DK170735B1 - Plasmid, mikroorganisme indeholdende samme samt anvendelse deraf ved fremstilling af amylaser - Google Patents
Plasmid, mikroorganisme indeholdende samme samt anvendelse deraf ved fremstilling af amylaser Download PDFInfo
- Publication number
- DK170735B1 DK170735B1 DK251485A DK251485A DK170735B1 DK 170735 B1 DK170735 B1 DK 170735B1 DK 251485 A DK251485 A DK 251485A DK 251485 A DK251485 A DK 251485A DK 170735 B1 DK170735 B1 DK 170735B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- plasmid
- amylase
- kanamycin
- microorganism
- bacillus subtilis
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 title description 19
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 title description 19
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 title description 19
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 30
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 30
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 30
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 108020001482 shikimate kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
i DK 170735 B1
Den foreliggende opfindelse angår et plasmid indeholdende et amylasekodende gen og mikroorganismer indeholdende plasmidet samt deres anvendelse ved fremstilling af amy-laser.
5
Opfindelsen angår et plasmid af den i indledningen til krav 1 angivne type. Plasmidet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i kravets kendetegnende del anførte.
10
Opfindelsen angår også genetisk manipulerede Bacillus subtilis mikroorganismer indeholdende plasmidet ifølge opfindelsen, ejendommelige ved det i krav 2's henholdsvis krav 3's kendetegnende del anførte.
15
Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling af sådanne mikroorganismer, ejendommelige ved det i krav 4's henholdsvis krav 5's kendetegnende del anførte.
20 Derudover angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af a-amylase, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 6's kendetegnende del anførte.
I ansøgernes europæiske patentansøgning nr. 81300578.2 er 25 der beskrevet rekombinant DNA indeholdende et amylasekodende gen, som fremstilles ved en proces med in vitro kløvning af DNA afledt fra en bakteriel donormikroorganisme og kombinering af de resulterende DNA-fragmenter med en vektor, som er blevet tilsvarende kløvet, hvilken 30 vektor omfatter et plasmid eller DNA af et derivat af fag-lambda. Denne rekombinante DNA kan Indsættes i en bakterieværtsorganisme og denne dyrkes til fremstilling af amylasen. En række forskellige bakterielle donororganismer og bakterielle værtsorganismer er beskrevet i den 35 europæiske ansøgning tillige med en række egnede plas-mider og derivater af fag-lambda.
2 DK 170735 B1
Anvendelsen af plasmider til Indføring af et gen 1 en mikroorganisme er en vidt udbredt teknik. Nylig litteratur indeholder beskrivelser af en række plasmider, som er blevet foreslået til dette formål. Specielt beskriver to 5 artikler i "Gene" udgivet af Elsevier Biomedical Press, 15 (1981) 43-58 af Ilkka Palva et al. og 19 (1982) 81-87 af Ilkka Palva alene isoleringen af genet kodende for a-amylase fra Bacillus amyloliquefaciens ved direkte shot-gun-kloning under anvendelse af Bacillus subtilis som 10 vært. Genomet af Bacillus amyloliquefaciens blev specielt nedbrudt med restriktionsendonuclease Mbo I, og 2 til 5 Kb-fragmenter blev isoleret og samlet til plasmid pUBHO.
Kompetente Bacillus subtilis amylase-negative celler blev transformeret med de hybride plasmider, og kanamycin-re-15 sistente transformanter blev screenet for fremstillingen af a-amylase.
Fra SE-B-442-632 er det kendt, at et plasmid afledt fra pUBHO kan forekomme i flere kopier i Bacillus. EP-A-3062 20 er et andet eksempel på et højt kopi tal for plasmider.
Det overraskende ved opfindelsen som forklaret nærmere i det følgende er ikke blot, at der er flere plasmider til stede, men også at de er stabile i mikroorganismen efter mange generationer. Ingen af de nævnte patentskrifter an-25 tyder en så langvarig stabilitet i efterfølgende generationer.
Et af problemerne ved anvendelse af en genetisk manipuleret mikroorganisme i industriel skala er stabiliteten af 30 den rekombinante DNA, som er blevet indført ved den genetiske manipulationsproces. Hvis der er en mangel på stabilitet, har den rekombinante DNA tendens til at tabes eller undergå sekvensomlejringer, når efterfølgende gene- , rationer af organismen produceres, indtil eventuelt det 35 amylasekodende gen ikke længere udtrykkes eller kun udtrykkes svagt af efterfølgende mikroorganismer.
3 DK 170735 B1
Det har nu vist sig muligt at udvikle rekombinant DNA, som blandt andet omfatter visse amylasekodende gener beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 81300578.2, men som er afledt fra et plasmid, der ikke er specifikt be-5 skrevet i sidstnævnte dokument. Plasmidet er pUBHO, som også er beskrevet i en artikel i Journal of Bacteriology 1978, bind 134, pp 318-329. Plasmidet pUBHO omfatter et gen kodende for resistens mod kanamycin eller analoge antibiotika inaktiveret af nucleotidyl transferase-enzymet.
10 Det har nu vist sig, at den rekombinante DNA afledt fra dette plasmid og visse amylasekodende gener kan indføres i en værtsmikroorganisme, og at, særlig når værten er Bacillus subtilis, mutantstammer kan produceres og dyrkes, hvilke stammer har forbedret stabilitet og høje kopital.
15 Mutantmikroorganismerne, som omfatter den hidtil ukendte rekombinante DNA, kan derfor anvendes på industriel basis til produktion af amylase og specielt til produktion af a-amylase fra Bacillus megaterium, en amylase, der har særlige nyttige kommercielle egenskaber.
20 Følgelig angår opfindelsen et hidtil ukendt plasmid indeholdende et amylasekodende gen fremstillet ved en in vitro fremgangsmåde, ved hvilken man kløver DNA afledt fra en Bacillus megaterium og kombinerer de resulterende 25 DNA-fragmenter omfattende det amylasekodende gen med en tilsvarende kløvet vektor, som er et plasmid, nemlig plasmidet pUBHO.
Man anvender Bacillus megaterium NCIB nr. 11568, som in-30 deholder gener kodende for α-amylase og tf-amylase, henholdsvis, og en særlig nyttig rekombinant DNA er den, der dannes ved kombination af fragmenter af DNA fra Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 omfattende genet kodende for a-amylase og den kløvede vektor pUBHO, og som betegnes 35 pAMYlOO. Den analoge rekombinante DNA fra den kløvede vektor pUBHO og det fragment, der omfatter genet kodende for tf-amylase, er blevet betegnet pAMY400.
DK 170735 Bl 4
Det skal bemærkes, at udtrykket Bacillus megaterium anvendes i den foreliggende beskrivelse som omfattende accepterede synonymer for Bacillus megaterium, herunder 1 især Bacillus carotårum, som beskrevet i Bergey's "Manual 5 of Determinative Bacteriology" (8. udgave) R.E. Buchanan og N.E. Gibbons (udg.), side 537.
Produktionen af plasmidet ifølge opfindelsen sker ved anvendelse af konventionel og velkendt teknik som beskrevet 10 i de efterfølgende eksempler.
Til industriel anvendelse inkorporeres plasmidet ifølge opfindelsen først i en værtsmikroorganisme. Værten kan være en gærart eller en bakterie, idet sidstnævnte fore-15 trækkes. Skønt plasmidet kan inkorporeres i en vilkårlig af de værtsbakterier, der er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 81300578.2, foretrækkes det at anvende en Bacillus subtilis. Bacillus subtilis kan således være Bacillus subtilis BGSC 1A289 eller, mere foretrukkent, en 20 asporogen mutant af sidstnævnte, der er blevet deponeret som Bacillus subtilis NCIB 11979 (i det følgende benævnt BAS8).
Når sidstnævnte er vært for den rekombinante DNA pAMYlOO, 25 en hidtil ukendt mikroorganisme, der er deponeret som Bacillus subtilis NCIB 11980 (i det følgende benævnt BAS35).
For at opnå forbedret stabilitet og et højt kopital har 30 det vist sig, at ved anvendelse af følgende teknik kan BAS35 bringes til at mutere til opnåelse af en organisme, hvori disse Ønskede egenskaber er forbedret. BAS35 dyrkes først i et næringsmedium, som indeholder 250 ug/ml kana- * mycin eller analoge antibiotika, som kan være inaktiveret 35 med nucleotidyl transferase-enzymet. Nogle kolonier er i stand til at gro på dette medium, andre kan ikke. Dvs., førstnævnte har højere kanamycinresistens. De kolonier, 5 DK 170735 B1 som har evnen til at gro på mediet, udvælges og dyrkes derpå separat. Den udvalgte stamme har vist sig at være en mutant af BAS35 og er blevet deponeret som Bacillus subtilis NC1B 11984 (i det følgende refereret som BAS72).
5 Hvis imidlertid den hidtil ukendte mutantstamme nu overføres i et næringsmedium omfattende 750 ug kanamycin/ml, kan en yderligere udvælgelse foretages af en mutant, der er i stand til at gro i dette medium og derfor være tilpasset til at modstå en koncentration på 750 ug/ml kana-10 mycin. Denne mutant kan udvælges og dyrkes separat og er blevet deponeret som Bacillus subtilis NCIB 11985 (i det følgende benævnt BAS73). Begge mutantstammerne BAS72 og BAS73 har kanamycinresistens, udviser forbedret stabilitet og forøget kopital. Kopitallet for BAS35 er således 15 ca. 15, for BAS72 er det mindst 25 og for BAS73 mindst 35. Denne procedure kan anvendes til at fremstille mutantstammer, der er resistente til endog højere koncentrationer af antibiotikum, f.eks. op til 5000 μg/ml og med tilsvarende højere kopital.
20 BAS72 og BAS73 er med deres stabilitet og høje plasmidko-pital attraktive til anvendelse industrielt til fremstilling af α-amylase for Bacillus megaterium NCIB nr. 11568, da begge indeholder den rekombinante DNA pAMYlOO omfat-25 tende genet kodende for denne amylase. Ved tilsvarende at starte med BAS8 eller Bacillus subtilis BGSC 1A289 er det muligt at indføre rekombinant DNA ifølge opfindelsen, hvori det amylasekodende gen er afledt fra andre donorer.
Der er f.eks. indført rekombinant DNA pAMY200, pAMY300 og 30 pAMY400 i BAS8 til opnåelse af hidtil ukendte mikroorganismer deponeret som Bacillus subtilis NCIB 11981 (i det følgende benævnt BAS36), Bacillus subtilis NCIB 11982 (i det følgende benævnt BAS37) og Bacillus subtilis NCIB 11983 (i det følgende benævnt BAS38). Disse tre stammer 35 kan muteres ved den fremgangsmåde, der er beskrevet for den analoge BAS35, til opnåelse af kanamycinresistente mutanter med forøget stabilitet og højt kopital.
6 DK 170735 B1
For at gøre de mutantstammer, der har højt kopital, mere egnede til industriel anvendelse, foretrækkes det fra den rekombinante DNA indeholdt i den respektive mikroorganis- .
me at fjerne det gen, der koder for kanamycinresistens.
5 Dette kan foretages ved kendt genetisk manipuleringstek-nik, f.eks. teknik, i hvilken den rekombinante DNA fjernes fra mikroorganismen, kløves in vitro, og det gen, der koder for kanamycinresistens, udslettes derfra ved hjælp af en restrlktionsendonuclease. Den resulterende DNA li-10 geres derpå ved hjælp af en ligase og genindsættes i en Bacillus subtilis vært, f.eks. i BAS8 eller i en "hærdet" form for BAS72 eller BAS73.
Skønt mikroorganismen indeholdende den rekombinante DNA 15 ifølge opfindelsen således kan manipuleres til fremstilling af en række amylaser, er de af særlig nytte ved fremstillingen af «-amylase af Bacillus megaterium NCIB nr. 11568, som er et enzym, der er aktivt ved katalysering af overføringen af polysaccharider, såsom stivelse 20 og delstivelseshydrolysater som beskrevet i ansøgernes verserende britiske patentansøgning nr. 8414272.
Opfindelsen beskrives nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, i hvilke følgende deponerede stammer og 25 plasmider blev anvendt:
Bacillus subtilis BGSC 1A289
Organismen er en mutant manglende genet kodende for a-30 amylase. Den blev opnået fra Bacillus Genetic Stock Centre, Ohio State University.
pUBHO
35 Som beskrevet i det foregående.
7 DK 170735 B1 pAMYl (inkorporeret i E. coli, depotnummer NCIB 11570)
Et derivat af E. coli plasmid pBR322 bærende en 2,2 Kb HindiII-indsats med det a-amylasekodende gen af Bacillus 5 megaterium NCIB 11568. Dette plasmid er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 81300578.2.
EKSEMPEL 1 10 pAMYlOO:
Et rekombinant plasmid afledt fra pUBHO og bærende et DNA-segment kodende for a-amylasen for Bacillus megaterium NCIB 11568 (se plasmidkortet på tegningens fig. 1).
15
Donor-DNA var pAMYl, og in vitro rekombineringen blev foretaget mellem 1 ug pAMYl DNA og 2 ug pUBHO DNA kløvet med 10 enheder EcoRI-restriktionsendonuclease. Ligering blev foretaget ved høj koncentration (75 ug DNA/ml) i 20 nærværelse af 1 enhed T4 DNA-ligase, for at danne conca-temere.
Det opnåede produkt blev anvendt til at transformere BGSC 1A289 ved den procedure, der er beskrevet i "Experiments 25 in Microbial Genetics", udgivet af Clowes & Highes, Blackwell 1968. Kanamycinresistente og amylaseproduceren-de kloner blev identificeret i LB-medium suppleret med 10 ug/ml kanamycin og 1% stivelse, idet de amylaseproduce-rende kloner blev identificeret ved iondamp ved den pro-30 cedure, der er beskrevet i europæisk patentansøgning nr.
81300578.2, side 20, afsnit B.
Fra de positive kloner blev der valgt en klon bærende pAMYlOO, et plasmid, hvori hele pUBHO var bibeholdt, 35 AMY-fragmentet og kun en lille del af pBR322 begrænset af
HindiIl-stederne flankerende AMY-fragmentet.
DK 170735 B1 e pAMYlOO DNA blev derpå ekstraheret fra denne stamme og anvendt til at transformere BAS8 som beskrevet 1 eksempel 5.
5 EKSEMPEL 2
Fremstilling af Bacillus subtills 8, en asporogen mutant af Bacillus subtilis BGSC 1A289 10 En prøve af en kultur, der havde stået natten over, af BGSC 1A289 blev bestrålet med UV-lys og anvendt til at inokulere følgende medium med successive subkulturer:
Difco-gærekstrakt 1 g 15 MgS04 . 7 H20 200 mg
FeSO^ . 7 H20 10 mg
MnSO^ . H20 7 mg
CaCl2 . 2 H20 73 mg
P04~puffer, pH 7,0 0,067 M
20 glutamat 0,1 M
methionin 40 mg aromatiske aminosyrer 40 mg H20 1 liter 25 Dette medium er beskrevet af Bergere og Hermier (Ann.
Inst. Pasteur 106, 214 235 1964) som et sporulationsindu-cerende medium. Successive subkulturer i et sådant medium giver en selektiv fordel for de vegetative celler (som ikke sporulerer) mod sporerne, som først må spire, før de 30 er i stand til at mangfoldiggøre sig. Hvert subkulturtrin kan således berige populationen på asporogene mutanter.
BAS8 blev isoleret efter 6 subkulturer.
De generiske markører rapporteret for Bacillus subtilis 35 BGSC 1A289 er: i 9 DK 170735 B1 amy-E: En mutation i det strukturelle gen, der koder for β-amylase for B. subtilis resulterende i fraværet af e-amylasen.
5 arol906: En mutation i det strukturelle gen kodende for shikimate-kinase resulterende i et behov (auxotropi) for de aromatiske aminosyrer (phe-nylalanin, tyrosin og tryptophan).
10 metB5: En mutation i det strukturelle gen kodende for et af enzymerne for methioninbiosyntesevejen resulterende i et behov for methionin.
sacA321: En mutation i et strukturelt gen kodende for 15 et enzym involveret i saccharosenedbrydning og resulterende i manglende evne til at nedbryde saccharose.
Virkningen af den ultraviolette behandling var at frem-20 stille en mutation i et ukendt gen resulterende i den manglende evne til at sporulere. Mutanten BAS8 producerer 7 mindre end en spore for 10 bakterier i sporulationsmediet som beskrevet i det foregående, mens Bacillus subtilis BGSC 1A289 producerer en spore for 2 bakterier under sam-25 me betingelser. Den mutante organisme Bacillus subtilis BAS8 indeholder den genetiske markør spo-8, men har samtidig mistet markørerne arol906 og sacA321 under mutationsprocessen .
30 EKSEMPEL 3
Fremstilling af BAS35 indeholdende den rekombinante DNA pAMYlOO
35 pAMYlOO DNA blev anvendt til at transformere BAS8 ved den metode, der er refereret i eksempel 1 og beskrevet i "Experiments in Microbial Genetics", hvortil der henvises i 10 DK 170735 B1 det foregående.
Plasmidstabiliteten af BAS35 blev målt ved successiv sub-dyrkning ved 37 °C i et komplet medium (Difco-trypton, 5 1%? Difco-gærekstrakt, 1%; NaCl, 0,5%) uden kanamycin, det antibiotikum, hvortil plasmid pUBHO giver resistens.
En første subkultur blev inokuleret med en prøve af en kultur dyrket natten over i nærværelse af 20 ng/ml kana-10 mycin. For hver subkultur blev der foretaget en tælling af levedygtige organismer umiddelbart efter inokulering og efter vaskst for at bestemme antallet af generationer. Generationstiden for BAS35 i eksponentiel fase i komplet medium ved 37 “C er 30 minutter.
15
Efter hver subkultur blev procentdelen af amylasepositive kloner (med bibeholdt plasmid) målt. Resultaterne var som følger: 20 Antal % af Amy+ generationer_kloner 10 100 19 100 29 90,7 25 35 58,7 46 14,4 53 4,9 EKSEMPEL 4 30 ·%
Produktion af BAS72, en mutant af BAS35, omfattende en mutation i et ukendt gen, som koder for forøget kanamy-cinresistens og plasmidstabilitet.
35 BAS35, indeholdende plasmidet pAMYlOO, som giver resistens mod kanamycin ved en maksimumkoncentration på ca. 30 ug/ml, blev dyrket natten over i et komplet medium. Uden 11 DK 170735 B1 mutagenbehandling blev prøver på 0,1 ml udspredt på plader indeholdende komplet medium og suppleret med 250 Mg/ml kanamycin. Efter 2 dages inkubering ved 37 °C dannedes kloner resistente mod denne koncentration af kana-5 mycin ved en hyppighed på 10-^ pr. inokuleret BAS35-cel-le. En klon, betegnet BAS72, blev valgt blandt de resistente kloner, og mutationen givende den forøgede resistens til kanamycin-phenotype blev betegnet irk-72. Denne phenotype holdt sin stabilitet efter flere subkulturer i 10 fravær af antibiotiket. Generationstiden for BAS72 i eksponentiel fase i komplet medium ved 37 °C er 60 minutter.
Stabilitet af pAMYlOO i BAS72 15 Stabilitet blev målt som i tilfælde af BAS35 og er rapporteret i det følgende. Det er klart, at pAMYlOO er meget mere stabil i BAS73 end i BAS35.
Antal % af Amy+ 20 generationer_kloner 11 100 17 100 29 100 34 100 25 45 100 50 100 EKSEMPEL 5 30 Produktion af BAS73 omfattende en mutation af et ukendt gen, der giver en højere resistens mod kanamycin end i det foregående eksempel.
En prøve på 0,1 ml af en kultur, der har stået natten 35 over, i komplet medium af BAS72 (som er resistent mod kanamycin ved en koncentration på 250 ug/ml) blev spredt på en plade indeholdende komplet medium suppleret med 750 12 DK 170735 B1 ug/ml kanamycin. Kloner, der er spontant resistente ved denne koncentration af antibiotiket, dannedes med en hyppighed på 10“^ pr. udbredt celle. En sådan klon blev renset og betegnet BAS73. Dens resistens mod 750 ug/ml kana-5 mycin blev opretholdt i stabilitet efter flere subkulturer i fravær af antibiotiket. Generationstiden for BAS73 i eksponentiel fase i komplet medium ved 37 "C er 60 minutter .
10 Stabilitet af pAMYlOO i BAS73
Plasmidstabilitet blev målt som i BAS35 tilfældet og er rapporteret i det følgende. Det er klart, at pAMYlOO er meget mere stabil i BAS73 end i BAS35.
15
Antal % af Amy+ generationer_kloner 10 100 18 100 20 28 100 34 100 45 100 50 100 25 EKSEMPEL 6
Fremstilling af BAS36 indeholdende den rekombinante DNA PAMY200 30 pAMY200 DNA blev anvendt til at transformere BAS8 ved den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1 samt i "Experiments in Microbial Genetics", hvortil der henvises i det foregående.
35 Plasmidstabiliteten blev målt på samme måde som for pAMYlOO.
13 DK 170735 B1
Resultaterne fremgår af det følgende:
Antal % af Amy+ generationer kloner 5 20 17,6 36 5,8 52 0,4 EKSEMPEL 7 10
Fremstilling af BAS37 indeholdende den rekombinante DNA PAMY30Q
pAMY300 DNA blev anvendt til at transformere BAS8 ved den 15 fremgangsmåde, der er beskrevet i eksempel 1 samt i "Experiments in Microbial Genetics", hvortil der henvises i det foregående.
Plasmidstabiliteten blev målt på samme som for pAMYlOO.
20
Resultaterne fremgår af det følgende:
Antal % af Amy+ generationer_kloner 25 10 100 26 100 44 100 55 96 30 EKSEMPEL 8
Fremstilling af a-amylase med Bacillus subtilis BAS35 og BAS73 35 Fire 20 liters fermentatorer indeholdende 15 liter dyrkningsmedium omfattende, angivet i vægt i forhold til volumen, 1% bactopepton, 3% gærekstrakt, 0,5% glucose og DK 170735 B1 14 0,5% NaCl blev inokuleret med 1% af en prækultur indeholdt i samme medium. Prækulturerne blev fremstillet ved at fremstille flere subkulturer, således at i det endelige trin før fermentatorerne var der fremstillet ca. 35 5 generationer. To fermentatorer blev podet med stammen BAS35 i nærværelse af og fravær af kanamycin (5 ug/ml) og to med stammen BAS73 i nærværelse af og fravær af kanamycin (5 ug/ml). Fermentatorerne blev omrørt ved 250 omdr./min., luftet med 0,15 liter luft/liter/min. og 10 holdt ved 40 °C i 55 timer. Efter 6 timers forløb og i yderligere 48 timer blev fermentorerne kontinuerligt tilført en glucoseopløsning, således at den totale mængde glucose sat til fermentatorerne var 1,5% efter vægt/vol.
Ved afslutningen af fermenteringen blev a-amylaseaktivi-15 teten målt i dyrkningsbouillonen. Resultaterne fremgår af følgende tabel:
Enzymaktivitet U/ml 20 BAS35 BAS 7 3 + Kanamycin 220 160 - Kanamycin 80 150 25 De i det foregående nævnte stammer NCIB 11979-11986 er deponeret hos The National Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd. i Skotland under Budapesttraktatens regler for indleveringen af nærværende ansøgning. De er tilgængelige for offentligheden og kan fås ved henvendel-30 se til NCIB.
35
Claims (6)
1. Plasmid indeholdende et gen kodende for et a-amylase-5 enzym fremstillet ved in vitro kløvning af DNA afledt fra Bacillus megaterium NCIB nr. 11568 og kombinering af de resulterende DNA-fragmenter omfattende det a-amylaseko-dende gen med en tilsvarende kløvet plasmidvektor pUBHO, kendetegnet ved, at plasmidet har en molekyl-10 vægt på 6,7 kb og det restriktionsendonucleasespaltnings-kort, der er vist på tegningens fig. 1.
2. Genetisk manipuleret Bacillus subtilis mikroorganisme indeholdende plasmidet ifølge krav 1, kendetegne 15. ved, at den er i stand til at gro i et næringsmedium indeholdende mindst 250 ug kanamycin pr. ml og har deponeringsnummer NCIB 11984.
3. Genetisk manipuleret Bacillus subtilis mikroorganisme 20 indeholdende plasmidet ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er i stand til at gro i et næringsmedium indeholdende mindst 750 ug kanamycin pr. ml og har deponeringsnummer NCIB 11985.
4. Fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man a) dyrker Bacillus subtilis med deponeringsnummer NCIB 11980 på et næringsmedium indeholdende 250 ug kanamy- 30 cin, b) udvælger en eller flere kolonier, som gror på mediet, c) overfører kolonierne til et nyt næringsmedium og 35 d) dyrker de udvalgte kolonier på det nye medium. DK 170735 B1 16
5. Fremgangsmåde til fremstilling af en mikroorganisme ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man a) dyrker en kanamycin-resistent mutant ifølge krav 2 på 5 et næringsmedium indeholdende 750 ag kanamycin pr. ml, * b) udvælger en eller flere kolonier, som gror på mediet, c) overfører kolonierne til et nyt næringsmedium og 10 d) dyrker de udvalgte kolonier på det nye medium.
6. Fremgangsmåde til fremstilling af a-amylase, kendetegnet ved, at en mikroorganisme ifølge et vil- 15 kårligt af kravene 2-3 dyrkes under a-amylaseproducerende betingelser. 20 25 30 £ 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848414271A GB8414271D0 (en) | 1984-06-05 | 1984-06-05 | Recombinant dna |
| GB8414271 | 1984-06-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK251485D0 DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
| DK251485A DK251485A (da) | 1985-12-06 |
| DK170735B1 true DK170735B1 (da) | 1995-12-27 |
Family
ID=10561932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK251485A DK170735B1 (da) | 1984-06-05 | 1985-06-04 | Plasmid, mikroorganisme indeholdende samme samt anvendelse deraf ved fremstilling af amylaser |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4806426A (da) |
| EP (1) | EP0165002B1 (da) |
| JP (1) | JPH0779683B2 (da) |
| AT (1) | ATE76902T1 (da) |
| AU (1) | AU4313285A (da) |
| BR (1) | BR8502681A (da) |
| CA (1) | CA1279590C (da) |
| DE (1) | DE3586145T2 (da) |
| DK (1) | DK170735B1 (da) |
| ES (2) | ES8702947A1 (da) |
| FI (1) | FI91885C (da) |
| GB (1) | GB8414271D0 (da) |
| IE (1) | IE58259B1 (da) |
| MX (1) | MX7725E (da) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4962026A (en) * | 1986-09-15 | 1990-10-09 | Enzyme Bio-Systems, Ltd. | Process for the production of panosyl derivatives |
| US5209938A (en) * | 1989-09-13 | 1993-05-11 | Cpc International Inc. | Method for retarding staling of baked goods |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2759053A1 (de) * | 1977-12-30 | 1979-07-12 | Uhlin | Verfahren zum herstellen von genprodukten von plasmid-dns |
| ZA81424B (en) * | 1980-02-15 | 1982-02-24 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| DK135983D0 (da) * | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Novo Industri As | Maltogen amylaseenzymprodukt og fremgangsmade til dets fremstilling og anvendelse |
-
1984
- 1984-06-05 GB GB848414271A patent/GB8414271D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-22 IE IE128785A patent/IE58259B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-23 US US06/737,311 patent/US4806426A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-24 FI FI852084A patent/FI91885C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 AU AU43132/85A patent/AU4313285A/en not_active Abandoned
- 1985-06-03 MX MX85956U patent/MX7725E/es unknown
- 1985-06-04 EP EP85303947A patent/EP0165002B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 DE DE8585303947T patent/DE3586145T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-04 ES ES543860A patent/ES8702947A1/es not_active Expired
- 1985-06-04 AT AT85303947T patent/ATE76902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 BR BR8502681A patent/BR8502681A/pt not_active IP Right Cessation
- 1985-06-04 DK DK251485A patent/DK170735B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-06-05 CA CA000483212A patent/CA1279590C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-05 JP JP60120735A patent/JPH0779683B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-28 ES ES551307A patent/ES8802536A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE76902T1 (de) | 1992-06-15 |
| FI852084A0 (fi) | 1985-05-24 |
| CA1279590C (en) | 1991-01-29 |
| ES8702947A1 (es) | 1987-01-16 |
| FI91885B (fi) | 1994-05-13 |
| DE3586145D1 (de) | 1992-07-09 |
| ES543860A0 (es) | 1987-01-16 |
| JPH0779683B2 (ja) | 1995-08-30 |
| DE3586145T2 (de) | 1992-12-03 |
| FI91885C (fi) | 1994-08-25 |
| JPS6119491A (ja) | 1986-01-28 |
| FI852084L (fi) | 1985-12-06 |
| IE851287L (en) | 1985-12-05 |
| GB8414271D0 (en) | 1984-07-11 |
| EP0165002A2 (en) | 1985-12-18 |
| BR8502681A (pt) | 1986-02-12 |
| EP0165002B1 (en) | 1992-06-03 |
| DK251485A (da) | 1985-12-06 |
| MX7725E (es) | 1991-01-30 |
| EP0165002A3 (en) | 1987-09-02 |
| ES551307A0 (es) | 1988-07-16 |
| DK251485D0 (da) | 1985-06-04 |
| ES8802536A1 (es) | 1988-07-16 |
| US4806426A (en) | 1989-02-21 |
| IE58259B1 (en) | 1993-08-25 |
| AU4313285A (en) | 1985-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2571338B2 (ja) | 形質転換された細菌 | |
| US5352604A (en) | Alkaline proteolytic enzyme and method of production | |
| Bergquist et al. | Genetics and potential biotechnological applications of thermophilic and extremely thermophilic microorganisms | |
| EP0127328A2 (en) | The use of chromosomal integration to stabilize heterologous genes | |
| WO2010084349A1 (en) | Method of double crossover homologous recombination in clostridia | |
| Kawamura et al. | Catabolite-resistant sporulation (crsA) mutations in the Bacillus subtilis RNA polymerase sigma 43 gene (rpoD) can suppress and be suppressed by mutations in spo0 genes. | |
| Kashket et al. | Isolation of a degeneration-resistant mutant of Clostridium acetobutylicum NCIMB 8052 | |
| DK170735B1 (da) | Plasmid, mikroorganisme indeholdende samme samt anvendelse deraf ved fremstilling af amylaser | |
| US4801541A (en) | Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism | |
| US5695976A (en) | Stable integration of DNA in bacterial genomes | |
| NO159863B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling og seleksjon av en rekombinant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme. | |
| CA2083407C (en) | Microorganisms for the stabilization of plasmids | |
| US5985668A (en) | Sucrose metabolism mutants | |
| EP0173327A2 (en) | Bialaphos producing gene | |
| US6048694A (en) | Bacterial positive selection vector | |
| EP0787800A2 (en) | Plasmid and plasmid vector from Lactobacillus helveticus | |
| EP0179025B1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| Maschke et al. | Plasmid instabilities of single and three-plasmid systems in Escherichia coli during continuous cultivation | |
| JPH04287686A (ja) | 無胞子性菌株バシラス・サチリス ｓｍｓ２７５ | |
| EP0164117B1 (en) | Amylase-negative, asporogenous mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system | |
| US6770475B1 (en) | Promoters | |
| EP0400931A1 (en) | Plasmid pTY1 | |
| US4886754A (en) | Recombinant bateriophage for heterologous cloning of bacillus microorganisms and method for its production | |
| CA2096284A1 (en) | Process for stable chromosomal gene amplification | |
| NO160525B (no) | Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder alfa- amylasegenet, til hetorolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten bacillus. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |