JPH04287686A - 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ - Google Patents
無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５Info
- Publication number
- JPH04287686A JPH04287686A JP3355272A JP35527291A JPH04287686A JP H04287686 A JPH04287686 A JP H04287686A JP 3355272 A JP3355272 A JP 3355272A JP 35527291 A JP35527291 A JP 35527291A JP H04287686 A JPH04287686 A JP H04287686A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- sms275
- bacillus subtilis
- plasmid
- psm274
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 title claims abstract description 22
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 title claims abstract description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 7
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 6
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 241000297434 Stenotarsus subtilis Species 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 9
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101000825940 Homo sapiens Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 2 Proteins 0.000 description 6
- 102100022771 Phosphatidylcholine:ceramide cholinephosphotransferase 2 Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 101100434872 Bacillus cereus spoII gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 101150047369 spoIID gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium bromide Chemical compound [Br-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC JRMUNVKIHCOMHV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 101100406366 Caenorhabditis elegans pad-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000022912 endospore formation Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006740 morphological transformation Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 101150107042 pyrD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150092104 pyrDB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002623 sporogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】本発明は、無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＭＳ２７５
（ＣＭＳ ４３２．９０）及び異質生成物の製造のため
の宿主−ベクター系における宿主としての該菌株の使用
に係る。
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＭＳ２７５
（ＣＭＳ ４３２．９０）及び異質生成物の製造のため
の宿主−ベクター系における宿主としての該菌株の使用
に係る。
【０００２】当分野では、ある種の生産系（この用語は
、タンパク質又はポリペプチドをコード付ける遺伝子を
含有する発現ベクターと該ベクターを含有する宿主との
組合せを意味する）を使用する発酵法によるタンパク質
及びポリペプチドの製造が知られている。現在市場にあ
る多くの（遺伝子）組換え生成物は、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞又はサッカロ
ミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主として使用した生産系の利
用によって生成されたものである。
、タンパク質又はポリペプチドをコード付ける遺伝子を
含有する発現ベクターと該ベクターを含有する宿主との
組合せを意味する）を使用する発酵法によるタンパク質
及びポリペプチドの製造が知られている。現在市場にあ
る多くの（遺伝子）組換え生成物は、大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ＣＨＯ細胞又はサッカロ
ミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主として使用した生産系の利
用によって生成されたものである。
【０００３】しかしながら、これらの系は完全には満足
できるものではなく、従って、当分野では、基本的には
、たとえばバシラス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びスト
レプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は酵
母のような細菌、クルフェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びヤロヴィア
・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）のような真菌又は昆虫細胞の如き宿主組織の使用に
基づく異質生成物生産用の他の生産系を提供することが
求められている。工業的見地からみて理想の生産系は、
容易に精製され、天然のタンパク質と同じ生物活性を有
する組換え生成物の生産を高収率かつ経済的に注目に値
するコストで実施し得るものである。このような系は下
記のもので構成される。 １）細胞中にコピーが多数存在し、細胞内において目的
の生成物が高収率で生産されるように安定して保存され
る強い調節エレメント（プロモーター及びターミネータ
ー）を含有するベクター。 ２）異種遺伝子により提供される指令を正確に実行して
、天然生成物と同一の生成物の生産を可能とし、コマー
シャルレベルでの培養に好適である［すなわち、耐性で
あり、高密度に増殖でき、栄養因子に関する要求があま
り過酷でなく、安全（すなわち毒性の汚染物を生産しな
い）である］宿主。
できるものではなく、従って、当分野では、基本的には
、たとえばバシラス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びスト
レプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又は酵
母のような細菌、クルフェロミセス・ラクチス（Ｋｌｕ
ｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びヤロヴィア
・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ）のような真菌又は昆虫細胞の如き宿主組織の使用に
基づく異質生成物生産用の他の生産系を提供することが
求められている。工業的見地からみて理想の生産系は、
容易に精製され、天然のタンパク質と同じ生物活性を有
する組換え生成物の生産を高収率かつ経済的に注目に値
するコストで実施し得るものである。このような系は下
記のもので構成される。 １）細胞中にコピーが多数存在し、細胞内において目的
の生成物が高収率で生産されるように安定して保存され
る強い調節エレメント（プロモーター及びターミネータ
ー）を含有するベクター。 ２）異種遺伝子により提供される指令を正確に実行して
、天然生成物と同一の生成物の生産を可能とし、コマー
シャルレベルでの培養に好適である［すなわち、耐性で
あり、高密度に増殖でき、栄養因子に関する要求があま
り過酷でなく、安全（すなわち毒性の汚染物を生産しな
い）である］宿主。
【０００４】現在、組換え生成物の生産用発現系の開発
に当たりバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）（以降、Ｂ．サチリスと表示する）が注
目されている。実際、Ｂ．サチリスは、完全な非病原性
であり、培地中に遺伝子発現生成物を分泌でき、大規模
な生育が容易であるため、バイオテクノロジーの見地か
ら特に注目される微生物である。医薬品工業及び食品工
業にとって興味深い異質タンパク質及びポリペプチドの
発現用宿主としてＢ．サチリスを使用することは、これ
ら生成物の生産方法の許可を受けるための重要な要因で
ある。しかしながら、微生物の使用に関する禁忌の１つ
は、ある種の生理的生育条件下における胞子形成の能力
による。事実、化学的−物理的試薬に対する高い抵抗性
によって特徴づけられる胞子は、最も一般的な環境条件
下で生残る大きい可能性を有する。医薬及び食品の分野
で興味深い生成物の製法においてＢ．サチリスの組換え
菌株を使用することは、胞子が外部環境に分散される可
能性が低いことを示さない場合には、法律上の規制を受
けることになる。 Ｂ．サチリスにおける内生胞子の形成は、細胞の生理系
及び超微細構造における変化（生育栄養源が限定される
条件に対する応答の結果として）によって生ずる細胞分
化過程である。胞子形成（平均して３７℃において６な
いし８時間で行われる）の間に、細胞は一連の良好に限
定された形態学的段階を受ける。この段階は胞子嚢内で
の増殖形への交代細胞形である内生胞子の形成によって
終わる。これらの段階（慣例的に段階０−ＶＩＩとして
定義される）は、異なる遺伝子（ｓｐｏ遺伝子）によっ
てコード付けられる一連の物質を要求する。当分野では
、化学試薬又は物理試剤によるｓｐｏ遺伝子の突然変異
により、又はインビトロでの変異誘発技術の利用により
胞子を生産しないＢ．サチリスの菌株（無胞子性菌株）
を調製することが知られている。胞子の形成を生じなく
なった突然変異体は、理論的には、異質タンパク質の生
産に使用される。しかしながら、突然変異体のいくつか
のものは、ｓｐｏ−表現型の不安定性、発現ベクターを
安定に保存できないこと、菌株内に存在するベクターの
コピー数が少ないことにより、Ｂ．サチリスの無胞子性
発現用の系の開発に関して完全には満足できる宿主では
ないことが明らかになっている。
に当たりバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）（以降、Ｂ．サチリスと表示する）が注
目されている。実際、Ｂ．サチリスは、完全な非病原性
であり、培地中に遺伝子発現生成物を分泌でき、大規模
な生育が容易であるため、バイオテクノロジーの見地か
ら特に注目される微生物である。医薬品工業及び食品工
業にとって興味深い異質タンパク質及びポリペプチドの
発現用宿主としてＢ．サチリスを使用することは、これ
ら生成物の生産方法の許可を受けるための重要な要因で
ある。しかしながら、微生物の使用に関する禁忌の１つ
は、ある種の生理的生育条件下における胞子形成の能力
による。事実、化学的−物理的試薬に対する高い抵抗性
によって特徴づけられる胞子は、最も一般的な環境条件
下で生残る大きい可能性を有する。医薬及び食品の分野
で興味深い生成物の製法においてＢ．サチリスの組換え
菌株を使用することは、胞子が外部環境に分散される可
能性が低いことを示さない場合には、法律上の規制を受
けることになる。 Ｂ．サチリスにおける内生胞子の形成は、細胞の生理系
及び超微細構造における変化（生育栄養源が限定される
条件に対する応答の結果として）によって生ずる細胞分
化過程である。胞子形成（平均して３７℃において６な
いし８時間で行われる）の間に、細胞は一連の良好に限
定された形態学的段階を受ける。この段階は胞子嚢内で
の増殖形への交代細胞形である内生胞子の形成によって
終わる。これらの段階（慣例的に段階０−ＶＩＩとして
定義される）は、異なる遺伝子（ｓｐｏ遺伝子）によっ
てコード付けられる一連の物質を要求する。当分野では
、化学試薬又は物理試剤によるｓｐｏ遺伝子の突然変異
により、又はインビトロでの変異誘発技術の利用により
胞子を生産しないＢ．サチリスの菌株（無胞子性菌株）
を調製することが知られている。胞子の形成を生じなく
なった突然変異体は、理論的には、異質タンパク質の生
産に使用される。しかしながら、突然変異体のいくつか
のものは、ｓｐｏ−表現型の不安定性、発現ベクターを
安定に保存できないこと、菌株内に存在するベクターの
コピー数が少ないことにより、Ｂ．サチリスの無胞子性
発現用の系の開発に関して完全には満足できる宿主では
ないことが明らかになっている。
【０００５】発明者らは、上述の問題点を解消するＢ．
サチリスの無胞子性突然変異体を新たに単離した。この
突然変異体（ＳＭＳ２７５として公知）は１９９０年１
０月５日付けでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏ
ｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託してあり
、その受託番号はＣＢＳ ４３２．９０である。このよ
うに、本発明の目的は、無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス ＳＭＳ２７５を提供することにある。本発明の他の
目的は、異質生成物の生産用宿主−ベクター系における
宿主としての該菌株の使用にある。本発明の他の目的は
、異質生成物をコード付ける遺伝子を含有する発現ベク
ターによる無胞子性菌株バシラス・サチリス ＳＭＳ２
７５の形質転換、好適な培地中での形質転換菌株バシラ
ス・サチリス ＳＭＳ２７５の生育及びこのようにして
生産された遺伝子発現生成物の分離及び精製を包含する
所望の異質生成物の製法にある。特に、本発明による無
胞子性菌株バシラス・サチリス ＳＭＳ２７５は、遺伝
子マーカー ｓｐｏＩＩ：Ｄ−、Ｌｅｕ（ロイシンの不
存在下では最小培地中で生育しない）、ｐｙｒＤ１（ウ
ラシルの不存在下では最小培地中で生育しない）、ａｐ
ｒ−及びｎｐｒ−（セリンプロテアーゼ及びニュートラ
ルプロテアーゼを生育しない）によって特徴づけられる
。該菌株はｓｐｏ−表現型を安定して保存でき（実際の
ところ、胞子形成性への逆戻りの頻度は約１０−８であ
る）、複製可能な発現ベクターの多数のコピーを安定に
保存できる。
サチリスの無胞子性突然変異体を新たに単離した。この
突然変異体（ＳＭＳ２７５として公知）は１９９０年１
０月５日付けでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏ
ｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託してあり
、その受託番号はＣＢＳ ４３２．９０である。このよ
うに、本発明の目的は、無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス ＳＭＳ２７５を提供することにある。本発明の他の
目的は、異質生成物の生産用宿主−ベクター系における
宿主としての該菌株の使用にある。本発明の他の目的は
、異質生成物をコード付ける遺伝子を含有する発現ベク
ターによる無胞子性菌株バシラス・サチリス ＳＭＳ２
７５の形質転換、好適な培地中での形質転換菌株バシラ
ス・サチリス ＳＭＳ２７５の生育及びこのようにして
生産された遺伝子発現生成物の分離及び精製を包含する
所望の異質生成物の製法にある。特に、本発明による無
胞子性菌株バシラス・サチリス ＳＭＳ２７５は、遺伝
子マーカー ｓｐｏＩＩ：Ｄ−、Ｌｅｕ（ロイシンの不
存在下では最小培地中で生育しない）、ｐｙｒＤ１（ウ
ラシルの不存在下では最小培地中で生育しない）、ａｐ
ｒ−及びｎｐｒ−（セリンプロテアーゼ及びニュートラ
ルプロテアーゼを生育しない）によって特徴づけられる
。該菌株はｓｐｏ−表現型を安定して保存でき（実際の
ところ、胞子形成性への逆戻りの頻度は約１０−８であ
る）、複製可能な発現ベクターの多数のコピーを安定に
保存できる。
【０００６】本発明による無胞子性菌株を構成するに当
たり使用できる方法は、Ｂ．サチリスの胞子形成菌株に
ついてトランスポゾンにより突然変異を生じさせ、この
ようにして生成した無胞子性突然変異体を単離すること
からなる。トランスポゾンは、移動可能で、ゲノム内の
異なった位置に挿入され、宿主の菌株に新たに遺伝性特
性を付与するＤＮＡのエレメントである。事実、ゲノム
内の部位に挿入された後、トランスポゾン（抗生物質に
対する耐性をコード付ける遺伝子を含有する）は遺伝子
の配列を中断する（表現型突然変異によって表示される
）と共に、宿主に特殊な抗生物質に対する耐性を付与す
る。本発明の１具体例によれば、トランスポゾンＴＮ９
１７（Ｔｏｍｉｃｈ及びＣｌｅｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，（１９８０），１４１：１３６６−１５
７４）（中でも、抗生物質のエリスロマイシン（Ｅｍ）
に対する耐性をコード付ける）を使用する。トランスポ
ゾンの挿入による突然変異は、公知技術による接合又は
形質転換によって行われる。特に、本発明による無胞子
性菌株は、野生形（胞子形成性）の菌株Ｂ．サチリス
ＳＭＳ１１８を、バシラス属菌において複製されないも
のであって、トランスポゾンＴＮ９１７を含有するプラ
スミドで形質転換させ、エリスロマイシンを添加した培
地で突然変異菌株を選別することによって調製される。 実際のところ、理論上では、トランスポゾンＴＮ９１７
が胞子形成性菌株の染色体ＤＮＡ内に一体化されたクロ
ーンのみがこの培地で生育できる。
たり使用できる方法は、Ｂ．サチリスの胞子形成菌株に
ついてトランスポゾンにより突然変異を生じさせ、この
ようにして生成した無胞子性突然変異体を単離すること
からなる。トランスポゾンは、移動可能で、ゲノム内の
異なった位置に挿入され、宿主の菌株に新たに遺伝性特
性を付与するＤＮＡのエレメントである。事実、ゲノム
内の部位に挿入された後、トランスポゾン（抗生物質に
対する耐性をコード付ける遺伝子を含有する）は遺伝子
の配列を中断する（表現型突然変異によって表示される
）と共に、宿主に特殊な抗生物質に対する耐性を付与す
る。本発明の１具体例によれば、トランスポゾンＴＮ９
１７（Ｔｏｍｉｃｈ及びＣｌｅｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，（１９８０），１４１：１３６６−１５
７４）（中でも、抗生物質のエリスロマイシン（Ｅｍ）
に対する耐性をコード付ける）を使用する。トランスポ
ゾンの挿入による突然変異は、公知技術による接合又は
形質転換によって行われる。特に、本発明による無胞子
性菌株は、野生形（胞子形成性）の菌株Ｂ．サチリス
ＳＭＳ１１８を、バシラス属菌において複製されないも
のであって、トランスポゾンＴＮ９１７を含有するプラ
スミドで形質転換させ、エリスロマイシンを添加した培
地で突然変異菌株を選別することによって調製される。 実際のところ、理論上では、トランスポゾンＴＮ９１７
が胞子形成性菌株の染色体ＤＮＡ内に一体化されたクロ
ーンのみがこの培地で生育できる。
【０００７】この目的に好適なプラスミドは、たとえば
ｐＴＶ１ＴＳ、ｐＴＶ３２ＴＳ、又はｐＴＶ５１ＴＳ（
Ｙｏｕｎｇｍａｎｎら，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉ
．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｓｌｅｐａｃｋｙ及びＰ．Ｓｅ
ｔｔｌｏｗ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ６５−８７，１９８９）で
ある。一方、トランスポゾンＴＮ９１７は、プラスミド
ｐＡＤ２［Ｔｏｍｉｃｈ及びＣｌｅｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８０），１４１：１３６６−
１５７４］から単離され、Ｂ．サチリス内で複製されな
いプラスミドに導入される。エリスロマイシン耐性クロ
ーンの非胞子形成特性を、光学顕微鏡での分析及び胞子
形成培地上での直接表示（胞子を形成するコロニーは数
日後には褐色に着色するが、無胞子性のコロニーは白色
のままであり、溶菌する傾向がある）の両方によってテ
ストした。分析したいくつかのＥｍ耐性（Ｅｍｒ）形質
転換体はｓｐｏ−表現型を示した。ｓｐｏＩＩ：Ｄ遺伝
子内における変異を含むｓｐｏ−形質転換体の１つ（Ｓ
ＭＳ２７５と称す）を、さらにｌｅｕ、ｐｙｒＤ１、ａ
ｐｒ−及びｎｐｒ−遺伝子型の安定性をチェックするた
めテストに供した。Ｌｅｕ及びｐｙｒＤ１マーカーの分
析を、ロイシン及びウラシルの不存在下及び存在下、最
小培地で菌株ＳＭＳ２７５を生育することによって行っ
た。両化合物を含有する培地でのみ生育する菌株の能力
はマーカーの安定性を示すものである。また、ａｐｒ−
及びｎｐｒ−マーカーの分析を、カゼインを濃度１％で
含有する最大培地（たとえばＶＹ培地又はＴＢＡＢ培地
（ＤＩＦＣＯ）など）で菌株ＳＭＳ２７５を平板培養す
ることによって行った。ＳＭＳ２７５の周りに暈輪が存
在しないことは、該菌株が２種のプロテアーゼを生産し
ないことを表示する。最後に、菌株ＳＭＳ２７５のｓｐ
ｏ−表現型の安定性を、該菌株を高温で処理することに
より検定した。 このテストは、胞子を生成し得ない菌株（ｓｐｏ−表現
型）は短時間の高温処理に対する抵抗性が低下するとの
事実に基づくものである。熱処理は細胞を破壊するが、
胞子を破壊しないため、平面培地上で生育するコロニー
は、液体培地中での生育の間に生成され、最大培地上で
平板培養される際に発芽し得る胞子に由来するものであ
る。 この目的のため、菌株ＳＭＳ２７５を胞子形成培地にお
いて３７℃で約２４時間生育させ、ついで８０℃で約１
０分間熱処理した。ついで、培養物の好適な希釈物を、
カナマイシン及びクロラムフェニコールを含有する最大
培地で平板培養し、生きている細胞（ＣＦＵ）を計数し
た。データの分析結果は、菌株ＳＭＳ２７５がｓｐｏ＋
表現型に逆戻りする頻度は１×１０−８より小であるこ
とを示した。このように、菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２
７５は、所望の異質生成物の生産用宿主−ベクター系に
おける宿主としての使用に特に適していると思われる。
ｐＴＶ１ＴＳ、ｐＴＶ３２ＴＳ、又はｐＴＶ５１ＴＳ（
Ｙｏｕｎｇｍａｎｎら，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉ
．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｓｌｅｐａｃｋｙ及びＰ．Ｓｅ
ｔｔｌｏｗ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ６５−８７，１９８９）で
ある。一方、トランスポゾンＴＮ９１７は、プラスミド
ｐＡＤ２［Ｔｏｍｉｃｈ及びＣｌｅｗｅｌｌ，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８０），１４１：１３６６−
１５７４］から単離され、Ｂ．サチリス内で複製されな
いプラスミドに導入される。エリスロマイシン耐性クロ
ーンの非胞子形成特性を、光学顕微鏡での分析及び胞子
形成培地上での直接表示（胞子を形成するコロニーは数
日後には褐色に着色するが、無胞子性のコロニーは白色
のままであり、溶菌する傾向がある）の両方によってテ
ストした。分析したいくつかのＥｍ耐性（Ｅｍｒ）形質
転換体はｓｐｏ−表現型を示した。ｓｐｏＩＩ：Ｄ遺伝
子内における変異を含むｓｐｏ−形質転換体の１つ（Ｓ
ＭＳ２７５と称す）を、さらにｌｅｕ、ｐｙｒＤ１、ａ
ｐｒ−及びｎｐｒ−遺伝子型の安定性をチェックするた
めテストに供した。Ｌｅｕ及びｐｙｒＤ１マーカーの分
析を、ロイシン及びウラシルの不存在下及び存在下、最
小培地で菌株ＳＭＳ２７５を生育することによって行っ
た。両化合物を含有する培地でのみ生育する菌株の能力
はマーカーの安定性を示すものである。また、ａｐｒ−
及びｎｐｒ−マーカーの分析を、カゼインを濃度１％で
含有する最大培地（たとえばＶＹ培地又はＴＢＡＢ培地
（ＤＩＦＣＯ）など）で菌株ＳＭＳ２７５を平板培養す
ることによって行った。ＳＭＳ２７５の周りに暈輪が存
在しないことは、該菌株が２種のプロテアーゼを生産し
ないことを表示する。最後に、菌株ＳＭＳ２７５のｓｐ
ｏ−表現型の安定性を、該菌株を高温で処理することに
より検定した。 このテストは、胞子を生成し得ない菌株（ｓｐｏ−表現
型）は短時間の高温処理に対する抵抗性が低下するとの
事実に基づくものである。熱処理は細胞を破壊するが、
胞子を破壊しないため、平面培地上で生育するコロニー
は、液体培地中での生育の間に生成され、最大培地上で
平板培養される際に発芽し得る胞子に由来するものであ
る。 この目的のため、菌株ＳＭＳ２７５を胞子形成培地にお
いて３７℃で約２４時間生育させ、ついで８０℃で約１
０分間熱処理した。ついで、培養物の好適な希釈物を、
カナマイシン及びクロラムフェニコールを含有する最大
培地で平板培養し、生きている細胞（ＣＦＵ）を計数し
た。データの分析結果は、菌株ＳＭＳ２７５がｓｐｏ＋
表現型に逆戻りする頻度は１×１０−８より小であるこ
とを示した。このように、菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２
７５は、所望の異質生成物の生産用宿主−ベクター系に
おける宿主としての使用に特に適していると思われる。
【０００８】本発明による方法は、たとえば無胞子性菌
株を、所望の異質生成物をコード付ける遺伝子を含有す
る複製可能な発現ベクターで形質転換させ、このように
して形質転換した無胞子性菌株を好適な条件下で生育さ
せ、最後に、得られた遺伝子発現生成物を単離し、精製
することからなる。好適なベクターは、各種実験室及び
コレクションセンターから利用できるＢ．サチリスにお
いて複製可能なプラスミドの中から選択される。これら
ベクターによるＢ．サチリス ＳＭＳ２７５細胞の形質
転換は、常法の１つを利用して行われる。無胞子性菌株
Ｂ．サチリス ＳＭＳ２７５は、たとえば酵素（α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ等）の如き原核性ポリペプチ
ド、又はたとえばインターロイキン、インターフェロン
、ヒト生長ホルモン、又はこれらの前駆体の如き真核性
ポリペプチドをコード付ける遺伝子の発現用宿主として
有用である。本発明の１具体例によれば、ヨーロッパ特
許公開第３２１９４０号に開示された如く、ヒト生長ホ
ルモンの前駆体をコード付けるＤＮＡ配列を含有するプ
ラスミド ｐＳＭ２７４で菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２
７５を形質転換させる。ついで、形質転換された菌株を
、炭素源、窒素源及びミネラル塩を含有する培地におい
て、光学密度（波長６００ｎｍで測定）約３−４まで生
育させる。
株を、所望の異質生成物をコード付ける遺伝子を含有す
る複製可能な発現ベクターで形質転換させ、このように
して形質転換した無胞子性菌株を好適な条件下で生育さ
せ、最後に、得られた遺伝子発現生成物を単離し、精製
することからなる。好適なベクターは、各種実験室及び
コレクションセンターから利用できるＢ．サチリスにお
いて複製可能なプラスミドの中から選択される。これら
ベクターによるＢ．サチリス ＳＭＳ２７５細胞の形質
転換は、常法の１つを利用して行われる。無胞子性菌株
Ｂ．サチリス ＳＭＳ２７５は、たとえば酵素（α−ア
ミラーゼ、β−アミラーゼ等）の如き原核性ポリペプチ
ド、又はたとえばインターロイキン、インターフェロン
、ヒト生長ホルモン、又はこれらの前駆体の如き真核性
ポリペプチドをコード付ける遺伝子の発現用宿主として
有用である。本発明の１具体例によれば、ヨーロッパ特
許公開第３２１９４０号に開示された如く、ヒト生長ホ
ルモンの前駆体をコード付けるＤＮＡ配列を含有するプ
ラスミド ｐＳＭ２７４で菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２
７５を形質転換させる。ついで、形質転換された菌株を
、炭素源、窒素源及びミネラル塩を含有する培地におい
て、光学密度（波長６００ｎｍで測定）約３−４まで生
育させる。
【０００９】つづいて、プラスミドの安定性及び菌株Ｓ
ＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）のｈＧＨ前駆体の生産能力
を測定する。その結果は、プラスミド ｐＳＭ２７４が
安定であること（多数のコピーが細胞中に存在する）を
示した（図１）。さらに、菌株から抽出された総可溶性
タンパク質の電気泳動分析では、ヒト生長ホルモンの前
駆体に相当するバンドの存在を示した。菌株Ｂ．サチリ
ス ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）の生存度を、グリセ
リン中に６カ月間維持した培地１ｍｌ当たりの生存細胞
の数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定によって評価した。得られ
た結果は、これらが保持された条件下において細胞の生
存度が良好であること及びｓｐｏ−表現型が安定である
ことを示した。プラスミド ｐＳＭ２７４を含有する無
胞子性菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２７５を１９９０年１
０月５日付けでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏ
ｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｔｕｒｅｓに寄託してあり、
受託番号はＣＢＳ ４３３．９０である。
ＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）のｈＧＨ前駆体の生産能力
を測定する。その結果は、プラスミド ｐＳＭ２７４が
安定であること（多数のコピーが細胞中に存在する）を
示した（図１）。さらに、菌株から抽出された総可溶性
タンパク質の電気泳動分析では、ヒト生長ホルモンの前
駆体に相当するバンドの存在を示した。菌株Ｂ．サチリ
ス ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）の生存度を、グリセ
リン中に６カ月間維持した培地１ｍｌ当たりの生存細胞
の数（ＣＦＵ／ｍｌ）の測定によって評価した。得られ
た結果は、これらが保持された条件下において細胞の生
存度が良好であること及びｓｐｏ−表現型が安定である
ことを示した。プラスミド ｐＳＭ２７４を含有する無
胞子性菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２７５を１９９０年１
０月５日付けでＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏ
ｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｔｕｒｅｓに寄託してあり、
受託番号はＣＢＳ ４３３．９０である。
【００１０】後述の比較例は、ＳＭＳ２７５以外のＢ．
サチリス ｓｐｏ−菌株をプラスミド ｐＳＭ２７４で
形質転換させる例を開示する。プラスミドの安定性及び
ペアーの数について及びｓｐｏ−表現型の安定性につい
て分析を行った際、これらの菌株は下記の結果を示した
。 −ｓｐｏＯＦ変異を有する菌株ＳＭＳ２６８内では、プ
ラスミド ｐＳＭ２７４は構造的には不安定である。 −ｓｐｏＩＩＡ１変異を有する菌株ＳＭＳ２７０内では
、野生形菌株ＳＭＳ１１８内におけるよりも少ないプラ
スミド ｐＳＭ２７４のコピーが存在する。 −ｓｐｏＩＩＦ９６変異を有する菌株ＳＭＳ２７２内で
は、プラスミドは安定であり、コピーの数は野生形菌株
ＳＭＳ１１８内におけるものに匹敵する。しかしながら
、顕微鏡観察によって行った評価では、この菌株はかな
り高い頻度でｓｐｏ＋表現型を要求する傾向があった。 さらに、菌株ＳＭＳ２７２は、たとえばグリセリン中に
維持される際には、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）
よりも生存度が低いことを示す。事実、グリセリンの添
加後、培地１ｍｌ当たり生存細胞の数は３．７×１０７
ＣＦＵ／ｍｌであり、７日後、この値は７３％に低下
し、１９日後では６８％に、４０日後では約５４％に低
下した。これらの理由から、菌株ＳＭＳ２７２は、工業
的発酵処理における使用には適していない。
サチリス ｓｐｏ−菌株をプラスミド ｐＳＭ２７４で
形質転換させる例を開示する。プラスミドの安定性及び
ペアーの数について及びｓｐｏ−表現型の安定性につい
て分析を行った際、これらの菌株は下記の結果を示した
。 −ｓｐｏＯＦ変異を有する菌株ＳＭＳ２６８内では、プ
ラスミド ｐＳＭ２７４は構造的には不安定である。 −ｓｐｏＩＩＡ１変異を有する菌株ＳＭＳ２７０内では
、野生形菌株ＳＭＳ１１８内におけるよりも少ないプラ
スミド ｐＳＭ２７４のコピーが存在する。 −ｓｐｏＩＩＦ９６変異を有する菌株ＳＭＳ２７２内で
は、プラスミドは安定であり、コピーの数は野生形菌株
ＳＭＳ１１８内におけるものに匹敵する。しかしながら
、顕微鏡観察によって行った評価では、この菌株はかな
り高い頻度でｓｐｏ＋表現型を要求する傾向があった。 さらに、菌株ＳＭＳ２７２は、たとえばグリセリン中に
維持される際には、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）
よりも生存度が低いことを示す。事実、グリセリンの添
加後、培地１ｍｌ当たり生存細胞の数は３．７×１０７
ＣＦＵ／ｍｌであり、７日後、この値は７３％に低下
し、１９日後では６８％に、４０日後では約５４％に低
下した。これらの理由から、菌株ＳＭＳ２７２は、工業
的発酵処理における使用には適していない。
【００１１】次に図面について詳述する。図１及び図２
の写真はアーガロースゲル上で行ったプラスミド ｐＳ
Ｍ２７４のＤＮＡの電気泳動の結果を示すものである。 図１において、１：ｐＳＭ２７４コントロール（未消化
）、２：ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したｐ
ＳＭ２７４コントロール、３：菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳ
Ｍ２７４）から抽出したプラスミドＤＮＡ（未消化）、
４：菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）から抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したプラスミドＤ
ＮＡ、５：分子量基準である。 図２において、１−４：菌株ｓｐｏＩＩＤ ＳＭＳ２７
５（ｐＳＭ２７４）の２つのクローンから抽出されたプ
ラスミドＤＮＡであって、１及び３は未消化のＤＮＡ、
２及び４はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した
ＤＮＡであり；５−８；菌株ｓｐｏＩＩＡ１ ＳＭＳ２
７０（ｐＳＭ２７４）の２つのクローンから抽出された
プラスミドＤＮＡであって、５及び７は未消化のＤＮＡ
、６及び８はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し
たＤＮＡであり；９は分子量基準であり；１０−１３：
菌株ｓｐｏＩＩＦ９６ ＳＭＳ２７２（ｐＳＭ２７４）
の２つのクローンから抽出されたプラスミドＤＮＡであ
って、１０及び１２は未消化のＤＮＡ、１１及び１３は
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したＤＮＡであ
り；１４及び１５：菌株ｓｐｏＯＦ ＳＭＳ２２８（ｐ
ＳＭ２７４）の１つのクローンから抽出されたプラスミ
ドＤＮＡであって、１４は未消化のＤＮＡ、１５はＥｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡである。図
３は、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）から抽出され
たタンパク質の１２．５％ナトリウムドデシルポリアク
リルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における電気泳動
の結果を示す写真である。図中、Ａは標準（部分的に精
製したｈＧＨ前駆体）であり；ＢはｈＧＨ前駆体をコー
ド付ける配列を含有しないコントロールプラスミド ｐ
ＳＭ２１４によって形質転換された菌株２７５から抽出
されたタンパク質であり；Ｃ−Ｆ：プラスミド ｐＳＭ
２７４によって形質転換された菌株ＳＭＳ２７５の４つ
のクローンから抽出されたタンパク質である。以下の実
施例は本発明を説明するものであり、これらに限定され
ない。
の写真はアーガロースゲル上で行ったプラスミド ｐＳ
Ｍ２７４のＤＮＡの電気泳動の結果を示すものである。 図１において、１：ｐＳＭ２７４コントロール（未消化
）、２：ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したｐ
ＳＭ２７４コントロール、３：菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳ
Ｍ２７４）から抽出したプラスミドＤＮＡ（未消化）、
４：菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）から抽出し、Ｅ
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したプラスミドＤ
ＮＡ、５：分子量基準である。 図２において、１−４：菌株ｓｐｏＩＩＤ ＳＭＳ２７
５（ｐＳＭ２７４）の２つのクローンから抽出されたプ
ラスミドＤＮＡであって、１及び３は未消化のＤＮＡ、
２及び４はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した
ＤＮＡであり；５−８；菌株ｓｐｏＩＩＡ１ ＳＭＳ２
７０（ｐＳＭ２７４）の２つのクローンから抽出された
プラスミドＤＮＡであって、５及び７は未消化のＤＮＡ
、６及び８はＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し
たＤＮＡであり；９は分子量基準であり；１０−１３：
菌株ｓｐｏＩＩＦ９６ ＳＭＳ２７２（ｐＳＭ２７４）
の２つのクローンから抽出されたプラスミドＤＮＡであ
って、１０及び１２は未消化のＤＮＡ、１１及び１３は
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化したＤＮＡであ
り；１４及び１５：菌株ｓｐｏＯＦ ＳＭＳ２２８（ｐ
ＳＭ２７４）の１つのクローンから抽出されたプラスミ
ドＤＮＡであって、１４は未消化のＤＮＡ、１５はＥｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡである。図
３は、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）から抽出され
たタンパク質の１２．５％ナトリウムドデシルポリアク
リルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における電気泳動
の結果を示す写真である。図中、Ａは標準（部分的に精
製したｈＧＨ前駆体）であり；ＢはｈＧＨ前駆体をコー
ド付ける配列を含有しないコントロールプラスミド ｐ
ＳＭ２１４によって形質転換された菌株２７５から抽出
されたタンパク質であり；Ｃ−Ｆ：プラスミド ｐＳＭ
２７４によって形質転換された菌株ＳＭＳ２７５の４つ
のクローンから抽出されたタンパク質である。以下の実
施例は本発明を説明するものであり、これらに限定され
ない。
【００１２】実施例１
無胞子性菌株Ｂ．サチリス ＳＭＳ２７５の構成Ｃｏｎ
ｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｎａｕによって開示された方法（
Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７９），１６７：２
５１−２５８）に従い、トランスポゾンＴｎ９１７を含
有するプラスミドＤＮＡ ｐＴＶ５ＴＳ（１μｇ）を使
用してコンピテントＢ．サチリス ＳＭＳ１１８細胞を
形質転換させた。ついで、細胞をＶＹ最大培地（ｖｅａ
ｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ｖｅａｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ）２５ｇ／リットル、酵母エ
キス５ｇ／リットル及び寒天（ＤＩＦＣＯ）２０ｇ／リ
ットル）２０ｍｌ上で平板培養し、該プレート上にエリ
スロマイシン １２５μｇ／ｍｌを含有するソフト寒天
５ｍｌを注加し、プレートを３７℃でさらに１８時間イ
ンキュベートすることによって形質転換体を選別した。 エリスロマイシン耐性（Ｅｍｒ）形質転換体（すなわち
、染色体レベルで同種の組換えが行われたもの）を、胞
子を形成しない能力に関するテストに供した。この目的
のため、Ｅｍｒコロニーを、下記組成を有するＳｃｈａ
ｅｆｆｅｒ胞子形成培地（ｐＨ７．０）のプレート上に
移し、３７℃で生育させた。 普通ブロス（ＤＩＦＣＯ） ８
．０ ｇ／リットルＫＣｌ
１．０ ｇ／リットルＭｇ
ＳＯ４
１．２５×１０−１ｇ／リットル寒天（ＤＩＦＣＯ
） １６．０ ｇ
／リットルＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．９８×１０−３ ｇ／リットル
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．７８×１０−４ ｇ／リットルＮａ２ＳＯ
４ １
．４２×１０−１ ｇ／リットルＨ２Ｏ
１．０ リッ
トル数日後、光学顕微鏡での観察、及びコロニーの形態
的変成の実施によって胞子の形成を測定した。胞子を形
成したコロニーは実際に象徴的な褐色に着色し、一方、
無胞子性のコロニーは透明のままであり、溶菌する傾向
を示した。上述の如く得られた結果から、無胞子性表現
型（ｓｐｏ−）を有するいくつかのＥｍｒ形質転換体を
単離することができた。ｓｐｏＩＩ：Ｄ遺伝子内に変異
を有するこれら形質転換体の１つをＳＭＳ２７５と表示
した。
ｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｎａｕによって開示された方法（
Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７９），１６７：２
５１−２５８）に従い、トランスポゾンＴｎ９１７を含
有するプラスミドＤＮＡ ｐＴＶ５ＴＳ（１μｇ）を使
用してコンピテントＢ．サチリス ＳＭＳ１１８細胞を
形質転換させた。ついで、細胞をＶＹ最大培地（ｖｅａ
ｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（ｖｅａｌ ｉｎｆｕｓｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ（ＤＩＦＣＯ）２５ｇ／リットル、酵母エ
キス５ｇ／リットル及び寒天（ＤＩＦＣＯ）２０ｇ／リ
ットル）２０ｍｌ上で平板培養し、該プレート上にエリ
スロマイシン １２５μｇ／ｍｌを含有するソフト寒天
５ｍｌを注加し、プレートを３７℃でさらに１８時間イ
ンキュベートすることによって形質転換体を選別した。 エリスロマイシン耐性（Ｅｍｒ）形質転換体（すなわち
、染色体レベルで同種の組換えが行われたもの）を、胞
子を形成しない能力に関するテストに供した。この目的
のため、Ｅｍｒコロニーを、下記組成を有するＳｃｈａ
ｅｆｆｅｒ胞子形成培地（ｐＨ７．０）のプレート上に
移し、３７℃で生育させた。 普通ブロス（ＤＩＦＣＯ） ８
．０ ｇ／リットルＫＣｌ
１．０ ｇ／リットルＭｇ
ＳＯ４
１．２５×１０−１ｇ／リットル寒天（ＤＩＦＣＯ
） １６．０ ｇ
／リットルＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．９８×１０−３ ｇ／リットル
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．７８×１０−４ ｇ／リットルＮａ２ＳＯ
４ １
．４２×１０−１ ｇ／リットルＨ２Ｏ
１．０ リッ
トル数日後、光学顕微鏡での観察、及びコロニーの形態
的変成の実施によって胞子の形成を測定した。胞子を形
成したコロニーは実際に象徴的な褐色に着色し、一方、
無胞子性のコロニーは透明のままであり、溶菌する傾向
を示した。上述の如く得られた結果から、無胞子性表現
型（ｓｐｏ−）を有するいくつかのＥｍｒ形質転換体を
単離することができた。ｓｐｏＩＩ：Ｄ遺伝子内に変異
を有するこれら形質転換体の１つをＳＭＳ２７５と表示
した。
【００１３】実施例２
菌株ＳＭＳ２７５の特性表示
菌株ＳＭＳ２７５について、さらに、遺伝子性マーカー
ａｐｒ−、ｎｐｒ−、ｌｅｕ、ｐｙｒＤ１及びｓｐｏ
−の安定性をチェックするため検定を行った。詳述すれ
ば、（ｉ）生育培地における菌株のプロテアーゼ活性が
低いこと（セリンプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒ）及びニ
ュートラルプロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒ）が不活性化さ
れたことを示す）、（ｉｉ）ロイシン及びウラシルの非
存在下、最小培地において菌株が生育しないこと及び、
（ｉｉｉ）非胞子形性能をチェックするためテストを行
った。カゼイン１％を含有するＶＹ最大培地に菌株ＳＭ
Ｓ２７２を平板培養することによりプロテアーゼ活性を
測定した（Ｔｏｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（
１９８６），１４７：７４０−７４３）。セリンプロテ
アーゼ及びニュートラルプロテアーゼの作用によるコロ
ニーの周囲における特徴的な加水分解暈輪の不存在は、
これら２つの酵素が分泌されていないことを示す。菌株
ＳＭＳ２７５から単離されたコロニーはいずれも加水分
解暈輪をもたない。しかしながら、ロイシン（ｌｅｕ）
及びウラシル（ｐｙｒＤ１）に関する栄養要求について
は、Ｐ．ＹｏｕｎｇｍａｎによりＰｌａｓｍｉｄｓ：ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｇ．Ｈ
ａｒｄｙ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６），７９
−１０３に記載された組成を有する最小培地（生育ファ
クターを含まない）、ｌｅｕ（５０μｇ／ｍｌ）のみ含
有する最小培地、ウラシル（５０μｇ／ｍｌ）のみ含有
する最小培地、及び両方を含む最小培地で菌株を平板培
養することによってコントロールテストを行った。両方
の栄養ファクターを含有する培地でのみ生育が観察され
た。これより、遺伝子性マーカー ｌｅｕ及びｐｙｒＤ
１の安定性が確認された。最後に、細胞の総量に関連し
て生成する胞子の量を測定し、同時に、エリスロマイシ
ンによる選択的圧力の不存在下におけるｓｐｏ−表現型
の安定性をチェックした。該分析は、胞子を生成し得な
い菌株は短時間の高温処理に対する抵抗性が小さいとの
事実に基づくものである。それぞれＳｃｈａｅｆｆｅｒ
液状胞子形成培地１０ｍｌを収容するフラスコ（１００
ｍｌ）２個に、それぞれ菌株ＳＭＳ２７５及び胞子形成
性菌株ＳＭＳ１８１（コントロール）を接種し、初めに
３７℃で２４時間、ついで８０℃で１０分間インキュベ
ートした。ついで、培養物の一定量を適当に希釈し、各
希釈物０．１ｍｌを、抗生物質を補充したＶＹ最大培地
で平板培養した。室温で生育後、生存する細胞（ＣＦＵ
）を８０℃での処理の前後で計数した。
ａｐｒ−、ｎｐｒ−、ｌｅｕ、ｐｙｒＤ１及びｓｐｏ
−の安定性をチェックするため検定を行った。詳述すれ
ば、（ｉ）生育培地における菌株のプロテアーゼ活性が
低いこと（セリンプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒ）及びニ
ュートラルプロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒ）が不活性化さ
れたことを示す）、（ｉｉ）ロイシン及びウラシルの非
存在下、最小培地において菌株が生育しないこと及び、
（ｉｉｉ）非胞子形性能をチェックするためテストを行
った。カゼイン１％を含有するＶＹ最大培地に菌株ＳＭ
Ｓ２７２を平板培養することによりプロテアーゼ活性を
測定した（Ｔｏｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（
１９８６），１４７：７４０−７４３）。セリンプロテ
アーゼ及びニュートラルプロテアーゼの作用によるコロ
ニーの周囲における特徴的な加水分解暈輪の不存在は、
これら２つの酵素が分泌されていないことを示す。菌株
ＳＭＳ２７５から単離されたコロニーはいずれも加水分
解暈輪をもたない。しかしながら、ロイシン（ｌｅｕ）
及びウラシル（ｐｙｒＤ１）に関する栄養要求について
は、Ｐ．ＹｏｕｎｇｍａｎによりＰｌａｓｍｉｄｓ：ａ
ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｇ．Ｈ
ａｒｄｙ編，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６），７９
−１０３に記載された組成を有する最小培地（生育ファ
クターを含まない）、ｌｅｕ（５０μｇ／ｍｌ）のみ含
有する最小培地、ウラシル（５０μｇ／ｍｌ）のみ含有
する最小培地、及び両方を含む最小培地で菌株を平板培
養することによってコントロールテストを行った。両方
の栄養ファクターを含有する培地でのみ生育が観察され
た。これより、遺伝子性マーカー ｌｅｕ及びｐｙｒＤ
１の安定性が確認された。最後に、細胞の総量に関連し
て生成する胞子の量を測定し、同時に、エリスロマイシ
ンによる選択的圧力の不存在下におけるｓｐｏ−表現型
の安定性をチェックした。該分析は、胞子を生成し得な
い菌株は短時間の高温処理に対する抵抗性が小さいとの
事実に基づくものである。それぞれＳｃｈａｅｆｆｅｒ
液状胞子形成培地１０ｍｌを収容するフラスコ（１００
ｍｌ）２個に、それぞれ菌株ＳＭＳ２７５及び胞子形成
性菌株ＳＭＳ１８１（コントロール）を接種し、初めに
３７℃で２４時間、ついで８０℃で１０分間インキュベ
ートした。ついで、培養物の一定量を適当に希釈し、各
希釈物０．１ｍｌを、抗生物質を補充したＶＹ最大培地
で平板培養した。室温で生育後、生存する細胞（ＣＦＵ
）を８０℃での処理の前後で計数した。
【００１４】加熱処理は細胞を破壊するが、胞子を破壊
しないため、平板培地上で生育したコロニーは、３７℃
における液体培地中での生育の間に生成し、最大培地上
で平板培養する際に発芽し得る胞子に由来するものであ
る。表１は上記テストの結果（ＣＦＵ／ｍｌで表示）を
示す。
しないため、平板培地上で生育したコロニーは、３７℃
における液体培地中での生育の間に生成し、最大培地上
で平板培養する際に発芽し得る胞子に由来するものであ
る。表１は上記テストの結果（ＣＦＵ／ｍｌで表示）を
示す。
【表１】
注１：表中の数値は３回の測定結果の平均値である。
注２：ｔ．ｑ．：希釈していない培養物（０．１ｍｌ）
− ：加熱処理前 ＋ ：加熱処理後 データの分析から、下記の事項が認められる。 ｉ）３７℃で生育させた菌株ＳＭＳ１１８及びＳＭＳ２
７５の培養物中に存在する細胞の数は、それぞれ１．９
×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ及び１×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ
である。 ｉｉ）菌株ＳＭＳ２７５がｓｐｏ＋表現型に逆戻りする
頻度は１×１０−８より小であり、熱処理に対して生残
るＳＭＳ２７５及びＳＭＳ１１８の百分率の間の比率は
０．００１％より小である。 ｉｉｉ）３７℃、２４時間後に生成され、最大培地で発
芽し得る胞子の量は、胞子形成性菌株ＳＭＳ１１８につ
いては１．４×１０５であり、非胞子形成性菌株ＳＭＳ
２７５については０である。 液状培地中、３７℃での培養をエリスロマイシンの不存
在下で行っているのであるから、８０℃における熱処理
後にＳＭＳ２７５コロニーが全く存在しないことは、菌
株ＳＭＳ２７５によって獲得されたｓｐｏ−特性が非常
に安定であることを示す。実際、細胞はトランスポゾン
を失っていると思われるが、無胞子性表現型を保持して
いる。
− ：加熱処理前 ＋ ：加熱処理後 データの分析から、下記の事項が認められる。 ｉ）３７℃で生育させた菌株ＳＭＳ１１８及びＳＭＳ２
７５の培養物中に存在する細胞の数は、それぞれ１．９
×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ及び１×１０８ ＣＦＵ／ｍｌ
である。 ｉｉ）菌株ＳＭＳ２７５がｓｐｏ＋表現型に逆戻りする
頻度は１×１０−８より小であり、熱処理に対して生残
るＳＭＳ２７５及びＳＭＳ１１８の百分率の間の比率は
０．００１％より小である。 ｉｉｉ）３７℃、２４時間後に生成され、最大培地で発
芽し得る胞子の量は、胞子形成性菌株ＳＭＳ１１８につ
いては１．４×１０５であり、非胞子形成性菌株ＳＭＳ
２７５については０である。 液状培地中、３７℃での培養をエリスロマイシンの不存
在下で行っているのであるから、８０℃における熱処理
後にＳＭＳ２７５コロニーが全く存在しないことは、菌
株ＳＭＳ２７５によって獲得されたｓｐｏ−特性が非常
に安定であることを示す。実際、細胞はトランスポゾン
を失っていると思われるが、無胞子性表現型を保持して
いる。
【００１５】実施例３
プラスミド ｐＳＭ２７４による菌株ＳＭＳ２７５の形
質転換コンピテントＢ．サチリス ＳＭＳ２７５細胞を
プラスミド ｐＳＭ２７４（１０ｎｇ）で形質転換させ
、ついで、カナマイシン５μｇ／ｍｌ及びクロラムフェ
ニコール５μｇ／ｍｌを含有するＶＹ最大培地のプレー
ト上、３７℃で１８時間培養して形質転換体を選別した
。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｒｏｄｒｉｇ
ｕｅｚ及びＴａｉｔ編，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，（１９８３
），１６４］に記載された急速抽出法によって耐性コロ
ニーの１つから単離したプラスミドＤＮＡの一定量を、
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＢＲＬ）に
より、該酵素の供給者の情報に従って消化した。 ついで、消化したプラスミドＤＮＡ ２μリットル及び
未消化の同じＤＮＡ ２μリットルを０．８％アーガロ
ースゲル上に負荷し、同様にプラスミド ｐＳＭ２７４
（コントロール）（２μリットル）（前記のものと同じ
酵素で処理したもの及び処理していないもの）及びいく
つかの分子量基準を負荷した。図１に示す結果は、Ｂ．
サチリス ＳＭＳ２７５クローンから単離し、制限酵素
で消化したプラスミド ｐＳＭ２７４が予想される移動
速度を示し、ｐＳＭ２７４のものと一致する消化パター
ンを示すことを表した。実際、６７００ｂｐ及び８００
ｂｐの長さ（それぞれプラスミドベクター及びヒト生長
ホルモンをコード付けるインサートに相当）を有する２
つのフラグメントに相当する２つのバンドを、脱色後、
臭化エチジウムで溶解させた。菌株Ｂ．サチリス ＳＭ
Ｓ２７５（ｐＳＭ２７４）のｈＧＨ前駆体を生成する能
力を、該菌株をＶＹ培地１０ｍｌ中、３７℃で１８時間
生育させ、溶解させた細胞から抽出された可溶性の総タ
ンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動さ
せ、クマシーブルーで染色することによって分析してチ
ェックした。タンパク質抽出物中におけるヒト生長ホル
モン前駆体に相当するバンドの存在が図３に見られる。
質転換コンピテントＢ．サチリス ＳＭＳ２７５細胞を
プラスミド ｐＳＭ２７４（１０ｎｇ）で形質転換させ
、ついで、カナマイシン５μｇ／ｍｌ及びクロラムフェ
ニコール５μｇ／ｍｌを含有するＶＹ最大培地のプレー
ト上、３７℃で１８時間培養して形質転換体を選別した
。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｒｏｄｒｉｇ
ｕｅｚ及びＴａｉｔ編，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，（１９８３
），１６４］に記載された急速抽出法によって耐性コロ
ニーの１つから単離したプラスミドＤＮＡの一定量を、
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＢＲＬ）に
より、該酵素の供給者の情報に従って消化した。 ついで、消化したプラスミドＤＮＡ ２μリットル及び
未消化の同じＤＮＡ ２μリットルを０．８％アーガロ
ースゲル上に負荷し、同様にプラスミド ｐＳＭ２７４
（コントロール）（２μリットル）（前記のものと同じ
酵素で処理したもの及び処理していないもの）及びいく
つかの分子量基準を負荷した。図１に示す結果は、Ｂ．
サチリス ＳＭＳ２７５クローンから単離し、制限酵素
で消化したプラスミド ｐＳＭ２７４が予想される移動
速度を示し、ｐＳＭ２７４のものと一致する消化パター
ンを示すことを表した。実際、６７００ｂｐ及び８００
ｂｐの長さ（それぞれプラスミドベクター及びヒト生長
ホルモンをコード付けるインサートに相当）を有する２
つのフラグメントに相当する２つのバンドを、脱色後、
臭化エチジウムで溶解させた。菌株Ｂ．サチリス ＳＭ
Ｓ２７５（ｐＳＭ２７４）のｈＧＨ前駆体を生成する能
力を、該菌株をＶＹ培地１０ｍｌ中、３７℃で１８時間
生育させ、溶解させた細胞から抽出された可溶性の総タ
ンパク質を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動さ
せ、クマシーブルーで染色することによって分析してチ
ェックした。タンパク質抽出物中におけるヒト生長ホル
モン前駆体に相当するバンドの存在が図３に見られる。
【００１６】比較例
ｓｐｏＩＩＦ９６、ｓｐｏＩＩＡ１及びｓｐｏＯＦ変異
を有する無胞子性菌株の形質転換 それぞれｓｐｏＩＩＦ９６、ｓｐｏＩＩＡ１及びｓｐｏ
ＯＦ変異を有する無胞子性菌株Ｂ．サチリスＳＭＳ２６
８、ＳＭＳ２７０及びＳＭＳ２７２をプラスミド ｐＳ
Ｍ２７４で形質転換させ、ついでプラスミドの安定性、
存在するプラスミドのコピーの数及びｓｐｏ−表現型の
安定性をチェックするためテストを行った。図２から見
られるように、ｓｐｏＯＦ変異を有する菌株においては
プラスミド ｐＳＭ２７４は不安定であり、ｓｐｏＩＩ
Ａ１変異を有する菌株内に存在するプラスミドのコピー
の数は菌株ＳＭＳ１１８内よりも少ない。これに対して
、ｓｐｏＩＩＦ９６菌株はプラスミドを安定状態で保持
しており、そのコピー数は菌株ＳＭＳ１１８の場合に匹
敵するものである。しかしながら、ｓｐｏ−の安定性を
チェックするためにテストした際、この菌株は顕微鏡観
察によって行った評価では、かなり高い頻度でｓｐｏ−
表現型を要求する傾向を示した。
を有する無胞子性菌株の形質転換 それぞれｓｐｏＩＩＦ９６、ｓｐｏＩＩＡ１及びｓｐｏ
ＯＦ変異を有する無胞子性菌株Ｂ．サチリスＳＭＳ２６
８、ＳＭＳ２７０及びＳＭＳ２７２をプラスミド ｐＳ
Ｍ２７４で形質転換させ、ついでプラスミドの安定性、
存在するプラスミドのコピーの数及びｓｐｏ−表現型の
安定性をチェックするためテストを行った。図２から見
られるように、ｓｐｏＯＦ変異を有する菌株においては
プラスミド ｐＳＭ２７４は不安定であり、ｓｐｏＩＩ
Ａ１変異を有する菌株内に存在するプラスミドのコピー
の数は菌株ＳＭＳ１１８内よりも少ない。これに対して
、ｓｐｏＩＩＦ９６菌株はプラスミドを安定状態で保持
しており、そのコピー数は菌株ＳＭＳ１１８の場合に匹
敵するものである。しかしながら、ｓｐｏ−の安定性を
チェックするためにテストした際、この菌株は顕微鏡観
察によって行った評価では、かなり高い頻度でｓｐｏ−
表現型を要求する傾向を示した。
【００１７】実施例４
無胞子性菌株ＳＭＳ２７５及びＳＭＳ２７２の生存度の
分析菌株ＳＭＳ２７５の生存度をチェックするため、グ
リセリン中で４つの細胞ブランクを調製した。実際には
、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）及び菌株ＳＭＳ２
７２（ｐＳＭ２７４）の予培養物（１００ｍｌ）２つを
下記処方のＴＹＭ培地中で調製した。 トリプトン １３
ｇ／リットル酵母エキス
３ｇ／リットルマルトース
４０ｇ／リットルカナマイシン
５ｍｇ／リットルクロラ
ムフェニコール ５ｍｇ／リットルフラ
スコを２２０ｒｐｍで撹拌し、３７℃で２４時間インキ
ュベートした。それぞれＴＹＭ培地１リットルを収容す
る２つの発酵槽（２リットル）に、予培養物の１つを１
００ｍｌ接種した（初期光学密度（Ｏ．Ｄ．）：６６０
ｎｍにおいて０．１９０）。空気を０．５ｖ／ｖ／分で
充填しながら、８００ｒｐｍ、ｐＨ７．０で発酵を行っ
た。Ｏ．Ｄ．３．０まで１５時間発酵を行った後、培養
物を遠心処理し、細胞を回収した。ついで、サンプル２
ｍｌにグリセリンを最終濃度１５％となるまで補充し、
−８０℃に維持した。調製の日から６カ月後、グリセリ
ン内におけるサンプル中の生存細胞（コロニー形成単位
−ＣＦＵ）の量を測定した。このテストは、グリセリン
中のサンプルの一定量を培地で希釈し、直ちに希釈物０
．１ｍｌを寒天を含有し、抗生物質（カナマイシン及び
クロラムフェニコール）を含有又は含有しないＴＢＡＢ
最大生育培地上で平板培養することによって実施される
。ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）については、グリセリ
ン中のサンプル１ｍｌ当たりの生存細胞数は２．４×１
０８ ＣＦＵ／ｍｌであった。該分析を抗生物質（カナ
マイシン及びクロラムフェニコール）の存在下又は不存
在下で実施した。これらの結果は、利用した保存条件下
においてＳＭＳ２７５細胞の安定性及び生存率が良好で
あることを示した。しかしながら、ＳＭＳ２７２（ｐＳ
Ｍ２７４）について得られたＣＦＵ値は生存率が低いこ
とを示した。実際のところ、グリセリンの添加後では、
３．７×１０７ ＣＦＵ／ｍｌの値が測定された。７日
後、この値は７３％に低下し、１９日後では６８％に、
４０日後では約５４％に低下した。菌株ＳＭＳ２７４（
ｐＳＭ２７４）の培養物についても、実施例２及び３に
記載の如く分析したところ、プラスミドは安定であり、
ｈＧＨ前駆体をコード付ける遺伝子の配列が無傷である
ことを示した。
分析菌株ＳＭＳ２７５の生存度をチェックするため、グ
リセリン中で４つの細胞ブランクを調製した。実際には
、菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）及び菌株ＳＭＳ２
７２（ｐＳＭ２７４）の予培養物（１００ｍｌ）２つを
下記処方のＴＹＭ培地中で調製した。 トリプトン １３
ｇ／リットル酵母エキス
３ｇ／リットルマルトース
４０ｇ／リットルカナマイシン
５ｍｇ／リットルクロラ
ムフェニコール ５ｍｇ／リットルフラ
スコを２２０ｒｐｍで撹拌し、３７℃で２４時間インキ
ュベートした。それぞれＴＹＭ培地１リットルを収容す
る２つの発酵槽（２リットル）に、予培養物の１つを１
００ｍｌ接種した（初期光学密度（Ｏ．Ｄ．）：６６０
ｎｍにおいて０．１９０）。空気を０．５ｖ／ｖ／分で
充填しながら、８００ｒｐｍ、ｐＨ７．０で発酵を行っ
た。Ｏ．Ｄ．３．０まで１５時間発酵を行った後、培養
物を遠心処理し、細胞を回収した。ついで、サンプル２
ｍｌにグリセリンを最終濃度１５％となるまで補充し、
−８０℃に維持した。調製の日から６カ月後、グリセリ
ン内におけるサンプル中の生存細胞（コロニー形成単位
−ＣＦＵ）の量を測定した。このテストは、グリセリン
中のサンプルの一定量を培地で希釈し、直ちに希釈物０
．１ｍｌを寒天を含有し、抗生物質（カナマイシン及び
クロラムフェニコール）を含有又は含有しないＴＢＡＢ
最大生育培地上で平板培養することによって実施される
。ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）については、グリセリ
ン中のサンプル１ｍｌ当たりの生存細胞数は２．４×１
０８ ＣＦＵ／ｍｌであった。該分析を抗生物質（カナ
マイシン及びクロラムフェニコール）の存在下又は不存
在下で実施した。これらの結果は、利用した保存条件下
においてＳＭＳ２７５細胞の安定性及び生存率が良好で
あることを示した。しかしながら、ＳＭＳ２７２（ｐＳ
Ｍ２７４）について得られたＣＦＵ値は生存率が低いこ
とを示した。実際のところ、グリセリンの添加後では、
３．７×１０７ ＣＦＵ／ｍｌの値が測定された。７日
後、この値は７３％に低下し、１９日後では６８％に、
４０日後では約５４％に低下した。菌株ＳＭＳ２７４（
ｐＳＭ２７４）の培養物についても、実施例２及び３に
記載の如く分析したところ、プラスミドは安定であり、
ｈＧＨ前駆体をコード付ける遺伝子の配列が無傷である
ことを示した。
【図１】プラスミド ｐＳＭ２７４のＤＮＡの電気泳動
の結果を示す写真である。
の結果を示す写真である。
【図２】菌株ｓｐｏＩＩＤ ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７
４）のクローンから抽出されたプラスミドＤＮＡの電気
泳動の結果を示す写真である。
４）のクローンから抽出されたプラスミドＤＮＡの電気
泳動の結果を示す写真である。
【図３】菌株ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）から抽出さ
れたタンパク質の電気泳動の結果を示す写真である。
れたタンパク質の電気泳動の結果を示す写真である。
Claims (8)
- 【請求項１】胞子形成性に逆戻りする頻度が１０−８よ
り小であり、遺伝子性マーカー ｌｅｕ，ｐｙｒＤ１，
ａｐｒ−及びｎｐｒ−、及びＳｐｏＩＩ：Ｄを有するこ
とによって特徴づけられる、無胞子性菌株バシラス・サ
チリス ＳＭＳ２７５（ＣＢＳ ４３２．９０）。 - 【請求項２】請求項１記載のものにおいて、組換えＤＮ
Ａ技術による異質ポリペプチド及びタンパク質又はこれ
らの前駆体の製造に使用される宿主−ベクター系の宿主
として使用されるものである、無胞子性菌株バシラス・
サチリス ＳＭＳ２７５。 - 【請求項３】請求項２記載のものにおいて、前記ベクタ
ーが、異質ポリペプチド又はタンパク質又はこれらの前
駆体をコード付ける遺伝子を含むバシラス・サチリス内
において発現可能なプラスミドである、無胞子性菌株バ
シラス・サチリス ＳＭＳ２７５。 - 【請求項４】請求項３記載のものにおいて、前記プラス
ミドがヒト生長ホルモンの前駆体をコード付ける遺伝子
を含有するものである、無胞子性菌株バシラス・サチリ
ス ＳＭＳ２７５。 - 【請求項５】請求項４記載のものにおいて、前記プラス
ミドがｐＳＭ２７４（ＣＢＳ ７５２８８）である、無
胞子性菌株バシラス・サチリス ＳＭＳ２７５。 - 【請求項６】受託番号ＣＢＳ ４３３．９０で寄託され
ている請求項５記載の無胞子性菌株バシラス・サチリス
ＳＭＳ２７５（ｐＳＭ２７４）。 - 【請求項７】異質ポリペプチド及びタンパク質又はこれ
らの前駆体を製造する方法において、バシラス属菌内で
発現可能であり、前記異質ポリペプチド又はタンパク質
又はこれらの前駆体をコード付ける遺伝子を含有するベ
クターによって形質転換させた請求項１記載の菌株バシ
ラス・サチリス ＳＭＳ２７５を、炭素源、窒素源、ミ
ネラル塩、ロイシン及びウラシルを含有する培地中で生
育させ、遺伝子発現生成物を回収することを特徴とする
、異質ポリペプチド及びタンパク質又はこれらの前駆体
の製法。 - 【請求項８】請求項７記載の製法において、前記バシラ
ス・サチリスがＣＢＳ４３３．９０である、異質ポリペ
プチド及びタンパク質又はこれらの前駆体の製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT02247690A IT1244477B (it) | 1990-12-21 | 1990-12-21 | Ceppo asporigeno di bacillus subtilis e suo impiego come ospite per la preparazione di prodotti eterologhi |
| IT22476A/90 | 1990-12-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04287686A true JPH04287686A (ja) | 1992-10-13 |
| JP3013008B2 JP3013008B2 (ja) | 2000-02-28 |
Family
ID=11196787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3355272A Expired - Fee Related JP3013008B2 (ja) | 1990-12-21 | 1991-12-20 | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6284490B1 (ja) |
| EP (1) | EP0492274B1 (ja) |
| JP (1) | JP3013008B2 (ja) |
| AT (1) | ATE114171T1 (ja) |
| DE (1) | DE69105188T2 (ja) |
| DK (1) | DK0492274T3 (ja) |
| ES (1) | ES2074208T3 (ja) |
| GR (1) | GR3014979T3 (ja) |
| IT (1) | IT1244477B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7585674B2 (en) | 2001-05-29 | 2009-09-08 | Kao Corporation | Host microorganisms |
| GB0116798D0 (en) * | 2001-07-10 | 2001-08-29 | Secr Defence | Expression system |
| JP5140307B2 (ja) * | 2007-04-10 | 2013-02-06 | 花王株式会社 | 組換え微生物 |
| US8673290B2 (en) * | 2011-03-01 | 2014-03-18 | MYGALAXY Limited Company | Sporulation-deficient B. texasporus cells and methods for efficient and cost-effective inactivation and use thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4302544A (en) * | 1979-10-15 | 1981-11-24 | University Of Rochester | Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system |
| US4450235A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| US4450236A (en) * | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| US4465773A (en) * | 1982-04-21 | 1984-08-14 | Cpc International Inc. | Amylase-negative, asporogenous mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| IE58099B1 (en) * | 1984-06-06 | 1993-06-30 | Cpc International Inc | Amylase-negative, asporogenous mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
| JPH0669377B2 (ja) * | 1985-11-25 | 1994-09-07 | 工業技術院長 | Ｄｎａ塩基配列およびベクタ− |
| GB8727772D0 (en) * | 1987-11-27 | 1987-12-31 | Celltech Ltd | Host cells |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
-
1990
- 1990-12-21 IT IT02247690A patent/IT1244477B/it active IP Right Grant
-
1991
- 1991-12-11 ES ES91121211T patent/ES2074208T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-11 EP EP91121211A patent/EP0492274B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-12-11 DK DK91121211.6T patent/DK0492274T3/da active
- 1991-12-11 DE DE69105188T patent/DE69105188T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-11 AT AT91121211T patent/ATE114171T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-12-19 US US07/810,138 patent/US6284490B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-12-20 JP JP3355272A patent/JP3013008B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-02-08 GR GR940404127T patent/GR3014979T3/el unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| US7655452B1 (en) | 2003-11-11 | 2010-02-02 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Brevibacillus choshinensis and process for prodcuing protein wtih use of the microbe as host |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2074208T3 (es) | 1995-09-01 |
| US6284490B1 (en) | 2001-09-04 |
| EP0492274A3 (en) | 1993-09-22 |
| EP0492274B1 (en) | 1994-11-17 |
| DK0492274T3 (da) | 1995-04-18 |
| IT1244477B (it) | 1994-07-15 |
| EP0492274A2 (en) | 1992-07-01 |
| IT9022476A0 (it) | 1990-12-21 |
| IT9022476A1 (it) | 1992-06-22 |
| JP3013008B2 (ja) | 2000-02-28 |
| GR3014979T3 (en) | 1995-05-31 |
| DE69105188D1 (de) | 1994-12-22 |
| ATE114171T1 (de) | 1994-12-15 |
| DE69105188T2 (de) | 1995-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4302544A (en) | Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system | |
| US4493893A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
| GB2120677A (en) | Asporogentic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| EP0057976B1 (en) | a process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| EP0195078A1 (en) | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels | |
| Niu et al. | High yield recombinant thermostable α-amylase production using an improved Bacillus licheniformis system | |
| GB2095286A (en) | New vectors and a process for transforming certain microorganisms | |
| Kulakova et al. | Plasmid pRTL1 controlling 1-chloroalkane degradation by Rhodococcus rhodochrous NCIMB13064 | |
| CA1150169A (en) | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles | |
| JPWO2005045005A1 (ja) | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 | |
| JPH04287686A (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ | |
| Tokuda et al. | Survival of Bacillus subtilis NB22 and its transformant in soil | |
| US4465773A (en) | Amylase-negative, asporogenous mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| US4450236A (en) | Asporogenic mutant of Bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| US7550281B2 (en) | Method for production of alpha-amylase in recombinant Bacillus | |
| CA1279590C (en) | Recombinant dna, microorganisms containing same and their use in the production of amylases | |
| FI81380B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av amylas-negativ och moejligen sporfri mutant av bacillus subtilis, som aer anvaendbar som vaerd i vaerd-vektorsystem. | |
| Hatada et al. | Induction of pleiotropic mutation in Streptomyces griseus by incubation under stress conditions for mycelial growth | |
| Rincón et al. | Continuous culture to produce recombinant β-galactosidase in Bacillus subtilis | |
| Cheung et al. | An easy method for screening and isolating rod mutants of Bacillus subtilis | |
| Corstjens et al. | Transposon mutagenesis of a manganese-oxidizing Pseudomonas species | |
| JPS62181783A (ja) | 好熱性細菌の染色体に組み込まれる特微を有する変異プラスミド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19991020 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071217 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081217 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091217 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |