DE3423899C2

DE3423899C2 -

Info

Publication number: DE3423899C2
Application number: DE3423899A
Authority: DE
Inventors: John Everett Whitehouse Station N.J. Us Mccullough
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1983-06-30
Filing date: 1984-06-28
Publication date: 1993-04-22
Also published as: IT8421694A1; JPH0545234B2; JPS6037989A; US4554250A; CA1222708A; GB8415953D0; JPH0614767A; FR2550547B1; GB2142336A; IT8421694A0; FR2550547A1; DE3423899A1; GB2142336B; JPH0661261B2; IT1176375B

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 und 2 an gegebene Plasmid pJM3, das Verfahren zu dessen Herstellung nach Anspruch 3 und dessen Verwendung nach Anspruch 6 sowie Bacillus megaterium ATCC 39 383 nach Anspruch 4 und dessen Herstellungsverfahren nach Anspruch 5.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung der Penicillin-Acylase in höherer Ausbeute sowie für die Herstellung der Penicillin-Acylase verwendbare Trans formanten von Bacillus megaterium bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch Anwendung der DNA-Rekombinationstech niken gelöst. Dadurch können weitaus höhere Penicillin-Acy lase-Produktionsraten erzielt werden, als es mit den bisher angewandten konventionellen Techniken der Mutagenese und an schließend Mutantenisolierung möglich war. Erfindungsge mäß wird ein ausgewähltes chromosomales DNA-Fragment aus Bacillus megaterium isoliert, welches ein geeignetes Gen zur Steigerung der Penicillin-Acylase-Herstellung enthält. Dieses DNA-Fragment wird in einen "multi-copy" Vektor inseriert, der in gram-positiven Bakterien repliziert werden kann. Der auf diese Weise hergestellte "multi-copy" Vektor wird durch Trans formation in einen Wirtsorganismus eingeschleust. Der trans formierte Wirtsorganismus ist ein bereits Penicillin-Acylase- synthetisierender Stamm, nämlich Bacillus megaterium. Durch die Transformation entsteht ein Stamm von Bacillus megaterium, der eine erhöhte Penicillin-Acylase Produktion aufweist.

Erfindungsgemäß wird ein Plasmid aus Bacillus subtilis, näm lich pPL608 als Klonierungsvektor verwendet. Dieses Plasmid enthält ein bestimmtes chromosomales DNA-Fragment aus Bacillus megaterium, dessen Länge zwischen 1 kb und 10 kb liegt. Vorzugsweise hat das chromosomale DNA-Fragment eine Länge von 2,7 kb. Dieses Fragment wiederum beinhaltet ein geeigne tes Gen zur Erhöhung der Penicillin-Acylase-Herstellung. Das vorstehend genannte, bevorzugte Plasmid wird im folgen den als Plasmid pJM3 bezeichnet.

Erfindungsgemäß wird auch ein neuer Stamm von Bacillus megaterium, nämlich SC3593 (pJM3) bereitgestellt, der neue erhöhte Acylase-Produktkapazität aufweist und der den Klonierungsvektor bzw. das Plasmid pPL608 enthält, wobei pPL608 das 2,7 kb lange chromosomale DNA-Fragment als Insertion trägt.

Das Plasmid pJM3 wird aus dem bekannten Bacillus subtilis-Plasmid pPl608 hergestellt; vgl. Lovett, P. S. et al., "Expression of a Foreign Procaryotic Gene in Bacillus subtilis in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals" (Hsg. Hollaender, A. et al.), S, 51-59, Plenum Press, New York, 1982. Dabei wird ein Hind III-Fragment einer Länge von 2,7 kb aus Bacillus megaterium DNA in die einzige Hind III-Stelle von pPL608 eingebaut.

Das aus der chromosomalen DNA von Bacillus megaterium ausgewählte Hind III-Fragment beinhaltet ein Gen, das in jedem Stamm von Bacillus megaterium eingebracht werden kann, der Penicillin-Acylase bildet. Dazu wird die Transformationsmethode von Brown und Carlton verwendet; vgl. "Plasmid Mediated Transformation in Bacillus megaterium", J. Bact. 142, S. 508-512, 1980. Die mit pJM3 transformierten Bacillus megaterium-Stämme zeigen höhere Penicillin-Acylase-Titer als die identischen Stämme, die kein Plasmid enthalten.

Wird ein anderes als das 2,7 kb DNA-Fragment aus chromosomaler DNA von Bacillus megaterium ausgewählt, nämlich eines, dessen Länge 1 kb bis 10 kb beträgt, werden andere Restriktionsenzyme als Hind III verwendet, nämlich MboII, HpaII, HaeIII oder EcoRI. Diese 1 bis 10 kb langen DNA-Fragmente enthalten ein für die Penicillin-Acylase-Herstellung geeignetes Gen und können nach den nachfolgend beschriebenen Methoden als Insertion eines geeigneten Plasmids in Bacillus subtilis eingebracht werden. Außerdem kann das genannte Plasmid nach den nachfolgend beschriebenen Methoden in Bacillus megaterium cloniert werden.

Die beigefügte Figur zeigt eine Restriktionskarte von pJM3. Dabei befindet sich das durch einen schwarzen Balken symbolysierte, eingebaute Bacillus megaterium DNA-Fragment zwischen den beiden Hind III-Spaltstellen.

Folgende Mikroorganismen sind unter den genannten Hinterlegungs-Nummern bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, erhältlich:
Bacillus megaterium SC3593, ATCC 14945,
Bacillus megaterium SC3593, ATCC 14945 (pJM3) - ATCC 39383.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Ein Plasmid pJMI, das ein chromosomales DNA-Fragment aus Bacillus megaterium (SC3593, ATCC 14945) enthält, wurde wie folgt konstruiert.

Es wurde der Expressionsvektor pPL608 aus Bacillus subtilis verwendet (Lovett, P.S. et al., "Expression of a Foreign Procaryotic Gene in Bacillus subtilis in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals" (Hrsg. Hollaender, A. et al.) S. 51-59, Plenum Press, New York 1982). Dieser Vektor ver mittels seinem Wirt Resistenz gegenüber Neomycin und Chlor amphenicol. Innerhalb seines Chlormaphenicol-Acetyl-Trans ferase-Gens (CAT) enthält er eine Hind III-Restriktionsspalt stelle.

Durch den Einbau chromosomaler Bacillus megaterium Hind III- DNA-Fragmente in diese Hind III-Spaltstelle wurde eine kleine Plasmidgenbank hergestellt. Dazu wurde zunächst sowohl das Plasmid pPL608 als auch die Bacillus megaterium DNA mit dem Restriktionsenzym Hind III gespalten. Die so entstandenen DNA-Moleküle wurden vermischt und mit Hilfe der Polynukleotid ligase rezirkularisiert. Die Ligierungsprodukte wurden nach der Transformationsmethode von Keggins et al. ("Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus substilis and properties of vector plasmid pUB110", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75 (1978) in Bacillus subtilis eingebracht. Auf diese Weise erhielt man 1500 Neomycin resistente, Chloramphenicol-sensitive Bacillus subtilis- Clone. Mit Hilfe einer Stichprobe von 20 Plasmiden wurde die durchschnittliche Größe der Hind III-Insertionen in der vorstehend beschriebenen Bacillus megaterium (SC3593)-Genbank zu 3,2 kb durch Größenabmessungen ermittelt.

Der Bacillus megaterium-Stamm SC3593 (pJM3), der das Plasmid pJM3 enthält, wurde wie folgt selektiert.

Die Plasmid-DNA der Genbank wurde in Bacillus megaterium SC3593 durch Transformation eingebracht. Dazu wurde im wesentlichen die von Brown und Carlton entwickelte Methode zur Tranformation von Bacillus megaterium verwendet; vgl. "Plasmid Mediated Transformation in Bacillus megaterium", J. Bact. 142, S. 508-512 (1980). Veränderte Parameter werden nachfolgend beschrieben. Eine Lysozym-Konzentration von 1 mg/ml wurde zur Herstellung von Protoplasten benötigt. Diese Protoplasten ließ man auf DM-3-Platten ohne Antibiotika- Selektionen regenerieren und auf die transformierten Zellen wurden nachfolgend durch Herstellung von Replika auf Antibiotika enthaltenden Medien (Neomycin, 2,5 µg/ml) selektiert. Die Transformanten wurden nach der schnellen Filterpapier plattenabsuchmethode von Szweczuk et al. ("Colorimetric assay of penicillin amidase activity using phenylacetyl aminobenzoic acid as substrate", Analytical Biochem. 103, S. 166-169 (1980) abgesucht.

Dabei wurden die folgenden Modifikationen eingebracht. Nachdem die Filter von den Platten abgenommen worden waren, wurden sie 7 Minuten bei 65°C getrocknet. Die Natriumnitrit- Konzentration und die des sauren Sprühmittels wurden zehnfach erhöht. Beim Nachweis der erhöhten Penicillin-Acylase- Produktion wurde die Substratkonzentration halbiert und Phenylessigsäure wurde bis zu einer Endkonzentration von 2% des Substratpuffers zugefügt. Mit Hilfe dieser Methode konnten Kolonien untersucht werden, die auf Tryptose-Blut-Agar vermehrt wurden.

Eine der Bacillus megaterium-Transformanten ergab bei diesem Test ein intensiveres Signal als die nicht transformierten SC3593-Zellen in wiederholten Tests.

Ein 7,7 kb großes Plasmid (pJM3) wurde aus diesem Stamm (SC3593 (pJM3)) isoliert. Eine Spaltung dieses Plasmids mit Hind III und eine anschließende Elektrophorese auf einem 1%igen Agaronsegel zeigten, daß dieses Plasmid ein größen identisches Fragment zu pPL608 sowie ein weiteres 2,7 kB langes DNA-Fragment enthält.

Der Bacillus megaterium-Stamm SC3595 (pJMI) wurde wie folgt auf die Penicillin-Acylase-Bildung untersucht.

100 ml eines Nährmediums, das enzymatisch hydrolysiertes Casein (4,0% w/v) und Maisquellwasser (1,0% w/v) enthält, einen pH von 6,8 hat und sich in einem 500 ml-Erlenmeyer- Kolben befindet, wurde mit Bacillus megaterium-Zellen angeimpft. Das Inoculum wurde aus einem Schrägagarröhrchen entnommen, das vorher 24 Stunden bei 30°C inkubiert worden war. Die Kolben wurden auf einem Rotationsschüttelgerät 24 Stunden lang bei 30°C und 280 U/min geschüttelt. Dann wurden 5 ml entnommen und in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 100 ml eines Mediums enthielt, das aus enzymatisch hy drolysiertem Casein (3,0%) und Hefeextrakt (0,5%) bestand und einen pH von 6,8 hatte. Dem Medium war unmittelbar vor dem Animpfen Phenylessigsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,2% zugesetzt worden. Nach 24 und 42 Stunden Inkubation auf einem Rotationsschüttelgerät bei 30°C und 280 U/min wurden die Kulturen geerntet und auf Penicillin-Acylase- Aktivität getestet.

Die Penicillin-Acylase-Aktivität wurde photometrisch bestimmt. Dazu wurde Phenylacetylaminobenzoesäure als chromogenes Substrat verwendet. Diese Methode ist von Szweczuk et al. beschrieben ("Colorimetric Assay of Penicillin Amidase Activityl Using Phenylacetyl Aminobenzoic Acid as Substrate". Analytical Biochem. 103, S. 166-169 (1980)).

Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Acylase-Bildung von Bacillus megaterium SC3593-Stämmen

Aus den in der Tabelle zusammengefaßten Testergebnissen geht hervor, daß die Penicillin-Acylase-Ausbeute von SC3593 (pJM3) 20% höher ist als die von SC3593. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit dem qualitativen Agarplatten-Test.

Claims

1. Plasmid pJM3, dadurch gekennzeichnet, daß es die gesamte Nukleotidsequenz des Bacillus subtilus Plasmids pPL608 enthält und darüber hinaus über eine Insertion verfügt, die ein 1 bis 10 kb langes chromo somales DNA-Fragment aus Bacillus megaterium Sc3593 ist; die Insertion enthält ein zur Steigerung der Peniclillin- Acylase-Herstellung geeignetes Gen und ist in die Hind III-Spaltstelle von pPL608 eingebaut.

2. Plasmid pJM3 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion ein 2,7 kB langes chromosomales Fragment aus Bacillus megaterium SC3593 ist.

3. Verfahren zur Herstellung des Plasmids pJM3 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Plasmid pPL608 mit Hind III linearisiert, und
b) ein chromosomales DNA-Fragment aus Bacillus megaterium SC3593 isoliert, welches das geeignete Penicillin- Acylase-Gen enthält, und
c) diese chromosomale DNA mit Hind III spaltet, und
d) das linearisierte Plasmid pPL608 und das chromosomale DNA-Fragment aus Bacillus megaterium SC3593 mit einander ligiert.

4. Bacillus megaterium SC3593 (pJM3) mit der ATCC-Hinterlegungs- Nummer 39383.

5. Verfahren zur Herstellung der Transformante nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus megaterium SC3593 mit pJM3 transformiert.

6. Verwendung eines mit dem Plasmid pJM3 transformierten Stammes von Bacillus megaterium zur Herstellung von Penicillin-Acylase.