RU2003689C1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК рВА1418, кодирующа альфа-амилазу BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS и штамм-бактерий BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - продуцент альфа-амилазы BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  получени  фермента альфа-амилазы. Сущность изобретени  состоит в том, что методами генетической инженерии созданы плазмида, направл юща  биосинтез альфа- амилазы В. amyloliquefadens. и устойчивый к действию р да распространенных флагов бактериальный штамм - продуцент альфа-амилазы. Штамм- продуцент устойчив к эритромицину и позвол ет получать до 18 г/л альфа-амилазы. 2 са ф-лы, 1 ил, 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , генетической инженерии и микробиологии и представл ет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, кодиру- ющую биосинтез альфа-амилазы B.amyloliquefaciens, а также фагоустойчи- вый шгамм бактерий B.amylollquefaclens - продуцент альфа-амилазы.

Альфа-амилаза - это фермент, расщепл ющий амилозную компоненту крахмала. Ее используют в пищевой и легкой промышленности , а также в сельском хоз йстве и медицине.

В насто щее врем  известны бацилл рные штаммы -- продуценты альфа-амилазы, созданные методами традиционной селекции , а также методами генной инженерии 1,2,3.

Известен штамм B.subtills, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном аль- фа-амилазы B.amyloliquefaciens A50 4.

Однако использование этого штамма в промышленности затруднено вследствие низкого уровн  биосинтеза фермента, плохого роста штамма на промышленных средах и нестабильности рекомбинантной плазмиды при выращивании штамма на среде без антибиотика.

В качестве прототипа выбран штамм B.subtilts 65 ВКПМ В-2387 5 , который используетс  в насто щее врем  дл  промышленных целей. Основным недостатком этого штамма  вл етс  его низка  продуктивностью . Поэтому задача повышени  уровн  продукции альфа-амилазы чрезвычайно важна. Кроме того, существенным недостатком штамма B.subtills 65  вл етс  его чувствительность к фагам, что приводит к потер м в производстве вследствие фаголи- зиса. Поэтому создание фагоустойчивого штамма-продуцента представл ет собой важную задачу.

Получены рекомбинзнтна  плазмидна  ДНК рВА1418, кодирующа  биосинтез альфа- амилазы и фагоустойчивый штамм Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) - продуцент альфа-амилазы B.amyloliguefaclens.

Сконструированна  рекомбинантна  плазмида рВА1418 имеет размер б.бт.п.н. и содержит Ват Hl-фрагмет ДНК векторной плазмиды рВА4, размером 4,4 т.п.н.; Ват Hl-Clal - фрагмент ДНК хромосомы B.amyloliguefaciens размером 2,2 т.п.н,; содержащий ген альфа-амилазы B.amyloliguefactens A50; Qal-BamHI - фрагмент ДНК плазмиды pBR322 размером 035 т.п.н.; а также участки расщеплени  следующих рестриктаз:

Bam Hi с координатами 0 т.п.н. и 2,55 т.п.н.,

Clal с координатой 0,35 т.п.н.; а также гены и генетические маркеры: ату - ген., кодирующий альфа-амилазу B.amyloliquefaciens A50,

erm С - ген, кодирующий устойчивость

клеток к эритромицину.

Новый штамм Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) - фагоустойчивый продуцент альфа-амилазы, секретирующий 780 0 единиц активности фермента на 1 мл культу- ральной жидкости (активность фермента определ ют по методике Госстандарта {б , задепонирован, Его регистрационный номер ВКПМ В-5144 во Всесоюзной коллек- 5 ции промышленных микроорганизмов.

Штамм продуцент Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (pBAi418) получают путем введени  известным методом 7 новой рекомбинантной плазммды 0 рВА1418, кодирующей синтез альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens A50, в протопласты бесплазмидного штамма Bacillus arnyloliquefaciens 65 ВКПМ В-2387, называемого ранее Bacillus subtilis 65 ВКПМ В- 5 2387. В процессе работы сданным штаммом было вы снено, что его следует называть Bacxillus amyloliquefaciens 65, так как штамм способен усваивать лактозу и имеет систему рестрикции Ват, что  вл етс  ха- 0 рактерными признаками вида Bacillus amyloliquefaciens. Поэтому в дальнейшем штамм ВКПМ В-2387 называют Bacillus amyloliquefaciens.

Путем отбора из штамма

5 B.amyloliquefaciens 65 (рВА1418) получают

мутант OR28, устойчивый к фагам Е25, Е26

и ЕЮ, выделенным из промышленных фаголизатов .

Штамм Bacillus amyloquefaciens В-5144 0 характеризуетс  следующими признаками. Морфологические признаки. Клетки пр мые, палочковидные, размером 2,5-4,0 х 0,5-0,8 мкм, подвижные, грам- положительные, спорообразующие. Размер 5 спор 1,0-1,2 х 0,6-0,7 мкм.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на м сопептон- ном агаре, агаре Хоттингера - колонии 0 шероховатые, круглые, матовые, желтовато- серые, край неровный, лопастной. При росте в жидких средах: м сопептонном бульоне, LB-бульоне без аэрации образуют сухую пленку безпомутнени  среды, а при 5 аэрации - интенсивную мутность.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре от 20 до 45°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности D-глюкозу, D- фруктозу, лактозу. Не усваивают ацетат, галактозу .

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме , так и в органической форме в виде пептона , аминокислот.

Желатину разжижают.

Индол не образуют,

Уреазную активность не обнаруживает,

Штамм про вл ет устойчивость к эритромицину , обусловленную наличием плаз- миды рВА1418.

Штамм устойчив к вирулентным фагам ЕЮ, Е25, Е26, выделенным из промышленных фаголизатов и препаратов субтилизина ГХЗ.

П р и м е р 1, Конструирование гибридной плазмиды рВА1418.

На чертеже представлена схема конструировани  гибридной плазмиды рВА1418. Дл  того, чтобы клонировать ген альфа-амилазы и зкспрессировать его, провод т следующие манипул ции.

ЮмкгДНКхромосомы B.amyloliquefaciens А50, выделенной так, как описано в руководстве Маниатиса и др. 9, обрабатывают эн- донуклеазой рестрикции ЗаиЗА в стандартных услови х 9 и смешивают с об- работаннойтаким же образом эндонуклеазой BamHI ДНК плазмиды рМХЗЭ 11 в соотношении 1:1 и высаживают, добавл   2,5 объема этанола. Образовавшийс  осадок раствор ют в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-CI, рН 7,5, 10 мМ MgSCM, 50 гпМ NaCI, 0,5 mM АТР, и добавл ют 5 ед. ДНК- лигазы фага Т4. Лигирование провод т при 14°С в течение 12 ч. Полученной смесью трансформируют клетки штамма B.subtilis 21гесЕ4 а ту4, описанного ранее 12. Полученной смесью трансформируют клетки штамма В.subtilis 21 гесЕ4 ату 4, описанного ранее 12 . Трансформацию провод т следующим образом: ночную культуру клеток B.subtilis 21 recE4amy4, выращенных в жидкой среде Спицайзена 1 (0,8% глюкозы, 0,04% казаминовых кислот, 0,1% дрожжевого экстракта, 5 мкг/мл L-триптофаза, 1,83% К2НР04 0,2% (МНфЗСМ 0,12% ЫазСбНбО х 5,5Т , 0,01 % MgSCMx7H20, рН 7,0) развод т средой в 10 раз и и раст т 4,5 ч с аэрацией при 37°С. Затем клетки развод т средой Спицайзена 11, отличающейс  от среды спицайзена 1 тем, что она не содержит дрожжевого экстракта, триптофана , а содержание казаминовых кислот и MgS04 составл ет 0,02% и 0,07% соответственно . Клетки в такой среде раст т 1,5 ч с аэрацией, после чего используют дл  трансформации . Препарат ДНК инкубируют с

полученными клетками при 37°С 2 ч и высевают на агаризованную среду LB с эритромицином (10 мкг/мл) и амилопектиназуром (0,15%), Отбирают клоны, устойчивые к 5 эритромицину и гидролизующие амилопек- тиназур. Из отобранных таким образом клонов выдел ют плазмидную ДНК и называют ее рАА2. Плазмида рАА2 содержит ген альфа-амилазы B.amyloliquefaciens, ответст0 венный за синтез секретируемой альфа-амилазы.

Анализ генетических ипокеров в плаз- миде провод т следующим образом.

1. Устойчивость клеток В. subtilis 21

5 гесЕ4 ату/4, содержащих плазмиду рАА2, анализируют на среде с содержанием эритромицина от5 мкг/мл до 10 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с такой концентрацией эритромицина,

0 2. Наличие секретируемой альфа-амилазы в клетках B.subtilis 21 гесЕ4 ату/4, содержащих плазмиду рАА2, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных клонов нанос т а чашку Петри с LB-агаром,

5 содержащим 0,15% амилопектиназур, в виде точек или полос и инкубируют при 37°С 18-24 ч. Вокруг выросшей массы клеток образуетс  прозрачна  зона гидрозованно- го амилопектиназура. Клетки исходного

0 штамма, не содержащие плазмиды, зон гидролиза аминопектиназура не образуют.

Активность альфа-амилазы в культу- ральной жидкости определ ют по методике Госстандарта СССР 6 во врем  фермента5 ции по гидролизу 1%-ного растворимого крахмала в 10 мМ Na-K-фосфатном буфере, рН 6,0, 0,3 мМ CaCIa и 33 мм NaCI.

Реакционна  смесь содержит 10 мл 1 %- ного растворимого крахмала, растворенно0 го в 15 мМ Na-K-фосфатном буфере, рН 6,0, и 5 мл исследуемого образца (разведенного в 2 мМ ацетатном буфере, рН 6,0, 03, мМ CaCl2,100 мМ NaCI). Контроль вместо исследуемого образца содержит 5 мл буфера дл 

5 разведени  фермента. Пробы инкубируют при 30°С 10 мин. Реакцию останавливают добавлением к 1 мл реакционной смеси 10 мл 0,1 М раствора HCI. Из полученной смеси отбирают 1 мл и перенос т в 10 мл раствора

0 йода, содержащего 0,0025% J и 0,025% KJ. Реакционную смесь выдерживают при 20°С 20 мин и измер ют оптическую плотность раствора при длине волны 656 нм, Контрольный раствор имеет синюю окра5 ску, а опытные образцы приобретают фиолетовый цвет. Контрольный раствором при калориметрировании  вл етс  дистиллированна  вода. Количество прогид- ролизованного крахмала определ ют по формуле

г- D1 -p2xn 1 с jjjхил,

где D1 - огттическа  плотность контрольного раствора;

D2 - оптическа  плотность опытного раствора;

0,1 - количество субстрата, вз тое в пробу, г.

Если количество прогидролизованного крахмала меньше 00,2 г или больше 0,06 г, то испытани  повтор ют, подбира  разведени  фермента.

Аминолитическую активность (АС) в ед/мл определ ют по формуле

АС

5.885ХС -0,00167

Хп,

где С - количество прогидролизованного крахмала, г.

п - величина разведени .

За единицу активности амилолитиче- ских ферментов (АС) прин то такое их количество , которое в стандартных услови х расщепл ет 1 г растворимого крахмала до декстриноов различной молекул рной массы .

Затем ДНК плазмид рАА2 и pBR322 9 обрабатывают рестриктазами BamHl и Clal, ДНК плазмиды pUB110 10 -ферментом BamHl, все смешивают и обрабатывают ли- гззой, как описано выше, и трансформируют компетентные клетки штамма B.subtilis 21 amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше. Трансформанты отбирают на агаризован- ной среде, содержащей 5 мг/мл канамици- на и 0,15% амилопектиназура. Отбирают клоны, устойчивые к канамицину и продуцирующие альфа-амилазу. Из отобранных клонов выдел ют плазмидную ДНК и называют ее рАА1 (чертеж).

ДН К плазмид рАА12 и рВА4 8 обрабатывают рестриктазой BamHl, затем лигазой (как описано выше) и трансформируют компетентные клетки штамма B.subtilis 21 amy4 гесЕ4 по методу, описанному выше.

Трансформанты отбирают на агаризо- ванной среде, содержащей 10 мкг/л эритро- мицина и 0,15% амилопектиназура. Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину , и гидролизующие амилопектинаур. Из отобранных таким образом клонов выдел ют плазмидную ДНК и называют ее рВА1418. Плазмида рВА1418 содержит ген альфа-амилазы B.amylollquefaciens, ответственный за синтез секретируемой альфа- амилазы и клонированный на векторе рВА4, который обеспечивает стабильное наследование в отсутствие селективного давлени 

П р и ме р 2. Конструирование штамма Bacillus amyloliquefaciens 65 (рВА1418).

Дл  трансформации В. amyioliquefaciens 65 плазмидой рВА1418 используют метод,

описанный в 7. Трансформацию протопластов клеток В.amyloliquefaciens 65 провод т следующим образом. 1 мл с суспензии ночной культуры В.amyloliquefaciens 65 внос т в 9 мл питательного бульона PC и выращивают

0 до титра 10кл/мл, Клетки собирают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин., 20°С). дважды промывают специальной средой SMMP 7, а затем ресуспендируют в среде SMMP, содержащей 100 мг/мл лизоцима, и

5 инкубируют 30 мин при 42°С. Образовавшиес  протопласты промывают средой SMMP добавлением 0,1 %-мого бычьего ел вороточ- ного альбумина и используют дл  трансформации . Плазмидную ДНК рВА1418(2-10 мкг)

0 инкубируют 2 мин при ОоС с протопластами клеток B.amyloliquefaciekns 65 и 22%-ным полиэтиленгликолем 6000, приготовленным на буфере SMMP. После дес тикратного разведени  средой SMMP с 0,1%-ным аль5 бумином трансформированные протопласты высаживают центрифугированием (2000 об/мин, 10 мин, 20°С), суспендируют в 1 мл той же среды, инкубируют 2 ч при 30°С и высевают на агаризованную среду DM3 с

0 эритромицином (5 мкг/мл). Отбор трансформантов производ т 48 ч роста при 37°С. Отбирают клоны, устойчивые к эритромицину (10 мкг/мл).

П р и м е р 3. Получение фагоустойчивого

5 мутанта штамма В.amyloliquefaciens 65 OR28(pBA1418).

Дл  получени  фагоустойчивого мутанта штамма B.amyloiiquefaciens 65(рВА1418) клетки этого штамма в вегетативной фазе

0 роста смешивают с фагами, выделенными из промышленных фаголизатов (множественность инфекции 10), способ выделени  фагов описан в 13. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 3 ч, высе5 вают на поверхность твердой питательной среды, содержащей 10 мкг/мл эритромицина , и инкубируют 18 ч при 30°С. Выросшие клоны, устойчивые к фагам, после очистки перевод т в споры, суспензию спор прогре0 зают при 85°С 20 мин и высевают на поверхность твердой питательной среды дл  получени  отдельных колоний. Отобранные клоны испытывают на чувствительность к фагам ЕЮ, Е25 и Е26, выделенным из про5 мышленных фаголизатов. Чувствительность к фагам оценивают качественно, использу  капельный метод, заключающийс  в том, что на поверхность твердой питательной среды высевают верхний слой полужидкого 0,7% агара, содержащего клетки испытуе

мого штамма в титре 10 , и нанос т фаголи- зат 14 . По наличию зоны лизиса суд т о фагочувствительности. Используют также количественный метод двухслойного титровани . Дл  этого на поверхность твердой питательной среды нанос т 0,7%-ный агар, содержащий клетки испытуемого штамма в титре 108 и соответствующие разведени  фагов 14 . Клоны, устойчивые к фагам, оценивают по уровню продукции секретиру- емой альфа-амилазы,

В результате экспериментов был отобран штамм OR28, который продуцировал альфа-амилазу на уровне исходного штамма и был устойчив к фагам, выделенным из фа- голизатов. Результаты этих экспериментов представлены в табл.1.

П р и м е р 4. Получение альфа-амилазы с помощью рекомбинантного штамма Bacillus amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418)ВКПМ В-5144).

Накоплениеальфа-амилазы

В.amyloliquefaciens в культуральной жидкости штаммов В.amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) - за вл емый шгамм и в культуральной жидкости В amyloliquefaciens 65 ВКПМ В-2387 (прототип ) изучают при культивировании их в промышленных ферментационных средах следующего состава, г/л: картофельный крахмал, осахаренный альфа-амилазой, 100, кукурузный экстракт 24, белково-вита- минный концентрат или пивные дрожжи 3, лактоза 2,8; (МНфЗСМ 8; КаЗСм 3; MgSCU 7Н20 0,14, CuSCM 0,0038, NaCI 0,3, рН 7,2. Штамм B.amyloliquefaciens OR28, содержащий стабильно наследуемую плазмиду рВА1418, выращивают на среде без антибиотика , как и штамм-прототип, не содержащий плазмиду.

Процесс ферментации провод т в кача- лочных колбах объемом 750 мл, содержащих по 100, мл ферментационной среды, Колбы инкубируют при 37°С на качалке с интенсив- ной аэрацией (240 об/мин). Активность фермента в ходе ферментации определ ют по методу, описанному в примере 1. Данные по накоплению альфа-амилазы B.amyloliaquefaciens в культуральной жид- костью A.amyloliquefaciens 65 OR28

(рВА1418) (ВКПМВ-5144) и

B.amyloliquefaciens 65 во врем  ферментации суммированы в табл. 2.

Из анализа данных, представленных в табл. 2,  сно, что предлагаемый в данной за вке рекомбинантный фагоустойчивый штамм - продуцент альфа-амилазы - B.amyloliquefaciens 65 OR28 (рВА1418) (ВКПМ В-5144) позвол ет получать в 2 раз больше секретируемой альфа-амилазы, чем штамм-прототип (до 80 ед/мл) без селективного давлени . Удельна  активность альфа- амилазы B.amyloliquefaciens составл ет 50 ед. ГОСТ/мг. Таким образом, штамм B.amyloliquefaciens B-51454 продуцирует до18г/лальфа-амилазы,

B.amyloiiquefaciens В-5144 продуцирует до 18 r/z, альфа-амилазы.

Штамм продуцент хорошо растет на стандартных промышленных средах.

(56) 1. Патент США № 3808102, кл. 195- 65.

2.Авторское свидетельство СССР № 538024,кл. С 12 N 13/10.

3.Патент ФРГШ № 2218733, кл С 12 N 13/10,

4.Сорокин А.В. и др. Молек. ген., микр- биол. вирусолог., 6. 27-29, 1986.

(56) 5. Авторское свидетельство СССР № 1089118, кл. С 12 N9/28, 1986.

6.Методы определени  амилодитиче- ской активности ГОСТ 20264. 4-74.

7.Vehmaanpera J. FEMS Microbiol.Lett., 49, 101, 1988.

8.Авторское свидетельство СССР № 1615180.

9.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж, Методы генетической инженерии. Молекул рное клонирование. М,: Мир, 1984.

10.Keggins R.V., et al. Proc,Nat.Acad,Sco.,75, 1423-1427, 1978

11.Rabinovich P.M. et al. In: Piasmids in Bacteria. Eds: Helinsky D.R. et al. p. 635- 656, New York, 1985.

12.Смирнова НА и др. Молекул рна  биологи , 22, № 5, 1257-1265, 1988,

13.Авторское свидетельство СССР № 1412290.

14.Дж. Миллер, Эксперименты в молекул рной генетике. М.: Мир, 1976.

11

2003689

12 Таблица 1

Определение фагочувствительности штаммов В. amyloflquefaclens 65 (рВА1418) и 65 OR28

(рВА1418)

Таблица 2

Накопление альфа-амилазы В. amyloiiquefaclens, продуцируемой штаммами, В. amyloliquefaciens B-5144 и В, amylollquefaciens В-2387 во врем  ферментации.

Claims (2)

1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК рВА 1418, кодирующа  альфа-амилазу Bacillus amyfoliquefaciens размером 6,6 т.п.н. и содержаща 

Bam HI - фрагмент ДНК плазмиды рВА

4 размером 4,4 т.п.н.; Bam HI - Clal - фрагмент ДНК хромосомы В,amyloliquefaciens A - 50 размером 2,2 т.п.н.; Clal - Bam HI - фрагмент ДНК плазмиды

pBR 322 размером 0,35 т.п.н., участки расщеплени  следующих рестриктаз:

-Bam HI с координатами 0 т.п.н, и 2,55 т.п.н.

-Clal с координатой 0,35 т.п.н.;

а также гены и генетические маркеры:

-Amy - ген, кодирующий альфа-амилазу В, amyloliquefaciens A 50;

-erm С - ген, кодирующий устойчивость клеток к эритромицину.

2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-5144 - продуцентальфа-амилазыBacillus amyloliquefaciens.

Sctu3A

SCU3A

IK.in Лг.О DNA

amHI icial

° pMK /J

/

Clal

Clal , / ч, х BamHI -/ Amy V рЛЛУ

,W kh /

Em

BcmH) + CloJ

-- / лХ BamHI

- , / Amy ч

/ ; /

7 Kb| I I

AT/n

4, I K

BamH J

Clal

BamHI

BamHI

/

j BamHI

pMXs 24 kh

Llcr ate

ч

Em

/

B

BamHI

/ ptlHI lo

,) kl

BamH) Cla)

BamHI

Km

Llffa o

BamHI

I

4, I Kb /

BamH 1

Em

Ltgato

BamH