JPH0661261B2 - ペニシリンアシラーゼの増産方法 - Google Patents

ペニシリンアシラーゼの増産方法

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JPH0661261B2
JPH0661261B2 JP5004758A JP475893A JPH0661261B2 JP H0661261 B2 JPH0661261 B2 JP H0661261B2 JP 5004758 A JP5004758 A JP 5004758A JP 475893 A JP475893 A JP 475893A JP H0661261 B2 JPH0661261 B2 JP H0661261B2
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bacillus megaterium
pjm3
plasmid
penicillin acylase
bacillus
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    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はペニシリンアシラーゼの
増産方法、更に詳しくは、ペニシリンアシラーゼの産生
を増大する方法およびペニシリンアシラーゼの産生に有
用な改良菌株のバチルス・メガテリウム(Ｂacillus me
gaterium)に関する。上記増産方法において、ペニシリ
ンアシラーゼ産生を増大する適当な遺伝子を含むバチル
ス・メガテリウムの染色体ＤＮＡフラグメントの挿入物
(insert)を含有するバチルス・サブチリス(Ｂacillus
subtilis,枯草菌)プラスミドはバチルス・メガテリウム
にクローン化され、該プラスミドを含有するバチルス・
メガテリウムをペニシリンアシラーゼの産生に用いる。
【０００２】
【発明の構成と効果】本発明によれば、組換えＤＮＡ技
術の使用によりペニシリンアシラーゼの収率を改良する
方法が提供され、ここで該収率は通常の変異誘発および
スクリーニング技術を用いて得られるこれまでのものよ
りも実質的に大である。ペニシリンアシラーゼの収率を
改良する本発明方法は、バチルス・メガテリウムから選
択した染色体ＤＮＡフラグメント(該フラグメントはペ
ニシリンアシラーゼの産生を増大するのに適当な遺伝子
を含有)を単離し、該ＤＮＡフラグメントをグラム陽性
菌において複製する多複写(multi−copy)ベクターに挿
入し、次いで該ＤＮＡフラグメントを含む生成した多複
写ベクターをペニシリンアシラーゼの合成について既に
知られている宿主菌(即ち、バチルス・メガテリウム)に
形質転換してペニシリンアシラーゼ産生性を増大したバ
チルス・メガテリウムを生成することから成る。
【０００３】更に本発明によれば、挿入物としてバチル
ス・メガテリウムから選択した染色体ＤＮＡフラグメン
トを包含するクローニングベクタープラスミド(バチル
ス・サブチリスから得られる)、すなわちpＰＬ６０８が
提供される。該染色体ＤＮＡフラグメントは１〜１０Ｋ
b、好ましくは２.７Ｋbの染色体ＤＮＡフラグメントで
あり、また該フラグメントはペニシリンアシラーゼ産生
を増大するのに適当な遺伝子を包含する。上記ベクター
プラスミドpＰＬ６０８に挿入物を組込んだ好ましいプ
ラスミドをプラスミドpＪＭ３と称す。
【０００４】加えて、本発明によれば、アシラーゼ産生
性を増大した新種菌株のバチルス・メガテリウム、即ち
ＳＣ３５９３(pＪＭ３)が提供され、これは２.７Ｋb染
色体ＤＮＡフラグメントを含有するクローニングベクタ
ーまたはプラスミドpＰＬ６０８を包含する。
【０００５】プラスミドpＪＭ３はバチルス・サブチリ
スプラスミドpＰＬ６０８から形成され[Ｌovett,Ｐ.Ｓ.
ら、“Ｅxpression of a Ｆoreign Ｐrocargotic
Ｇenein Ｂacillus subtilis in Ｇenetic Ｅngin
eering of Ｍicroorganisms for Ｃhemicals"(Ｈol
laender,Ａ．ら編)、５１〜５９頁(Ｐlenum Ｐress,Ｎ
ew Ｙork,１９８２年)]、これはその特異なＨind Ｉ
ＩＩ部位に挿入されたバチルス・メガテリウムＤＮＡの
Ｈind ＩＩＩフラグメント(２.７Ｋb)を含有する。
【０００６】このバチルス・メガテリウム染色体ＤＮＡ
のＨind ＩＩＩフラグメントはペニシリンアシラーゼ
合成能を有するいずれのバチルス・メガテリウム株にも
挿入することができる遺伝子であって、その挿入はブラ
ウンおよびカールトンの“Ｐlasmid Ｍediated Ｔran
sformation in Ｂacillus megaterium",Ｊ．Ｂac
t．,１４２,５０８〜５１２頁(１９８０年)に記載の形
質転換操作を用いて行なうことができる。かかるpＪＭ
３を有するバチルス・メガテリウム株は、該プラスミド
を有しない同一菌株よりも高い力価のペニシリンアシラ
ーゼを産生する。
【０００７】バチルス・メガテリウムから選択される染
色体ＤＮＡフラグメントが２.７ＫbのＤＮＡフラグメン
ト以外の１〜１０Ｋb染色体ＤＮＡフラグメントである
場合には、Ｈind ＩＩＩ以外の制限酵素、即ちＭboＩ
Ｉ、ＨpaＩＩ、ＨaeＩＩＩまたはＥcoＲＩを使用する。
１〜１０ＫbＤＮＡのフラグメント(２.７Ｋbフラグメン
ト以外の)はペニシリンアシラーゼ産生に適当な遺伝子
を包含し、また本明細書に記載の以下に示す操作でバチ
ルス・サブチリスに挿入されて、適当なプラスミドを形
成しうる。このようにして形成されるプラスミドは、本
明細書記載の操作でバチルス・メガテリウムにクローン
化される。
【０００８】添付の図１はpＪＭ３の制限酵素地図であ
る。挿入したバチルス・メガテリウムセグメントは２つ
のＨind ＩＩＩ部位間に位置する。下記の微生物は、
メリーランド州２０８５２,ロックビル、パークラウン
・ドライブ１２３０１のザ・アメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクション(theＡmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollection、ＡＴＣＣ)の永久コレクションから入手
することができる。 バチルス・メガテリウムＳＣ３５９３,ＡＴＣＣ１４９
４５ バチルス・メガテリウムＳＣ３５９３,ＡＴＣＣ１４９
４５(pＪＭ３)−ＡＴＣＣ３９３８３
【０００９】
【実施例】次に挙げる実施例は、本発明の好ましい具体
例である。 実施例 バチルス・メガテリウム(ＳＣ３５９３、ＡＴＣＣ１４
９４５)から、染色体ＤＮＡフラグメントを有するプラ
スミド(pＪＭ１)を以下の要領で調製する。発現ベクタ
ーpＰＬ６０８(バチルス・サブチリス)[Ｌovett,Ｐ.Ｓ.
at.al．,“Ｅxpression of a Ｆoreign Ｐrocaryot
ic Ｇene in Ｂacillus Ｓubtilis in Ｇenetic
Ｅngineering of Ｍicroorganism for Ｇhemical
s"(Ｈollaender Ａ．ら編)、５１〜５９頁(Ｐlenum
Ｐress,Ｎew Ｙork,１９８２年)]を用いる。このベク
ターはネオマイシンおよびクロラムフエニコールの両方
に対する耐性を宿主に付与し、クロラムフエニコールア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子(ＣＡＴ)内にＨind
ＩＩＩ挿入不活性部位を有する。
【００１０】このＨind ＩＩＩ部位にバチルス・メガ
テリウムＨind ＩＩＩ染色体フラグメントを挿入する
ことにより小さいプラスミドライブラリーが構築され
る。これは、pＰＬ６０８およびバチルス・メガテリウ
ムＤＮＡの両方を制限酵素ＨindＩＩＩで開裂すること
により行う。ＤＮＡをポリヌクレオチドリガーゼと混
ぜ、環状に戻す。Ｋeggins らの“Ｍolecular clonig
of genetically activefragments of Ｂacillus
ＤＮＡ in Ｂacillus ｓubtilis and properties
of vector plasmid pＵＢ１１０"(proc．Ｎat．Ｓ
ci．ＵＳＡ７５,１９７８年)に記載の形質転換操作を用
いて上記ＤＮＡをバチルス・サブチリスに導入する。１
５００のバチルス・サブチリスが得られるが、これらは
ネオマイシンに耐性を有するが、クロラムフエニコール
には感受性である。
【００１１】バチルス・メガテリウム(３５９３)Ｈind
ＩＩＩフラグメントのライブラリーにおける挿入物の
平均寸法は、２０のプラスミドのランダムサンプルにお
ける挿入物の寸法測定により３.２Ｋbであることが判
る。プラスミド(pＪＭ３)を含有するバチルス・メガテ
リウム株ＳＣ３５９３(pＪＭ３)を、下記の方法で選択
する。
【００１２】ライブラリーからのプラスミドＤＮＡを形
質転換によりバチルス・メガテリウムＳＣ３５９３に導
入する。使用する形質転換法は、ブラウンおよびカート
ンが開発したバチルス・メガテリウム形質転換法[“Ｐl
asmid Ｍediated Ｔransformation in Ｂacillus
megaterium",Ｊ．Ｂact．,１４２,５０８〜５１２頁(１
９８０年)]に以下の如く変更を加えて使用する。プロト
プラストのため１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム濃度が必要で
ある。抗生物質による選別なしでＤＭ−３平板でプロト
プラストを再生せしめ、形質転換細胞を抗生物質含有培
地(ネオマイシン、２.５μg／ｍｌ)にレプリカ平板培養
して選択する。
【００１３】この形質転換体を、Ｓzweczukらの“Ｃolo
rimetric assay of penicillinamidase activity
using phenylacetyl,aminobenzoic acid as substr
ate“Ａnalytical Ｂiochem．,１０３,１６６〜１６９
頁(１９８０年)に記載の迅速濾紙平板スクリーンでスク
リーニングする。
【００１４】濾紙コロニー検定の方法に下記の如き変更
を加える。濾紙を平板から取出した後、これを６５℃で
７分間乾燥する。亜硝酸ナトリウムおよびＨ酸噴霧の両
方の濃度を１０倍に増大する。高ペニシリンアシラーゼ
プロジューサーを検定するため、基質濃度を半減し、基
質緩衝液に対しフェニル酢酸を２％濃度に加える。この
方法を用いて、トリプトース血液寒天ベース(ＴＢＡ
Ｂ、デイフコ社)平板で発育したコロニーを検定するこ
とができる。
【００１５】プラスミドを有する１つのバチルス・メガ
テリウム形質転換体は、非形質転換ＳＣ３５９３よりも
強いスポットを与える。７.７Ｋbプラスミド(pＪＭ３)
をこの菌株ＳＣ３５９３(pＪＭ３)から単離する。この
プラスミドをＨind ＩＩＩで消化し、１％アガロース
ゲルに電気泳動することにより、プラスミドはpＰＬ６
０８と同一寸法のフラグメントとさらに２.７Ｋbフラグ
メントを含有しているのがわかる。
【００１６】バチルス・メガテリウム株ＳＣ３５９３(p
ＪＭ１)のペニシリンアシラーゼ産生について、下記の
通り試験を行う。
【００１７】酵素加水分解カゼイン(４.０％Ｗ／Ｖ)お
よびコーンスチープリカー(１.０％Ｗ／Ｖ)を含む培地
(pＨを６.８)１００ｍｌを入れた５００ｍｌエルレンマ
イヤーフラスコに無菌ループを用い、３０℃で２４時間
培養した斜面培地からのバチルス・メガテリウム細胞を
接種する。これらのフラスコを回転振盪器(２８０rpm)
にて３０℃で２４時間振盪する。５ｍｌを取出し、これ
を酵素加水分解カゼイン(３.０％)および酵母エキス
(０.５％)を含む培地(pＨ６.８)１００ｍｌを入れた５
００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに接種する。接種直
前に、フェニル酢酸(最終濃度０.２％)を上記培地に加
える。回転振盪器(２８０rpm)にて３０℃、２４時間お
よび４２時間培養したのち、フラスコから培養物を収集
し、ペニシリンアシラーゼを検定する。
【００１８】かかる振盪フラスコブロスについて、Ｓzw
eczukらの“Ｃolormetric Ａssayof Ｐenicillin Ａ
midase Ａctivity Ｕsing Ｐhenylacetyl,Ａminoben
zoic Ａcid as Ｓubstrate",Ａnalytical Ｂioche
m．,１０３,１６６〜１６９(１９８０年)に記載の方法
により、色素産生基質としてフェニルアセチル−アミノ
安息香酸を用い、測光検定でペニシリンアシラーゼの検
定を行う。
【００１９】振盪フラスコ試験の結果を下記表１に示
す。
【表１】
【００２０】上記表１の振盪フラスコ試験結果から明ら
かなようにＳＣ３５９３(pＪＭ３)のペニシリンアシラ
ーゼ収率はＳＣ３５９３のそれより２０％高いことが示
される。これは定量寒天平板検定に一致した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 pＪＭ３の制限酵素地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:11） (Ｃ１２Ｎ 9/84 Ｃ１２Ｒ 1:11）

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 形質転換によりプラスミドpＪＭ３をバ
    チルス・メガテリウムＳＣ３５９３にクローン化するこ
    とを特徴とするＡＴＣＣ寄託番号３９３８３を有するバ
    チルス・メガテリウムＳＣ３５９３(pＪＭ３)の形質転
    換微生物の形成方法。
  2. 【請求項２】 ペニシリンアシラーゼ産生を改良する方
    法であって、バチルス・サブチリスプラスミドpＰＬ６
    ０８の全ヌクレオチド配列およびpＰＬ６０８のＨindＩ
    ＩＩ部位に挿入されたペニシリンアシラーゼの産生を増
    大する適当な遺伝子を含むバチルス・メガテリウムＳＣ
    ３５９３ＤＮＡの１〜１０Ｋb染色体フラグメントから
    なる挿入物を有するプラスミドpＪＭ３を形成し、該プ
    ラスミドpＪＭ３をバチルス・メガテリウムＳＣ３５９
    ３にクローン化してバチルス・メガテリウムＳＣ３５９
    ３(pＪＭ３)を形成し、ついでペニシリンアシラーゼの
    産生にバチルス・メガテリウムＳＣ３５９３(pＪＭ３)
    を用いることを特徴とする方法。
JP5004758A 1983-06-30 1993-01-14 ペニシリンアシラーゼの増産方法 Expired - Lifetime JPH0661261B2 (ja)

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