JPH0856669A - 新規シャトルベクタープラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 次のＤＮＡ領域をもち、大腸菌及びロトコッ
カス(Rhodococcus）属に属する菌株のいずれの細胞内で
も複製可能なシャトルベクタープラスミド。 （Ａ）ロドコッカス属菌株の細胞内で複製増殖可能なＤ
ＮＡ領域。 （Ｂ）大腸菌の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域。 （Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域。 （Ａ）は、ノカルディオフォルム細菌に属する菌株由来
のプラスミド pNC 500またはpNC 903 に含有されるＤＮ
Ａ領域が用いられる。 【効果】 大腸菌及びロトコッカス属細菌内のいずれに
おいても複製可能であって、工業的に利用し得る微生物
の育種改良に用いることができる。特に、プラスミド p
NC500 または pNC903 の制限酵素による開裂部位を利用
して、外来ＤＮＡ断片を導入修飾し、多くの有用なプラ
スミドベクターの開発に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大腸菌及びRhodococcu
s 属に属する菌株の何れの細胞内でも複製可能な新規シ
ャトルベクタープラスミドに関する。更に詳しくは、ノ
カルディオフォルム細菌に属する菌株由来のプラスミド
pNC500又はpNC903に含まれ、 Rhodococcus属に属する菌
株の細胞内で複製可能なＤＮＡ領域を含有するＤＮＡ断
片及び、大腸菌の細胞内で複製可能なＤＮＡ領域を含有
するＤＮＡ断片を含んでなるシャトルベクタープラスミ
ドに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、土壌中より分離したノカルディア
属、ロドコッカス属などのノカルディオフォルム細菌が
オレフィンを酸化して、対応するエポキシド類を生産す
ることが知られている。例えば、土壌中より分離したノ
カルディア・コラリーナは、プロピレンを炭素源として
光学活性エポキシドあるいはトリフルオロプロペンオキ
シド（TFPO) の生産などに利用されている。これらの化
合物は、合成樹脂、医薬、農業などの有機化学製品の製
造原料中間体として広範囲に用いられている。これらの
土壌中より分離したノカルディオフォルム細菌を用い、
更なる菌株改良のため、エポキシド生産能を有するノカ
ルディオフォルム細菌の宿主−ベクター系の開発が以前
から期待されていた。これらの微生物を宿主とするのに
適したベクターの開発はあまりみられない。本発明者ら
は、既にノカルディオフォルム細菌に分類されるエポキ
シド生産株より見いだした、ノカルディオフォルム細菌
の宿主−ベクター系に適用可能な２種類のプラスミド、
即ち Nocardia corallina(ノカルディア・コラリーナ)
B-276 (FERM P-4094) 由来のプラスミド pNC500(特開平
5-244953 号公報を参照) 及び Rhodococcus rhodochro
us P-II-123-1(FERM P-14193) 由来のプラスミド pNC90
3(特願平6-73795 号明細書を参照）を特許出願した。ま
た、ロドコッカス属の一部を宿主とする、宿主−ベクタ
ー系の開発例として、ジャーナル オブ バクテリオロ
ジー(J.Bacteriol.) 170,638(1988)、 アプライド アン
ド エンバイロメンタル マイクロバイオロジー(Appl.
Environ.Microbiol.) 56,2818(1990) 、プラスミド（Pl
asmid) 23,242(1990) 等に数例が報告されているにすぎ
ない。

【０００３】しかしながら、前記するプラスミド pNC50
0 並びに pNC903 を除き、従来より報告されているノカ
ルディオフォルム細菌由来のプラスミドの多くは、ロド
コッカス属の一部のみを宿主にすることができるにすぎ
ないものであった。そのため、より広い範囲のノカルデ
ィオフォルム細菌を宿主として適用でき、宿主のエポキ
シド生産菌から、微生物を育種、改良するために利用で
きる新しいベクタープラスミドの開発が強く要望されて
いる。特には、ノカルディオフォルム細菌を宿主として
適用できるばかりではなく、大腸菌をも宿主として適用
できるベクタープラスミド、即ちノカルディオフォルム
細菌と大腸菌の何れの細胞内でもその複製が行われる大
腸菌−ノカルディオフォルム細菌のシャトルベクタープ
ラスミドとして有用な環状のベクタープラスミドの開発
が強く要望されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記課題を解
決しようとするものである。すなわち、本発明の目的
は、ノカルディオフォルム細菌を宿主として適用できる
ばかりではなく、大腸菌をも宿主として適用できる新規
なベクタープラスミド、即ちノカルディオフォルム細菌
と大腸菌の何れの細胞内でもその複製が行われる新規な
環状シャトルベクタープラスミドを提供することにあ
る。特には、大腸菌とノカルディオフォルム細菌である
Rhodococcus属に属する菌株との間のシャトルベクター
プラスミドとして用いられる新規な環状のプラスミドを
提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ノカルデ
ィオフォルム細菌を宿主とすることができ、ＤＮＡ組換
えに使用可能な新規プラスミドを開発すべく鋭意研究を
行い、本発明者らが既に見出し、特許出願した、上記す
る２種類のプラスミド、即ち プラスミド pNC500 及び
プラスミド pNC903 を用いて、新規な環状プラスミド
を創製し、それを大腸菌及びロドコッカス属に属する微
生物の細胞内に導入し、得られた細菌を培養したとこ
ろ、何れの宿主においても当該環状プラスミドが複製さ
れることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】本発明のプラスミドは、次の（Ａ）〜
（Ｃ）のＤＮＡ領域を含有し、大腸菌及びロドコッカス
(Rhodococcus) 属に属する菌株の何れの細胞内でも複製
可能なシャトルベクタープラスミドである。 （Ａ）ノカルディオフォルム細菌に属する菌株由来のプ
ラスミド pNC500 或いはpNC903 から選ばれる一つのプ
ラスミドに含有され、且つ Rhodococcus属に属する細菌
株の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域、（Ｂ）大腸菌
の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域、（Ｃ）薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ領域

【０００７】本発明のプラスミドに含まれる、（Ａ）ノ
カルディオフォルム細菌に属する菌株由来のプラスミド
pNC500 或いは pNC903 から選ばれる一つのプラスミド
に含有され、且つRhodococcus 属に属する細菌株の細胞
内で複製増殖可能なＤＮＡ領域は、当該プラスミドから
制限酵素により切り出されるＤＮＡ断片であり、少なく
とも Rhodococcus属に属する菌株細胞内で複製増殖に必
要なレプリコン領域を含むならば、該プラスミドの全体
であってもよく、或いは一断片であってもよい。なお、
該プラスミド pNC500 は、Nocardia corallina B-276
(FERM P-4094)株由来のプラスミドであり（特開 平 5-
244953 号公報を参照) 、又プラスミド pNC903 は、Rho
dococcus rhodochrous P-II-123-1 (FERM P-14193) 株
由来のプラスミドであり、その制限酵素地図を図３及び
図４に示す。なお、プラスミド pNC500 を保持する Noc
ardia corallina B-276 (FERM P-4094) 株は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に、受託番号 FERM P-4094と
して、またプラスミド pNC903 を保持する Rhodococcus
rhodochrous P-II-123-1 (FERM P-14193)株は、受託番
号 FERM P-14193 として、それぞれ寄託されている。

【０００８】また、本発明のプラスミドに含まれる、
（Ｂ）大腸菌の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域と
は、大腸菌内で複製増殖し得る環状プラスミドに含ま
れ、当該プラスミドから制限酵素により切り出されるＤ
ＮＡ断片であり、該環状プラスミドの複製開始点として
作用する(ORI) ＤＮＡ領域を包含するＤＮＡ断片である
ならば、該プラスミドの全体であってもよく、或いは一
断片であってもよい。なお、大腸菌内で複製増殖し得る
環状プラスミドとして、プラスミド pHSG298, pHSG299,
pUC18, pUC19 等を公知のものとして例示できる。これ
ら公知のプラスミドにある複製開始点として作用するＤ
ＮＡ領域(ORI) は、例えば、プラスミド pHSG299におい
ては、該プラスミドの制限酵素地図（図５) 上において
ORI と記す部分であり、既に報告されている文献により
特定できる。なお、プラスミド pHSG298, pHSG299, pUC
18及びpUC19 の制限酵素地図を、図５及び図６にそれぞ
れ示す。なお、これらの図では、大腸菌内でのマーカー
として公知の薬剤耐性遺伝子の位置も併せて示す。

【０００９】更に、（Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ
領域は、宿主とする Rhodococcous属に属する細菌或は
大腸菌内で発現し、宿主に薬剤耐性を与えることができ
る薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片であり、例えば、大
腸菌内でのマーカーとして公知の薬剤耐性遺伝子、カナ
マイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラ
ムフェニコール耐性遺伝子などの大腸菌由来の薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片、或は Rhodococcus属細菌内で
のマーカーとして公知の薬剤耐性遺伝子、チオストレプ
トン耐性遺伝子などのノカルディオフォルム細菌並びに
その近縁関係にある放線菌等に由来の薬剤耐性遺伝子を
含むＤＮＡ断片などを例示することができる。特には、
上記する大腸菌内で複製増殖し得る環状プラスミドに遺
伝子組換え技術により導入し、当該薬剤耐性を示す大腸
菌に形質転換できる大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子、及び
該プラスミド pNC500 或いは pNC903 に遺伝子組換え技
術により導入し、当該薬剤耐性を示す Rhodococcus属に
属する細菌株に形質転換できるノカルディオフォルム細
菌並びにその近縁関係にある放線菌等に由来の薬剤耐性
遺伝子は好適に用いられる。更には、Rhodococcus 属に
属する細菌及び大腸菌の両属間において、薬剤耐性によ
り、菌体内にプラスミドの存在が示唆される限り、薬剤
の種類は例示するものに限られるものではなく、また薬
剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域は一種類でも複数存在し
ていても良い。

【００１０】なお、（Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ
領域として、大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ
断片と Rhodococcus属細菌内でのマーカーとして公知の
薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とをともに含有させる
ことにより、大腸菌由来の薬剤耐性遺伝子に起因する薬
剤耐性の有無により、当該プラスミドが大腸菌の菌体内
に存在することを、又 Rhodococcus属細菌内でのマーカ
ーとして公知の薬剤耐性遺伝子に起因する薬剤耐性の有
無により、当該プラスミドが Rhodococcus属細菌の菌体
内に存在することを、それぞれ識別することができ、よ
り好ましいプラスミドとなる。

【００１１】本発明のプラスミドは、例えば、以下の手
段により構築することができる。先ず、当該プラスミド
pNC500 の制限酵素開裂地図 (図３) 或いは pNC903 の
制限酵素開裂地図 (図４) を参照して、該プラスミドに
単一の切断部位数を有する制限酵素、例えば、プラスミ
ド pNC500 においては制限酵素 BamHI、又プラスミド p
NC903 においては制限酵素 ClaI を用いて、当該環状プ
ラスミドを開裂する。得られる単一のＤＮＡ断片を1.0%
アガロースゲル電気泳動等の方法を用いて単離、精製す
る。このＤＮＡ断片は、（Ａ）ノカルディオフォルム細
菌に属する菌株由来のプラスミド pNC500 或いは pNC90
3 から選ばれるプラスミドに含有され、且つRhodococcu
s 属に属する細菌株の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領
域を含有する。

【００１２】また、大腸菌内で複製増殖し得るプラスミ
ドpHSG298, pHSG299, pUC18, pUC19などを、これらのプ
ラスミドに単一の切断部位数を有する制限酵素、例えば
プラスミド pUC18及び pUC19においては、制限酵素 Hin
c IIを用いてまた、プラスミド pHSG298及びpHSG299,に
おいては制限酵素 AccI を用いてプラスミドを開裂し、
アルカリホスファターゼと反応させた後単離精製して、
複製開始点(ORI) ＤＮＡを包含するＤＮＡ断片を得る。
次に、このようにして得られたRhodococcus 属に属する
菌株の細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域と、大腸菌の
細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域とを連結する。連結
は通常、市販のライゲーションキットを用いることによ
って容易に行なうことができる。得られた連結ＤＮＡを
大腸菌のコンビテントセル中に導入して培養し、大量に
複製する。

【００１３】このようにして得られたプラスミドから所
定のRhodococcus 属に属する細菌株の細胞内で増殖可能
なＤＮＡ領域と、大腸菌の細胞内で複製増殖可能なＤＮ
Ａ領域とを含むＤＮＡ断片を制限酵素で切断して採取
し、単離精製する。単離精製は通常、アガロースゲル電
気泳動にかけ、所定の分子量のバンドを切り出し、これ
を溶出し、フェノールクロロホルム処理、エタノール沈
澱等を行なうことによって行なわれる。一方、薬剤耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片は、前記したような種々の薬剤
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片が用いられる。例えば、チ
オストレプトン耐性遺伝子を用いようとする場合、プラ
スミドpIJ 702 〔E.Kats, Journal of General Microbi
ology, 129, 2703-2714(1983) 〕を保持する Streptomy
ces Lividanse TK-24 を培養し、得られる菌体を溶菌し
てＤＮＡ断片を採取し、このなかからチオストレプトン
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離精製し、これをサブ
クローニングする。このようにして得られたプラスミド
から所定の断片を制限酵素で切断して採取し、単離精製
する。単離精製は、通常、アガロースゲル電気泳動にか
け、所定のバンドを切り出しこれを溶出し、フェノール
クロロホルム処理、エタノール沈澱等を行なう。

【００１４】次に、前記したRhodococcus 属に属する細
菌株の細胞内で増殖可能なＤＮＡ領域と、大腸菌の細胞
内で複製増殖可能なＤＮＡ領域とを含むＤＮＡ断片と薬
剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結する。この連結
は、通常、市販のライゲーションキットを用いることに
よって容易に行なうことができる。このようにして得ら
れたプラスミドは、大腸菌のコンピテントセル中に導入
して大量に複製する。本発明のこのようにして得られた
プラスミドにはプラスミド pWC 5403,プラスミドpNE 95
01等がある。これらのプラスミドでRhodococcus 属細菌
を形質転換し増殖させ、薬剤耐性培地で培養し、生育す
る菌株からプラスミドを回収し、精製を行って、これら
のプラスミドの存在を確認することができる。本発明の
プラスミド pNC 5403 をRhodococcus rhodochrous に組
込んだ組換え体は、受託番号 FERM P-14322 として、ま
たプラスミドpNC 9501を組込んだ組換え体は、受託番号
FERM P-14323 として工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。

【００１５】次に、本発明を実施例により具体的に説明
する。なお、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。

【実施例１】 ベクタープラスミドpNC5403 の構築 （１）プラスミドpNC500の大腸菌由来のベクターpUC18
へのクローニング プラスミドpNC500(1μg)に制限酵素BamHI(5units) を加
え、37 ℃、2 時間反応させた。これを、1.0%アガロース
ゲル電気泳動 (100V、２時間）にかけ、約7.2kbpのバン
ドを切りだした。この際、サイズマーカーとしてラムダ
ファージＤＮＡのHindIII 消化物を用い、 ＤＮＡ断片の
分子量を算出した。切り出したゲルから、分子量約7.2k
bpのＤＮＡ断片を電気的に溶出し、フェノール−クロロ
ホルム処理、エタノール沈殿して精製した後、TE緩衝液
〔0.025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（トリス）、0.025M EDTA : pH8.0 〕に溶解した。更
に、得られるpNC500 BamHI切断ＤＮＡの両末端をTakara
Blanting Kit を用いて平滑末端化した。

【００１６】一方、大腸菌由来のベクターpUC18 0.5μ
g を制限酵素HincII(5units)と、37℃、２時間反応させ
該プラスミドＤＮＡを切断した。この反応液１容に1M T
ris-HCl(pH8.0)を1/10容加え、アルカリホスファターゼ
(1unit) と65℃、1 時間反応させた。この溶液をフェノ
ール−クロロホルム処理し、エタノール沈殿してＤＮＡ
断片を回収し、TE緩衝液に溶解した。

【００１７】上記するpNC500のＤＮＡ断片を含む液とpU
C18 のＤＮＡ断片を含む液を、各１容ずつ混合し、この
ＤＮＡ溶液に８容のTakara ligation kit A 液を加え、
良く撹拌した。さらにこのＤＮＡ溶液に、１０容のTaka
ra ligation kit B 液を追加し、16℃,30 分間インキュ
ベートした。

【００１８】大腸菌 JM109株のコンピテントセル (TOYO
BO製) に前記ＤＮＡ溶液を加え、０℃, １時間静置後、
42℃,2分間の熱処理を行い、SOC 培地〔トリプトン 2%,
酵母エキス 0.5%, 0.025M NaCl, 0.0025 KCl, 0.01M
MgSO4, 0.01M MgCl2, 0.02Mグルコース： pH7.4〕を加
えて37℃、1 時間振とうした。得られた大腸菌を、50μ
g/ml アンピシリン、1mM IPTG（イソプロピル−β−ガ
ラクトピラノシド) 、および0.02% X-gal(5-ブロモ-4-
クロロ-3- インドリル- β-D- ガラクトピラノシド) を
含むLB培地(10% トリプトン、5% 酵母エキス、10% Na
Cl：pH8.0)に塗布し、37℃、1 夜静置培養した。出現し
た白色コロニーよりプラスミドを調製し、制限酵素開裂
地図を解析することにより目的のプラスミドを保持して
いるコロニーをスクリーニングした。スクリーニングし
たコロニーを300ml のLB液体培地(50μg/ml アンピシ
リン含有) で培養し、プラスミドＤＮＡをSDS-アルカリ
法により大量調製した。

【００１９】（２）XbaI-KpnI 断片の調製 前記（１）で調製したプラスミド(1μg)に制限酵素XbaI
及びKpnI (各5units)を加え、37 ℃、2 時間反応させプ
ラスミドＤＮＡを切断した。このＤＮＡ断片を含む液
を、1.0%アガロースゲル電気泳動 (100V、２時間）にか
け、約9.9kbpのバンドを切り出した。この際、サイズマ
ーカーとしてラムダファージＤＮＡのHindIII 消化物を
用い、 ＤＮＡ断片の分子量を算出した。切り出したゲル
から、分子量約9.9kbpのＤＮＡ断片を電気的に溶出し、
フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿して精
製した後、TE緩衝液に溶解した。

【００２０】（３）チオストレプトン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片の取得 プラスミドpIJ702を保持する菌株であるStreptomyces l
ividanse TK-24を500ml の液体培地〔Nutrient Broth N
o.2(Oxoid) 2.5%,グルコース 1%,グリシン 1%〕に接種
し、30℃で21時間振盪培養した。この時点で培養液中0.
5units/ml の濃度となるようにペニシリンG を添加し、
さらに30℃で3 時間培養を継続した。培養液からStrept
omyces lividanse TK-24の菌体を集菌し、TE緩衝液〔0.
025M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリ
ス）、0.025M EDTA : pH8.0 〕で洗浄後、菌体を溶菌液
〔0.3M ショ糖、0.025M トリス、0.025M EDTA、2mg/
mlリゾチーム、2mg/ml アクロモペプチダーゼ、50μg/
ml RNase : pH8.0〕20mlに懸濁し、30℃で2 時間反応さ
せた。その反応液に、2%ラウリル硫酸ナトリウムと0.3M
水酸化ナトリウムからなる溶液10mlを添加し、良く混合
してから55℃の湯浴中に１時間置いた。この液中に、フ
ェノール・クロロホルム（１容：１容）溶液4ml を加
え、全体が白濁するまで良く混ぜた（１分間）。得られ
た白濁液を、4℃で30分間17000 ×g の遠心にかけ、上
層を採取した。

【００２１】再度、上層１容に対し、１容のフェノール
・クロロホルム（１容：１容）溶液を加え良く混ぜた
後、4 ℃で30分間17000 ×g の遠心分離を行い、分離し
た上層を採取した。採取した上層１容に対し、１容のジ
エチルエーテルを加え、穏やかに撹拌した後しばらく放
置した。上層に分離するジエチルエーテル層を捨て、再
度下層にジエチルエーテルを加え抽出した。エーテル抽
出後分離する下層１容に対し、0.1 容の3M 酢酸ナトリ
ウム水溶液と2 容のエタノールを加え、析出する沈殿物
を遠心で回収した。

【００２２】回収した沈殿物を5ml のTE緩衝液に溶解
し、その液にCsClを7.5g、1.5mg/ml臭化エチジウム-TE
緩衝液を2ml 加え混合した。この溶液を42時間 120,000
×ｇの密度勾配遠心分離にかけた。紫外線照射により
検出されたプラスミド画分を分取した。このプラスミド
画分をn-ブタノールで処理し臭化エチジウムを除いた。
更に、TE緩衝液に対して透析後、エタノール沈殿により
精製プラスミド画分を得た。次いで、この精製プラスミ
ド画分10μg を制限酵素BclI(2単位）で37℃、4時間完全
消化し、これを1.0%アガロースゲル電気泳動 (100V、２
時間）にかけ、約1.05kbp のバンドを切り出した。切り
出したゲルから、分子量約1.05kbp のＤＮＡ断片を電気
的に溶出し、フェノール−クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿して精製した後、TE緩衝液に溶解した。

【００２３】（４）チオストレプトン耐性遺伝子のサブ
クローニング 大腸菌由来のベクタpUC18 0.5μg を制限酵素BamHI(5u
nits) と37℃、２時間反応させプラスミドＤＮＡを切断
した。反応液１容に対し、1M Tris-HCl(pH8.0)を1/10容
加えアルカリホスファターゼ(1unit) と65℃、1 時間反
応させた。この溶液をフェノール−クロロホルム処理
し、エタノール沈殿してＤＮＡ断片を回収し、TE緩衝液
に溶解した。前記の（３）で調製したチオストレプトン
耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を含む液とpUC18 ＤＮＡ断
片を含む液を、各１容ずつ混合し、Takara ligation ki
t A液を８容加え、良く撹拌した。更に、１０容のTakar
a ligation kit B 液を追加して、16℃,30 分間インキ
ュベートした。

【００２４】大腸菌JM109 株のコンピテントセル (TOYO
BO製) に上記反応液を加え、0 ℃,1時間静置後、42℃,2
分間の熱処理を行い、SOC 培地〔トリプトン 2%, 酵母
エキス 0.5%, 0.025M NaCl, 0.0025 KCl, 0.01M MgSO4,
0.01M MgCl₂, 0.02M グルコース : pH7.4〕を加えて37
℃、1 時間振とうした。得られた大腸菌を、50μg/mlア
ンピシリン、1mM IPTG（イソプロピル−β−ガラクトピ
ラノシド) 、および0.02% X-gal(5-ブロモ-4- クロロ-3
- インドリル -β-D- ガラクトピラノシド) を含むLB培
地〔トリプトン 10%、酵母エキス 5% 、NaCl 10% : pH
8.0〕に塗布し、37℃、１夜静置培養した。出現した白
色コロニーよりプラスミドを調製し、制限開裂酵素地図
を解析することにより目的のプラスミドを保持している
コロニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコ
ロニーを300ml のLB液体培地（アンピシリン 50 μg/ml
含有) で培養し、プラスミドＤＮＡをSDS-アルカリ法に
より大量調製した。

【００２５】（５）XbaI-KpnI(チオストレプトン耐性遺
伝子を含む) 断片の調製 前記（４）で調製したプラスミド(1μg)に制限酵素XbaI
とKpnI( 各5units) を加え、37℃、２時間反応させプラ
スミドＤＮＡを切断した。得られる液を、1.0%アガロー
スゲル電気泳動（100V、２時間）にかけ、約1.05kbp の
バンドを切り出した。この際、サイズマーカーとしてラ
ムダファージＤＮＡのHindIII 消化物を用い、 ＤＮＡ断
片の分子量を算出した。切り出したゲルから、分子量約
1.05kbpのＤＮＡ断片を電気的に溶出し、フェノール−
クロロホルム処理、エタノール沈殿して精製した後、TE
緩衝液に溶解した。

【００２６】（６）プラスミドpNC5403 の作製 前記（２）で調製したプラスミド断片を含む溶液と、前
記（５）で調製したチオストレプトン耐性遺伝子を含む
分子量約1.05kbp のＤＮＡ断片を含む溶液、各１容ずつ
混合し、Takara ligation kit A 液を８容加え、良く撹
拌した。さらに、このＤＮＡ溶液に１０容のTakara lig
ation kit B 液を追加し、16℃,30 分間インキュベート
した。

【００２７】大腸菌 JM109株のコンピテントセル (TOYO
BO製) に上記反応液を加え、0 ℃,1時間静置後、42℃,2
分間の熱処理を行い、SOC 培地を加えて37℃、1 時間振
とうした。得られた大腸菌を、50μg/ml アンピシリ
ン、1mM IPTG、および0.02% X-gal を含むLB培地に塗布
し、37℃、1 夜静置培養した。出現した白色コロニーよ
りプラスミドを調製し、制限酵素開裂地図を解析するこ
とにより目的のプラスミドを保持しているコロニーをス
クリーニングした。このプラスミドをpNC5403 と命名し
た。スクリーニングにより得たコロニーを300ml のLB液
体培地（アンピシリン 50μg/mlを含有) で培養し、プ
ラスミドpNC5403 をSDS-アルカリ法により大量調製し
た。

【００２８】（７）Rhodococcus 属細菌の形質転換Rhodcoccus rhodcchrous ATCC 12674 株１白金耳を液体
培地〔Nutrient BrothNo.2(Oxoid) 2.5%,グルコース 1
%,グリシン 1% 〕に接種し、30℃で21時間振盪培養し
た。この時点で培養液中0.5units/ml の濃度となるよう
にペニシリンG を添加し、さらに30℃で3 時間培養を継
続した。培養液から菌体を集菌し、P 緩衝液〔ショ糖 1
0.3g, K₂SO₄ 0.025g, MgCl₂ 6H₂O 0.202g, 微量金属液
0.2ml, 0.5% KH₂PO₄ 1ml, 3.68% CaCl₂・2H₂O 10ml, 5.
73% トリスメチル-2- アミノエタンスルホン酸 10ml, H
₂O 80ml : pH7.2 〕で洗浄後、溶菌液〔10mgリゾチー
ム、10mg アクロモペプチダーゼ/ml P緩衝液〕に懸濁
した。この懸濁液を30℃で２時間インキュベートした
後、遠心分離で集菌し、P 緩衝液で2 回洗浄し、再びP
緩衝液に懸濁した。上記のプラスミドpNC5401 溶液 1μ
l(該プラスミドを0.1 μg含有) と菌体懸濁液10μl(109
cell/ml) を混合し、更に200 μl の25%PEG8000（ポリ
エチレングリコール8000/P緩衝液) を添加混合し、25℃
で10分間インキュベイトした。この液を100 μl づつ、
R2YE再生寒天培地〔ショ糖 10.3g, K₂SO₄ 0.025g, MgCl
₂ 6H₂O 1.012g,グルコース 1g, カザミノ酸 0.01g, 微
量金属液0.2ml, 酵母エキス 0.5g, トリスメチル-2-
アミノエタンスルホン酸 0.573g, 寒天 2.2g,0.5% KH₂
PO₄ 1.0ml, 5M CaCl₂ 2H₂O 0.4ml, 20% L-アルギニン
1.5ml,1N NaOH 0.7ml,H₂O 100ml 〕に塗布し30℃で24時
間培養した後、50μl/mlチオストレプトン入り SNA寒天
培地〔Nutrient broth 0.8%, 寒天 0.3%〕を重層し、
更に、30℃で３〜５日間培養した。出現したコロニーよ
りプラスミドを回収、精製しアガロースゲル電気泳動に
供し、ゲルを臭化エチジウムで染色することにより、分
子量 約11.0 kbpのプラスミドpNC5403 の存在を確認し
た。上記培養された菌株は、Rhodcoccus rhodcchrous 1
2674(PNC 5403) (受託番号FERM P-14322) として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託さている。

【００２９】

【実施例２】 ベクタープラスミド pNC9501 の構築 （１）プラスミドpNC903の大腸菌由来のベクターpUSG29
9 へのクローニング プラスミドpNC903(1μg)に制限酵素ClaI(5units)を加
え、37 ℃、2 時間反応させた。これを、1.0%アガロー
スゲル電気泳動 (100V、２時間）にかけ、約2.4kbpのバ
ンドを切り出した。この際、サイズマーカーとしてラム
ダファージＤＮＡのHindIII 消化物を用い、ＤＮＡのサ
イズを算出した。切り出したゲルから約2.4kbpのＤＮＡ
断片を電気的に溶出し、フェノール−クロロホルム処
理、エタノール沈殿して、精製した。精製しＤＮＡ断片
を、TE緩衝液〔0.025M トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（トリス）、0.025M EDTA : pH8.0 〕に溶解
した。

【００３０】一方、大腸菌由来のベクターpHSG299 0.5
μg を制限酵素 AccI (5units)で、37℃、２時間反応さ
せプラスミドＤＮＡを切断した。この反応液１容に1/10
容の1M Tris-HCl(pH8.0)を加え、アルカリホスファター
ゼ(1unit) と65℃、1 時間反応させた。この溶液をフェ
ノール−クロロホルム処理し、エタノール沈殿して、Ｄ
ＮＡ断片を回収しTE緩衝液に溶解した。

【００３１】上記のpNC903ＤＮＡ断片とpHSG299 ＤＮＡ
断片を含む液を、各１容ずつ混合し、Takara ligation
kit A 液をこのＤＮＡ溶液８容を加え、良く撹拌した。
更に、このＤＮＡ溶液に１０容のTakara ligation kit
B 液を追加し、16℃,30 分間インキュベートした。

【００３２】大腸菌 JM109株のコンピテントセル (TOYO
BO製) に上記反応液を加え、0 ℃,1時間静置後、42℃,2
分間の熱処理を行い、SOC 培地〔トリプトン 2%, 酵母
エキス 0.5%, 0.025M NaCl, 0.0025 KCl, 0.01M MgSO₄,
0.01M MgCl₂, 0.02M グルコース： pH7.4〕を加えて37
℃、1 時間振とうした。得られた大腸菌を、50μg/mlカ
ナマイシン、1mM IPTG（イソプロピル -β- ガラクトピ
ラノシド) 、および0.02% X-gal(5-ブロモ-4- クロロ-3
- インドリル -β-D- ガラクトピラノシド) を含むLB培
地〔トリプトン 10%、酵母エキス 5%、NaCl 10% : pH
8.0 〕に塗布し、37℃、１夜静置培養した。出現した白
色コロニーよりプラスミドを調製し、制限酵素地図を解
析することにより目的のプラスミドを保持しているコロ
ニーをスクリーニングした。スクリーニングしたコロニ
ーを300ml のLB液体培地（カナマイシン 50μg/ml含
有) で培養し、プラスミドＤＮＡをSDS-アルカリ法によ
り大量調製した。

【００３３】（２）XbaI-KpnI 断片の調製 前記（１）で調製したプラスミド(1μg)に制限酵素XbaI
と制限酵素KpnI（各5units) を加え、37 ℃、2 時間反応
させプラスミドＤＮＡを切断した。このＤＮＡ断片を含
む液を、1.0%アガロースゲル電気泳動 (100V、２時間）
にかけ、約5.1kbpのバンドを切り出した。この際、サイ
ズマーカーとしてラムダファージＤＮＡのHindIII 消化
物を用い、 ＤＮＡ断片の分子量を算出した。切り出した
ゲルから、分子量約5.1kbpのＤＮＡ断片を電気的に溶出
し、フェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿し
て精製した後、TE緩衝液に溶解した。

【００３４】（３）プラスミドpNC9501 の作製 前記（２）で調製したプラスミド断片を含む溶液と、上
記の実施例１の（５）で調製したチオストレプトン耐性
遺伝子を含むＤＮＡ断片（約1.05kbp のXbaI-KpnI 制限
酵素切断ＤＮＡ断片) を含む溶液、各１容ずつ混合し、
Takara ligation kit A 液８容を加え、良く撹拌した。
さらに、このＤＮＡ溶液に１０容のTakara ligation ki
t B 液を追加し、16℃,30 分間インキュベートした。

【００３５】大腸菌JM109 株のコンピテントセル (TOYO
BO製) に上記反応液を加え、0 ℃,1時間静置後、42℃,2
分間の熱処理を行い、SOC 培地を加えて37℃、1 時間振
とうした。得られた大腸菌を、50μg/mlカナマイシン、
1mM IPTG、および0.02% X-gal を含むLB培地に塗布し、
37℃、1 夜静置培養した。出現した白色コロニーよりプ
ラスミドを調製し、制限酵素開裂地図を解析することに
より目的のプラスミドを保持しているコロニーをスクリ
ーニングした。このプラスミドをpNC9501 と命名した。
スクリーニングにより得たコロニーを300ml のLB液体培
地（カナマイシン 50 μg/ml含有) で培養し、プラスミ
ドpNC9501 をSDS-アルカリ法により大量調製した。

【００３６】（４）Rhodococcus 属細菌の形質転換Rhodcoccus rhodcchrous ATCC 12674 株１白金耳を液体
培地〔Nutrient BrothNo.2(Oxoid) 2.5%,グルコース 1
%,グリシン 1% 〕に接種し、30℃で21時間振盪培養し
た。この時点で培養液中0.5units/ml の濃度となるよう
にペニシリンG を添加し、さらに30℃で3 時間培養を継
続した。培養液から菌体を集菌し、P 緩衝液〔ショ糖 1
0.3g, K₂SO₄ 0.025g, MgCl₂ 6H₂O 0.202g, 微量金属液
0.2ml, 0.5% KH₂PO₄ 1ml, 3.68% CaCl₂・2H₂O 10ml, 5.
73% トリスメチル-2- アミノエタンスルホン酸 10ml, H
₂O 80ml : pH7.2 〕で洗浄後、溶菌液〔10mgリゾチー
ム、10mg アクロモペプチダーゼ/ml P緩衝液〕に懸濁
した。この懸濁液を30℃で２時間インキュベイトした
後、遠心分離で集菌し、P 緩衝液で2 回洗浄し、再びP
緩衝液に懸濁した。上記のプラスミドpNC9501 溶液 1μ
l(該プラスミドを0.1 μg含有) と菌体懸濁液10μl(10⁹
cell/ml) を混合し、更に200 μl の25%PEG8000（ポリ
エチレングリコール8000/P緩衝液) を添加混合し、25℃
で10分間インキュベイトした。この液を100 μl づつ、
R2YE再生寒天培地〔ショ糖 10.3g, K₂SO₄ 0.025g, MgCl
₂ 6H₂O 1.012g,グルコース 1g, カザミノ酸 0.01g, 微
量金属液0.2ml, 酵母エキス 0.5g, トリスメチル-2-
アミノエタンスルホン酸 0.573g, 寒天 2.2g,0.5% KH₂
PO₄ 1.0ml, 5M CaCl₂ 2H₂O 0.4ml, 20% L-アルギニン
1.5ml,1N NaOH 0.7ml,H₂O 100ml 〕に塗布し30℃で24時
間培養した後、50μl/mlチオストレプトン入り SNA寒天
培地〔Nutrient broth 0.8%, 寒天 0.3%〕を重層し、
更に30℃で３〜５日間培養した。出現したコロニーより
プラスミドを回収、精製し、アガロースゲル電気泳動に
供し、ゲルを臭化エチジウムで染色することにより、分
子量 約6.2 kbp のプラスミドpNC9501 の存在を確認し
た。上記培養された菌株は、Rhodcoccus rhodochrous 1
2674(PNC 9501) (受託番号FERM P-14323) として工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【００３７】

【発明の効果】本発明の新規プラスミドは、大腸菌及び
Rhodococcus 属細菌内で複製可能なシャトルベクタープ
ラスミドで、その工業的に利用しうる微生物を育種、改
良するために有用である。特に、本発明で用いられる環
状プラスミドpNC903は、種々の制限酵素による開裂部位
各一つを有しており、この特定される開裂部位を利用し
て、外来のＤＮＡ断片を導入修飾し、多くの有用なプラ
スミドベクターを開発することができる。更に、当該プ
ラスミドは、ノカルディオフォルム細菌を宿主として、
ノカルディオフォルム細菌中において複写が可能であ
る、宿主−ベクター系におけるプラスミドベクターとし
て有用である。また、該プラスミドを用いて、外来のＤ
ＮＡ断片を導入修飾して得られる環状プラスミドベクタ
ーとし、更に得られる環状プラスミドベクターに種々の
酵素或は蛋白質をコードする遺伝子を組み込み得られる
環状プラスミドを導入した宿主微生物の形質転換株を利
用し、該形質転換株を培養して目的の酵素或は蛋白質を
産出させることができ、又目的とする酵素とその基質と
の反応による有用な代謝物や酵素反応産物の製造を行う
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のシャトルベクターpNC 5403の制限酵素
開裂地図。

【図２】本発明のシャトルベクターpNC 9501の制限酵素
開裂地図。

【図３】プラスミドpNC500の制限酵素開裂地図。

【図４】プラスミドpNC903の制限酵素開裂地図。

【図５】プラスミドpHSG298 及びpHSG299 の制限酵素開
裂地図。

【図６】プラスミドpUC18 及びpUC19 の制限酵素開裂地
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌及びロドコッカス(Rhodococcus)
   属に属する菌株の何れの細胞内でも複製可能なシャトル
   ベクタープラスミドであり、（Ａ）ノカルディオフォル
   ム細菌に属する菌株由来のプラスミドpNC500或いはpNC9
   03から選ばれる一つのプラスミドに含有され、且つRhod
   ococcus 属に属する細菌株の細胞内で複製増殖可能なＤ
   ＮＡ領域と、（Ｂ）大腸菌の細胞内で複製増殖可能なＤ
   ＮＡ領域と、（Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域と
   を含有することを特徴とするプラスミド。
2. 【請求項２】 （Ｂ）大腸菌の細胞内で複製増殖可能な
   ＤＮＡ領域が、環状プラスミド pHSG299、 pHSG298、pU
   C18 及び pUC19よりなる群より選択される一つのプラス
   ミドに含有され、且つ該プラスミドの複製開始点を含む
   ＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１に記載のプ
   ラスミド。
3. 【請求項３】 分子量が約11.0 kbpであり且つ制限酵素
   開裂地図（図１）で示されるプラスミドpNC5403 。
4. 【請求項４】 分子量が約6.3kbpであり且つ制限酵素開
   裂地図（図２）で示されるプラスミドpNC9501 。