JPH05130876A - プラスミドベクター - Google Patents
プラスミドベクターInfo
- Publication number
- JPH05130876A JPH05130876A JP7802791A JP7802791A JPH05130876A JP H05130876 A JPH05130876 A JP H05130876A JP 7802791 A JP7802791 A JP 7802791A JP 7802791 A JP7802791 A JP 7802791A JP H05130876 A JPH05130876 A JP H05130876A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- restriction enzyme
- escherichia coli
- vector
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【目的】 大腸菌、枯草菌等広宿主において好適に発現
し、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、乳酸菌に
おいて発現する可能性のある新規なプラスミドベクター
を提供する。 【構成】 ストレプトコッカス属に属する微生物由来の
プラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを結合させた複
合プラスミド、またはストレプトコッカス属に属する微
生物由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する大腸
菌のプラスミドと、ビフィドバクテリウム・ロンガムに
属する新規微生物由来の新規なプラスミド、とを結合さ
せた新規なプラスミドベクター。
し、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、乳酸菌に
おいて発現する可能性のある新規なプラスミドベクター
を提供する。 【構成】 ストレプトコッカス属に属する微生物由来の
プラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを結合させた複
合プラスミド、またはストレプトコッカス属に属する微
生物由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する大腸
菌のプラスミドと、ビフィドバクテリウム・ロンガムに
属する新規微生物由来の新規なプラスミド、とを結合さ
せた新規なプラスミドベクター。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、大腸菌、枯草菌等広
宿主において好適に発現し、ビフィドバクテリウム属に
属する微生物および乳酸菌においても発現可能な新規プ
ラスミドベクターに関するものである。
宿主において好適に発現し、ビフィドバクテリウム属に
属する微生物および乳酸菌においても発現可能な新規プ
ラスミドベクターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ビフィドバクテリウム属に属する微生物
は、人および動物の腸管内において優勢であり、宿主の
健康に大きな影響を与える有用微生物であることから、
従来より食品、医薬品、飼料等に広範に利用されてい
る。このビフィドバクテリウム属に属する微生物をより
有効に利用するために、遺伝子操作技術を応用してこの
微生物を改良すること、または所望の性質を発現させる
ために、人為的に改変することが期待されてはいるが、
未だ開発の途上にある。
は、人および動物の腸管内において優勢であり、宿主の
健康に大きな影響を与える有用微生物であることから、
従来より食品、医薬品、飼料等に広範に利用されてい
る。このビフィドバクテリウム属に属する微生物をより
有効に利用するために、遺伝子操作技術を応用してこの
微生物を改良すること、または所望の性質を発現させる
ために、人為的に改変することが期待されてはいるが、
未だ開発の途上にある。
【０００３】ビフィドバクテリウム属に属する微生物の
遺伝子操作技術の確立には、ビフィドバクテリウム属に
属する微生物の宿主ベクター系の開発が必須であるが、
ビフィドバクテリウム属に属する微生物の遺伝子操作に
使用し得るプラスミドベクターとしては特開昭63-12338
4号公報に開示されている。この発明に開示されたプラ
スミドベクターは、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２
２とビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミド
とを結合させ、必要に応じてスタフィロコッカス・オウ
レウス由来のプラスミドｐＣ１９４、ｐＣ１９４のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子領域、および／またはビフ
ィドバクテリウム・ロンガムのトリプトファン合成系遺
伝子を結合させたものである。
遺伝子操作技術の確立には、ビフィドバクテリウム属に
属する微生物の宿主ベクター系の開発が必須であるが、
ビフィドバクテリウム属に属する微生物の遺伝子操作に
使用し得るプラスミドベクターとしては特開昭63-12338
4号公報に開示されている。この発明に開示されたプラ
スミドベクターは、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２
２とビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラスミド
とを結合させ、必要に応じてスタフィロコッカス・オウ
レウス由来のプラスミドｐＣ１９４、ｐＣ１９４のクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子領域、および／またはビフ
ィドバクテリウム・ロンガムのトリプトファン合成系遺
伝子を結合させたものである。
【０００４】一方、微生物に外来ＤＮＡを導入する方法
については、プラスミドｐＡＭβ１がビフィドバクテリ
ウム属に属する微生物に導入され、導入されたｐＡＭβ
１のエリスロマイシン耐性遺伝子が、ビフィドバクテリ
ウム属に属する微生物で発現することが知られている。
（特開平2-107192号公報）。
については、プラスミドｐＡＭβ１がビフィドバクテリ
ウム属に属する微生物に導入され、導入されたｐＡＭβ
１のエリスロマイシン耐性遺伝子が、ビフィドバクテリ
ウム属に属する微生物で発現することが知られている。
（特開平2-107192号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、特開昭
63-123384号公報に開示されたプラスミドベクターは、
次に理由を記載するように多くの制約を有し、かつ不明
な要素を包含するベクターである。すなわち、ビフィド
バクテリウム・ロンガムに使用し得るプラスミドベクタ
ーは、この微生物で発現可能なマーカー遺伝子を有する
ことが必須の要件であるが、このプラスミドのマーカー
遺伝子においては、スタフィロコッカス・オウレウス由
来のプラスミドｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性
遺伝子領域、またはビフィドバクテリウム・ロンガムの
トリプトファン合成系遺伝子が相当する。しかしなが
ら、（ａ）これらのマーカー遺伝子がビフィドバクテリ
ウム・ロンガムで発現するという確証がないこと、
（ｂ）トリプトファン合成系遺伝子がビフィドバクテリ
ウム・ロンガムで発現すると仮定しても、このプラスミ
ドベクターの使用可能な菌株はトリプトファン合成系遺
伝子が欠落した変異株に限定され、この変異株を新たに
分離取得しなければならないこと、（ｃ）ビフィドバク
テリウム・ロンガムの野生株はほとんどトリプトファン
合成系遺伝子を保有しているので、この遺伝子を欠落し
た変異株を分離取得するのは至難であること、（ｄ）こ
のプラスミドベクターは病原菌であるスタフィロコッカ
ス・オウレウスで発現するため利用範囲が限定されるこ
と、および（ｅ）このプラスミドベクターの作成には極
めて煩雑な遺伝子操作を要すること、等の制約および欠
点を有している。
63-123384号公報に開示されたプラスミドベクターは、
次に理由を記載するように多くの制約を有し、かつ不明
な要素を包含するベクターである。すなわち、ビフィド
バクテリウム・ロンガムに使用し得るプラスミドベクタ
ーは、この微生物で発現可能なマーカー遺伝子を有する
ことが必須の要件であるが、このプラスミドのマーカー
遺伝子においては、スタフィロコッカス・オウレウス由
来のプラスミドｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性
遺伝子領域、またはビフィドバクテリウム・ロンガムの
トリプトファン合成系遺伝子が相当する。しかしなが
ら、（ａ）これらのマーカー遺伝子がビフィドバクテリ
ウム・ロンガムで発現するという確証がないこと、
（ｂ）トリプトファン合成系遺伝子がビフィドバクテリ
ウム・ロンガムで発現すると仮定しても、このプラスミ
ドベクターの使用可能な菌株はトリプトファン合成系遺
伝子が欠落した変異株に限定され、この変異株を新たに
分離取得しなければならないこと、（ｃ）ビフィドバク
テリウム・ロンガムの野生株はほとんどトリプトファン
合成系遺伝子を保有しているので、この遺伝子を欠落し
た変異株を分離取得するのは至難であること、（ｄ）こ
のプラスミドベクターは病原菌であるスタフィロコッカ
ス・オウレウスで発現するため利用範囲が限定されるこ
と、および（ｅ）このプラスミドベクターの作成には極
めて煩雑な遺伝子操作を要すること、等の制約および欠
点を有している。
【０００６】また、特開平2-107192号公報に開示された
プラスミドは、ストレプトコッカス・フェカリス由来の
広宿主域で接合伝達可能な公知のプラスミド（Journal
of Bacteriology,117 （１）, 283, 1974 ：同誌、157
（２）, 445, 1984）であるが、ＤＮＡサイズが 26.5kb
と大きく、そのままではビフィドバクテリウム属に属す
る微生物のプラスミドベクターとして使用できないとい
う欠点がある。
プラスミドは、ストレプトコッカス・フェカリス由来の
広宿主域で接合伝達可能な公知のプラスミド（Journal
of Bacteriology,117 （１）, 283, 1974 ：同誌、157
（２）, 445, 1984）であるが、ＤＮＡサイズが 26.5kb
と大きく、そのままではビフィドバクテリウム属に属す
る微生物のプラスミドベクターとして使用できないとい
う欠点がある。
【０００７】このように、ビフィドバクテリウム属に属
する微生物の遺伝子操作技術の確立は、これらの微生物
の遺伝子学的研究、育種等の分野から切望されているに
もかかわらず、従来公知のプラスミドベクターはその利
用に多くの制約があり、上記の要求を満足させるもので
はなかった。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、大腸菌、枯草菌等広宿主において好
適に発現し、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、
乳酸菌においても発現可能な新規なプラスミドベクター
を提供することを目的としている。
する微生物の遺伝子操作技術の確立は、これらの微生物
の遺伝子学的研究、育種等の分野から切望されているに
もかかわらず、従来公知のプラスミドベクターはその利
用に多くの制約があり、上記の要求を満足させるもので
はなかった。この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、大腸菌、枯草菌等広宿主において好
適に発現し、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、
乳酸菌においても発現可能な新規なプラスミドベクター
を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ストレプトコッカス属に属する
微生物由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを
結合させた複合プラスミドと、新規なビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物に由来し、ただ一種類の
プラスミドのみを含み、多数の制限酵素認識部位を有
し、かつプラスミドの収量が高い新規なプラスミドとを
結合してなるプラスミドベクターを提供する。
を解決するものとして、ストレプトコッカス属に属する
微生物由来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを
結合させた複合プラスミドと、新規なビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物に由来し、ただ一種類の
プラスミドのみを含み、多数の制限酵素認識部位を有
し、かつプラスミドの収量が高い新規なプラスミドとを
結合してなるプラスミドベクターを提供する。
【０００９】またこの発明は、ストレプトコッカス属に
属する微生物由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有
する大腸菌のプラスミドと、新規なビフィドバクテリウ
ム・ロンガム属に属する微生物に由来し、だた１種類の
プラスミドのみを含み、多数の制限酵素認識部位を有
し、かつプラスミドの収量が高い新規なプラスミドとを
結合してなるプラスミドベクターをも提供する。
属する微生物由来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有
する大腸菌のプラスミドと、新規なビフィドバクテリウ
ム・ロンガム属に属する微生物に由来し、だた１種類の
プラスミドのみを含み、多数の制限酵素認識部位を有
し、かつプラスミドの収量が高い新規なプラスミドとを
結合してなるプラスミドベクターをも提供する。
【００１０】すなわち、この発明の発明者らは、ビフィ
ドバクテリウム属に属する微生物に使用可能であり、か
つより好適なプラスミドベクターを開発すべく鋭意研究
を行った結果、新規なビフィドバクテリウム・ロンガム
を自然界から分離し、この新菌株から新規なプラスミド
を分離し、このプラスミドから新規なプラスミドベクタ
ーを作成することに成功し、この発明を完成した。
ドバクテリウム属に属する微生物に使用可能であり、か
つより好適なプラスミドベクターを開発すべく鋭意研究
を行った結果、新規なビフィドバクテリウム・ロンガム
を自然界から分離し、この新菌株から新規なプラスミド
を分離し、このプラスミドから新規なプラスミドベクタ
ーを作成することに成功し、この発明を完成した。
【００１１】以下、この発明において使用するビフィド
バクテリウム・ロンガム由来のプラスミドを取得するた
めの新菌株について詳しく説明する。この発明の発明者
らは、多数の健康な乳児の糞便から常法により分離した
５０菌株のビフィドバクテリウム・ロンガムに属する微
生物の中から、プラスミドベクター作成に好適な次の性
質を有する３菌株を分離した。即ち、（ａ）ただ一種類
のプラスミドのみを含む菌株、（ｂ）制限酵素認識部位
を多数有するプラスミドを含む菌株、および（ｃ）プラ
スミドの収量が高い菌株、の３つの性質である。これら
の菌株は、それぞれビフィドバクテリウム・ロンガムＭ
Ｏ９１０１（以下ＭＯ９１０１株と記載する）、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０２（以下ＭＯ９１
０２株と記載する）、およびビフィドバクテリウム・ロ
ンガムＭＯ９１０３（以下ＭＯ９１０３株と記載する）
と命名され、平成３年４月４日付で工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され、それぞれ微工研菌寄第12167
号、微工研菌寄第12168号、および微工研菌寄第12169号
なる受託番号が付された（以下これらの３菌株をまとめ
て「本菌」と記載することがある）。
バクテリウム・ロンガム由来のプラスミドを取得するた
めの新菌株について詳しく説明する。この発明の発明者
らは、多数の健康な乳児の糞便から常法により分離した
５０菌株のビフィドバクテリウム・ロンガムに属する微
生物の中から、プラスミドベクター作成に好適な次の性
質を有する３菌株を分離した。即ち、（ａ）ただ一種類
のプラスミドのみを含む菌株、（ｂ）制限酵素認識部位
を多数有するプラスミドを含む菌株、および（ｃ）プラ
スミドの収量が高い菌株、の３つの性質である。これら
の菌株は、それぞれビフィドバクテリウム・ロンガムＭ
Ｏ９１０１（以下ＭＯ９１０１株と記載する）、ビフィ
ドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０２（以下ＭＯ９１
０２株と記載する）、およびビフィドバクテリウム・ロ
ンガムＭＯ９１０３（以下ＭＯ９１０３株と記載する）
と命名され、平成３年４月４日付で工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され、それぞれ微工研菌寄第12167
号、微工研菌寄第12168号、および微工研菌寄第12169号
なる受託番号が付された（以下これらの３菌株をまとめ
て「本菌」と記載することがある）。
【００１２】本菌の菌学的性質は、次のとおりであ
る。， １．形態学的性質 （１）菌形（光学顕微鏡による観察） ＢＬ寒天平板培地（光岡知足；臨床検査、第１８巻、第
1163ページ、1974年）を用い、３７℃で４８時間常法に
より嫌気培養したときの本菌は、0.5〜0.8μ×1.7〜4.0
μ、桿状または分岐状の菌形を呈する。 （２）コロニーの形態 前記（１）と同一の条件で嫌気培養したとき、本菌のコ
ロニーの形態（光岡知足著、「腸内菌の世界」、第110
ページ、叢文社、1980年）は、次のとおりである。
る。， １．形態学的性質 （１）菌形（光学顕微鏡による観察） ＢＬ寒天平板培地（光岡知足；臨床検査、第１８巻、第
1163ページ、1974年）を用い、３７℃で４８時間常法に
より嫌気培養したときの本菌は、0.5〜0.8μ×1.7〜4.0
μ、桿状または分岐状の菌形を呈する。 （２）コロニーの形態 前記（１）と同一の条件で嫌気培養したとき、本菌のコ
ロニーの形態（光岡知足著、「腸内菌の世界」、第110
ページ、叢文社、1980年）は、次のとおりである。
【００１３】ａ）形態：円形（circular） ｂ）隆起：凸状（convex） ｃ）周縁：円滑（entire） ｄ）大きさ（直径）：１〜３mm ｅ）色調：褐色不透明 ｉ）表面：円滑で光沢あり ２．生理学的性質 （１）ガスを産生せず （２）１５℃で発育せず （３）運動性なし （４）好気的条件で発育せず （５）ブドウ糖からの主発酵生成物は、乳酸および酢酸
である （６）糖からの酸生成 １）ＭＯ９１０１株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオースおよびラフィノ
ースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、デキストリン、スターチ、グリコー
ゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、イノシ
トール、エスクリン、サリシン、アミグダリン、α−メ
チルグルコシドおよびグルコン酸塩は陰性、 ２）ＭＯ９１０２株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラ
クトース、メリビオースおよびラフィノースは陽性、ラ
ムノース、セロビオース、トレハロース、メレチトー
ス、デキストリン、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリンおよびグルコン酸塩は
陰性、フラクトースは遅れて陽性、α−メチルグルコシ
ドは遅れて微陽性 ３）ＭＯ９１０３株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオース、およびラフィ
ノースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリン、α−メチルグルコシ
ドおよびグルコン酸塩は陰性、デキストリンは遅れて弱
陽性 （７）インドールを産生せず （８）硫化水素を産生せず （９）硝酸塩を還元せず （10）カタラーゼ陰性 （11）プラスミドの特性 ＭＯ９１０１株およびＭ０９１０２株は、両菌株とも、
約3.7kbの塩基からなる同一のプラスミドｐＢＬ６７た
だ一種を保持している。一方、ＭＯ９１０３株は、約8.
5kbの塩基からなるプラスミドｐＢＬ７８ただ一種を保
持している。これらのプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８は、図１および図２に各々のプラスミド模式図を
示したように、多数の制限酵素認識部位を有している
（試験例１を参照）。 （12）ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７
０７に対して７０％以上のＤＮＡ相同性 以上の菌学的性質から、本菌は公知のビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物であるが、本菌のプラス
ミドの特性は、プラスミドを保有しないビフィドバクテ
リウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（この菌株は、Th
e American Type Culture Collectionに第15707号とし
て寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムの基
準株である。以下、この寄託機関をＡＴＣＣと略記し、
ここに寄託されている菌株をＡＴＣＣ１５７０７のよう
に記載する）、ＡＴＣＣ１５７０８、および公知の菌株
（特公昭47-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324
号、特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第65
48号）、プラスミドを保有する公知の菌株（特開昭63-1
23384号公報に記載された微工研菌寄第9049号、微工研
菌寄第9050号）とは次のように全く異なっている。
である （６）糖からの酸生成 １）ＭＯ９１０１株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオースおよびラフィノ
ースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、デキストリン、スターチ、グリコー
ゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、イノシ
トール、エスクリン、サリシン、アミグダリン、α−メ
チルグルコシドおよびグルコン酸塩は陰性、 ２）ＭＯ９１０２株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラ
クトース、メリビオースおよびラフィノースは陽性、ラ
ムノース、セロビオース、トレハロース、メレチトー
ス、デキストリン、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリンおよびグルコン酸塩は
陰性、フラクトースは遅れて陽性、α−メチルグルコシ
ドは遅れて微陽性 ３）ＭＯ９１０３株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオース、およびラフィ
ノースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリン、α−メチルグルコシ
ドおよびグルコン酸塩は陰性、デキストリンは遅れて弱
陽性 （７）インドールを産生せず （８）硫化水素を産生せず （９）硝酸塩を還元せず （10）カタラーゼ陰性 （11）プラスミドの特性 ＭＯ９１０１株およびＭ０９１０２株は、両菌株とも、
約3.7kbの塩基からなる同一のプラスミドｐＢＬ６７た
だ一種を保持している。一方、ＭＯ９１０３株は、約8.
5kbの塩基からなるプラスミドｐＢＬ７８ただ一種を保
持している。これらのプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８は、図１および図２に各々のプラスミド模式図を
示したように、多数の制限酵素認識部位を有している
（試験例１を参照）。 （12）ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７
０７に対して７０％以上のＤＮＡ相同性 以上の菌学的性質から、本菌は公知のビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物であるが、本菌のプラス
ミドの特性は、プラスミドを保有しないビフィドバクテ
リウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（この菌株は、Th
e American Type Culture Collectionに第15707号とし
て寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムの基
準株である。以下、この寄託機関をＡＴＣＣと略記し、
ここに寄託されている菌株をＡＴＣＣ１５７０７のよう
に記載する）、ＡＴＣＣ１５７０８、および公知の菌株
（特公昭47-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324
号、特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第65
48号）、プラスミドを保有する公知の菌株（特開昭63-1
23384号公報に記載された微工研菌寄第9049号、微工研
菌寄第9050号）とは次のように全く異なっている。
【００１４】ＡＴＣＣのカタログ記載の菌株、特公昭47
-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324号、および
特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第6548号
にはプラスミドが含まれておらず、本菌とは別個の菌株
である。特開昭63-123384号公報に記載された微工研菌
寄第9049号、および微工研菌寄第9050号については、同
公開公報の記載から明らかなように本菌とは異なる別個
の菌株である。その理由は次のとおりである。
-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324号、および
特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第6548号
にはプラスミドが含まれておらず、本菌とは別個の菌株
である。特開昭63-123384号公報に記載された微工研菌
寄第9049号、および微工研菌寄第9050号については、同
公開公報の記載から明らかなように本菌とは異なる別個
の菌株である。その理由は次のとおりである。
【００１５】微工研菌寄第9049号の菌株は、２種のプラ
スミドを有することが明らかであり（公開公報第483
頁、上段左３〜４行）、これらのプラスミド模式図（公
開公報、第１図および第２図）と、本明細書の図１およ
び図２に示したプラスミド模式図とを比較すれば、制限
酵素認識部位が全く異なっている。さらに微工研菌寄第
9049号の菌株から得られるプラスミドｐＴＢ４およびｐ
ＴＢ１０の塩基数は、それぞれ2.9kbおよび3.6kbであ
り、本菌から得られるプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８のそれは、それぞれ3.7kbおよび8.5kbであり、両
菌から得られるプラスミドは明らかに異なっている。従
って、本菌と微工研菌寄第9049号の菌株は、明らかに個
別のプラスミドを有している全く別個の菌株である。
スミドを有することが明らかであり（公開公報第483
頁、上段左３〜４行）、これらのプラスミド模式図（公
開公報、第１図および第２図）と、本明細書の図１およ
び図２に示したプラスミド模式図とを比較すれば、制限
酵素認識部位が全く異なっている。さらに微工研菌寄第
9049号の菌株から得られるプラスミドｐＴＢ４およびｐ
ＴＢ１０の塩基数は、それぞれ2.9kbおよび3.6kbであ
り、本菌から得られるプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８のそれは、それぞれ3.7kbおよび8.5kbであり、両
菌から得られるプラスミドは明らかに異なっている。従
って、本菌と微工研菌寄第9049号の菌株は、明らかに個
別のプラスミドを有している全く別個の菌株である。
【００１６】微工研菌寄第9050号の菌株から得られるプ
ラスミドの模式図（公開公報、第３図）と、本明細書の
図１および図２に示したプラスミド模式図とを比較すれ
ば制限酵素確認部位が全く異なっている。さらに微工研
菌寄第9050号の菌株から得られるプラスミドｐＴＢ６の
塩基数は3.6kbであり、本菌から得られるプラスミドｐ
ＢＬ６７およびｐＢＬ７８のそれは前記のとおりである
ことから、両菌から得られるプラスミドは明らかに異な
っている。従って、本菌と微工研菌寄第9050号の菌株
は、明らかに別個のプラスミドを有している全く別個の
菌株である。
ラスミドの模式図（公開公報、第３図）と、本明細書の
図１および図２に示したプラスミド模式図とを比較すれ
ば制限酵素確認部位が全く異なっている。さらに微工研
菌寄第9050号の菌株から得られるプラスミドｐＴＢ６の
塩基数は3.6kbであり、本菌から得られるプラスミドｐ
ＢＬ６７およびｐＢＬ７８のそれは前記のとおりである
ことから、両菌から得られるプラスミドは明らかに異な
っている。従って、本菌と微工研菌寄第9050号の菌株
は、明らかに別個のプラスミドを有している全く別個の
菌株である。
【００１７】なお、プラスミドｐＴＢ４，ｐＴＢ６およ
びｐＴＢ１０の塩基数は、同公開公報第１図〜第３図に
おいてプラスミドｐＢＲ３２２の塩基数を4.4kbとして
算出したものである。この発明において、制限酵素認識
部位を多数有するビフィドバクテリウム・ロンガムに属
する微生物のプラスミドを用いた理由は、 （ａ）多数の制限酵素で消化できるので、種々のＤＮＡ
断片が得られること （ｂ）他の外来ＤＮＡと種々の結合が可能であること （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の結果として広宿主で発
現できるプラスミドベクターが得られること によるものである。
びｐＴＢ１０の塩基数は、同公開公報第１図〜第３図に
おいてプラスミドｐＢＲ３２２の塩基数を4.4kbとして
算出したものである。この発明において、制限酵素認識
部位を多数有するビフィドバクテリウム・ロンガムに属
する微生物のプラスミドを用いた理由は、 （ａ）多数の制限酵素で消化できるので、種々のＤＮＡ
断片が得られること （ｂ）他の外来ＤＮＡと種々の結合が可能であること （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の結果として広宿主で発
現できるプラスミドベクターが得られること によるものである。
【００１８】次に、ビフィドバクテリウム・ロンガムに
属する微生物のプラスミドを比較するために行なった試
験を以下に示す。 （試験例１） （１）試料の調製 常法により健康な乳児の糞便から５０菌株のビフィドバ
クテリウム・ロンガムに属する微生物を単離した。これ
らの菌株について参考例１と同一の方法によりプラスミ
ドを調製した。 （２）試験方法 プラスミドの制限酵素認識部位は、マニアチス等の方法
（T.Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook, Molecula
r Cloning, p250, Cold Spring Harbor, 1982）により
各種制限酵素で消化したＤＮＡ断片のアガロースゲル電
気泳動で求められるＤＮＡサイズから確認した。 （３）試験結果 供試した５０菌株のうち１５株からプラスミドを検出し
たが、ＭＯ９１０１株、ＭＯ９１０２株、およびＭＯ９
１０３株以外の１２菌株からは１０μｇ以下の少ないＤ
ＮＡが検出され、しかもこれら１２菌株中１０菌株は２
種類以上のプラスミドを保持していた。
属する微生物のプラスミドを比較するために行なった試
験を以下に示す。 （試験例１） （１）試料の調製 常法により健康な乳児の糞便から５０菌株のビフィドバ
クテリウム・ロンガムに属する微生物を単離した。これ
らの菌株について参考例１と同一の方法によりプラスミ
ドを調製した。 （２）試験方法 プラスミドの制限酵素認識部位は、マニアチス等の方法
（T.Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook, Molecula
r Cloning, p250, Cold Spring Harbor, 1982）により
各種制限酵素で消化したＤＮＡ断片のアガロースゲル電
気泳動で求められるＤＮＡサイズから確認した。 （３）試験結果 供試した５０菌株のうち１５株からプラスミドを検出し
たが、ＭＯ９１０１株、ＭＯ９１０２株、およびＭＯ９
１０３株以外の１２菌株からは１０μｇ以下の少ないＤ
ＮＡが検出され、しかもこれら１２菌株中１０菌株は２
種類以上のプラスミドを保持していた。
【００１９】ＭＯ９１０１株およびＭＯ９１０２株から
分離したプラスミドｐＢＬ６７は、制限酵素ＰｓｔＩ、
ＳａｌＩ、ＰｖｕII、およびＨｉｎｄIIIにより消化さ
れなかったことから、これらの制限酵素認識部位を有し
ていないことが判明した（図１参照）。また、ＭＯ９１
０３株から分離したプラスミドｐＢＬ７８は、制限酵素
ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化
されないことから、これらの制限酵素認識部位を有して
いないことが明らかになった（図２参照）。
分離したプラスミドｐＢＬ６７は、制限酵素ＰｓｔＩ、
ＳａｌＩ、ＰｖｕII、およびＨｉｎｄIIIにより消化さ
れなかったことから、これらの制限酵素認識部位を有し
ていないことが判明した（図１参照）。また、ＭＯ９１
０３株から分離したプラスミドｐＢＬ７８は、制限酵素
ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化
されないことから、これらの制限酵素認識部位を有して
いないことが明らかになった（図２参照）。
【００２０】以上の結果から、この発明に用いるプラス
ミドｐＢＬ６７およびｐＢＬ７８は、公知のプラスミド
とは異なる新規なプラスミドであることを確認した。次
に、ストレプトコッカス属に属する微生物由来のプラス
ミドと大腸菌由来のプラスミドとを結合させた複合プラ
スミドと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラ
スミドとを結合させたプラスミドベクターについてさら
に詳しく説明する。
ミドｐＢＬ６７およびｐＢＬ７８は、公知のプラスミド
とは異なる新規なプラスミドであることを確認した。次
に、ストレプトコッカス属に属する微生物由来のプラス
ミドと大腸菌由来のプラスミドとを結合させた複合プラ
スミドと、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のプラ
スミドとを結合させたプラスミドベクターについてさら
に詳しく説明する。
【００２１】まず、図３に示した複合プラスミドｐＳＡ
３と図１に示したビフィドバクテリウム・ロンガム由来
のプラスミドｐＢＬ６７とを公知の方法（R.F.Schleif
andP.C. Wensik 著、山崎達美訳、「分子生物実験マニ
ュアル」第153ページ、講談社、1985年）により結合さ
せ、約13.9kbの塩基よりなるプラスミドベクター５種類
を作成した。なお、プラスミドｐＳＡ３は、大腸菌（E.
coli）のプラスミドｐＡＣＹＣｌ８４とスプレプトコ
ッカス・サンガイス（S.sanguis)のプラスミドｐＧＢ３
０５とを結合して作成した公知のプラスミドベクターで
ある(Applied and Enviromental Microbiology, 49
（１），115, 1985）。
３と図１に示したビフィドバクテリウム・ロンガム由来
のプラスミドｐＢＬ６７とを公知の方法（R.F.Schleif
andP.C. Wensik 著、山崎達美訳、「分子生物実験マニ
ュアル」第153ページ、講談社、1985年）により結合さ
せ、約13.9kbの塩基よりなるプラスミドベクター５種類
を作成した。なお、プラスミドｐＳＡ３は、大腸菌（E.
coli）のプラスミドｐＡＣＹＣｌ８４とスプレプトコ
ッカス・サンガイス（S.sanguis)のプラスミドｐＧＢ３
０５とを結合して作成した公知のプラスミドベクターで
ある(Applied and Enviromental Microbiology, 49
（１），115, 1985）。
【００２２】これら５種類のプラスミドベクターは、図
４に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐ１１
２，図５に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐ
Ｂ１０、図６に示す制限酵素認識部位を有するプラスミ
ドｐＣ１０、図７に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐＤ１０、および図８に示す制限酵素認識部位を
有するプラスミドｐＬ１０である。
４に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐ１１
２，図５に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐ
Ｂ１０、図６に示す制限酵素認識部位を有するプラスミ
ドｐＣ１０、図７に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐＤ１０、および図８に示す制限酵素認識部位を
有するプラスミドｐＬ１０である。
【００２３】プラスミドｐ１１２は、図４にも示したよ
うに、プラスミドｐＳＡ３およびプラスミドｐＢＬ６７
を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。同様に、図
５に示したプラスミドｐＢ１０は、プラスミドｐＳＡ３
およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩでそ
れぞれ消化し、得られた開裂プラスミドを結合させたプ
ラスミドである。図６に示したプラスミドｐＣ１０は、
プラスミドｐＳＡ３およびプラスミドｐＢＬ６７を制限
酵素ＳｐｈＩでそれぞれ消化し、得られた開裂プラスミ
ドを結合させたプラスミドである。図７に示したプラス
ミドｐＤ１０は、プラスミドｐＳＡ３およびｐＢＬ６７
を制限酵素ＥｃｏＲＶでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。図８に示し
たプラスミドｐＬ１０は、プラスミドｐＳＡ３およびｐ
ＢＬ６７を制限酵素ｋｐｎＩでそれぞれ消化し、得られ
た開裂プラスミドを結合させたプラスミドである。な
お、プラスミドｐＳＡ３のｋｐｎＩ認識部位は、この発
明の発明者らによって新たに見い出された制限酵素認識
部位である。
うに、プラスミドｐＳＡ３およびプラスミドｐＢＬ６７
を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。同様に、図
５に示したプラスミドｐＢ１０は、プラスミドｐＳＡ３
およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩでそ
れぞれ消化し、得られた開裂プラスミドを結合させたプ
ラスミドである。図６に示したプラスミドｐＣ１０は、
プラスミドｐＳＡ３およびプラスミドｐＢＬ６７を制限
酵素ＳｐｈＩでそれぞれ消化し、得られた開裂プラスミ
ドを結合させたプラスミドである。図７に示したプラス
ミドｐＤ１０は、プラスミドｐＳＡ３およびｐＢＬ６７
を制限酵素ＥｃｏＲＶでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。図８に示し
たプラスミドｐＬ１０は、プラスミドｐＳＡ３およびｐ
ＢＬ６７を制限酵素ｋｐｎＩでそれぞれ消化し、得られ
た開裂プラスミドを結合させたプラスミドである。な
お、プラスミドｐＳＡ３のｋｐｎＩ認識部位は、この発
明の発明者らによって新たに見い出された制限酵素認識
部位である。
【００２４】次に、図９にそのプラスミド模式図を示し
た複合プラスミドｐＶＡ８３８と、図１に示したプラス
ミドｐＢＬ６７とを結合させて、約12.9kbの塩基よりな
るプラスミドベクター４種類を常法により作成した。な
お、上記複合プラスミドｐＶＡ８３８は、大腸菌のプラ
スミドｐＡＣＹＣ１８４とストレプトコッカス・サイガ
イスのプラスミドｐＶＡ７４９とを結合して作成したプ
ラスミドベクターであり、大腸菌ＡＴＣＣ３７１６０が
保持しており、容易に入手できる。
た複合プラスミドｐＶＡ８３８と、図１に示したプラス
ミドｐＢＬ６７とを結合させて、約12.9kbの塩基よりな
るプラスミドベクター４種類を常法により作成した。な
お、上記複合プラスミドｐＶＡ８３８は、大腸菌のプラ
スミドｐＡＣＹＣ１８４とストレプトコッカス・サイガ
イスのプラスミドｐＶＡ７４９とを結合して作成したプ
ラスミドベクターであり、大腸菌ＡＴＣＣ３７１６０が
保持しており、容易に入手できる。
【００２５】これら４種類のプラスミドベクターは、図
１０に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐＮ２
０、図１１に示す制限酵素認識部位を有するプラスミド
ｐＭ１０、図１２に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐＸ１０、および図１３に示す制限酵素認識部位
を有するプラスミドｐＯ３６である。プラスミドＰＮ２
０は、図１０にも示したように、プラスミドｐＶＡ８３
８およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩで
それぞれ消化し、得られた開裂プラスミドを結合させた
プラスミドである。図１１に示したプラスミドｐＭ１０
は、プラスミドｐＡＶ８３８およびプラスミドｐＢＬ６
７を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、得られた開
裂プラスミドを結合させたプラスミドである。図１２に
示したプラスミドｐＸ１０は、プラスミドｐＡＶ８３８
およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＶでそ
れぞれを消化し、得られた開裂プラスミドを結合させた
プラスミドである。図１３に示したプラスミドｐＯ３６
は、プラスミドｐＡＶ８３８およびプラスミドｐＢＬ６
７を制限酵素ＡｖａＩでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。
１０に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐＮ２
０、図１１に示す制限酵素認識部位を有するプラスミド
ｐＭ１０、図１２に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐＸ１０、および図１３に示す制限酵素認識部位
を有するプラスミドｐＯ３６である。プラスミドＰＮ２
０は、図１０にも示したように、プラスミドｐＶＡ８３
８およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩで
それぞれ消化し、得られた開裂プラスミドを結合させた
プラスミドである。図１１に示したプラスミドｐＭ１０
は、プラスミドｐＡＶ８３８およびプラスミドｐＢＬ６
７を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、得られた開
裂プラスミドを結合させたプラスミドである。図１２に
示したプラスミドｐＸ１０は、プラスミドｐＡＶ８３８
およびプラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＶでそ
れぞれを消化し、得られた開裂プラスミドを結合させた
プラスミドである。図１３に示したプラスミドｐＯ３６
は、プラスミドｐＡＶ８３８およびプラスミドｐＢＬ６
７を制限酵素ＡｖａＩでそれぞれ消化し、得られた開裂
プラスミドを結合させたプラスミドである。
【００２６】さらに図１４に示した複合プラスミドｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫと、図１に示したプラスミドｐＢＬ６７
とを結合させ、約8.6kbの塩基よりなるプラスミドベク
ター２種類を常法により作成した。なお、上記複合プラ
スミドｐＨＹ３００ＰＬＫは、大腸菌のプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１７７とストレプトコッカス・フェカリス由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔc r ）を含むプラスミ
ドｐＡＭα１を結合させた約4.9kbの塩基からなるプラ
スミドであり、市販（宝酒造社製）されている。
Ｙ３００ＰＬＫと、図１に示したプラスミドｐＢＬ６７
とを結合させ、約8.6kbの塩基よりなるプラスミドベク
ター２種類を常法により作成した。なお、上記複合プラ
スミドｐＨＹ３００ＰＬＫは、大腸菌のプラスミドｐＡ
ＣＹＣ１７７とストレプトコッカス・フェカリス由来の
テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔc r ）を含むプラスミ
ドｐＡＭα１を結合させた約4.9kbの塩基からなるプラ
スミドであり、市販（宝酒造社製）されている。
【００２７】これら２種類のプラスミドベクターは、図
１５に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐＡ
３、および図１６に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐ１１１である。プラスミドｐＡ３は図１５にも
示したように、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫおよびプ
ラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩでそれぞれ消
化し、得られた開裂プラスミドを結合させたプラスミド
である。またプラスミドｐ１１１は、図１６にも示した
ように、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫおよびプラスミ
ドｐＢＬ６７を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、
得られた開裂プラスミドを結合させたプラスミドであ
る。
１５に示す制限酵素認識部位を有するプラスミドｐＡ
３、および図１６に示す制限酵素認識部位を有するプラ
スミドｐ１１１である。プラスミドｐＡ３は図１５にも
示したように、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫおよびプ
ラスミドｐＢＬ６７を制限酵素ＥｃｏＲＩでそれぞれ消
化し、得られた開裂プラスミドを結合させたプラスミド
である。またプラスミドｐ１１１は、図１６にも示した
ように、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫおよびプラスミ
ドｐＢＬ６７を制限酵素ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し、
得られた開裂プラスミドを結合させたプラスミドであ
る。
【００２８】次に、以上のようにして得た新規なプラス
ミドベクターの発現を確認するために行なった試験例を
以下に示す。 試験例２ （１）試料の調製 プラスミドベクターｐ１１２を保有する大腸菌ＨＢ１０
１から調製したプラスミドベクターｐ１１２が枯草菌に
おいて発現することを、バシラス・サチリスＩＳＷ１２
１４株（宝酒造製。以下ＩＳＷ１２１４株と略記する）
を用い、Y. SadaieおよびT. Kadaの方法(Journal of Ba
cteriology, 153 (2), 813, 1983）により次のように確
認した。ＩＳＷ１２１４株をＬＢブイヨンで培養した菌
液をＳＰＩ培地（硫酸アンモニウム0.2％、リン酸二カ
リウム1.4％、リン酸一カリウム0.6％、クエン酸ナトリ
ウム２水塩0.1％、硫酸マグネシウム７水塩0.02％、グ
ルコース0.5％、カザミノ酸0.02％、酵母エキス0.1％、
Ｌ−ロイシン50μｇ／ml、Ｌ−メチオニン50μｇ／mlか
らなる）に約１％接種し、３７℃で振とう培養した。得
られた培養液をＳＰＩＩ培地（硫酸アンモニウム0.2
％、リン酸二カリウム1.4％、リン酸一カリウム0.6％、
クエン酸ナトリウム２水塩0.1％、硫酸マグネシウム７
水塩0.02％、グルコース0.5％、塩化マグネシウム５m
M、酵母エキス0.02％、Ｌ−ロイシン5 μｇ／ml、Ｌ−
メチオニン5 μｇ／mlからなる）で7.5倍に希釈し、３
７℃で９０分間振とう培養した。この培養菌液５０μｌ
に、0.01-0.1μｇのＤＮＡを含むプラスミドベクターｐ
１１２の溶液50μｌを加え、３７℃で３０分間振とう培
養した。次いで100μｌのＬＢブイヨンを加え、更に３
７℃で６０分間振とう培養し、ＩＳＷ１２１４株を形質
転換した。３０μｇ／mlのエリスロマイシンを含むＬＢ
寒天培地上に塗抹し、３７℃で１夜培養し、エリスロマ
イシン耐性の形質転換体を検出した。この形質転換した
ＩＳＷ１２１４株を、３０μｇ／mlのエリスロマイシン
を含むＬＢブイヨンで培養した菌体から大腸菌の場合と
同様の方法でプラスミドを抽出し、制限酵素認識部位を
試験例１と同様の方法で分析した。その結果、このプラ
スミドがプラスミドベクターｐ１１２であり、ＩＳＷ１
２１４株で発現したことを確認した。
ミドベクターの発現を確認するために行なった試験例を
以下に示す。 試験例２ （１）試料の調製 プラスミドベクターｐ１１２を保有する大腸菌ＨＢ１０
１から調製したプラスミドベクターｐ１１２が枯草菌に
おいて発現することを、バシラス・サチリスＩＳＷ１２
１４株（宝酒造製。以下ＩＳＷ１２１４株と略記する）
を用い、Y. SadaieおよびT. Kadaの方法(Journal of Ba
cteriology, 153 (2), 813, 1983）により次のように確
認した。ＩＳＷ１２１４株をＬＢブイヨンで培養した菌
液をＳＰＩ培地（硫酸アンモニウム0.2％、リン酸二カ
リウム1.4％、リン酸一カリウム0.6％、クエン酸ナトリ
ウム２水塩0.1％、硫酸マグネシウム７水塩0.02％、グ
ルコース0.5％、カザミノ酸0.02％、酵母エキス0.1％、
Ｌ−ロイシン50μｇ／ml、Ｌ−メチオニン50μｇ／mlか
らなる）に約１％接種し、３７℃で振とう培養した。得
られた培養液をＳＰＩＩ培地（硫酸アンモニウム0.2
％、リン酸二カリウム1.4％、リン酸一カリウム0.6％、
クエン酸ナトリウム２水塩0.1％、硫酸マグネシウム７
水塩0.02％、グルコース0.5％、塩化マグネシウム５m
M、酵母エキス0.02％、Ｌ−ロイシン5 μｇ／ml、Ｌ−
メチオニン5 μｇ／mlからなる）で7.5倍に希釈し、３
７℃で９０分間振とう培養した。この培養菌液５０μｌ
に、0.01-0.1μｇのＤＮＡを含むプラスミドベクターｐ
１１２の溶液50μｌを加え、３７℃で３０分間振とう培
養した。次いで100μｌのＬＢブイヨンを加え、更に３
７℃で６０分間振とう培養し、ＩＳＷ１２１４株を形質
転換した。３０μｇ／mlのエリスロマイシンを含むＬＢ
寒天培地上に塗抹し、３７℃で１夜培養し、エリスロマ
イシン耐性の形質転換体を検出した。この形質転換した
ＩＳＷ１２１４株を、３０μｇ／mlのエリスロマイシン
を含むＬＢブイヨンで培養した菌体から大腸菌の場合と
同様の方法でプラスミドを抽出し、制限酵素認識部位を
試験例１と同様の方法で分析した。その結果、このプラ
スミドがプラスミドベクターｐ１１２であり、ＩＳＷ１
２１４株で発現したことを確認した。
【００２９】なお、プラスミドベクターｐＢ１０，ｐＣ
１０，ｐＤ１０，ｐＬ１０，ｐＮ２０，ｐＭ１０，ｐＸ
１０，およびｐＯ３６についてもｐ１１２と同様の試験
を行なった結果、いずれのプラスミドベクターも大腸菌
ＨＢ１０１株およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４
株において好適に発現することを確認した。プラスミド
ベクターｐＡ３およびｐ１１１の試験においては、大腸
菌ＨＢ１０１およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４
株でこれらのプラスミドベクターを発現させた形質転換
体を検出する培地としてテトラサイクリン２０μｇ／ml
を含むＬＢ寒天培地を使用し、またこれらの形質転換体
を培養する液体培地としてテトラサイクリン２０μｇ／
mlを含むＬＢブイヨンを使用したが、これらの培地を使
用した以外は上記と同一の方法で試験を行ない、プラス
ミドベクターｐＡ３およびｐ１１１も大腸菌ＨＢ１０１
株およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４株において
好適に発現することが確認され、ビフィドバクテリウム
属に属する微生物、乳酸菌等においてもその発現に十分
な可能性がある。
１０，ｐＤ１０，ｐＬ１０，ｐＮ２０，ｐＭ１０，ｐＸ
１０，およびｐＯ３６についてもｐ１１２と同様の試験
を行なった結果、いずれのプラスミドベクターも大腸菌
ＨＢ１０１株およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４
株において好適に発現することを確認した。プラスミド
ベクターｐＡ３およびｐ１１１の試験においては、大腸
菌ＨＢ１０１およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４
株でこれらのプラスミドベクターを発現させた形質転換
体を検出する培地としてテトラサイクリン２０μｇ／ml
を含むＬＢ寒天培地を使用し、またこれらの形質転換体
を培養する液体培地としてテトラサイクリン２０μｇ／
mlを含むＬＢブイヨンを使用したが、これらの培地を使
用した以外は上記と同一の方法で試験を行ない、プラス
ミドベクターｐＡ３およびｐ１１１も大腸菌ＨＢ１０１
株およびバシラス・サチリスＩＳＷ１２１４株において
好適に発現することが確認され、ビフィドバクテリウム
属に属する微生物、乳酸菌等においてもその発現に十分
な可能性がある。
【００３０】この試験で得られた形質転換体の代表菌株
例として、プラスミドベクターｐ１１２で形質転換した
枯草菌ＩＳＷ１２１４をＭＯ９１０４と命名し、平成３
年４月４日付で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
し、微工研菌寄第12170号なる受託番号が付された。次
に第２の発明、すなわち、ストレプトコッカス属に属す
る微生物のエリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅm r ）を有
する大腸菌のプラスミドと、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガム由来のプラスミドとを結合させたプラスミドベク
ターについてさらに詳しく説明する。
例として、プラスミドベクターｐ１１２で形質転換した
枯草菌ＩＳＷ１２１４をＭＯ９１０４と命名し、平成３
年４月４日付で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
し、微工研菌寄第12170号なる受託番号が付された。次
に第２の発明、すなわち、ストレプトコッカス属に属す
る微生物のエリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅm r ）を有
する大腸菌のプラスミドと、ビフィドバクテリウム・ロ
ンガム由来のプラスミドとを結合させたプラスミドベク
ターについてさらに詳しく説明する。
【００３１】まず、ストレプトコッカス属に属する微生
物のエリスロマイシン耐性遺伝子を有する大腸菌のプラ
スミドｐＥ３８、ｐＰ４１、およびｐＳＡＨ１を公知の
方法により、各々、次のようにして作成した。プラスミ
ドｐＥ３８は、図１７にその作成工程を示したように、
公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２から、制限酵素Ａ
ｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化して得られた約3.0kbの
プラスミド断片に、プラスミドｐＡＭβ１から同一の酵
素で消化して得られるエリスロマイシン耐性遺伝子を含
む約2.0kbのＤＮＡ断片を結合させた、約5.0kb塩基から
なるプラスミドである。なお、上記プラスミドｐＡＭβ
１は、ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５（ＡＴ
ＣＣ１４５０８）の保持するプラスミドであり、この菌
株はＡＴＣＣから容易に入手し得る。
物のエリスロマイシン耐性遺伝子を有する大腸菌のプラ
スミドｐＥ３８、ｐＰ４１、およびｐＳＡＨ１を公知の
方法により、各々、次のようにして作成した。プラスミ
ドｐＥ３８は、図１７にその作成工程を示したように、
公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２から、制限酵素Ａ
ｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化して得られた約3.0kbの
プラスミド断片に、プラスミドｐＡＭβ１から同一の酵
素で消化して得られるエリスロマイシン耐性遺伝子を含
む約2.0kbのＤＮＡ断片を結合させた、約5.0kb塩基から
なるプラスミドである。なお、上記プラスミドｐＡＭβ
１は、ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５（ＡＴ
ＣＣ１４５０８）の保持するプラスミドであり、この菌
株はＡＴＣＣから容易に入手し得る。
【００３２】プラスミドｐＰ４１は、図１８にその作成
工程を示したように、公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ３
２２から、制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化
して得られた約3.0kbのプラスミド断片に、プラスミド
ｐＶＡ８３８（図９参照）から同一の酵素で消化して得
られるエリスロマイシン耐性遺伝子を含む約1.7kbのＤ
ＮＡ断片を結合させた、約4.7kbの塩基からなるプラス
ミドである。
工程を示したように、公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ３
２２から、制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化
して得られた約3.0kbのプラスミド断片に、プラスミド
ｐＶＡ８３８（図９参照）から同一の酵素で消化して得
られるエリスロマイシン耐性遺伝子を含む約1.7kbのＤ
ＮＡ断片を結合させた、約4.7kbの塩基からなるプラス
ミドである。
【００３３】プラスミドｐＳＡＨ１は、図１９にその作
成工程を示したように、公知のプラスミドｐＳＡ３（図
３参照）のＨｉｎｄIII 断片を電気泳動し、得られた約
5.0kbのエリスロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
を再結合して得られる新規なプラスミドである。このよ
うにして得たプラスミドｐＥ３８、ｐＰ４１、またはｐ
ＳＡＨ１と、前記ビフィドバクテリウム・ロンガム由来
のプラスミドｐＢＬ６７（図１）またはｐＢＬ７８（図
２）を公知の方法で結合させ、以下に示す８種の新規な
プラスミドベクターを作成した。
成工程を示したように、公知のプラスミドｐＳＡ３（図
３参照）のＨｉｎｄIII 断片を電気泳動し、得られた約
5.0kbのエリスロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片
を再結合して得られる新規なプラスミドである。このよ
うにして得たプラスミドｐＥ３８、ｐＰ４１、またはｐ
ＳＡＨ１と、前記ビフィドバクテリウム・ロンガム由来
のプラスミドｐＢＬ６７（図１）またはｐＢＬ７８（図
２）を公知の方法で結合させ、以下に示す８種の新規な
プラスミドベクターを作成した。
【００３４】すなわち、図２０にその作成工程を示した
ように、プラスミドｐＥ３８とｐＢＬ６７とを制限酵素
ＡｖａＩ認識部位で結合させて約8.7kbの塩基からなる
プラスミドベクターｐＩａを作成した。同様に、プラス
ミドｐＥ３８とｐＢＬ６７とを制限酵素ＥｃｏＲＩ認識
部位で結合させて図２１に示したプラスミドベクターｐ
Ｋ２を作成した。また、プラスミドｐＥ３８とｐＢＬ７
８とを制限酵素ＰｓｔＩ認識部位で結合させて図２２に
示したプラスミドベクターｐＶ４を作成した。
ように、プラスミドｐＥ３８とｐＢＬ６７とを制限酵素
ＡｖａＩ認識部位で結合させて約8.7kbの塩基からなる
プラスミドベクターｐＩａを作成した。同様に、プラス
ミドｐＥ３８とｐＢＬ６７とを制限酵素ＥｃｏＲＩ認識
部位で結合させて図２１に示したプラスミドベクターｐ
Ｋ２を作成した。また、プラスミドｐＥ３８とｐＢＬ７
８とを制限酵素ＰｓｔＩ認識部位で結合させて図２２に
示したプラスミドベクターｐＶ４を作成した。
【００３５】次に図２３にその作成工程を示したよう
に、プラスミドｐＰ４１とｐＢＬ７８とを制限酵素Ｐｓ
ｔＩ認識部位で結合させてプラスミドベクターｐＷ３４
を作成した。また、プラスミドｐＰ４１とｐＢＬ６７と
を制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位で結合させて図２４に示
したプラスミドベクターｐＵ２を、同様に制限酵素Ａｖ
ａＩ認識部位で結合させて図２５に示したプラスミドベ
クターｐＴ４を作成した。
に、プラスミドｐＰ４１とｐＢＬ７８とを制限酵素Ｐｓ
ｔＩ認識部位で結合させてプラスミドベクターｐＷ３４
を作成した。また、プラスミドｐＰ４１とｐＢＬ６７と
を制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位で結合させて図２４に示
したプラスミドベクターｐＵ２を、同様に制限酵素Ａｖ
ａＩ認識部位で結合させて図２５に示したプラスミドベ
クターｐＴ４を作成した。
【００３６】さらに、プラスミドｐＡＳＨ１とｐＢＬ６
７とを制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位で結合させて図２６
に示したプラスミドベクターｐＳ１０を、同様に制限酵
素ＡｖａＩを認識部位で結合させて図２７に示したプラ
スミドベクターｐＲ１を作成した。以下に、これらの新
規なプラスミドベクターの発現を確認するために行なっ
た試験例を示す。 試験例３ プラスミドの大腸菌における発現は常法の形質転換法
（T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Mole
cular Cloning, P250, Cold SpringHarbor, 1982）によ
り次のように行った。
７とを制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位で結合させて図２６
に示したプラスミドベクターｐＳ１０を、同様に制限酵
素ＡｖａＩを認識部位で結合させて図２７に示したプラ
スミドベクターｐＲ１を作成した。以下に、これらの新
規なプラスミドベクターの発現を確認するために行なっ
た試験例を示す。 試験例３ プラスミドの大腸菌における発現は常法の形質転換法
（T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Mole
cular Cloning, P250, Cold SpringHarbor, 1982）によ
り次のように行った。
【００３７】プラスミドベクターｐＩａのＤＮＡ0.005
〜0.5μｇを含むＴＥ液（１０mMトリス塩酸および１mM
ＥＤＴＡからなりpH8.0）約１０μｌにＴＣＭ液（１０m
Mトリス塩酸、１０mM塩化カルシウムおよび１０mM塩化
マグネシウムからなる。pH7.0）を添加して液量を100μ
ｌに調整し、これに大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセ
ル（宝酒造製）200μｌを添加した後、３０分間氷冷し
た。のち４２℃の恒温水槽中で２分間保温し、ＬＢブイ
ヨン（培地１１当たり酵母エキス５ｇ、バクトトリプト
ン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇからなる）１mlを
加えて３７℃で１時間培養した。このようにして得られ
た形質転換大腸菌の培養液に0.7％寒天溶液３mlを加
え、均一に混合した試料を、エリスロマイシン250μｇ
／mlを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し３７℃で１夜培養
し、形質転換体を検出した。エリスロマイシン耐性を示
した大腸菌、即ち形質転換体のコロニー１白金耳をエリ
スロマイシン250μｇ／mlを含むＬＢブイヨン２mlに接
種して３７℃で１夜培養し、この培養液を遠心分離して
得られた大腸菌の菌体からアルカリ−ＳＤＳ法（T. Man
iatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cl
oning, P368, Cold Spring Harbor, 1982）によりプラ
スミドを分離し、さらにこのプラスミドの制限酵素認識
部位を試験例１と同様の方法で分析した。その結果、こ
のプラスミドがプラスミドベクターｐＩａであり、大腸
菌で発現したことを確認した。
〜0.5μｇを含むＴＥ液（１０mMトリス塩酸および１mM
ＥＤＴＡからなりpH8.0）約１０μｌにＴＣＭ液（１０m
Mトリス塩酸、１０mM塩化カルシウムおよび１０mM塩化
マグネシウムからなる。pH7.0）を添加して液量を100μ
ｌに調整し、これに大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセ
ル（宝酒造製）200μｌを添加した後、３０分間氷冷し
た。のち４２℃の恒温水槽中で２分間保温し、ＬＢブイ
ヨン（培地１１当たり酵母エキス５ｇ、バクトトリプト
ン１０ｇ、および塩化ナトリウム５ｇからなる）１mlを
加えて３７℃で１時間培養した。このようにして得られ
た形質転換大腸菌の培養液に0.7％寒天溶液３mlを加
え、均一に混合した試料を、エリスロマイシン250μｇ
／mlを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し３７℃で１夜培養
し、形質転換体を検出した。エリスロマイシン耐性を示
した大腸菌、即ち形質転換体のコロニー１白金耳をエリ
スロマイシン250μｇ／mlを含むＬＢブイヨン２mlに接
種して３７℃で１夜培養し、この培養液を遠心分離して
得られた大腸菌の菌体からアルカリ−ＳＤＳ法（T. Man
iatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cl
oning, P368, Cold Spring Harbor, 1982）によりプラ
スミドを分離し、さらにこのプラスミドの制限酵素認識
部位を試験例１と同様の方法で分析した。その結果、こ
のプラスミドがプラスミドベクターｐＩａであり、大腸
菌で発現したことを確認した。
【００３８】なお、上記と同一の方法により、プラスミ
ドベクターｐＫ２，ｐＶ４，ｐＵ２，ｐＴ４，ｐＷ３
４，ｐＳ１０およびｐＲ１が大腸菌ＨＢ１０１において
好適に発現することが確認され、ビフィドバクテリウム
属に属する微生物においてもその発現に十分な可能性が
ある。この試験で得られた形質転換体の代表菌株例とし
て、プラスミドベクターｐＩａで形質転換した大腸菌Ｈ
Ｂ１０１をＭＯ９１０５と命名し、平成３年４月４日付
で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、微工研菌
寄第12171号なる受託番号が付された。
ドベクターｐＫ２，ｐＶ４，ｐＵ２，ｐＴ４，ｐＷ３
４，ｐＳ１０およびｐＲ１が大腸菌ＨＢ１０１において
好適に発現することが確認され、ビフィドバクテリウム
属に属する微生物においてもその発現に十分な可能性が
ある。この試験で得られた形質転換体の代表菌株例とし
て、プラスミドベクターｐＩａで形質転換した大腸菌Ｈ
Ｂ１０１をＭＯ９１０５と命名し、平成３年４月４日付
で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、微工研菌
寄第12171号なる受託番号が付された。
【００３９】次に参考例および実施例を示してこの発明
をさらに具体的に説明するが、この発明は以下に記載す
る実施例に限定されるものではない。 参考例１ ＧＡＭブイヨン液体培地（日水製薬社製）1000mlにビフ
ィドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０１株の前培養液
５０mlを接種し、３７℃で５時間培養した。培養液を遠
心分離し、集菌した菌体から橋場らの方法（Applied an
d Environmental Microbiology，55 (6), 1655, 1989）
の方法により、プラスミドを次のように調製した。菌体
をＳＴＭ液（１Ｍショ糖、および１０mMトリス・マレイ
ン酸からなり、pH6.5）で洗浄し、同液１０mlに懸濁
し、Ｎ−アセチルムラミディスＳＧ（生化学工業製、lm
g／ml）0.5mlを加えて３７℃で３０分間保温した。これ
に0.2Ｎ水酸化ナトリウム２０mlと１０％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）２mlを加えて溶菌し、３７℃で１
５分間保温し、のち氷冷した。次いで３M酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.8）１５mlを加えて氷冷し、遠心分離し
て上清液約４０mlを得た。この上清液に蒸留水４０mlを
加え、ＴＥ液（１０mMトリス塩酸、および１mMＥＤＴＡ
からなり、pH8.0。以下ＴＥ液と記載する）飽和フェノ
ール４０mlとクロロホルム−イソアミルアルコール混液
（容積で２４：１の比率）４０mlとを加えて混合し、こ
れを遠心分離して水層部を得た。この水層部をＴＥ液飽
和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液で２回反復して処理し、得られた水層部６５mlに３M
酢酸ナトリウム緩衝液6.5mlとエタノール143mlを加え、
−８０℃で３０分間冷却し、遠心分離して沈澱を得た。
この沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ液
0.5mlに溶解した。この溶液にＤＮＡフリーの牛すい臓
リボヌクレアーゼ（シグマ社製。１０mg／ml）２μｌを
加え、３７℃で１０分間保温し、プロテイナーゼＫ（シ
グマ社製。２５mg／ml）２μｌを加え、３７℃で３０分
間保温した。次いで上記ＴＥ液飽和フェノールとクロロ
ホルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノール
で処理し、最終的にプラスミドＤＮＡのＴＥ液0.5mlを
得た。このＴＥ液には、ＭＯ９１０１株のプラスミドｐ
ＢＬ６７が約２０μｇ含まれていた。 参考例２ ＭＯ９１０２株を用いた以外は参考例１と同一の方法に
より約２０μｇのプラスミドｐＢＬ６７を得た。 参考例３ ＭＯ９１０３株を用いた以外は参考例１と同一の方法に
より約６０μｇのプラスミドｐＢＬ７８を得た。
をさらに具体的に説明するが、この発明は以下に記載す
る実施例に限定されるものではない。 参考例１ ＧＡＭブイヨン液体培地（日水製薬社製）1000mlにビフ
ィドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０１株の前培養液
５０mlを接種し、３７℃で５時間培養した。培養液を遠
心分離し、集菌した菌体から橋場らの方法（Applied an
d Environmental Microbiology，55 (6), 1655, 1989）
の方法により、プラスミドを次のように調製した。菌体
をＳＴＭ液（１Ｍショ糖、および１０mMトリス・マレイ
ン酸からなり、pH6.5）で洗浄し、同液１０mlに懸濁
し、Ｎ−アセチルムラミディスＳＧ（生化学工業製、lm
g／ml）0.5mlを加えて３７℃で３０分間保温した。これ
に0.2Ｎ水酸化ナトリウム２０mlと１０％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）２mlを加えて溶菌し、３７℃で１
５分間保温し、のち氷冷した。次いで３M酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.8）１５mlを加えて氷冷し、遠心分離し
て上清液約４０mlを得た。この上清液に蒸留水４０mlを
加え、ＴＥ液（１０mMトリス塩酸、および１mMＥＤＴＡ
からなり、pH8.0。以下ＴＥ液と記載する）飽和フェノ
ール４０mlとクロロホルム−イソアミルアルコール混液
（容積で２４：１の比率）４０mlとを加えて混合し、こ
れを遠心分離して水層部を得た。この水層部をＴＥ液飽
和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液で２回反復して処理し、得られた水層部６５mlに３M
酢酸ナトリウム緩衝液6.5mlとエタノール143mlを加え、
−８０℃で３０分間冷却し、遠心分離して沈澱を得た。
この沈澱を７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＴＥ液
0.5mlに溶解した。この溶液にＤＮＡフリーの牛すい臓
リボヌクレアーゼ（シグマ社製。１０mg／ml）２μｌを
加え、３７℃で１０分間保温し、プロテイナーゼＫ（シ
グマ社製。２５mg／ml）２μｌを加え、３７℃で３０分
間保温した。次いで上記ＴＥ液飽和フェノールとクロロ
ホルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノール
で処理し、最終的にプラスミドＤＮＡのＴＥ液0.5mlを
得た。このＴＥ液には、ＭＯ９１０１株のプラスミドｐ
ＢＬ６７が約２０μｇ含まれていた。 参考例２ ＭＯ９１０２株を用いた以外は参考例１と同一の方法に
より約２０μｇのプラスミドｐＢＬ６７を得た。 参考例３ ＭＯ９１０３株を用いた以外は参考例１と同一の方法に
より約６０μｇのプラスミドｐＢＬ７８を得た。
【００４０】
実施例１ プラスミドｐＳＡ３を保有する大腸菌ＨＢ１０１から、
試験例３と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミド
ｐＳＡ３を調製した。このプラスミドｐＳＡ３を制限酵
素ＢａｍＨＩで消化しＴＥ液飽和フェノールとクロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノールで
処理し、開裂プラスミドを含むＴＥ液を調製した。この
開裂プラスミドｐＳＡ３を常法（T. Maniatis,E. F. Fr
itsch and J. Sambrook, Molecular Cloning, p133, Co
ld Spring Harbor, 1982）により牛腸由来のアルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液
飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール
混液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＳＡ３
を精製した。参考例１と同一の方法により得たプラスミ
ドｐＢＬ６７を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、上記脱リ
ン酸化ｐＳＡ３と常法によりＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸
菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、形質転換した。形質転換大腸菌を薬剤添加培地で培
養し、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールに
耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有するコロニ
ーを分離した。この形質転換大腸菌から上記と同一のア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドベクターｐ１１２を
得た。 実施例２ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリンに耐
性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有する大腸
菌からプラスミドベクターｐＢ１０を得た。 実施例３ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＳｐｈＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵
素ＳｐｈＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方法に
よりエリスロマイシンおよびクロラムフェニコールに耐
性を有し、テトラサイクリンに感受性を有する大腸菌か
らプラスミドベクターｐＣ１０を得た。 実施例４ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリンに耐
性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有する大腸
菌からプラスミドベクターＰＤ１０を得た。 実施例５ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＫｐｎＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵
素ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方法に
よりエリスロマイシン、テトラサイクリンおよびクロラ
ムフェニコールに耐性を有する大腸菌からプラスミドベ
クターｐＬ１０を得た。 実施例６ プラスミドｐＶＡ８３８を保有する大腸菌（ＡＴＣＣ３
７１６０）から実施例１と同一のアルカリーＳＤＳ法に
よりプラスミドｐＶＡ８３８を調製した。このプラスミ
ドｐＶＡ８３８を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＴＥ液
飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール
混液、およびエタノールで処理し、開裂プラスミドを含
むＴＥ液を調製した。この開裂プラスミドｐＶＡ８３８
を実施例１と同一の方法により牛腸由来のアルカリフォ
スファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液飽
和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＶＡ８３
８を精製した。この脱リン酸化ｐＶＡ８３８と別に制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例２と同一の方法により調製）を実施例１と同一の方法
によりＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で連結
し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセル（宝酒造製）に導入し、形質転換した。形質
転換大腸菌を薬剤添加培地で培養し、エリスロマイシン
およびテトラサイクリンに耐性を有し、クロラムフェニ
コールに感受性を有するコロニーを分離した。この形質
転換大腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドベクターｐＮ２０を得た。 実施例７ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化し、別に
制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニ
コールに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＭ１０を得た。 実施例８ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化し、別に
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドＰＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリ
ンに耐性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＸ１０を得た。 実施例９ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＡｖａＩで部分消化し、脱リン酸化し、別
に制限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニ
コールに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＯ３６を得た。 実施例１０ プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化し、ＴＥ液飽和フェノールとクロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノールで
処理し、開裂プラスミドを含むＴＥ液を調製した。この
開裂プラスミドＰＨＹ３００ＰＬＫを実施例１と同一の
方法により牛腸由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒
造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液飽和フェノールとクロ
ロホルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノー
ルで処理し、脱リン酸化ｐＨＹ３００ＰＬＫを精製し
た。この脱リン酸化ｐＨＹ３００ＰＬＫと別に制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例２
と同一の方法により調製）を実施例１と同一の方法によ
りＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で連結し、
塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピテン
トセル（宝酒造製）に導入し、形質転換した。形質転換
した大腸菌を薬剤添加培地で培養し、アンピシリンおよ
びテトラサイクリンに耐性を有するコロニーを分離し
た。この形質転換した大腸菌から実施例１と同一のアル
カリ−ＳＤＳ法によりプラスミドベクターｐＡ３を得
た。 実施例１１ 実施例１０と同一の方法により得たプラスミドｐＨＹ３
００ＰＬＫを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化
し、別に制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢ
Ｌ６７（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例
１０と同一の方法によりアンピシリンおよびテトラサイ
クリンに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐ
１１１を得た。 実施例１２ ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５（ＡＴＣＣ１
４５０８）を用いた以外は参考例１と同一の方法により
ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５からプラスミ
ドｐＡＭβ１を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを制限
酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＴＥ液飽和
フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液、およびエタノールで処理し、ＤＮＡ断片を含むＴＥ
液を調製した。一方、大腸菌のプラスミドＰＢＲ３２２
（宝酒造製）を制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで
消化し、実施例１と同一の方法により牛腸由来のアルカ
リフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、Ｔ
Ｅ液飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコ
ール混液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＢ
Ｒ３２２断片を精製した。次に、実施例１と同一の方法
により、上記のｐＡＭβ１のＤＮＡ断片と脱リン酸化ｐ
ＢＲ３２２断片とをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１
０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、形質転
換した。形質転換大腸菌を薬剤添加培地で培養し、エリ
スロマイシンおよびアンピシリンに耐性を有し、テトラ
サイクリンに感受性を有するコロニーを分離した。この
形質転換大腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドｐＥ３８を得た。次にプラスミドｐ
Ｅ３８を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別
に制限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、再度塩化カルシウ
ム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒
造製）に導入し、形質転換した。形質転換した大腸菌を
薬剤添加培地で培養し、エリスロマイシンおよびアンピ
シリンに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐ
ｌａを得た。 実施例１３ 実施例１２と同一の方法により得たプラスミドｐＥ３８
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参
考例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造製）で連結した後、以下実施例１２と
同一の方法によりエリスロマイシンおよびアンピシリン
に耐性を有し、大腸菌からプラスミドベクターｐＫ２を
得た。 実施例１４ 実施例１２と同一の方法により得たプラスミドｐＥ３８
を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＬ７８（参考例
３と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１２と同一の方
法によりエリスロマイシンに耐性を有し、アンピシリン
に感受性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＶ４
を得た。 実施例１５ 実施例６と同一の方法で調製したプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、Ｔ
Ｅ液飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコ
ール混液、およびエタノールで処理し、ＤＮＡ断片を含
むＴＥ液を調製した。このプラスミドｐＶＡ８３８のＤ
ＮＡ断片と実施例１２と同一の方法で調製した脱リン酸
化ｐＢＲ３２２断片をＤＮＡライゲーションキット（宝
酒造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ
１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、形質
転換した。形質転換した大腸菌を薬剤添加培地で培養
し、エリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性を有
し、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに感
受性を有するコロニーを分離した。この形質転換した大
腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドｐＰ４１を得た。
試験例３と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミド
ｐＳＡ３を調製した。このプラスミドｐＳＡ３を制限酵
素ＢａｍＨＩで消化しＴＥ液飽和フェノールとクロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノールで
処理し、開裂プラスミドを含むＴＥ液を調製した。この
開裂プラスミドｐＳＡ３を常法（T. Maniatis,E. F. Fr
itsch and J. Sambrook, Molecular Cloning, p133, Co
ld Spring Harbor, 1982）により牛腸由来のアルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液
飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール
混液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＳＡ３
を精製した。参考例１と同一の方法により得たプラスミ
ドｐＢＬ６７を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、上記脱リ
ン酸化ｐＳＡ３と常法によりＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸
菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、形質転換した。形質転換大腸菌を薬剤添加培地で培
養し、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコールに
耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有するコロニ
ーを分離した。この形質転換大腸菌から上記と同一のア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドベクターｐ１１２を
得た。 実施例２ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリンに耐
性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有する大腸
菌からプラスミドベクターｐＢ１０を得た。 実施例３ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＳｐｈＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵
素ＳｐｈＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方法に
よりエリスロマイシンおよびクロラムフェニコールに耐
性を有し、テトラサイクリンに感受性を有する大腸菌か
らプラスミドベクターｐＣ１０を得た。 実施例４ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリンに耐
性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有する大腸
菌からプラスミドベクターＰＤ１０を得た。 実施例５ 実施例１と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＫｐｎＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵
素ＫｐｎＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造製）で連結し、以下実施例１と同一の方法に
よりエリスロマイシン、テトラサイクリンおよびクロラ
ムフェニコールに耐性を有する大腸菌からプラスミドベ
クターｐＬ１０を得た。 実施例６ プラスミドｐＶＡ８３８を保有する大腸菌（ＡＴＣＣ３
７１６０）から実施例１と同一のアルカリーＳＤＳ法に
よりプラスミドｐＶＡ８３８を調製した。このプラスミ
ドｐＶＡ８３８を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ＴＥ液
飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール
混液、およびエタノールで処理し、開裂プラスミドを含
むＴＥ液を調製した。この開裂プラスミドｐＶＡ８３８
を実施例１と同一の方法により牛腸由来のアルカリフォ
スファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液飽
和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＶＡ８３
８を精製した。この脱リン酸化ｐＶＡ８３８と別に制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例２と同一の方法により調製）を実施例１と同一の方法
によりＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で連結
し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセル（宝酒造製）に導入し、形質転換した。形質
転換大腸菌を薬剤添加培地で培養し、エリスロマイシン
およびテトラサイクリンに耐性を有し、クロラムフェニ
コールに感受性を有するコロニーを分離した。この形質
転換大腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドベクターｐＮ２０を得た。 実施例７ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化し、別に
制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニ
コールに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＭ１０を得た。 実施例８ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、脱リン酸化し、別に
制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドＰＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびテトラサイクリ
ンに耐性を有し、クロラムフェニコールに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＸ１０を得た。 実施例９ 実施例６と同一の方法により得たプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＡｖａＩで部分消化し、脱リン酸化し、別
に制限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例６と同
一の方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニ
コールに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有す
る大腸菌からプラスミドベクターｐＯ３６を得た。 実施例１０ プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化し、ＴＥ液飽和フェノールとクロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノールで
処理し、開裂プラスミドを含むＴＥ液を調製した。この
開裂プラスミドＰＨＹ３００ＰＬＫを実施例１と同一の
方法により牛腸由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒
造社製）で脱リン酸化し、ＴＥ液飽和フェノールとクロ
ロホルム−イソアミルアルコール混液、およびエタノー
ルで処理し、脱リン酸化ｐＨＹ３００ＰＬＫを精製し
た。この脱リン酸化ｐＨＹ３００ＰＬＫと別に制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例２
と同一の方法により調製）を実施例１と同一の方法によ
りＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）で連結し、
塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピテン
トセル（宝酒造製）に導入し、形質転換した。形質転換
した大腸菌を薬剤添加培地で培養し、アンピシリンおよ
びテトラサイクリンに耐性を有するコロニーを分離し
た。この形質転換した大腸菌から実施例１と同一のアル
カリ−ＳＤＳ法によりプラスミドベクターｐＡ３を得
た。 実施例１１ 実施例１０と同一の方法により得たプラスミドｐＨＹ３
００ＰＬＫを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化
し、別に制限酵素ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＢ
Ｌ６７（参考例２と同一の方法により調製）とＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造製）で連結し、以下実施例
１０と同一の方法によりアンピシリンおよびテトラサイ
クリンに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐ
１１１を得た。 実施例１２ ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５（ＡＴＣＣ１
４５０８）を用いた以外は参考例１と同一の方法により
ストレプトコッカス・フェカリスＤＳ−５からプラスミ
ドｐＡＭβ１を含むＤＮＡを調製し、このＤＮＡを制限
酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、ＴＥ液飽和
フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコール混
液、およびエタノールで処理し、ＤＮＡ断片を含むＴＥ
液を調製した。一方、大腸菌のプラスミドＰＢＲ３２２
（宝酒造製）を制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで
消化し、実施例１と同一の方法により牛腸由来のアルカ
リフォスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸化し、Ｔ
Ｅ液飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコ
ール混液、およびエタノールで処理し、脱リン酸化ｐＢ
Ｒ３２２断片を精製した。次に、実施例１と同一の方法
により、上記のｐＡＭβ１のＤＮＡ断片と脱リン酸化ｐ
ＢＲ３２２断片とをＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ１
０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、形質転
換した。形質転換大腸菌を薬剤添加培地で培養し、エリ
スロマイシンおよびアンピシリンに耐性を有し、テトラ
サイクリンに感受性を有するコロニーを分離した。この
形質転換大腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドｐＥ３８を得た。次にプラスミドｐ
Ｅ３８を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別
に制限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７
（参考例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲー
ションキット（宝酒造製）で連結し、再度塩化カルシウ
ム法により大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒
造製）に導入し、形質転換した。形質転換した大腸菌を
薬剤添加培地で培養し、エリスロマイシンおよびアンピ
シリンに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐ
ｌａを得た。 実施例１３ 実施例１２と同一の方法により得たプラスミドｐＥ３８
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制
限酵素ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参
考例１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造製）で連結した後、以下実施例１２と
同一の方法によりエリスロマイシンおよびアンピシリン
に耐性を有し、大腸菌からプラスミドベクターｐＫ２を
得た。 実施例１４ 実施例１２と同一の方法により得たプラスミドｐＥ３８
を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＬ７８（参考例
３と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１２と同一の方
法によりエリスロマイシンに耐性を有し、アンピシリン
に感受性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＶ４
を得た。 実施例１５ 実施例６と同一の方法で調製したプラスミドｐＶＡ８３
８を制限酵素ＡｖａＩおよびＨｉｎｄIIIで消化し、Ｔ
Ｅ液飽和フェノールとクロロホルム−イソアミルアルコ
ール混液、およびエタノールで処理し、ＤＮＡ断片を含
むＴＥ液を調製した。このプラスミドｐＶＡ８３８のＤ
ＮＡ断片と実施例１２と同一の方法で調製した脱リン酸
化ｐＢＲ３２２断片をＤＮＡライゲーションキット（宝
酒造製）で連結し、塩化カルシウム法により大腸菌ＨＢ
１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入し、形質
転換した。形質転換した大腸菌を薬剤添加培地で培養
し、エリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性を有
し、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに感
受性を有するコロニーを分離した。この形質転換した大
腸菌から実施例１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプ
ラスミドｐＰ４１を得た。
【００４１】次に、得られたプラスミドｐＰ４１を制限
酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造）で連結し、以下上記と同一の方法により形
質転換したエリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性
を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＵ２を得た。 実施例１６ 実施例１５と同一の方法により得たプラスミドｐＰ４１
を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例
１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１５と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性を
有する大腸菌からプラスミドベクターｐＴ４を得た。 実施例１７ 実施例１５と同一の方法により得たプラスミドｐＰ４１
を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＬ７８（参考例
３と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１５と同一の方
法によりエリスロマイシンに耐性を有し、アンピシリン
に感受性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＷ３
４を得た。 実施例１８ 実施例１と同一の方法で調製したプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化したＤＮＡ溶液を、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約５kbのＤＮＡ断片をゲルから
回収した。このＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造製）で再連結し、塩化カルシウム法により大腸
菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、形質転換した。形質転換した大腸菌を薬剤添加培地
で培養し、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコー
ルに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有するコ
ロニーを分離した。この形質転換した大腸菌から実施例
１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドｐＳＡ
Ｈ１を得た。
酵素ＥｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例１
と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキッ
ト（宝酒造）で連結し、以下上記と同一の方法により形
質転換したエリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性
を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＵ２を得た。 実施例１６ 実施例１５と同一の方法により得たプラスミドｐＰ４１
を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例
１と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１５と同一の方
法によりエリスロマイシンおよびアンピシリンに耐性を
有する大腸菌からプラスミドベクターｐＴ４を得た。 実施例１７ 実施例１５と同一の方法により得たプラスミドｐＰ４１
を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限
酵素ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＬ７８（参考例
３と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１５と同一の方
法によりエリスロマイシンに耐性を有し、アンピシリン
に感受性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＷ３
４を得た。 実施例１８ 実施例１と同一の方法で調製したプラスミドｐＳＡ３を
制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化したＤＮＡ溶液を、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ約５kbのＤＮＡ断片をゲルから
回収した。このＤＮＡをＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造製）で再連結し、塩化カルシウム法により大腸
菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（宝酒造製）に導入
し、形質転換した。形質転換した大腸菌を薬剤添加培地
で培養し、エリスロマイシンおよびクロラムフェニコー
ルに耐性を有し、テトラサイクリンに感受性を有するコ
ロニーを分離した。この形質転換した大腸菌から実施例
１と同一のアルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドｐＳＡ
Ｈ１を得た。
【００４２】次に、プラスミドｐＳＡＨ１を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例２と同一
の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキット（宝
酒造製）で連結し、以下上記と同一の方法によりエリス
ロマイシンに耐性を有し、クロラムフェニコールに感受
性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＳ１０を得
た。 実施例１９ 実施例１８と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡＨ
１を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別に制
限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１８と同一の
方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニコー
ルに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＲ１
を得た。
ｃｏＲＩで消化し、脱リン酸化し、別に制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考例２と同一
の方法により調製）とＤＮＡライゲーションキット（宝
酒造製）で連結し、以下上記と同一の方法によりエリス
ロマイシンに耐性を有し、クロラムフェニコールに感受
性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＳ１０を得
た。 実施例１９ 実施例１８と同一の方法により得たプラスミドｐＳＡＨ
１を制限酵素ＡｖａＩで消化し、脱リン酸化し、別に制
限酵素ＡｖａＩで消化したプラスミドｐＢＬ６７（参考
例２と同一の方法により調製）とＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造製）で連結し、以下実施例１８と同一の
方法によりエリスロマイシンおよびクロラムフェニコー
ルに耐性を有する大腸菌からプラスミドベクターｐＲ１
を得た。
【００４３】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って次のような効果が奏せられる。 （１） この発明のプラスミドベクターはいずれも大腸
菌で容易に得られ、また大腸菌を宿主とする遺伝子操作
技術により外来遺伝子の挿入が可能である。 （２） 第一の発明のプラスミドベクターは大腸菌、枯
草菌、乳酸菌およびビフィドバクテリウム属に属する微
生物のシャトルベクターとして好適である。 （３） 第二の発明のプラスミドベクターは、大腸菌お
よびビフィドバクテリウム属に属する微生物のシャトル
ベクターとして好適である。 （４） プラスミドｐＢＬ６７は異なったビフィドバク
テリウム・ロンガムのＭＯ９１０１株およびＭＯ９１０
２株から分離された同一のプラズミドであることから、
ビフィドバクテリウム・ロンガムに共通なＤＮＡ塩基配
列を含んでおり、ビフィドバクテリウム・ロンガム検出
のためのＤＮＡプローブの開発にも利用可能である。
って次のような効果が奏せられる。 （１） この発明のプラスミドベクターはいずれも大腸
菌で容易に得られ、また大腸菌を宿主とする遺伝子操作
技術により外来遺伝子の挿入が可能である。 （２） 第一の発明のプラスミドベクターは大腸菌、枯
草菌、乳酸菌およびビフィドバクテリウム属に属する微
生物のシャトルベクターとして好適である。 （３） 第二の発明のプラスミドベクターは、大腸菌お
よびビフィドバクテリウム属に属する微生物のシャトル
ベクターとして好適である。 （４） プラスミドｐＢＬ６７は異なったビフィドバク
テリウム・ロンガムのＭＯ９１０１株およびＭＯ９１０
２株から分離された同一のプラズミドであることから、
ビフィドバクテリウム・ロンガムに共通なＤＮＡ塩基配
列を含んでおり、ビフィドバクテリウム・ロンガム検出
のためのＤＮＡプローブの開発にも利用可能である。
【図１】この発明に用いるビフィドバクテリウム・ロン
ガム由来のプラスミドｐＢＬ６７の制限酵素認識部位を
示したプラスミド模式図である。
ガム由来のプラスミドｐＢＬ６７の制限酵素認識部位を
示したプラスミド模式図である。
【図２】この発明に用いるビフィドバクテリウム・ロン
ガム由来のプラスミドｐＢＬ７８の制限酵素認識部位を
示したプラスミド模式図である。
ガム由来のプラスミドｐＢＬ７８の制限酵素認識部位を
示したプラスミド模式図である。
【図３】この発明に用いる複合プラスミドｐＳＡ３の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図４】この発明のプラスミドベクターｐ１１２の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
【図５】この発明のプラスミドベクターｐＢ１０の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図６】この発明のプラスミドベクターｐＣ１０の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図７】この発明のプラスミドベクターｐＤ１０の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図８】この発明のプラスミドベクターｐＬ１０の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図９】この発明に用いる複合プラスミドｐＶＡ８３８
の制限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
の制限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図１０】この発明のプラスミドベクターｐＮ２０の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
【図１１】この発明のプラスミドベクターｐＭ１０の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図１２】この発明のプラスミドベクターｐＸ１０の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図１３】この発明のプラスミドベクターｐＯ３６の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図１４】この発明に用いる複合プラスミドｐＨＹ３０
０ＰＬＫの制限酵素認識部位を示したプラスミド模式図
である。
０ＰＬＫの制限酵素認識部位を示したプラスミド模式図
である。
【図１５】この発明のプラスミドベクターｐＡ３の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
【図１６】この発明のプラスミドベクターｐ１１１の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
【図１７】この発明に用いる大腸菌のプラスミドｐＥ３
８の作成工程図である。
８の作成工程図である。
【図１８】この発明に用いる大腸菌のプラスミドｐＰ４
１の作成工程図である。
１の作成工程図である。
【図１９】この発明に用いる大腸菌のプラスミドｐＳＡ
Ｈ１の作成工程図である。
Ｈ１の作成工程図である。
【図２０】この発明のプラスミドベクターｐＩａの制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
【図２１】この発明のプラスミドベクターｐＫ２の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
【図２２】この発明のプラスミドベクターｐＶ４の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図２３】この発明のプラスミドベクターｐＷ３４の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
【図２４】この発明のプラスミドベクターｐＵ２の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図２５】この発明のプラスミドベクターｐＴ４の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図である。
【図２６】この発明のプラスミドベクターｐＳ１０の制
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
限酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工
程図である。
【図２７】この発明のプラスミドベクターｐＲ１の制限
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
酵素認識部位を示したプラスミド模式図とその作成工程
図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年５月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】ａ）形態：円形（circular） ｂ）隆起：凸状（convex） ｃ）周縁：円滑（entire） ｄ）大きさ（直径）：１〜３mm ｅ）色調：褐色不透明 ｉ）表面：円滑で光沢あり ２．生理学的性質 （１）ガスを産生せず （２）１５℃で発育せず （３）運動性なし （４）好気的条件で発育せず （５）ブドウ糖からの主発酵生成物は、乳酸および酢酸
である （６）糖からの酸生成 １）ＭＯ９１０１株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオースおよびラフィノ
ースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、デキストリン、スターチ、グリコー
ゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、イノシ
トール、エスクリン、サリシン、アミグダリン、α−メ
チルグルコシドおよびグルコン酸塩は陰性、 ２）ＭＯ９１０２株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラ
クトース、メリビオースおよびラフィノースは陽性、ラ
ムノース、セロビオース、トレハロース、メレチトー
ス、デキストリン、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリンおよびグルコン酸塩は
陰性、フラクトースは遅れて陽性、α−メチルグルコシ
ドは遅れて微陽性 ３）ＭＯ９１０３株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオース、およびラフィ
ノースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリン、α−メチルグルコシ
ドおよびグルコン酸塩は陰性、デキストリンは遅れて弱
陽性 （７）インドールを産生せず （８）硫化水素を産生せず （９）硝酸塩を還元せず （10）カタラーゼ陰性（11）テトラサイクリン耐性 ＭＯ９１０１株およびＭＯ９１０２株は、両菌株とも、
テトラサイクリンに対して耐性を示さない。一方、ＭＯ
９１０３株は、テトラサイクリン耐性を有し、テトラサ
イクリン２０μｇ／ml含有のＧＡＭ寒天平板培地で生育
する。 （12） プラスミドの特性 ＭＯ９１０１株およびＭ０９１０２株は、両菌株とも、
約3.7kbの塩基からなる同一のプラスミドｐＢＬ６７た
だ一種を保持している。一方、ＭＯ９１０３株は、約8.
5kbの塩基からなるプラスミドｐＢＬ７８ただ一種を保
持している。これらのプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８は、図１および図２に各々のプラスミド模式図を
示したように、多数の制限酵素認識部位を有している
（試験例１を参照）。（13） ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７
０７に対して７０％以上のＤＮＡ相同性 以上の菌学的性質から、本菌は公知のビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物であるが、本菌のプラス
ミドの特性は、プラスミドを保有しないビフィドバクテ
リウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（この菌株は、Th
e American Type Culture Collectionに第15707号とし
て寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムの基
準株である。以下、この寄託機関をＡＴＣＣと略記し、
ここに寄託されている菌株をＡＴＣＣ１５７０７のよう
に記載する）、ＡＴＣＣ１５７０８、および公知の菌株
（特公昭47-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324
号、特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第65
48号）、プラスミドを保有する公知の菌株（特開昭63-1
23384号公報に記載された微工研菌寄第9049号、微工研
菌寄第9050号）とは次のように全く異なっている。
である （６）糖からの酸生成 １）ＭＯ９１０１株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオースおよびラフィノ
ースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、デキストリン、スターチ、グリコー
ゲン、イヌリン、マンニトール、ソルビトール、イノシ
トール、エスクリン、サリシン、アミグダリン、α−メ
チルグルコシドおよびグルコン酸塩は陰性、 ２）ＭＯ９１０２株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラ
クトース、メリビオースおよびラフィノースは陽性、ラ
ムノース、セロビオース、トレハロース、メレチトー
ス、デキストリン、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリンおよびグルコン酸塩は
陰性、フラクトースは遅れて陽性、α−メチルグルコシ
ドは遅れて微陽性 ３）ＭＯ９１０３株の糖からの酸生成 アラビノース、キシロース、リボース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、スクロース、
マルトース、ラクトース、メリビオース、およびラフィ
ノースは陽性、ラムノース、セロビオース、トレハロー
ス、メレチトース、スターチ、グリコーゲン、イヌリ
ン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、エス
クリン、サリシン、アミグダリン、α−メチルグルコシ
ドおよびグルコン酸塩は陰性、デキストリンは遅れて弱
陽性 （７）インドールを産生せず （８）硫化水素を産生せず （９）硝酸塩を還元せず （10）カタラーゼ陰性（11）テトラサイクリン耐性 ＭＯ９１０１株およびＭＯ９１０２株は、両菌株とも、
テトラサイクリンに対して耐性を示さない。一方、ＭＯ
９１０３株は、テトラサイクリン耐性を有し、テトラサ
イクリン２０μｇ／ml含有のＧＡＭ寒天平板培地で生育
する。 （12） プラスミドの特性 ＭＯ９１０１株およびＭ０９１０２株は、両菌株とも、
約3.7kbの塩基からなる同一のプラスミドｐＢＬ６７た
だ一種を保持している。一方、ＭＯ９１０３株は、約8.
5kbの塩基からなるプラスミドｐＢＬ７８ただ一種を保
持している。これらのプラスミドｐＢＬ６７およびｐＢ
Ｌ７８は、図１および図２に各々のプラスミド模式図を
示したように、多数の制限酵素認識部位を有している
（試験例１を参照）。（13） ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７
０７に対して７０％以上のＤＮＡ相同性 以上の菌学的性質から、本菌は公知のビフィドバクテリ
ウム・ロンガムに属する微生物であるが、本菌のプラス
ミドの特性は、プラスミドを保有しないビフィドバクテ
リウム・ロンガムＡＴＣＣ１５７０７（この菌株は、Th
e American Type Culture Collectionに第15707号とし
て寄託されているビフィドバクテリウム・ロンガムの基
準株である。以下、この寄託機関をＡＴＣＣと略記し、
ここに寄託されている菌株をＡＴＣＣ１５７０７のよう
に記載する）、ＡＴＣＣ１５７０８、および公知の菌株
（特公昭47-29995号公報に記載された微工研菌寄第1324
号、特公昭59-53829号公報に記載された微工研菌寄第65
48号）、プラスミドを保有する公知の菌株（特開昭63-1
23384号公報に記載された微工研菌寄第9049号、微工研
菌寄第9050号）とは次のように全く異なっている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】なお、プラスミドｐＴＢ４，ｐＴＢ６およ
びｐＴＢ１０の塩基数は、同公開公報第１図〜第３図に
おいてプラスミドｐＢＲ３２２の塩基数を4.4kbとして
算出したものである。また、本菌のうち、特にＭＯ９１
０３株は上記の通りテトラサイクリン耐性を有するが、
ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるこのようなテ
トラサイクリン耐性株の存在は、これまでにも一般的記
載としては知られていた。しかしながら、そのような菌
株の菌学的性質および耐性を示すテトラサイクリンの濃
度等について具体的に記載した先行文献は存在しない。
この発明の発明者等によるＧＡＭ寒天平板培地を用いた
実験からは、従来知られているビフィドバクテリウム・
ロンガム株は、テトラサイクリンの濃度が１μｇ／ml以
下でなければ生育できないことが確認されている。従っ
て、本菌のＭＯ９１０３株は、そのテトラサイクリン耐
性により、従来公知の菌株とは全く別個の菌株である。
この発明において、制限酵素認識部位を多数有するビフ
ィドバクテリウム・ロンガムに属する微生物のプラスミ
ドを用いた理由は、 （ａ）多数の制限酵素で消化できるので、種々のＤＮＡ
断片が得られること （ｂ）他の外来ＤＮＡと種々の結合が可能であること （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の結果として広宿主で発
現できるプラスミドベクターが得られること によるものである。
びｐＴＢ１０の塩基数は、同公開公報第１図〜第３図に
おいてプラスミドｐＢＲ３２２の塩基数を4.4kbとして
算出したものである。また、本菌のうち、特にＭＯ９１
０３株は上記の通りテトラサイクリン耐性を有するが、
ビフィドバクテリウム・ロンガムにおけるこのようなテ
トラサイクリン耐性株の存在は、これまでにも一般的記
載としては知られていた。しかしながら、そのような菌
株の菌学的性質および耐性を示すテトラサイクリンの濃
度等について具体的に記載した先行文献は存在しない。
この発明の発明者等によるＧＡＭ寒天平板培地を用いた
実験からは、従来知られているビフィドバクテリウム・
ロンガム株は、テトラサイクリンの濃度が１μｇ／ml以
下でなければ生育できないことが確認されている。従っ
て、本菌のＭＯ９１０３株は、そのテトラサイクリン耐
性により、従来公知の菌株とは全く別個の菌株である。
この発明において、制限酵素認識部位を多数有するビフ
ィドバクテリウム・ロンガムに属する微生物のプラスミ
ドを用いた理由は、 （ａ）多数の制限酵素で消化できるので、種々のＤＮＡ
断片が得られること （ｂ）他の外来ＤＮＡと種々の結合が可能であること （ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の結果として広宿主で発
現できるプラスミドベクターが得られること によるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:19 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/74 Ｃ１２Ｒ 1:01 1:19 1:46） (72)発明者 松熊 宏幸 神奈川県座間市緑ケ丘６−21−18 緑ケ丘 パークハイツ101 (72)発明者 寺口 進 東京都町田市成瀬2656−４ (72)発明者 八重島 智子 神奈川県海老名市柏ケ谷1145 ソレイユ海 老名204
Claims (3)
- 【請求項１】 ストレプトコッカス属に属する微生物由
来のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドとを結合させ
た複合プラスミドと、新規なビフィドバクテリウム・ロ
ンガムに属する微生物に由来し、ただ一種類のプラスミ
ドのみを含み、多数の制限酵素認識部位を有し、かつプ
ラスミドの収量が高い新規なプラスミドとを結合してな
るプラスミドベクター。 - 【請求項２】 ストレプトコッカス属に属する微生物由
来のエリスロマイシン耐性遺伝子を保有する大腸菌のプ
ラスミドと、新規なビフィドバクテリウム・ロンガムに
属する微生物に由来し、ただ一種類のプラスミドのみを
含み、多数の制限酵素認識部位を有し、かつプラスミド
の収量が高い新規なプラスミドとを結合してなるプラス
ミドベクター。 - 【請求項３】 ビフィドバクテリウム・ロンガムに属す
る微生物が、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１
０１（微工研菌寄第12167号）、ビフィドバクテリウム
・ロンガムＭＯ９１０２（微工研菌寄第12168号）、ビ
フィドバクテリウム・ロンガムＭＯ９１０３（微工研菌
寄第12169号）、およびこれらの混合菌株からなる群よ
り選択される請求項１または２記載のプラスミドベクタ
ー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7802791A JPH05130876A (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | プラスミドベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7802791A JPH05130876A (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | プラスミドベクター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130876A true JPH05130876A (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=13650332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7802791A Pending JPH05130876A (ja) | 1991-04-10 | 1991-04-10 | プラスミドベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05130876A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100676296B1 (ko) * | 2005-06-25 | 2007-01-30 | 씨제이 주식회사 | 락토바실러스 속 미생물용 벡터, 그를 포함하는 숙주 세포및 그를 이용하여 외래 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스속 미생물의 염색체에 삽입하는 방법 |
| JPWO2006057289A1 (ja) * | 2004-11-24 | 2008-06-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 新規シャトルベクター |
| WO2008114889A1 (ja) | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Morishita Jintan Co., Ltd. | 経口ワクチン |
-
1991
- 1991-04-10 JP JP7802791A patent/JPH05130876A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006057289A1 (ja) * | 2004-11-24 | 2008-06-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 新規シャトルベクター |
| JP4989231B2 (ja) * | 2004-11-24 | 2012-08-01 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 新規シャトルベクター |
| KR100676296B1 (ko) * | 2005-06-25 | 2007-01-30 | 씨제이 주식회사 | 락토바실러스 속 미생물용 벡터, 그를 포함하는 숙주 세포및 그를 이용하여 외래 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스속 미생물의 염색체에 삽입하는 방법 |
| WO2008114889A1 (ja) | 2007-03-19 | 2008-09-25 | Morishita Jintan Co., Ltd. | 経口ワクチン |
| US8758760B2 (en) | 2007-03-19 | 2014-06-24 | Morishita Jintan Co., Ltd. | Oral vaccine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Padmavathi et al. | Screening of potential probiotic lactic acid bacteria and production of amylase and its partial purification | |
| Ohman et al. | Toxin A-deficient mutants of Pseudomonas aeruginosa PA103: isolation and characterization | |
| CA1188236A (en) | Plasmids | |
| JP3079276B2 (ja) | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 | |
| RU2081173C1 (ru) | Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая полипептид со свойствами нитрилгидратазы, штамм бактерий eshcerichia coli - продуцент полипептида со свойствами нитрилгидратазы, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы | |
| Fukushima et al. | A polysaccharide deacetylase gene (pdaA) is required for germination and for production of muramic δ-lactam residues in the spore cortex of Bacillus subtilis | |
| JPH0112477B2 (ja) | ||
| JPH0440990B2 (ja) | ||
| US20210403894A1 (en) | Alginate Lyase and Application thereof | |
| AU615661B2 (en) | Acid urease and production thereof | |
| US4681847A (en) | Novel lysozyme-sensitive microorganism | |
| Bhattacharya et al. | Isolation and characterization of Rhizobium sp. form root of legume plant (Pisum sativum) and its antibacterial activity against different bacterial strains | |
| Johnson et al. | Selection of Lactobacillus acidophilus strains for use in “acidophilus products” | |
| Huq et al. | Paenibacillus ginsengiterrae sp. nov., a ginsenoside-hydrolyzing bacteria isolated from soil of ginseng field | |
| Gao et al. | Microbacterium zeae sp. nov., an endophytic bacterium isolated from maize stem | |
| US6887702B2 (en) | Plasmid originated from bifidobacterium, recombinant expression vector using the plasmid and transformation method | |
| JPH05130876A (ja) | プラスミドベクター | |
| JPH05244941A (ja) | Ｎａｄｈ依存性パラヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ及びその製造方法 | |
| JP2886547B2 (ja) | ノイラミニダーゼの製造法 | |
| Favre et al. | Relatedness of a periplasmic, broad-specificity RNase from Aeromonas hydrophila to RNase I of Escherichia coli and to a family of eukaryotic RNases | |
| Fortina et al. | Mapping of three plasmids from Lactobacillus helveticus ATCC 15009 | |
| Xing et al. | Halomonas salipaludis sp. nov., isolated from a saline-alkali wetland soil | |
| Butler et al. | Characterization of Aquaspirillum arcticum sp. nov., a new psychrophilic bacterium | |
| RU2003689C1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рВА1418, кодирующа альфа-амилазу BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS и штамм-бактерий BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - продуцент альфа-амилазы BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS | |
| JP5302189B2 (ja) | スフィンゴミエリナーゼ |