NO153305B

NO153305B - Fremgangsmaate for aa transformere sporogen bacillus subtilis rub 830 til asporogen bacillus subtilis rub 331 som er anvendelig som en vert i et vert-vektor system

Info

Publication number: NO153305B
Application number: NO802937A
Authority: NO
Inventors: Frank E Young; Gary A Wilson; Susan L Mottice
Original assignee: Univ Rochester
Priority date: 1979-10-15
Filing date: 1980-10-03
Publication date: 1985-11-11
Also published as: IL60815A; DK434480A; NO802937L; IL60815A0; ZA805690B; EP0029497B1; DE3070026D1; US4302544A; ATE11429T1; NO153305C; ES495910A0; EP0029497A1; JPS5661990A; ES8106932A1

Description

Det er vel kjent at den genetiske informasjon hos alle celler er lagret i deoksyribonukleinsyre (DNA) i organismens kromo-somer. Enheten for genetisk funksjon, dvs. stedet på kromosomet som er forbundet med et spesifikt arvelig trekk, kalles et gen.

Rekombinant DNA teknikk omfatter overføring av genetisk materiale (gener) fra en organisme til en annen organisme og kopiering av de rekombinerte materialer i bakterie- og dyre-celler. Cellen som det rekombinerte genetiske materiale inn-føres i, betegnes verten.

I 1950-årene ble det oppdaget at bakterieceller inneholder sirkulære ekstrakromosomale DNA-molekyler, kalt plasmider,

i tillegg til hoved-DNA-molekylet. Plasmidene inneholder en serie gener som er bundet sammen i sirkulær form. Plasmidene er små, lette å håndtere i laboratoriet og tar med letthet plass i andre bakterier. Plasmider er DNA-molekyler som aksepterer DNA-fragmenter, og de utgjør vektorkomponenten i vert-vektor-systemet. Senere ble det oppdaget at bakterieceller inneholder restriksjonsenzymer som fungerer som "kjemiske skalpeller" ved at de splitter DNA-molekylet i spesifikke fragmenter som vanligvis inneholder fra mindre enn 1-10 gener hver. Disse genetiske fragmenter er det genetiske materiale som innføres i vektoren. Kombinasjonen av DNA-fragmentet og vektoren kalles rekombinant DNA. Re-striks jonsenzymer deler opp viralt DNA på samme måte som de deler opp plasmid-DNA. Vira utgjør en annen type vektorer.

Ved å bruke rekombinant DNA teknikk kan genetisk utveksling mellom bakterier utføres på følgende måte. Plasmid- eller viralt DNA isoleres først. Plasmid-DNA gjøres deretter lineært ved å oppdele det på et enkelt sted, enten ved bruk av restriksjonsenzymer eller ved andre midler. DNA som skal innføres i vektoren, f.eks. kromosomalt DNA, deles så opp med restriksjonsenzymer eller ved hjelp av andre vel kjente teknikker som er utviklet for å bryte DNA opp i fragmenter. Et fragment for den ønskede genetiske karakteristikk innføres deretter i det splittede plasmid (vektor-DNA-ringen). Ved behandling med enzymet DNA-ligase, knyttes endene sammen, og et rekombinant plasmid-DNA-molekyl er dannet. Det rekombi-nante plasmid-DNA-molekyl inneholder genene fra bakterie-plasmidet pluss de nye genene fra"fragmentet som er innført. Dette plasmidet kan så innføres i en bakterievert. De nye genene kopieres og blir en del av bakteriens genetiske maskineri. For å kunne anvendes i rekombinant DNA teknikk, må mikroorganismen (verten) være i stand til å bli transformert. Dvs. at den selv må være i stand til å inkorporere DNA og gi en levedyktig mikroorganisme som er i stand til

å utvikle de trekkene som er innkodet av de nyinnførte genene. På denne måten kan mikroorganismen (verten) inkorporere ønskelige genetiske karakteristika fra andre organ-ismer.

Det har vært klart helt fra begynnelsen av eksperimenter-ingen i rekombinant DNA teknikk, at nye genkombinasjoner kan ha et potensial for biologisk risiko i det at nye mikroorganismer med evne til å utskille produkter som er skade-lige for mennesker, planter eller dyr, kan bli fremstilt.

I den hensikt å forhindre spredninger av potensielt farlige mikroorganismer, ble passende vernetiltak iverksatt.

Vern mot stoffer som har en potensiell biologisk risiko

kan oppnås på forskjellige måter. I 1978 utga direktøren for National Institute of Health, USA, "Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules" (FR. 4360108), som inneholder bestemmelser om vernetiltak. Fysiske vernetiltak består i å bruke et sett av mikrobiologiske standarder som er blitt utviklet gjennom flere år i forbindelse med håndtering av patogene mikroorganismer i forskning og i kliniske laboratorier. En like så viktig fremgangsmåte, fordi den bidrar meget klart til å begrense spredningen av et hvert stoff med biologisk risiko, er bruken av biologiske vernetiltak. Biologiske vernetiltak kan defineres som

bruken av vertceller og vektorer med begrensede muligheter til å overleve utenfor svært spesielle og finjusterte forhold som kan opprettholdes i laboratoriet, men som det er lite sannsynlig at mikroorganismer som er unnsloppet vil møte i naturlige omgivelser. Retningslinjene fra NIH fastsetter nivåer for biologiske vernetiltak for vert-vektor-systemer (kalt HV) avhengig av hvilken mikroorganisme og hvilken DNA som brukes. HVI, defineres som et "vert-vektor-system" som gir et moderat vernenivå.

I 1979 utga NIH "Actions" (FR. 4471) under de nevnte "Guidelines", som inkluderte kriterier for vurdering av Bacillus subtilis i forbindelse med godkjenning som vert i et HV1-system. De nevnte "Actions" fastslo at: "Asporogene mutanter avledet fra B. subtilis kan aksepteres som vertkomponenter i et HVl-system. Mutantene må ikke vende tilbake til sporogen form med en frekvens større enn 10 ^. Data som oppfyller dette kravet må legges fram for NIH for godkjennelse."

Det ble lagt vekt på å eliminere sporedannelsen hos mutantene ettersom visse Bacillus-arter har utviklet en spesialisert mekanisme for overleve som omfatter dannelsen av sporer. Sporer eer i en tilstand av latent liv uten noen metabolsk aktivitet og med en forhøyet resistens mot den dødelige effekten av varme, tørking, frysing, ødeleggende kjemikalier og bestråling. For å være mottagelig for biologiske vernetiltak kan Bacillus-mikroorganismene ikke være i stand til å fungere som fullgode sporedannere.

Oppfinnelsen vedrører altså en fremgangsmåte for å transformere sporogen Bacillus subtilis RUB 830 til asporogen Bacillus subtilis RUB 331 som er anvendelig som en vert i

et vert-vektor-system, idet fremgangsmåten er karakterisert ved inkubering av Bacillus subtilis RUB 830 i et egnet vekstmedium med donor DNA fra Bacillus subtilis 168T<+> (vill-type) og isolering av kolonier transformert til Bacillus subtilis RUB 331.

Litteraturen om sporulering og frembringelse av mutanter er omfattende. Frembringelsen av mutanter, inkludert asporogene mutanter, er beskrevet i Bacteriological Reviews, vol. 33, 1969, s. 48-71, og vol. 40, 1976, s. 908-962. Også i J. Bacteriol., vol. 81, 1961, s. 823-829, beskrives transformasjonen av B. subtilis. Disse referansene angår ikke fremstillingen av en asporogen mutant med fenotypekarakteristikaene.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av

en ny asporogen mutant av B. subtilis som tilfredsstiller kravene til NIH for godkjennelse som vert i et HVl-system. Mutanten ble fremstilt ved å inkorporere donor-DNA i en sporedannende B. subtilis-stamme og derved oppnå den nevnte asporogene B. subtilis med de følgende karakteristika: gjennomskinnelig fenotype på tryptose-blod-agar-plater,

men ikke på Spizizens minimalagarmedium supplert med glukose, en transformasjonsfrekvens med lineært eller kovalent lukket, sirkulært DNA på opptil 2%, lyserer i et komplekst medium, levedyktighet redusert til 0 CFU/ml etter tørking ved romtemperatur i ca. 12 timer og tilbakevendingsfrekvehs til sporedannere på mindre enn 10 ^ under forhold med minimal lufting og med det beskrevne vekstmedium.

B. subtilis-organismen fremstilt ifølge oppfinnelsen er de-ponert hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og har fått identifikasjonsnummer ATCC 31578. Kulturen er ålment tilgjengelig uten restriksjoner. Opp-havsst.ammen er beskrevet tidligere, og både RUB 830

(Williams, M.T. og Young, F.E., J. Virol., vol. 21, 1977,

s. 522-529) og B. subtilis 168T<+> (Bott. K.F. og Wilson, G.A. Bacteriol. Reviews, vol. 32, 1968, s. 370-378), (Wilson, G.A. og Young, F.E., J. Bacteriol., vol. 111, 1972, s. 705-716)

har vært ålment tilgjengelige fra forskernes egne samlinger.

Den asporogene stamme fremstilt ifølge oppfinnelsen er en stamme med stor evne til å transformeres genetisk med fre-kvenser på opptil 2%. Transformasjonen kan utføres enten med plasmid- eller med kromosomalt DNA. Tilbakevendings--7

frekvensen til sporedannere er mindre enn 10 . Stammen oppviser en markert følsomhet overfor effekten av tørking ved romtemperatur sammenlignet med sporedannende Bacillus. Under sporuleringsforhold, hvor opphavsstammen oppviser 20-80% sporulering, er det ikke blitt påvist sporulering hos mutantstammen. Ved dyrking under forhold som kreves for sporulering hos opphavsstammen, slik som beskrevet nedenfor, blir dessuten 90% av mutantstammen ikke-levedyktig.

B. subtilis RUB 331 (ATCC 31578) ble fremstilt fra B. subtilis RUB 830 ved å inkorporere DNA fra B. subtilis 168T<+> (vill-type) ved den følgende fremgangsmåte.

Eksemp_el

Transformasjonen av den opprinelige, sporedannende stamme

RUB 830 (pheAl, trpC2, thyAl, thyBl) til den asporogene

stamme RUB 331 ved inkorporering av DNA erholdt fra B. subtilis 168T<+> (vill-type), dvs. phe<+>, trp<+>, thy<+>, ble utført på følgende måte.

B. subtilis RUB 830 ble inkubert natten over i et vekstmedium (kalt GML) ved 32°C, GML inneholdt: 10 ml Spizizens mineralmedium supplert med 22 mM glukose, 0,02% syrehydroly-sert kasein, 0,1% gjærekstrakt og 500 yg hver av fenylalanin, tryptofan og tymidin. Spizizens minimalmedium er en oppløs-ning av (a) ammoniumsulfat - 0,2%, (b) dibasisk kaliumfosfat

- 1,4%, (c) monobasisk kaliumfosfat - 0,6%, (d) natriumcitrat

- 0,1% og (e) magnesiumsulfat - 0,02%, pH regulert til 7,4 (Spizizien, J., Proceedings National Academy of Sciences,

vol. 44, 1958, s. 1072-1078). Kulturen med RUB 830 ble fortynnet to ganger med friskt GMI 12 timer senere og inkuba-sjonen ble fortsatt ved 37°C inntil kulturen nådde en stasjo-nær vekstfase. 90 minutter senere ble kulturen fortynnet 10 ganger i et vekstmedium kalt GM2. GM2 er identisk med GMI med unntak av at CaC^ og MgCl2 ble tilsatt for å bringe sluttkonsentrasjonene til henholdsvis 5 og 2,5 mM. Inkuba-sjonen ble fortsatt i 60 minutter før donor-DNA ble tilsatt.

Donor-DNA ble erholdt fra B. subtilis 168T<+> (vill-type) ved den følgende fremgangsmåte.

Vill-stammen av B. subtilis som ble benyttet for å oppnå donor-DNA, ble dyrket i et peptonmedium ("Difco Penassay Broth"). Etter inkubasjon i 12 timer under rysting ved 37°C ble cellene utvunnet ved sentrifugering og vasket to ganger med og resuspendert i en buffer som besto av en oppløsning av 20 mM trihydroksymetylaminometan ("Trizma Base") og 20 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved pH 7,0.

Cellesuspensjonen ble lysert ved inkubering med krystallinsk eggehvitelysozym (1 mg pr. ml) i 30 minutter ved 37°C. Pro-tein ble fjernet fra lysatet ved behandling med natriumlaurylsulfat (sluttkonsentrasjon 1%) i 1 time ved 37°C.

DNA ble felt ut med 70% kald etanol og suspendert i en opp-løsning som inneholdt 10 mM "Trizma Base" og 1 ml EDTA ved pH 7,4. Det er kjent at sporemutasjoner oppstår i nærheten av den sonen i kromosomet som koder for biosynteseenzymene for fenylalanin. Den følgende fremgangsmåte ble brukt for å transformere mikroorganismen RUB 830.

En 0,1 ml prøve av DNA-oppløsningne ble tilsatt til 0,9 ml RUB 830 kultur og inkubert i 30 minutter ved 37°C under lufting. Cellekulturen ble fortynnet i Spizizens minimalmedium. Prøver (0,1 ml) ble fordelt på plater av Spizizens minimalagarmedium (supplert med 22 mM glukose, 1 mg/plate tymidin og 0,4 mg/plate tryptofan) for å velge ut celler transformert til uavhengighet av fenylalanin (phe<+>).

Det ble observert kolonier som var transformert til fenyl-alaninuavhengighet, og som var enten hyperpigmentert (rød-brune) eller ikke-pigmentert (hvitaktige) i motsetning til pigmenteringsnivået (brunt) som var observert hos opphavskoloniene. Disse koloniene ble isolert ved videre-dyrking på individuelle plater inneholdende det samme medium som beskrevet ovenfor. Koloniene ble også videredyrket på et peptonmedium av tryptose-blod-agar-plater (TBAB).

Medier som TBAB eller pepton er ikke definert kjemisk og refereres til som komplekse medier. TBAB-platene ble fremstilt fra en agarbase ("Bacto Tryptose Blood Agar Base"). Disse koloniene ga en karakteristisk gjennomskinnelig fenotype av asporogene stammer på tryptose-blod-agar-plater (TBAB), men ikke på Spizizens minimalagarmedium med glukose. (Se Bacteriol. Reviews, vol. 40, 1976 , s. 908-962.)

Både de ikke-pigmenterte mutanter og de hyperpigmenterte mutanter var asporogene. De ikke-pigmenterte isolatene syntes å være mindre hardføre enn de hyperpigmenterte isolatene.

Et hyperpigmentert isolat ble valgt ut og kalt RUB 331. Genotypen til denne stammen er trpC2, thyAl, thyBl, spo-331.

SåEåJSter^sering^v^^subtili^RUB^^i

1 • Transf 2SB§siionsf rekvens.

For å kunne fungere effektivt som vert i forbindelse med rekombinant DNA teknikk, må mikroorganismen ha evne til å transformeres, dvs. at den må ha evnen til å inkorporere DNA og danne levedyktige mutantorganismer. Mikroorganismen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan transformeres både ved hjelp av lineært og ved hjelp av kovalent lukket, sirkulært DNA.

Transformasjonsfrekvenser på over 0,01% er i den tidligere kjente teknikk blitt funnet å være akseptabel. Ved fremstillingen av asporogene mutanter er det generelt funnet at prosenten av transformasjonen som kan oppnås, avtar. Generelt forblir stammer som er egnet for transformasjon, resistente mot lysering i et komplekst medium. Denne resi-stensen er uønsket ettersom evnen til å lysere vil minske spredningen av mikroorganismen fra et laboratoriemiljø.

Som beskrevet nedenfor, lyserer stammen RUB 331 lett i et komplekst medium og kombinerer dermed de ønskede trekk med lysering og asporogenitet med en høy transformasjonsgrad. Transformasjonsfrekvensen ble bestemt ved å bruke både DNA fra B. subtilis 168T<+> (0,5-2,0 yg/ml) som er lineært, og sirkulært, kimært plasmid pCDl (0,1-65 yg/ml) som kilde for donor-DNA,

og å måle antallet dannede, levedyktige nye celler ved å velge ut en genetisk "markør" som kan måles kvantitativt.

a) Transformas2on_med_lineært_DNA.

Lineært DNA fra B. subtilis 168T<+> (vill-type) ble ^isolert som

beskrevet foran under fremstillingen av RUB 331. Transformasjonen av RUB 331 ved inkorporering av DNA fra B. subtilis 168T+ (vill-type) ble utført på samme måte som beskrevet foran med unntak av at seleksjonen var for tymidinuavhengig-het ved å utelukke tymidin fra vekstmediet. Transformasjonsfrekvensen ble bestemt ved utstrykning av enprøve av kulturen på vekstmedier med og uten tymidin. Transformasjonsfrekvensen uttrykkes ved forholdet mellom antall kolonier som krever tymidin for vekst og antall kolonier av transformerte celler som ikke krever tymidin på grunn av inkorporering av det genet som koder for tymidylatsyntetase.

Ved å bruke denne teknikken ble de følgende transformasjonsfrekvenser oppnådd.

b) Transformasion_med_sirkulært_DNA.

Plasmidet pCDl ble brukt som kilde for sirkulært DNA.

Isoleringen av og strukturen til dette plasmidet er beskrevet i Gene., vol. 1, 1977, s. 153-167. Transformasjonsfremgangs-måten og bestemmelsen av transformasjonsfrekvensen var identisk med det som er beskrevet ovenfor for lineært DNA.

De følgende transformasjonfrekvenser ble oppnådd. ,

Resultatene som er gjengitt i tabellene I og II indikerer

at selv ved lave konsentrasjoner av DNA, egner RUB 331 seg for bruk som en mutant i stand til å transformeres. 11. Levedyktighet •

En fordelaktig egenskap hos en mikroorganisme egnet for bruk som vertkomponent i et vert-vektor-system, er at den har begrensede overlevelsesmuligheter dersom den slipper ut til om-givelsene. Selv under de mest fordelaktige vekstbetingelser har RUB 331 små muligheter til å overleve sammenlignet med opphavsstammen. Dette ble undersøkt direkte ved å sammen-ligne levedyktigheten til RUB 331 med levedyktigheten til opphavsstammen RUB 830 ved å dyrke cellene i det følgende fordelaktige vekstmedium. Celler ble dyrket i en nærings-oppløsning ("M broth") som er satt sammen av et pepton- og gjærekstrakt. Næringsoppløsningen ble fremstilt ved å

blande 10 g "Difco tryptone", 5 g "Difco gjærekstrakt" og 9,9 g natriumklorid pr. liter destillert vann supplert

-4

med 10 M jernnitrat. Levedyktigheten ble bestemt i dette medium og sammenlignet med levedyktigheten i det samme medium tilsatt glukose. Som beskrevet nedenfor, ble levedyktigheten prøvet på TBAB-plater supplert med 2 mg/

plate tymidin. Levedyktigheten måles som kolonidannende enheter/ml (CFU/ml).

For hver kultur ble levedyktigheten normalisert til 100%

for seks-timers-verdien. Seks-timers-verdien for stamme RUB 331 var 5,1 x 10 7kolonidannende enheter (CFU/ml),

for RUB 331 i glukose var den 2,6 x IO<7> CFU/ml, for RUB 830 var den 1,3 x 10 Q CFU/ml og for RUB 830 i glukose var den 3,0 x IO<7> CFU/ml.

Figur 1 illustrerer levedyktigheten for RUB 830 og RUB 331 etter 6, 12- og 36 timers inkubering i "M broth" supplert med

-4 10 M Fe(N03)3) med og uten 0,5% glukose tilsatt. Som det sees av figur 1, avtar levedyktigheten for RUB 331 raskt under begge disse fordelaktige vekstforhold fra en maksimumsverdi som vanligvis nåes etter 6-12 timers inkubering. Levedyktigheten for RUB 830 øker derimot fortsatt etter 36 timer i nærvær av glukose.

III. Tilbakevendings f rekvens_til_sp_oredanner.

Mange mutanter som er svekket i sin evne til å danne sporer, og som kalles asporogene, danner faktisk sporer med lav frekvens som et resultat av "lekkasje" i den opprinnelige mutasjon.

Denne "lekkasjen" resulterer i varmeresistente sporer som bibeholder den opprinnelige mutasjon. Som et resultat av dette, er det nødvendig å skille mellom sporuleringsfrekvens ("lekkasje") og tilbakevendingsfrekvens for mutasjonen, som avspeiler mutasjonens stabilitet.

Hos de fleste asporogene stammer er det ikke mulig å måle tilbakevendingsfrekvensen, selv om dette er kriteriet som forlanges oppfylt av NIH for godkjennelse av en B. subtilis som HVl-vert. Mutantstammeri RUB 331 er enestående i det at det er mulig å fastslå tilbakevendingsfrekvensen uav-hengig av sporuleringsfrekvensen. Dette er mulig på grunn av kolonienes morfologi, dvs. fordi RUB 331 er gjennomskinnelig på TBAB-plater, mens opphavsstammen eller de tilbakevendte stammene ikke er det. I alle undersøkte tilfeller samsvarte tilbakevendingen til opake, store kolonier med tilbakevendingen til sporedannende bakterier. Tilbakevendingsfrekvensen ble målt med Newcombe's sprednings-metode (Nature, vol. 164, 194 6, s. 150) ettersom denne metoden har flere fordeler. Den er ikke bare tiltalende enkel, men den påvirkes heller ikke av forskjeller i vekstgraden hos mutant og vill-type-bakterie. Selv om mutantstammén har en gjennomskinnelig fremtreden på komplekse media, er det nød-vendig å fastslå om vill-type-kloner vil være utskillbare i en blandingskultur av mutante bakterier. For å undersøke dette ble mutant- og vill-type-bakterier blandet i varierende forhold. Opake vill-type-kolonier var klart utskillbare når de ble utstrøket i nærvær av 1,5 x 10 6 eller 1,5 x 10<3 >mutante, gjennomskinnelige RUB 331 celler. Dessuten var det ikke noen forskjell mellom antall vill-type-celler observert på kontrollplatene som ble utstrøket uten mutantceller og de som ble utstrøket med mutantceller. Disse resultatene indikerte at mutantcellene ikke forårsaket lyseringen av vill-type-cellene og fastslo klart at Newcombe-metoden kunne brukes for å bestemme tilbakevendingsfrekvensen. Celler ble rutinemessig utstrøket på TBAB-plater og inkubert ved 37°C i 5 timer. Deretter ble en serie av plater påført 0,1 ml minimalsaltoppløsning og reinkubert over natten.

1 time senere ble en annen serie med plater påført vekstmedium og reinkubert. Økningen i levedyktighet mellom 5

og 6 timer ble bestemt ved å suspendere koloniene fra re-presentative plater i 2 ml minimalsaltoppløsning og de resulterende fortynninger utstrøket. Mutasjonsgraden

(eller tilbakevendingsforholdet) ble utregnet ved hjelp av følgende formel (Newcombe)

hvori M-^ og M- er antallet vill-type-kloner som har oppstått på plater ved undersøkelse etter 5 og 6 timer, og N^ og N 2

er det tilsvarende totalantall bakterier på disse tidspunkter. Fra en serie plater hvor 1,3 x 10 CFU opprinnelig ble ut-strøket pr. plate, var tilbakevendingsfrekvensen 7 x 10

En tilsvarende verdi på 9 x IO<-10> ble observert, når platene ble utstrøket med 1,5 x IO<6> CFU. Disse verdier er godt innen-for grensene for tilbakevendingsfrekvensen til sporedannere for asporogene mutanter av B. subtilis satt av NIH's "Recombinant DNA Advisory Committee".

IV. A<sporoge>nit<etsgrenser.>

Det er vanskelig å fastlegge sporuleringsfrekvenser for stamme RUB 331 på grunn av avtagende levedyktighet i sporu-leringsmedia- sammenlignet med vill-type-stammer. Som rede-gjort for tidligere, sammenligner dataene vist i fig. 1 levedyktigheten til RUB 830 og RUB 331 etter 6, 12 og 36 timers

-4

inkubering i "M broth" (supplert med 10 M Fe(N03)3 med og uten 0,5% glukose tilsatt. Levedyktigheten for RUB 331 er ikke funnet å overskride 2 x 10 Q CFU/ml under disse forhold, og avtar hurtig fra en maksimumsverdi som vanligvis oppstår etter 6-12 timers inkubering. Opphavsstammen RUB 830 vil ikke sporulere under disse forhold etter 12 timer, men trenger minst 24 timer for 20-100% sporulering. Minsking av luftingsmengden under dyrkingen av RUB 331 ved å inkubere stammen i et prøverør i stedet for i en Erlenmeyerflaske, muliggjorde fastleggingen av sporuleringsfrekvenser etter 24 timer ved forsiktig å inhibere cellelyseringen. Det var fremdeles nødvendig å sentrifugere cellene før utstrykning på plater for å sikre at et tilfredsstillende antall celler var tilstede. Det var også nødvendig å tilsette 1% natriumlaurylsulfat til prøvene før oppvarming for å

få reproduserbare resultater av sporuleringen. Dette skyldtes varmeindusert koagulering av cellulære rester fra de lyserte celler som var i stand til å innkapsles og be-skytte levende celler. Dette fenomenet sees ikke i 12-timers-kulturer, hvor cellelyseringen av RUB 331 enda ikke er fremtredende. Resultatene av sporuleringsprøvene fremgår av tabell III.

Under disse forhold hvor RUB 830 oppviser en høy sporuler-ingsf rekvens , ble det ikke observert noen sporulering hos RUB 331. Dette viser at RUB 331 mangler evnen til å danne sporer, hvilket bringer dens potensial for uønsket langtids-overlevelse ned til det minst mulige.

v • Yi£l£5i02§£ _§Y_£££lSi22_Eå_2Ye.Eie.Y§is.e •

Dette forsøket ble utformet for å simulere bordplatesøl

av RUB 331 og å anslå tiden som et slikt søl av RUB 331 ville overleve. 8-timers-kulturer av RUB 331 eller RUB 830 i "M broth" (supplert med 10~<4> M Fe(N03)3) ble brukt for å mette sterile konsentrasjonsskiver med en diameter på,

0,6 cm, som så ble plassert i en steril petriskål ved romtemperatur. Disse skivene fikk deretter tørke. Levedyktigheten ble bestemt etter forskjellige tidsintervaller ved å suspendere en skive i 1 ml sterilt Spizizens minimal-saltoppløsning og utstrykning på TBAB-plater supplert med 2 mg/plate tymidin.

Som det fremgår av tabell IV, oppviser RUB 331 en ønsket føl-somhet overfor uttørking ved romtemperatur sammenlignet med opphavsstammen RUB 830. Minskningen av levedyktigheten til RUB 331 til 0 faller sammen med den fullstendige uttørking av konsentrasjonsskiven, og utgjør derfor en minimal fare for spredning.

Claims

Fremgangsmåte for å transformere sporbgen Bacillus subtilis RUB 830 til asporogen Bacillus subtilis RUB 331 som er anvendelig som en vert i et vert-vektor-system, karakterisert ved inkubering av Bacillus subtilis RUB 830 i et egnet vekstmedium med donor-DNA fra Bacillus subtilis 168T<+> (vill-type) og isolering av kolonier transformert til Bacillus subtilis RUB 331.