IT9022476A1 - Ceppo asporigeno di bacillus subtilis e suo impiego come ospite per la preparazione di prodotti eterologhi - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 CBS 432.90 e il suo impiego come ospite in un sistema ospitevettore per la preparazione di prodotti eterologhi.
E' noto nella tecnica preparare proteine e polipeptidi mediante procedimenti di fermentazione che utilizzano particolari sistemi di produzione, dove con questo termine si intende la combinazione di un vettore ad espressione contenente il gene che codifica per la proteina o il polipeptide e dell'ospite che lo contiene.
La maggior parte dei prodotti ricombinanti attualmente in commercio sono stati ottenuti impiegando sistemi di produzione che utilizzano come ospiti Escherichia coli, cellule CHO o Saccaromyces cerevisiae.
Tali sistemi, tuttavia, non sono compietamente soddisfacenti e, quindi, vi è nella tecnica l'esigenza di disporre di altri sistemi di produzione per la preparazione di prodotti eterologhi che si basano, fondamentalmente, sull'impiego di organismi ospiti quali, ad esempio, batteri come Bacillus e Streptomyces o lieviti e funghi come Kluyveromyces lactis e Yarrowia lipolytica oppure cellule di insetti.
Da un punto di vista industriale, un sistema di produzione ideale dovrebbe consentire la preparazione di un prodotto ricombinante facilmente purificabile, in rese elevate, con una attività biologica identica a quella della proteina naturale e a costi economicamente interessanti.
Un tale sistema dovrebbe essere costituito da:
1) un vettore che contenga degli elementi di regolazione (promotore e terminatore) forti; che sia presente nelle cellule in copie multiple e che sia mantenuto stabilmente all'interno delle cellule in modo da consentire una elevata produzione del prodotto di interesse e
2) un ospite che esegua correttamente le istruzioni fornite per il gene eterologo così da consentire l'ottenimento di una prodotto identico a quello naturale; che sia adatto per una coltura in scala commerciale, cioè resistente, capace di moltiplicarsi a densità elevate e poco esigente per guanto riguarda la richiesta di elementi nutritivi, e sicuro, cioè che non produca contaminanti tossici.
Attualmente vi è una considerevole attenzione per guanto riguarda lo sviluppo di sistemi di espressione per la produzione di prodotti ricombinanti in Bacillus subtilis (B.subtilis) .
B.subtilis , infatti, è un microorganismo particolarmente interessante da un punto di vista biotecnologico per il suo carattere di completa apatogenicità, per la capacità di secernere il prodotto dell'espressione genica nel mezzo di coltura e, infine, per la facilità di essere coltivato su larga scala.
L'uso di B.subtilis come ospite per l'espressione di proteine e polipeptidi eterologhi di interesse per l'industria farmaceutica ed alimentare può quindi risultare un elemento determinante per l'approvazione di processi di produzione di tali prodotti.
Tuttavia, una parziale controindicazione circa l'impiego di questo microorganismo deriva dalla sua capacità di dar luogo alla formazione di spore in determinate condizioni fisiologiche di crescita.
Infatti, le spore, che sono caratterizzate da una elevata resistenza ad agenti chimico-fisici, hanno un'alta probabilità di sopravvivenza nella maggior parte delle normali condizioni ambientali.
Di conseguenza l’impiego di un ceppo ricombinante di B.subtilis in un processo per la produzione di prodotti di interesse in campo farmaceutico ed alimentare, può trovare ostacoli di carattere legislativo quando non venga dimostrata la bassa probabilità che le spore, eventualmente generatesi, si disperdono nell'ambiente esterno.
La formazione dell'endospore in B.subtilis è un processo di differenziazione cellulare che ha luogo attraverso cambiamenti sequenziali della fisiologia della cellula e della sua ultrastruttura come conseguenza di una risposta a condizioni di ristrettezza di nutrienti per la crescita.
Durante la sporulazione, che a 37°C dura mediamente dalle 6 alle 8 ore, la cellula passa attraverso una serie di stadi morfologici ben definiti che terminano con la formazione, all'interno dello sporangio, di una forma cellulare alternativa a quella vegetativa, l'endospora.
Tali stadi definiti convenzionalmente (O-VII), richiedono una serie di prodotti che vengono codificati da geni differenti, detti geni spo-E' noto nella tecnica preparare ceppi di B.subtilis che non producono spore (asporigeni) mediante mutazione di un gene spo con agenti chimici, fisici o l'utilizzo di tecniche di mutagenesi in vitro.
Tali mutanti, che non sono più in grado di portare a maturazione la formazione della spora, possono teoricamente essere impiegati per la preparazione di proteine eterologhe.
Tuttavia, alcuni dì questi mutanti si sono mostrati degli ospiti non completamente soddisfacenti per lo sviluppo di sistemi di espressione asporigeni di B.subtilis, sia per l'instabilità del fenotipo spo , sia per la loro incapacità a mantenere stabilmente il vettore di espressione, sia, infine, per il basso numero di copie del vettore presenti nel ceppo.
E' stato ora isolato un mutante asporigeno di B.subtilis che consente di superare gli inconvenienti sopra riportati. Tale mutante, denominato SMS27S, è stato depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero CBS 432.90.
Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione l'uso di detto ceppo come ospite in un sistema ospite-vettore per la produzione di prodotti eterologhi.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un procedimento per la preparazione di un prodotto eterologo di interesse che comprende, il trasformare il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 con un vettore ad espressione contenente il gene che codifica per detto prodotto eterologo, il coltivare in ambiente di coltura adatto il ceppo Bacillus subtilis SMS275 trasformato e infine il separare e purificare il prodotto dell'espressione genica cosi ottenuto.
In particolare, il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 secondo la presente invenzione è caratterizzato dai marcatori genetici spoii:D , leu (incapacità di crescere in terreno minimo in assenza di leucina), pyrDl (incapacità di crescere in terreno minimo in assenza di uracile), apr e npr (incapacità di produrre la proteasi serinica e la proteasi neutra).
Tale ceppo inoltre è in grado di conservare stabilmente il fenotipo spo , mostra infatti una frequenza di reversione a formare spore inferiore a circa 10-8 , e di mantenere stabilmemte un vettore replicabile ad espressione in un numero di copie elevato.
La strategia utilizzata per la costruzione del ceppo asporigeno secondo la presente invenzione è consistita nel mutagenizzare un ceppo sporigeno di B.subtilis con un trasposone e nell 'isolare i ceppi mutanti asporigeni così ottenuti .
I trasposoni sono elementi di DNA che possono spostarsi ed inserirsi in punti diversi del genoma conferendo al ceppo ospite nuove proprietà ereditarie. Infatti, i trasposoni, che contengono geni che codificano per la resistenza ad antibiotici, dopo inserimento in punti del genoma oltre a provocare una interruzione nella sequenza di un gene, che si manifesta attraverso una mutazione fenotipica, conferiscono all’ospite la resistenza ad un particolare antibiotico.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione è stato utilizzato il trasposone TN917 [Tomich e Clewell, (1980), J. Bacteriol. , 141: 1366-1574] che, tra l'altro, codifica per la resistenza all'antibiotico Eritromicina (Era).
La mutagenesi mediante inserzione con un trasposone può essere condotta mediante coniugazione o trasformazione operando in accordo a tecniche note.
In particolare, il ceppo asporigeno secondo la presente invenzione è stato ottenuto trasformando il ceppo wild type (sporigeno) B.subtilis SMS118 con un plasmide non replicabile in Bacillus contenente il trasposone TN917 e selezionando i ceppi rautagenizzati su un terreno addizionato con eritromicina.
Infatti, teoricamente, solo i cloni in cui è è avvenuta l'integrazione del trasposone TN917 nel DNA cromosomiale del ceppo sporigeno potranno crescere su tale terreno.
Plasmidi adatti agli scopi possono essere, ad esempio, pTVITS, pTV32TS o pTV5lTS (Youngmann et al. "Regulation of Procaryotic development" (ed.) I. Smith, R.A.Slepacky e P.Settlow, American Soc. for Mocrobiology, pag.65-87, 1989). Alternativamente il trasposone TN917 può essere isolato dal plasmide pAD2 [Tomich e Clewell, (1980), J. Bacteriol. , 141: 1366-1574] e introdotto in un plasmide non replicabile in B.subtilis.
L'incapacità dei cloni eritromocina resistenti a sporulare è stata saggiata sia mediante analisi al microscopio ottico che mediante visualizzazione diretta su terreno di sporulazione dove le colonie in grado di sporulare assumono, dopo pochi giorni, una colorazione marrone, mentre quelle asporigene rimangono bianche e tendono a lisare .
Alcuni trasformanti Em resistenti (Emr) analizzati mostravano il fenotipo spo .
Uno dei trasfomanti spo contenente la mutazione nel gene spoII:D, denominato SMS275, è stato ulteriormente caratterizzato per verificare la stabilità del genotipo leu, pyrDl, apr e npr .
L'analisi dei marcatori leu e pyrDl è stata effettuata coltivando il ceppo SMS275 in terreno minimo, in assenza e presenza di leucina e uracile. La capacità del ceppo di crescere solo in terreno contenente entrambi i composti ha confermato la stabilità di detti marcatori.
L'analisi dei marcatori apr e npr
è stata effettuata piastrando il ceppo SMS275 su terreno massimo quale, ad esempio VY o TBAB (DIFCO) , contenente caseina ad una concentrazione dell'1%. L'assenza di alone intorno alle colonie di SMS275 indicava l'incapacità di tale ceppo a produrre le due proteasi.
Infine, si è determinata la stabilità del fenotipo spo del ceppo SMS275 mediante trattamento del ceppo ad alte temperature.
Il saggio si basa sul fatto che ceppi incapaci di generare spore (fenotipo spo ) mostrano una ridotta resistenza a brevi trattamenti ad alta temperatura.
Poiché il trattamento termico distrugge le cellule ma non le spore, le colonie che crescono su piastra saranno quelle derivate dalle spore eventualmente generatesi durante la crescita in terreno liquido ed in grado di germinare quando piastrate su terreno massimo.
A tale scopo il ceppo SMS275 è stato coltivato in terreno di sporulazione a 37°C per circa 24 ore e, poi, sottoposto ad un trattamento termico a 80°C per circa 10 minuti. Quindi opportune diluizioni delle colture sono state piastrate su terreno massimo contenente Kanamicina e Cloramfenicolo e al termine si sono contate le cellule vitali (CFU).
Dall'analisi dei dati è risultato che la frequenza della reversione a fenotipo spo+ del ceppo SMS275 era inferiore a 1x10-8
Il ceppo B.subtilis SMS275 appare quindi particolarmente adatto per l'uso come ospite in un sistema ospite vettore per la produzione di prodotti eterologhi di interesse.
L'attuazione del procedimento secondo la presente invezione consisterà, ad esempio, nel trasformare tale ceppo asporigeno con un vettore replicabile ad espressione contenente il gene che codifica il prodotto eterologo di interesse, nel coltivare il ceppo asporigeno così trasformato in condizioni adatte ed infine nell'isolare e purificare il prodotto dell'espressione genica ottenuto.
Vettori adatti possono essere scelti tra plasmidi che si replicano in B.subtilis e disponibili presso laboratori e centri di raccolta.
La trasformazione delle cellule di B.subtilis SMS 275 con tali vettori è condotta utilizzando una delle tecniche convenzionali.
Il ceppo asporigeno B.subtilis SMS275 può essere utile come ospite per l'espressione di geni che codificano per un polipeptide procariotico quale, ad esempio, un enzima come α-amilasi, β-amilasi etc. o per un polipeptide eucariotico come interleuchina, interferoni, ormone della crescita umano o precursori di questi.
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione il ceppo B.subtilis SMS275 è stato trasformato con il plasmide pSM274 contenente la sequenza di DNA che codifica per il precursore dell'ormone della crescita umano come descritto nella domanda di brevetto italiana N° 23.148 A/87.
Il ceppo trasformato è stato quindi coltivato in ambiente di coltura contenente fonti di carbonio, fonti azotate e sali minerali sino ad una densità ottica di circa 3-4 determinata ad una lunghezza d'onda di 600 nm.
Successivamente si è determinata la stabilità plasmidica e la capacità del ceppo SMS275 (pSM274) a produrre il precursore di hGH.
I risultati hanno confermato la stabilità del plasmide pSM274 che è presente nelle cellule in un numero elevato di copie {fig 1A).
Inoltre, l'analisi elettroforetica delle proteine totali solubili estratte da tale ceppo ha mostrato la presenza della banda corrispondente al precursore dell'ormone della crescita umano.
Ancora, la vitalità del ceppo B.subtilis SMS275 (pSM274) è stata valutata mediante determinazione del numero di cellule vitali per mi (CFU/ml) di una coltura conservata per 6 mesi sotto forma di glicerinato.
I risultati ottenuti hanno mostrato una buona vitalità delle cellule nelle condizioni di mantenimento e la stabilità del fenotipo spo .
II ceppo asporigeno B.subtilis SMS275 contenente il plasmide pSM274 è stato depositato presso il Centraalbureau Voor Schimmelcultures dove ha ricevuto il numero CBS 433.90.
Nell'esempio 4 di confronto si riporta la trasformazione di ceppi di B.subtilis spo ,
differenti da SMS275, con il plasmide pSM274.
Tali ceppi, analizzati per la stabilità e numero di copie del plasmide e per la stabilità del fenotipo spo-, hanno dato i seguenti risultati:
- nel ceppo SMS268, avente la mutazione spo0F, il plasmide pSM274 è strutturalmente instabile;
- nel ceppo SMS270, avente la mutazione spolIAl, il plasmide pSM274 è presente in un numero di copie inferiore rispetto al ceppo wild type SMS118;
nel ceppo SMS272, avente la mutazione spoIIF96, il plasmide è stabile e in un numero di copie confrontabile con quelle del ceppo wild type SMS118. Tale ceppo, tuttavia, tende a riacquistare il fenotipo sporulazione positivo con una frequenza piuttosto elevata, in base ad una stima eseguita mediante osservazione al microscopio.
Inoltre, il ceppo SMS272 mostra una ridotta vitalità rispetto al ceppo SMS275 (pSM274) quando viene conservato sotto forma, ad esempio, di glicerinato.
Infatti, dopo glicerinizzazione, il numero di cellule vitali/ml di coltura era di 3,7x107 CFU/ml; tale valore, dopo 7 giorni, risultava pari al 73%, dopo 19 giorni al 68% e dopo 40 giorni a circa il 54%.
Per tali motivi il ceppo SMS272 non è adatto per un suo impiego in un processo di fermentazione industriale.
Breve descrizione delle figure:
Figura 1 (A e B):
Analisi elettroforetica su gel di agarosio del DNA del plasmide pSM274.
A. 1) pSM274 di controllo non digerito;
2) pSM274 di controllo digerito con EcoRI e HindiII ;
3) DNA plasmidico non digerito estratto dal ceppo SMS275(pSM274);
4) DNA plasmidico digerito con EcoRI e HindlII estratto dal ceppo SMS275(pSM274);
5) standard di pesi molecolari.
B. 1-4) DNA plasmidico estratto da 2 cloni del ceppo spoIID SMS275 (pSM274) dove in 1 e 3 il DNA non è digerito e in 2 e 4 il DNA è digerito con EcoRI e HindlII;
5-8) DNA plasmidico estratto da 2 cloni del ceppo spoIIAl SMS270 (pSM274) dove in 5 e 7 11 DNA non è digerito e in 6 e 8 il DNA è digerito con EcoRI e HindlII;
9) standard di pesi molecolari;
10-13) DNA plasmidico estratto da 2 cloni del ceppo spoIIF96 SMS272 (pSM274) dove in 10 e 12 il DNA non è digerito e in 11 e 13 il DNA è digerito con EcoRI e HindlII;
14 e 15) DNA plasmidico estratto da 1 clone del ceppo spoOF SMS228 (pSM274) dove in 14 il DNA non è digerito e in 15 il DNA è digerito con EcoRI e HindlII;
Figura 2 (A-F):
Analisi elettroforetica su gel di sodiododecil-poliacrilammide (SDS-PAGE) 12,5% delle proteine estratte dal ceppo SMS275 (pSM274).
A) Standard {precursore hGH parzialmente purificato) ;
B) proteine estratte dal ceppo SMS275 trasformato con il plasmide di controllo pSM214, che non contiene la sequenza codificante per il precursore hGH.
C-F) proteine estratte da 4 cloni del ceppo SMS275 trasformato con il plasmide pSM274.
Gli esempi che seguono sono illustrativi e non limitativi per l'invenzione stessa.
Esempio 1
Costruzione del ceppo asporigeno B.subtilis SMS275.
Il DNA plasmidico pTVSTS contenente il trasposone Tn917 (1 ug) è impiegato per trasformare cellule competenti di B.subtilis SMS118 secondo la metodica descritta da Contente e Dubnau (Mol.Gen.Genetics., (1979), 167: 251-258).
Quindi, si selezionano i trasformanti piastrando le cellule su 20 mldi terreno massimo VY (Veal Infusion) (Veal Infusion Broth (DIFCO) 25 g/1, Yeast Extract 5 g/1, e agar (DIFCO) 20 g/1) e, versando sulle piastre 5 ml di agar soffice contenenti 125 ug/ml di eritromicina e incubando le piastre a 37°C per altre 18 ore.
I trasformanti eritromicina resistenti (Emr ), cioè quelli in cui era avvenuta una ricombinazione omologa a livello cromosomiale, sono saggiati per la loro incapacità a generare spore.
A tale scopo le colonie Emr vengono trasferite su piastre di terreno di sporulazione Schaeffer avente la seguente composizione:
pH 7,0, e coltivate a 37°C.
Dopo alcuni giorni si determina la formazione di spore sia mediante osservazione al microscopio ottico, che seguendo l'alterazione morfologica delle colonie.
Le colonie che danno origine a spore, infatti, assumono una tipica colorazione marrone, mentre quelle asporigene rimangono chiare e tendono a lisare.
I risultati ottenuti operando come sopra riportato hanno consentito di isolare alcuni trasformanti Emr con fenotipo asporigeno (spo ).
Uno di questi trasformanti, contenente una mutazione nel gene spoII:D, è stato contrassegnato con la sigla SMS275.
Esempio 2
Caratterizzazione del ceppo SMS275.
II ceppo SMS275 è stato ulteriormente caratterizzato per verificare la stabilità dei marcatori genetici apr , npr , leu, pyrDl, spo .
In particolare si è verificata (i) la bassa attività proteasica presente nel terreno di crescita elei ceppo (indice di una inattivazione dei geni della proteasi serinica (apr) e della proteasi neutra (npr), (ii) l’incapacità del ceppo a crescere su terreno minimo in assenza di leucina e di uracile e (iii) l'incapacità a sporulare. L'attività proteasica è stata determinata piastrando il ceppo SMS275 su terreno massimo VY contenente 1% di caseina (Toma et al., (1986), J.Bacteriol ., 147 :740-743). L'assenza del caratteristico alone di idrolisi intorno alle colonie, dovuto all’azione delle proteasi serinica e neutra, è indice della mancata secrezione dei due enzimi.
Nessuna delle colonie isolate dal ceppo SMS275 presentava l’alone di idrolisi.
In relazione invece alle richieste nutrizionali di .leucina (leu) e di uracile (purDl), gli esperimenti di controllo sono stati eseguiti piastrando il ceppo su terreno minimo avente la composizione riportata da P.Youngman, (1986), in "Plasmids: a practical approach" K.G. Hardy (ed.), IRL Press, 79-103], privo di fattori di crescita, in terreno minimo contenente solo leu (50 ug/ml), in terreno minimo contenente solo uracile (50 ug/ml) e in terreno minimo contenente entrambi i prodotti.
La crescita veniva osservata solo sul terreno contenente entrambi i fattori nutrizionali, confermando cosi la stabilità dei marcatori genetici leu e pyrDl.
Infine, si è determinata la quantità di spore, eventualmente generatesi, rispetto alla quantità totale di cellule e, contemporaneamente, si è verificata la stabilità del fenotipo spo- in assenza della pressione selettiva imposta dall 'eritromicina.
L'analisi si basa sul fatto che ceppi incapaci di generare spore mostrano una ridotta resistenza a brevi trattamenti ad alta temperatura.
Due beute da 100 mlcontenenti ciascuna 10 mi di terreno liquido di sporulazione Schaeffer sono inoculate, rispettivamente, con il ceppo SMS275 e con il ceppo sporigeno SMS118 (controllo) e incubate prima a 37°C per 24 ore e poi a 80°C per 10 minuti.
Quindi aliquote di tali colture vengono opportunamente diluite e 0,1 mldi tali diluizioni sono piastrate su terreno massimo VY addizionato con gli antibiotici. Dopo crescita a temperatura ambiente si effettua la conta delle cellule vitali (CFU) prima e dopo trattamento a 80°C.
Poiché il trattamento termico distrugge le cellule ma non le spore, le colonie cresciute su piastra saranno quelle derivate dalle spore eventualmente generatesi durante la crescita in terreno liquido a 37°C ed in grado di germinare quando piastrate su terreno massimo.
La tabella I mostra i risultati dell'esperimento espressi come CFU/ml.
TABELLA I
I valori riportati in tabella rappresentano una
media di tre determinazioni,
t.q.: coltura non diluita (0,1 ml);
- : prima del trattamento termico
: dopo trattamento termico
Dall'analisi dei dati si osserva che:
(i) il numero di cellule presenti per le colture a 37°C dei ceppi SMS118 e SMS275 è, rispettivamente, di 1,9x108 CFU/ml e di Ix108 CFU/ml;
(ii) la frequenza di reversione a fenotipo spo+ del ceppo SMS27 5 è inferiore a 1x10-8 ed il rapporto tra la percentuale di sopravvivenza al trattamento termico di SMS275 rispetto a SMS118 è inferiore allo 0,001%;
(iii) la quantità di spore che si formano dopo 24 ore a 37°C e in grado di germinare su terreno massimo è pari a 1,4x105 per il ceppo sporigeno SMS118 e pari a 0 per il ceppo asporigeno SMS275.
Poiché la coltura in terreno liquido a 37°C è stata condotta in assenza di eritromicina, la completa assenza di colonie per SMS275, dopo trattamento termico a 80°C, è indicativa dell'alta stabilità del carattere spo- acquisito da detto ceppo SMS275.
Infatti le cellule che potrebbero aver perso il trasposone hanno tuttavia mantenuto il fenotipo asporigeno.
Esempio 3
Trasformazione del ceppo SMS275 con il plasmide PSMS274.
Cellule competenti di B.subtilis SMS275 sono trasformate con il plasmide pSM274 (10 nanogrammi (ng)) ed i·trasformanti sono poi selezionati su piastre di terreno massimo VY contenenti 5 ug/ml di kanamicina e 5 ug/ml di cloramfenicolo a 37°C per 18 ore.
Una aliquota del DNA plasmidico isolato da uno dei cloni resistenti secondo la procedura di estrazione rapida descritta in "Recombinant DNA Techniques: an introduction" [(eds) Rodiguez e Tait, (1983), Addison-Wesley Publishing Company, 164] è digerita con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindlII (BRL) operando secondo le istruzioni della casa fornitrice
Quindi 2 μl del DNA plasmidico digerito e 2 μΐ dello stesso DNA non digerito sono caricati su gel di agarosio allo 0,8% insieme al plasmide pSM274 (2 μl) trattato o meno con gli stessi enzimi (controllo) e a degli standard di pesi molecolari .
I risultati riportati in figura 1 A mostrano che il plasmide pSM274 isolato dal clone B.subtilis SMS275 e digerito con gli enzimi di restrizione mostra la velocità di migrazione attesa ed un pattern di digestione in accordo con quello del pSM274.
Infatti, dopo decolorazione con Bromuro di Etidio sono risolte due bande corrispondenti a due frammenti con una lunghezza di 6700 bp e 800 bp che corrispondono, rispettivamente, al vettore plasmidico e all'inserto codificante per il precursore dell'ormone della crescita umano.
La capacità del ceppo B.subtilis SMS275 (pSM274) di produrre il precursore di hGH è stata verificata coltivando tale ceppo in 10 ml di terreno VY a 37°C per 18 ore e analizzando, successivamente, le proteine totali solubili estratte dalle cellule U sate, mediante elettroforesi su SDS-PAGE 12,5% e colorazione con Coomassie Blue. In figura 2 si osserva la presenza nell'estratto proteico della banda corrispondente al precursore dell'ormone della crescita umano. Esempio 4 (confronto)
Trasformazione di ceppi asporigeni contenenti le mutazioni spoIIF96, spoIIAl e spoOF.
I ceppi asporigeni B.subtilis SMS268, SMS270 e SMS272, contenenti rispettivamente le mutazioni spoIIF96, spoIIA1 e spoOF, sono trasformati con il plasmide pSM274 e poi esaminati per verificare la stabilità plasmidica, la presenza del numero di copie del plasmide e la stabilità del fenotipo spo- .
Come è evidenziabile dalla figura 1B, nel ceppo avente la mutazione spoOF il plasmide pSM274 appare instabile, mentre nel ceppo con mutazione spoIIAl il plasmide è presente in un più basso numero di copie rispetto a quelle presenti nel ceppo SMS118.
Al contrario, il ceppo spoIIF96 mantiene il plasmide stabilmente e in un numero di copie confrontabile con il ceppo SMS118.
Tale ceppo, tuttavia, quando saggiato per la verifica della stabilità del fenotipo spo , mostra la tendenza a riacquistare il fenotipo sporulazione positivo con una frequenza piuttosto elevata, in base ad una stima eseguita mediante osservazione al microscopio.
Esempio 5
Analisi della vitalità dei ceppi asporigeni SMS275 e SMS272.
Allo scopo di verificare la vitalità del ceppo SMS275, sono state preparate quattro banche cellulari sotto forma di glicerinati.
In pratica si preparano due precolture da 100 mi del ceppo SMS275 (pSM274) e del ceppo SMS272 (pSM274) (confronto) in terreno TYM avente la seguente formulazione:
Le beute, agitate a 220 rpm, sono incubate a 37°C per 24 ore.
Quindi 100 mldi ciascuna precoltura (densità ottica iniziale (O.D.) 0,190 a 660 nm) vengono inoculati in due fermentatori con una capacità di 2 1 contenenti ciascuno 1 litro di terreno TYM.
La fermentazione è condotta a 800 rpm, pH 7,0 con un ricambio dell'aria di 0,5 v/v/minuto.
Le cellule sono recuperate mediante centrifugazione del mezzo di coltura dopo 15 ore di fermentazione ad una O.D. di 3,0.
Quindi campioni da 2 ml ciascuno vengono addizionati con glicerolo ad una concentrazione finale del 15% e poi conservati a - 80°C.
Dopo 6 mesi dalla data di preparazione si determina il titolo delle cellule vitali (Colony Forming Units - CFU) dei glicerinati. Il saggio consiste nel diluire aliquote del glicerinato in terreno di crescita e nel piastrare, immediatamente, 0,1 ml di tali diluizioni su terreno massimo di crescita agarizzato TBAB (DIFCO) contenente o meno gli antibiotici Kanamicina e Cloramfenicolo.
Il numero di cellule vitali per mldi glicerinato risulta per SMS275 (pSM274) di 2,4xl08 CFU/ml eseguendo l'analisi sia in presenza che in assenza degli antibiotici kanamicina e cloramfenicolo.
Tali risultati indicano una buona stabilità e vitalità delle cellule SMS275 nelle condizioni di mantenimento utilizzate.
I valori di CFU ottenuti per SMS272 (pSM274) mostrano, invece, una ridotta vitalità.
Infatti, dopo glicerinizzazione, sono state misurate 3,7x107 CFU/ml. Tale valore, dopo 7 giorni, scende al 73%, dopo 19 giorni al 68% e, dopo 40 giorni, al 54% circa.
Le colture del. ceppo SMS275 (pSM274), analizzate come riportato negli esempi 2 e 3, mostrano, inoltre, una stabilità plasmidica e l'integrità della sequenza del gene che codifica per il precursore dell'hGH.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 caratterizzato da una frequenza di reversione a formare spore inferiore a circa 10-8 e dai marcatori genetici leu, pyrDl, apr e npr e spoII::D depositato come CBS 432.90 2. II ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 secondo la rivendicazione 1, per l'uso come ospite in un sistema ospite-vettore per la preparazione via DNA ricombinante di polipeptidi e proteine eterologhe o loro precursori. 3. Il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 secondo la rivendicazione 2, in cui il vettore è un plasmide ad espressione in Bacillus subtilis comprendente un gene che codifica per un polipeptide o una proteina eterologa o precursori di questi. 4. Il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 secondo la rivendicazione 3, in cui il plasmide contiene il gene che codifica per un precursore dell'ormone della crescita umano. 5. Il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 secondo la rivendicazione 4, in cui il plasmide è pSM274 CBS 75288. 6. Il ceppo asporigeno Bacillus subtilis SMS275 (pSM274) secondo la rivendicazione 5, depositato come CBS 433.90. 7. Procedimento per la preparazione di polipeptidi e proteine eterologhe o precursori di questi che comprende, il coltivare in ambiente di coltura adatto contenente fonti di carbonio, fonti azotate, sali minerali, leucina e uracile il ceppo Bacillus subtilis SMS275 secondo la rivendicazione 1 trasformato con un vettore ad espressione in Bacillus comprendente un gene che codifica per detti polipeptidi o proteine eterologhe o precursori di questi e il recuperare il prodotto dell'espressione genica. 8. Il procedimento secondo la rivendicazione 6, in cui Bacillus subtilis è CBS 433.90.
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