DE3530935C2 - - Google Patents

Description

Die N-Acylneuraminat-Aldolase wird auch als Sialinsäure- Aldolase bezeichnet. Sie ist ein bekanntes Enzym, das nach dem "Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry" mit der Enzym-Nr. EC 4.1.3.3. klassifiziert wird und systematisch als N-Acylneuraminat: Pyruvatlyase bezeichnet wird. Dieses Enzym katalysiert den Abbau und die Synthese von Sialinsäure (N-Acylneuraminsäure) gemäß folgendem Reaktionsschema:

Sialinsäure Acylmannosamin + Brenztraubensäure.

Es ist bereits ein Verfahren zur Herstellung der N-Acylneuraminat-Aldolase bekannt. Dieses basiert auf dem Befund, daß das Enzym leicht im technischen Maßstab durch Inkubation bekannter Bakterien der Gattung Escherichia und verschiedener anderer Gattungen in Gegenwart von Sialinsäure hergestellt werden kann (JP-PS-11 11 346). Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß zum Kulturmedium Sialinsäure zugegeben werden muß, welche selbst teuer ist und nur nach einem aufwendigen Herstellungsverfahren gewonnen werden kann. Darüber hinaus kann die N-Acylneuraminat- Aldolase entweder überhaupt nicht oder nur in sehr geringen Mengen hergestellt werden, wenn keine Sialinsäure zur Verfügung steht. Deshalb ist dieses Verfahren ohne die Verwendung von Sialinsäure industriell nicht durchführbar. Die im genannten Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind also im wesentlichen nicht in der Lage, N-Acylneuraminat-Aldolase in Abwesenheit von Sialinsäure herzustellen.

Dementsprechend liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, den größten Nachteil des vorstehend genannten Verfahrens, nämlich das Erfordernis Sialinsäure zu verwenden, zu umgehen und ein neues Verfahren zur Herstellung von N-Acylneuraminat-Aldolase im technischen Maßstab ohne Sialinsäure zu entwickeln.

Zur Lösung dieser Aufgabe wurde ein chromosomales DNA-Fragment, das ein N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, aus einem N-Acylneuraminat- Aldolase-bildenden Bakterium der Gattung Escherichia isoliert, die aus den im bekannten Verfahren verwendeten Mikroorganismen ausgewählt wurde. Durch Einbau dieses Fragments in einen Vektor wurde ein rekombinantes Plasmid erhalten. Dieses Plasmis wurde in einen Mikroorganismus eingebracht.

Wenn der so erhaltene transformierte Mikroorganismus in einem Sialinsäure-freien Medium inkubiert wird, bildet er große Mengen des gewünschten Enzyms.

Somit betrifft die Erfindung ein in E. coli replizierbares rekombinantes Plasmid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein chromosomales DNA-Fragment trägt, das ein von einem N-Acylneuraminat-Aldolase-bildenden Bakterium der Gattung Escherichia abgeleitetes N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, eine Größe von etwa 5,5 kb hat und die in der in Fig. 1 abgebildeten Restriktionskarte enthaltenen Spaltstellen aufweist.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Plasmids in einem damit transformierten N-Acylneuraminat-Aldolase-bildenden Bakterium der Gattung Escherichia oder N-Acylneuraminat- Aldolase-defizienten Stamm der Gattung Escherichia zur Herstellung von N-Acylneuraminat-Aldolase in einem Sialinsäure- freien Medium.

Mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid und der entsprechenden Transformante kann das gewünschte Enzym leicht in großen Mengen im industriellen Maßstab hergestellt werden. Dabei wird ein an sich bekanntes Kulturmedium zur Inkubation der Mikroorganismen verwendet, welches keine Substanzen enthält, die die N-Acylneuraminat-Aldolase-Bildung induzieren, wie die nur in aufwendiger Weise herstellbare Sialinsäure und ihre Analoga.

Die nachstehend beschriebenen Verfahren erläutern die Herstellung des erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmids und der entsprechenden Transformante.

Das erfindungsgemäße Plasmid wird durch Einbau eines chromosomalen DNA-Fragments, welches das von einem N-Acylneuraminat- Aldolase-bildende Bakterium der Gattung Escherichia abgeleitete N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, in einen Vektor hergestellt. Die als Spender der chromosomalen DNA verwendeten Bakterien der Gattung Escherichia sind vorzugsweise starke N-Acylneuraminat-Aldolase-Bildner, wie E. coli. Es sind jedoch auch andere Bakterien verwendbar, sofern sie überhaupt N-Acylneuraminat-Aldolase bilden.

Die chromosomale DNA aus dem N-Acylneuraminat-Aldolase-bildenden Bakterium wird in an sich bekannter Weise isoliert. Beispielsweise erfolgt die Isolierung nach dem Verfahren von Saito und Miura, bei dem Phenol verwendet wird (Biochim. Biophys. Acta Bd. 72, [1963], 619).

Die so erhaltene chromosomale DNA wird dann zur Ligierung mit einem Vektor gespalten. Neben der in an sich bekannter Weise erfolgenden Spaltung der chromosomalen DNA sind auch andere Methoden anwendbar. Beispielsweise kann die DNA durch physikalische Scherkräfte gespalten werden, solange das N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen dabei nicht zerschnitten wird. Wenn die chromosomale DNA mit einer Restriktionsendonuklease vollständig gespalten wird, können verschiedene Restriktionsendonukleasen verwendet werden, für die es keine Spaltstelle im betreffenden N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen gibt. Wenn die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, daß nur eine Partialspaltung erfolgt, kann jede Restriktionsendonuklease verwendet werden. Die Ligierung mit dem Vektor wird erleichtert, wenn eine Restriktionsendonuklease gewählt wird, für die es im Vektor nur eine einzige Spaltstelle gibt.

Das erfindungsgemäße chromosomale DNA-Fragment kann durch Ligierung in alle bekannten Vektoren inseriert werden. Besonders geeignet sind E. coli-Vektoren. Beispiele zweckmäßiger Vektoren sind ColE1, pSC101, pBR322, pACYC177, pCR1, R6K und Lambda-Phagen-Vektoren.

Die chromosomale DNA wird in an sich bekannter Weise mit der Vektor-DNA ligiert, beispielsweise durch Spaltung der chromosomalen Spender-DNA und des Vektors mit derselben Restriktionsendonuklease und nachfolgende Ligierung der Spaltprodukte mit einer DNA-Ligase. Wie vorstehend erläutert, wird vorzugsweise eine Restriktionsendonuklease gewählt, für die der Vektor nur eine Spaltstelle aufweist. Für den Vektor pBR322 wird beispielsweise Hind III, EcoR I, BamH I, Sal I oder Pst I verwendet, für ColE1 beispeilsweise EcoR I, Sma I oder Mlu I; für pSC101 beispielsweise EcoR I, Hind III, BamH I oder Sal I; für pACYC177 beispielsweise Hind III, Pst I, Hinc II, Xho I oder Xma I; für pCR1 beispielsweise EcoR I, Xho I, Sal I oder Hind III; und für den Lambda-Phagen beispielsweise Xho I oder Xba I. Durch die Ligierung wird ein rekombinantes Plasmid (rekombinantes DNA-Molekül, d. h. die Kombination des chromosomalen Spender-DNA-Fragments mit dem Vektor) erhalten.

Die Wirtsorganismen, d. h. die mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid transformierten Empfänger sind Bakterien der Gattung Escherichia, insbesondere die vorstehend genannten Spender von chromosomaler DNA oder davon abgeleitete N-Acylneuraminat-Aldolase-defiziente Stämme. Letztere Stämme sind besonders zur Suche nach Transformanten geeignet, die das erfindungsgemäße Plasmid tragen.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann in Wirtsbakterien der Gattung Escherichia durch Transformation in an sich bekannter Weise eingebracht werden, beispielsweise durch Verwendung kompetenter Zellen (Mol. Gen. Genet., Bd. 167 [1979] 251). Daneben kann nach anderen bekannten Methoden verfahren werden.

Mikroorganismen, die das chromosomale Spender-DNA-Fragment enthalten, welches das gewünschte N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, und welche in Abwesenheit von Sialinsäure oder ähnlichen induzierenden Substanzen das Enzym bilden, können aus den wie vorstehend beschrieben hergestellten Transformanten leicht ausselektiert werden. Dazu ist kein besonderes Verfahren erforderlich. Es wird lediglich ein Kulturmedium verwendet, in dem Clone mit den gewünschten chromosomalen genetischen Merkmalen und/oder den genetischen Merkmalen des Vektors selektiv wachsen. Wenn beispielsweise die chromosomale DNA mit Hind III gespalten wird und das Plasmid pBR322 verwendet wird, vermittelt pBR322 nur noch die Ampicillin-Resistenz, jedoch nicht mehr die Tetracyclin- Resistenz. Wenn andererseits in das Plasmid pBR322 ein chromosomales DNA-Fragment inseriert wird, das das gewünschte N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, vermittelt das Plasmid die genetische Information zur Herstellung von N-Acylneuraminat- Aldolase. Dementsprechend wächst die zu selektierende Transformante in einem mit Ampicillin und Sialinsäure als einziger Kohlenstoffquelle angereicherten Medium.

Auf diese Weise kann die gewünschte Transformante erhalten werden. Sie ist resistent gegen ein Antibiotikum, wächst in einem Sialinsäure-enthaltenden Minimalmedium und verfügt über die Fähigkeit, große Mengen N-Acylneuraminat-Aldolase in Medien zu bilden, die keine induzierenden Substanzen wie Sialinsäure enthalten.

Keines der bislang bekannten Bakterien der Gattung Escherichia weist eine solche bemerkenswert verbesserte Enzym-Herstellungskapazität auf. Darüber hinaus war nicht bekannt, daß die üblichen Bakterien der Gattung Escherichia infolge genetischer Rekombinationsverfahren eine derartige Enzymbildungskapazität erlangen können. Ferner war nicht bekannt, daß zur Bildung großer Mengen N-Acylneuraminat-Aldolase befähigte Transformanten in einem Sialinsäure-freien Medium wachsen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Plasmids in der entsprechenden Transformante zur Herstellung von N-Acylneuraminat-Aldolase (vgl. Anspruch 2).

Die zu verwendenden Medien zur Inkubation der Transformante sind synthetische, halbsynthetische oder natürliche Medien, wie sie häufig zur Inkubation von Bakterien verwendet werden. Sie enthalten Nährstoffe, wie Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Verbindungen. Beispiele günstiger Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Glucose, Fructose, Invertzucker, verzuckerte Stärke, Sorbit oder Glycerin, organische Säuren, wie Brenztraubensäure, Äpfelsäure oder Bernsteinsäure. Beispiele günstiger Stickstoffquellen sind Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydroxid, Ammoniumtartrat, Ammoniumacetat oder Harnstoff. Beispiele günstiger Nährstoffe, die sowohl als Stickstoff- als auch als Kohlenstoff-Quelle angeboten werden können, sind Pepton, Fleischextrakt oder Maisquellwasser. Beispiele günstiger anorganischer Verbindungen sind Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Natriumhydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Eisen(II)-chlorid, Eisen(III)-sulfat, Eisen(III)-chlorid, Mangansulfat oder Manganchlorid. Beispiele weiterer günstiger Nährstoffe sind Hefeextrakt oder Vitamine.

Die Transformante kann sowohl in einem flüssigen als auch in einem festen Medium inkubiert werden. Meistens ist es vorteilhaft, ein flüssiges Medium zu verwenden. Für die Großproduktion ist es besonders vorteilhaft, die Inkubation unter Schütteln oder unter Belüftung und Rühren durchzuführen. Die Inkubationstemperatur beträgt 20 bis 45°C, vorzugsweise 28 bis 37°C. Vorteilhaft ist es, das Medium auf einen pH-Wert von 6 bis 9 mit einem geeigneten Neutralisierungsmittel während der Inkubation einzustellen. Gewöhnlich wird die höchste N-Acylneuraminat-Aldolase-Aktivität erhalten, wenn die Transformante 10 bis 50 Stunden inkubiert wird. Das Enzym liegt in der Regel intrazellulär vor. Deshalb wird es aus der Kultur durch Ernten der Zellen mittels Zentrifugation oder ähnlicher Verfahren, Aufschluß der Zellen durch Beschallung, Verreiben mit Glasperlen oder durch "French-press"-Behandlung und nachfolgende Extraktion des Enzyms aus dem erhaltenen Zellaufschluß gewonnen. Das Extrakt wird nachfolgend in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration behandelt. Es wird gereinigte N-Acylneuraminat-Aldolase erhalten.

Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte des neuen rekombinanten Plasmids pMK6.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 (1) Herstellung chromosomaler DNA aus dem N-Acylneuraminat- Aldolase-bildenden Stamm E. coli K12C600

E. coli K12C600 wird in einem L-Medium der folgenden Zusammensetzung bei 37°C etwa 3 Stunden unter Schütteln inkubiert. Die Zellen werden in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt. Der Stamm E. coli K12C600 ist jederzeit erhältlich bei Dr. Barbara J. Bachmann, E. coli Genetic Stock Center, Yale University School of Medicine, 333, Cedar Street, P. O. Box 3333, New Haven, Conn. 06510, U. S. A. und ist ferner beschrieben in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor 1982 auf Seite 504.

Zusammensetzung des L-Mediums:

Pepton10 g/Liter Hefeextrakt 5 g/Liter Glucose 1 g/Liter NaCl 5 g/Liter;

der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt.

DNA wird aus den Zellen nach der Phenol-Methode von Saito und Miura (a.a.O.) extrahiert. Nach der Reinigung werden 3,8 mg chromosomale DNA erhalten.

(2) Herstellung von Vektor-DNA und Spaltung mit einem Restriktions-Enzym

DNA des Plasmids pBR322 wird wie folgt hergestellt. GPM-Medium der nachstehend beschriebenen Zusammensetzung wird mit E. coli K12C600 enthaltend das Plasmid pBR322 angeimpft. Es wird bei 37°C bis zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase inkubiert und anschließend nach Zugabe von Chloramphenicol bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml über Nacht weiter inkubiert.

Zusammensetzung des GPM-Mediums:

Glucose10 g Pepton10 g NH₄Cl 1 g Na₂HPO₄ · 12 H₂O15,2 g KH₂PO₄ 3 g NaCl 3 g Na₂SO₄ 0,115 g MgCl₂ · 6 H₂O 0,083 g Hefeextrakt 1 g vollentsalztes Wasser auf 1 Liter

Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren werden Zellen erhalten, die eine große Menge Plasmid-DNA enthalten. 16 Stunden nach der Zugabe von Chloramphenicol werden die Zellen geerntet und durch Behandlung mit Lysozym und SDS (Natriumdodecylsulfat) lysiert. Das Lysat wird bei 30 000 × g 1 Stunden ultrazentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird konzentriert und über einen Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid- äquilibrierten Dichtegradienten zentrifugiert. Es werden 700 µg DNA des Plasmids pBR322 erhalten.

(3) Insertion des chromosomalen DNA-Fragments in den Vektor

10 µg gemäß (1) erhaltener chromosomaler DNA werden mit der Restriktionsendonuklease Hind III 30 Minuten bei 37°C partiell gespalten. Die Spaltung wird dann durch 10minütige Hitzebehandlung bei 65°C abgebrochen. Gleichermaßen werden 10 µg chromosomale DNA 60 Minuten mit Hind III gespalten und hitzebehandelt. Ferner werden auf die gleiche Art und Weise 10 µg chromosomale DNA 120 Minuten mit Hind III gespalten und anschließend hitzebehandelt. Diese partiell gespaltenen DNA-Fragmente werden vermischt. Daneben wird DNA des Vektors pBR322 vollständig mit der Restriktionsendonuklease Hind III gespalten und nachfolgend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Es werden DNA-Fragmente von pBR322 erhalten.

Die Gesamtmenge der chromosomalen DNA-Fragmente wird mit 5 µg der pBR322-DNA-Fragmente vermischt. Sie werden 16 Stunden tei 10°C mit T₄-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP und Dithiothreit ligiert. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten bei 65°C erhitzt. Zum Reaktionsgemisch wird dann ein zweifaches Volumen Äthanol zugegeben. Die DNA, die nunmehr auch rekombinante Plasmid-DNA enthält, fällt dabei aus und wird gesammelt.

(4) Transformation mit rekombinanter Plasmid-DNA

(I) Zunächst wird der Bakterienstamm E. coli K12C600 in einem Mutationsverfahren unter Verwendung von N-Methyl-N′-nitro- N-nitrosoguanidin N-Acylneuraminat-Aldolase-defizient gemacht. Mit einer Impföse E. coli K12C600 wird ein Medium, enthaltend 0,5 bis 1 Gewichtsprozent Fleischextrakt und 0,5 bis 1 Gewichtsprozent Hefeextrakt, pH 7,0 vor der Sterilisierung, (nachstehend als "Medium A" bezeichnet) angeimpft und unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Zellen werden in der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase geerntet, mit sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in sterilisierter Kochsalzlösung suspendiert. Die Konzentration beträgt 5 × 10⁸ Zellen/ml. N-Methyl-N′-nitro-N- nitrosoguanidin wird zu dieser Suspension bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugegeben. Die Suspension wird 0,5 bis 1 Stunde bei 37°C leicht geschüttelt und anschließend zentrifugiert. Die Zellen werden gesammelt. Die Zellen werden mit sterilisierter Kochsalzlösung gewaschen und in sterilisierter Kochsalzlösung suspendiert. Medium A wird mit einem Teil der Suspension angeimpft und 5 bis 12 Stunden bei 30°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt, mit Kochsalzlösung gewaschen und ein Natriumcitrat-freies Dawis-Minimalmedium wird mit ihnen angeimpft. Dieses Medium enthält 0,2 bis 0,5 Gewichtsprozent Sialinsäure (als Kohlenstoffquelle), 0,7 Gewichtsprozent Dikaliumhydrogenphosphat, 0,2 Gewichtsprozent Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 Gewichtsprozent Ammoniumsulfat und 0,01 Gewichtsprozent Magnesiumsulfat, pH 6,8 vor der Sterilisierung (nachfolgend als "Medium B" bezeichnet). Es wird 3 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach Zugabe von Penicillin G bis zu einer Endkonzentration von 100 Einheiten/ml wird die Suspension 0,5 bis mehrere Stunden bei 37°C weiter inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt, in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in einer Verdünnungsreihe verdünnt. Die gewünschte Verdünnungsstufe wird auf einem festen Medium ausgestrichen. Dieses Medium enthält 0,2 Gewichtsprozent Glucose, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Agar. Der pH-Wert beträgt 6,8 vor der Sterilisation. Die Konzentration der anorganischen Substanzen waren dieselben wie beim Davis-Minimal-Medium. Dieses feste Medium wird nachfolgend als "Medium C" bezeichnet. Das Inoculum wird bei 37°C inkubiert. Mit der Replikatechnik werden die entstehenden Kolonien auf zwei verschiedene feste Medien übertragen. Das erste feste Medium wird durch Zugabe von Agar zum Medium B (nachstehend) als "Medium BA" bezeichnet) erhalten. Das zweite Medium ist Medium C. Die Kolonien werden 12 bis 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Ein auf Medium C wachsender Stamm, der nicht auf Medium BA wächst, wird isoliert. Dieser Stamm assimiliert keine Sialinsäure und ist somit ein N-Acylneuraminat-Aldolase-defizienter Stamm.

Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird ein N-Acylneuraminat- Aldolase-bildender Stamm der Gattung Escherichia in wiederholbarer Weise N-Acylneuraminat-Aldolase-defizient gemacht.

(II) Der wie vorstehend beschrieben durch Mutation von E. coli K12C600 mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin abgeleitete N-Acylneuraminat-Aldolase-defiziente Stamm wird in 10 ml L-Medium zur Mitte der logarithmischen Wachstumsphase inkubiert. Die Kultur wird zweimal mit Tris-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen. Der Puffer enthält 50 mM Calciumchlorid. Es werden kompetente Zellen gewonnen, d. h. Zellen, die DNA aufnehmen können. Zu 0,4 ml einer Suspension dieser kompetenten Zellen werden 0,1 ml der gemäß (3) erhaltenen DNA-Lösung mit rekombinanter Plasmid-DNA zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0°C inkubiert und dann 2 Minuten eines Hitzeschock bei 42°C unterworfen. Dabei nehmen die Zellen DNA auf.

Die Zellsuspension wird zu L-Medium zugegeben. Es wird 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Dabei wird die Transformations- Reaktion abgeschlossen. Die Zellen werden geerntet, mit sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und suspendiert. Die Suspension wird auf einer Minimalmedium-Kulturplatte ausgestrichen und 2 Tage bei 37°C inkubiert. Die Minimal-Medium-Platte wird durch Lösen von 2 g Sialinsäure, 1 g (NH₄)₂SO₄, 7 g K₂HPO₄, 2 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 20 mg Leucin, 20 mg Threonin und 1 mg Thiamin in 1 Liter destilliertem Wasser hergestellt. Der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt. Es werden 20 g Agar zur Lösung zugegeben, das Gemisch wird sterilisiert. Anschließend werden 10 µg/ml Ampicillin vor der Verfestigung des Mediums zugesetzt. Die entstehenden Kolonien werden entnommen. Zellen, die Ampicillin-resistent sind und intrazelluläre N-Acylneuraminat- Aldolase-Aktivität aufweisen, werden selektiert. Es wird die Transformante RC-H1/pMK2 erhalten. Das aus der Transformante isolierte rekombinante Plasmid pMK2 hat eine Größe von 14,2 kb, bestimmt durch Elektrophorese.

(5) Umclonierung des Plasmids mit der genetischen Information für die N-Acylneuraminat-Aldolase-Bildung

Die gemäß (4) erhaltene Transformante wird in 100 ml L-Medium inkubiert. Dann wird sie mit Chloramphenicol gemäß (2) behandelt. Die Zellen werden geerntet und mit sterilem Wasser gewaschen. Nach Behandlung der vorstehend genannten Zellen nach dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research Bd. 7 [1979] 1513-1523) wird eine Lösung des rekombinanten Plasmids (nachstehend als "pMK2" bezeichnet), das die genetische Information für die N-Acylneuraminat- Aldolase-Bildung trägt, in sterilem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) hergestellt.

Die Lösung wird einer Agarosegel-Elektrophorese (0,7% Agarose, 90 V, 5 Stunden) unterworfen. Die pMK2-Bande wird durch Aufsprühen von Äthidiumbromid auf das Agarose-Gel unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die pMK2-Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit TE-Puffer in einen Dialyseschlauch gefüllt. Durch 3stündige Elektrophorese bei 90 V wird das DNA aus dem 0,7%igen Agarosegel eluiert. Das Agarosegel wird entfernt. Das Äthidiumbromid wird durch Extraktion mit einer Isopropanol-gesättigten wäßrigen Cäsiumchloridlösung aus der verbleibenden Lösung extrahiert. Zur erhaltenen Lösung wird ein zweifaches Volumen Äthanol zur Fällung der enthaltenen DNA zugegeben. 90 µg der so erhaltenen DNA des Plasmids pMK2 werden in 5 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gelöst.

Gemäß (4) werden kompetente Zellen des Stammes E. coli K12C600 (nicht mutiert) hergestellt. Sie werden mit der vorstehend isolierten DNA des Plasmids pMK2 transformiert. Die Transformanten werden auf einer Minimal-Medium-Platte, angereichert mit 10 µg/ml Ampicillin, inkubiert. Die entstehenden Kolonien werden abgetrennt. Es werden Zellen gesammelt, die Ampicillin-resistent sind und intrazelluläre N-Acylneuraminat-Aldolase-Aktivität aufweisen. Es wird die Transformante RC-K12C600/pMK2 erhalten.

(6) Subclonierung des N-Acylneuraminat-Aldolase-Gens

10 µg DNA des Plasmids pMK2 werden gemäß (5) aus der in (5) hergestellten Transformante RC-K12C600/pMK2 isoliert. Die erhaltene Plasmid-DNA wird in einer einstündigen Doppelspaltung bei 37°C mit den Enzymen Eco RI und Hind III unterworfen. Die Spaltung wird durch 10minütiges Erhitzen der entstehenden Fragmente bei 65°C abgebrochen. Daneben wird DNA des Vektors pBR322 in einer Doppelspaltung mit den Restriktionsendonukleasen Eco RI und Hind III gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt. Es werden DNA-Fragmente von pBR322 erhalten.

Die pMK2 DNA-Fragmente werden mit 5 µg der pBR322 DNA-Fragmente vermischt und 16 Stunden bei 10°C mit T₄-Phagen-DNA- Ligase in Gegenwart von ATP und Dithiothreit ligiert. Es werden rekombinante Plasmide erhalten.

Gemäß (4) werden kompetente Zellen von E. coli K12C600 hergestellt und mit den wie vorstehend beschrieben erhaltenen rekombinanten Plasmiden transformiert.

Die Transformanten werden auf einer Minimal-Medium-Platte, angereichert mit 10 µg/ml Ampicillin, inkubiert. Die erhaltenen Kolonien werden abgetrennt und Zellen werden selektiert, die Ampicillin-resistent sind und intrazelluläre N-Acylneuraminat-Aldolase-Aktivität aufweisen. Es wird die Transformante RC-K12C600/pMK6 erhalten.

Die Transformante enthält das erfindungsgemäße rekombinante Plasmid, das ein chromosomales DNA-Fragment mit dem N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt. Dieses Plasmid wird im folgenden als "pMK6" bezeichnet.

Fig. 1 zeigt eine Restriktionskarte von pMK6. Das Plasmid enthält ein von pBR322 abgeleitetes DNA-Fragment und hat Pst I, Pvu II, Sal I und BamH I-Spaltstellen. Außerdem enthält es ein chromosomales DNA-Fragment, das von einem N-Acylneuraminat- Aldolase-bildenden Bakterium abgeleitet ist. Die beiden Fragmente sind an der Eco RI- und der Hind III-Spaltstelle miteinander ligiert. Das Plasmid hat eine Größe von etwa 5,5 kb.

Die das Plasmid pMK6 tragende Transformante wurde ursprünglich beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibaraki-ken 305, Japan, am 22. August 1984 unter der Bezeichnung E. coli K12C600/pMK6 unter der Hinterlegungs-Nr. FERM P-7797 hinterlegt. Die Hinterlegung wurde zu einer Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag am 8. Juli 1985 umgewandelt. Die neue Hinterlegungs-Nr. ist FERM BP-833.

Beispiel 2 Herstellung von N-Acylneuraminat-Aldolase mit der erfindungsgemäßen Transformante

Die in (6) erhaltene Transformante wird auf N-Acylneuraminat- Aldolase-Herstellung in einem Sialinsäure-enthaltenden Medium und in einem Sialinsäure-freien Medium (Hefeextrakt-Medium) im Vergleich mit dem DNA-Spender E. coli K12C600 getestet.

Die Medien haben die folgende Zusammensetzung.

Zusammensetzung des Sialinsäure-enthaltenden Mediums:

Sialinsäure5 g (NH₄)₂SO₄1 g K₂HPO₄7 g KH₂PO₄2 g MgSO₄ · 7 H₂O0,1 g Hefeextrakt0,5 g Destilliertes Wasser auf1 Liter (pH 6,0).

Zusammensetzung des Hefeextrakt-Mediums:

Hefeextrakt20 g Bernsteinsäure10 g Destilliertes Wasser auf 1 Liter (pH 6,0).

In getrennten Ansätzen wird jedes Medium mit jedem Mikroorganismus angeimpft und 24 Stunden unter Schütteln bei 30°C inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation gesammelt, in 100 ml 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, suspendiert und beschallt. Das Enzym wird aus dem Zellaufschluß extrahiert. Das Extrakt wird durch Zentrifugation in einen Überstand und ein Zentrifugat getrennt. Der Überstand ist eine rohe Enzymlösung.

Die Aktivität der Enzymlösung wird nach der Methode von Barnett et al., Biochemical Journal, Bd. 125 (1971) 275 bestimmt. Eine Einheit des Enzyms N-Acylneuraminat-Aldolase ist die Enzymmenge, die 1 Mikromol N-Acylneuraminsäure pro Minute bei einer Temperatur von 37°C abbaut. Die Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

Tabelle I zeigt, daß eine große Menge N-Acylneuraminat-Aldolase bei Verwendung des Sialinsäure-freien Mediums erhalten werden kann.

Ein rohes Enzym-Pulver kann aus der rohen Enzym-Lösung in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, nachfolgende Zentrifugation, Dialyse und Gefriertrocknung erhalten werden. Das Enzym-Pulver kann durch Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration oder in ähnlicher Weise zu einem Standard-Erzeugnis gereinigt werden.

Claims (2)

1. In E. coli replizierbares rekombinates Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein chromosomales DNA-Fragment trägt, das ein von einem N-Acylneuraminat-Aldolase-bildenden Bakterium der Gattung Escherichia abgeleitetes N-Acylneuraminat-Aldolase-Gen trägt, eine Größe von etwa 5,5 kb hat und die in der in Fig. 1 abgebildeten Restriktionskarte enthaltenen Spaltstellen aufweist, wobei die Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Verwendung des Plasmids nach Anspruch 1 in einem damit transformierten N-Acylneuraminat-Aldolase-bildenden Bakterium der Gattung Escherichia oder N-Acylneuraminat-Aldolase- defizienten Stamm der Gattung Escherichia zur Herstellung von N-Acylneuraminat-Aldolase in einem Sialinsäure- freien Medium.