.

16. The method according to item 1, characterized in that for the production of ß-glucanase in submerged Fermenta-, tion B. subtilis strains with recombinant plasmids consisting of the vector replicable in Bacillus subtilis DNA and the DHA fragment with the ß Glucanasegen be used from the Bacillus donor strain.

17 · Method according to items 1 and 16, characterized in that the recombinant plasmids pBG 2-3, pBG-7 in B. 1 for the production of Bacillus ß-1,3-1 »4-Glucana- _.ae by submerged fermentation subtilis host cells are used. come.

18. The method according to item 1 and 16, characterized in that for the production of Bacillus ß-1,3-1,4-glucanase by submerged fermentation Bacillus subtilis host strains with pleiotropic genes acting on the Exoenzymbildung genes are used.

19. Method according to items 1, 16 and 18, characterized in that Bacillus subtilis QB 112 is used as the host strain for pBG2-3 for the production of Bacillus β-1, 3-1,4-glucanase by submerged fermentation.

20. The method according to item 1.16 and 18, characterized in that for the production of Bacillus ß-1,3-1,4-glucanase by submerged fermentation Bacillus ZF 178 is used as a host strain for pBG7.

tables