NO160525B - Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder alfa- amylasegenet, til hetorolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten bacillus. - Google Patents
Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder alfa- amylasegenet, til hetorolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten bacillus. Download PDFInfo
- Publication number
- NO160525B NO160525B NO86860456A NO860456A NO160525B NO 160525 B NO160525 B NO 160525B NO 86860456 A NO86860456 A NO 86860456A NO 860456 A NO860456 A NO 860456A NO 160525 B NO160525 B NO 160525B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bacteriophage
- host
- bacillus
- dna
- recombinant
- Prior art date
Links
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims description 71
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims description 43
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 33
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 33
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 12
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 9
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 8
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 48
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 21
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 101000723939 Mus musculus Transcription factor HIVEP3 Proteins 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 2
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000005497 Thymidylate Synthase Human genes 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LHOLVWOLWSNGKW-DMTCNVIQSA-N (2r,3r)-3,4-bis(sulfanyl)butane-1,2-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](S)CS LHOLVWOLWSNGKW-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101100483268 Bacillus phage phi3T thyP3 gene Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001682 Dextranase Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 101001066878 Homo sapiens Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 102000002681 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 108010016899 bacitracin A Proteins 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- XEQLFNPSYWZPOW-HBYCGHPUSA-N butirosin B Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1N XEQLFNPSYWZPOW-HBYCGHPUSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol;hydrochloride Chemical compound Cl.CNC(O)(O)O DEQXHPXOGUSHDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N valyl gramicidin a Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-LUPIJMBPSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder cx-amylasegenet til heterolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten Bacillus.
Det er velkjent at den genetiske informasjon hos alle celler er lagret i deoksyribonukleinsyre (DNA) i organismens kromosomer. Enheten for genetisk funksjon, dvs. stedet på kromosomet som er forbundet med et spesifikt arvelig trekk, kalles et gen.
Rekombinant DNA-teknikk omfatter overføring av genetisk materiale (gener, eller DNA-fragmenter) fra en organisme til en annen organisme ved hjelp av en overføringskomponent som kalles en "vektor", for derved å fremstille en kombinasjon av genetisk materiale. Den andre organismen (som inneholder det overførte genetiske materialet) kalles for en rekombinant komponent. Den rekombinante komponenten innføres deretter i bakterie— eller dyreceller for formering av de kombinerte genene inneholdt i den rekombinante komponenten. Cellen som den rekombinante komponenten innføres i, kalles en verts-celle.
En vektortype omfatter bakteriofager, som er virus som infiserer bakterier. En typisk bakteriofag består av nukleinsyre innesluttet i en proteinkappe.
Ved å bruke en rekombinant DNA-teknikk kan genetisk modifi-sering utføres på følgende måte. Spesifikke DNA-fragmenter fra bakteriofager og DNA fra en bakterie "isoleres", f.eks. ved behandling med passende restriksjonsenzymer som fungerer som "kjemiske skalpeller" ved å splitte DNA-molekylene i spesifikke fragmenter som vanligvis inneholder fra mindre enn 1 til 10 gener hver, eller ved andre velkjente teknikker. Et DNA-fragment for den ønskede genetiske karakteristikk, dvs. "fremmed-DNA", Innføres deretter i bakteriofagvektorens DNA. Ved behandling med DNA-ligase innføres DNA-fragmentet i bakteriofagvektorens DNA, og et rekombinant bakteriofag DNA-molekyl er dannet. Den rekombinante bakteriofag inneholder genene til bakteriofagen pluss de nye genene (fremmed-DNA) fra det innførte fragmentet. Denne rekombinante bakteriofag kan innføres i en vertsbakterie og derved "klone" det fremmede DNA i verten. De nye genene formeres og blir en del av det genetiske maskineri i bakterieverten. Bakterieverten oppnår derved de arvelige egenskaper som de nye genene bidrar med og er i stand til å "uttrykke" disse egenskapene.
I arbeidet med rekombinant teknikk har man stått overfor en formidabel oppgave ved å bli i stand til å undersøke de transformerte cellene og velge ut cellene som har fått den ønskede arvelige egenskap, dvs. de levedyktige transformanter (verter). I visse bakteriestammer er det midler for "primær" seleksjon, f.eks. hvis den transformerte bakterie er resistent mot et bestemt antibiotikum, kan bakterien dyrkes i nærvær av antibiotikumet og cellene som overlever velges ut som levedyktige transformanter. Denne fremgangsmåte som omfatter bruk av gener som er av avgjørende betydning for bakteriens overlevelse, kalles primær seleksjon. Derimot kan arvelige egenskaper som ikke er av avgjørende betydning for bakteriens overlevelse, f.eks. fremstilling av ekstracellulære enzymer, slik som a-amylase, proteaser, cellulaser og hemicellulaser, ikke velges ut ved hjelp av primær seleksjon. Det er derfor et behov for en rekombinant teknikk som kan brukes til å klone både et gen som primær seleksjon ikke eksisterer for, i tillegg til å klone et gen som seleksjon eksisterer for.
Bacillus-slekten omfatter minst 48 arter, og praktisk talt alle arter skiller ut flere oppløselige, ekstracellulære enzymer under varierende opphavsforhold. Som redegjort for nedenfor, syntetiserer Bacillus-mikroorganismene dessuten også intracellulære enzymer og antibiotika. Utnyttelse av Bacillus-mikroorganismer har fått kommersiell betydning på så forskjellige områder som medisin og ølbrygging. Ytterligere kommersiell utnyttelse av Bacillus kan oppnås ved å bruke rekombinant teknikk for å innføre et antall Bacillus-gener som koder for ønskede arvelige egenskaper i forskjellige Bacillus-mikroorganismer, slik som B. subtilis.
Det er kjent at gener som koder for, eller regulerer, a-amylase i en Bacillus-stamme, kan innføres i B. subtilis dersom de to stammene er tilstrekkelig nært beslektet, dvs. dersom det er utstrakt genetisk likhet mellom de to stammene. Dette kalles homolog kloning. F.eks. beskrives i J. Bacteriol., 120 (1974), s. 1144-1150, innføringen av DNA fra B. subtilis var, amylosaccharitus som har en eksepsjonelt høy a-amylase-aktivitet, i en genetisk lignende (homolog) mikroorganisme B. subtilis Marburg som har en relativt lav a-amylase-aktivitet. De transformerte mikroorganismene som ble fremstilt fikk høy a-amylase-aktivitet.
De fleste Bacillus er imidlertid ikke tilstrekkelig beslektet med B. subtilis, dvs. er ikke tilstrekkelig homologe, til å tillate DNA erholdt fra en Bacillus subtilis å bli fullgodt innført i en annen Bacillus, J. Bacteriol., 111 (1972), s. 705-716.
I litteraturen (Kawamura et al., Gene, 5 (1979), s. 87-91) beskrives en rekombinant DNA-teknikk som også omfatter innføring av DNA i en bakteriofagvektor. Kawamura et al. beskriver isolering av kromosomale DNA-fragmenter fra en svekket B. subtilis bakteriofag og innføring av det isolerte DNA i en annen bakteriofag for å fremstille en rekombinant bakteriofag. Den rekombinante bakteriofagen ble deretter brukt til å omdanne en B. subtilis mikroorganisme og transformantene ble skilt ut ved hjelp av konvensjonelle teknikker. Ettersom det kromosomale DNA var erholdt fra en svekket B. subtilis bakteriofag, omfattet innføringen av DNA'et i en B. subtilis mikroorganisme en homolog omdannelse. Ingen av de ovenfor omtalte henvisninger til kjent teknikk beskriver en fremgangsmåte for å innføre fremmed DNA i en B. subtilis bakteriofag for å fremstille en rekombinant bakteriofag som kan brukes ved heterolog kloning av gener.
Foreliggende oppfinnelse er rettet på anvendelse av en rekombinant bakteriofag. Nærmere bestemt omfatter oppfin-nelsen anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder a-amylasegenet til heterolog transformasjon av en vertsmikroorganisme Bacillus subtilis RUB 201 (ATCC 31594) hvor transformasjonen innbefatter inkubering av verten Bacillus subtilis med en bakteriofag som er fremstilt ved å a) tilveiebringe genetiske fragmenter som koder for a-amylase fra B. amyloliquefaciens H,
b) isolere DNA-f ragmenter fra en bakteriofag, <p3T,
c) sammenholde DNA-fragmentene erholdt i trinn a) med DNA erholdt i trinn b) for å fremstille en blanding som
inneholder en rekke rekombinante molekyler,
d) inkubere blandingen fra trinn c) med DNA isolert fra en annen mikroorganisme, Bacillus subtilis, som ikke
inneholder DNA-fragmentene erholdt i trinn a), idet den andre mikroorganismen av slekten Bacillus i det vesentlige er genetisk homolog med vertsmikroorganismen av slekten Bacillus og er prototrof for en vekstbetingelse,
e) inkubere blandingen fra trinn d) med vertsmikroorganismen av slekten Bacillus, idet verten av slekten Bacillus er
lysogen for bakteriofagen fra trinn b) og auxotrof for den nevnte vekstbetingelsen, for å fremstille en blanding som inneholder en transformert vert av slekten Bacillus som er prototrof for den nevnte vekstbetingelsen, lysogen for den nevnte, ønskede rekombinante bakteriofag og som inneholder den ønskede arvelige egenskap i bakteriofagen,
f) selektere for den transformerte verten av slekten Bacillus ved å dyrke blandingen på et vekstmedium som ikke
inneholder den nevnte vekstbetingelsen og bestemme nærværet av den ønskede arvelige egenskap, og
g) erholde derfra den rekombinante bakteriof agen, cp3T (ATCC-3195-B1), som inneholder den ønskede arvelige egenskap ved
å indusere den prototrofe verten av slekten Bacillus, under betingelser som er egnet for å tillate innføring av den nevnte bakteriofagen i verten Bacillus, slik at heterolog transformasjon bevirkes.
Kromosomalt DNA som koder for det ønskede ekstracellulære enzym oppnås først fra Bacillus-mikroorganismer, deretter brytes det ned med et passende restriksjonsenzym, f.eks. et enzym isolert fra B. globigii (Bgl 11), og enzymet inaktiveres. DNA fra en q>3T bakteriofag behandles på samme måte med et restriksjonsenzym og enzymet inaktiveres. DNA fra Bacillus-mikroorganismen og fra bakteriofagen kobles deretter sammen ved hjelp av kjente teknikker for å fremstille en sammenkoblet blanding av DNA bestående av rekombinante molekyler. Den rekombinante molekylblandingen inneholder tilfeldig sammenkoblede blandinger av kromosomale DNA-fragmenter, bakteriofag-fragmenter og kromosomale fragmenter bundet til bakteriofag-fragmenter, (se J. Bacteriol., 121
(1975), s. 354-362).
Blandingen av rekombinante DNA-molekyler inkuberes med DNA isolert fra en annen Bacillus-mikroorganisme og med en vertsorganisme av slekten Bacillus. Eekkefølgen av inkuber-ingen kan varieres. Vertsorganismen er lysogen for bakteriofagen som brukes og er også auxotrof for en vekstbetingelse. Den andre Bacillus-mikroorganismen inneholder ikke arvestof f-f ragmentet som skal innføres, er i det vesentlige genetisk homolog med vert-Bacillus og er prototrof for vekstbetingelsen. Begrepet homologe og heterologe mikroorganismer er velkjente og omtalt i J. Bacteriol., 111
(1972), s. 705-716.
Trekket med å inkubere vert-Bacillus med det homologe DNA som er prototroft for vekstbetingelsen, er en teknikk for å skille ut Bacillus-verter som kan reagere med DNA og derved sørge for anrikning av transformerte vertsmikroorganismer.
For å fastslå hvilke av de rekombinante bakteriofager innført i vert-Bacillus som har den ønskede arvelige egenskap, må vert-Bacillus undersøkes. I foreliggende tilfelle undersøkes vert-Bacillus på fremstilling av a-amylase ved en vanlig stivelse-jod prøve. Den rekombinante bakteriofag kan deretter erholdes fra vert-Bacillus ved å indusere verten.
Ved foreliggende innlemmelse i eksempelet benyttes homologt DNA som er prototroft for treonin (Thr<+>) og en vertsmikroorganisme av slekten Bacillus som er auxotrof for treonin (Thr~). Identiteten av den auxotrofe vekstbetingelse er ikke kritisk. Vekstbetingelse for andre aminosyrer eller puriner eller pyrimidiner kunne vært brukt med den aktuelle mikroorganisme like så vel som slike selektive trekk som antibiotika-resistens. F.eks. omfatter passende aminosyrer lysin, tyrosin, adenin, leucin og serin. Passende puriner og pyrimidiner omfatter adenin, tymin, guanin, cytosin og tymidin. Antibiotika-resistenstrekk omfatter resistens mot erytromycin, spectinomycin og streptomycin.
Fremgangsmåten egner seg for å klone gener som koder for slike arvelige egenskaper som ekstracellulære enzymer, intracellulære enzymer og antibiotika. Ekstracellulære enzymer omfatter a-amylaser, proteaser, cellulaser, hemicellulaser, penicillinaser og pectinaser. Intracellulære enzymer omfatter lytiske enzymer, glukoseisomerase, poly-nukleotidfosforylase, restriksjonendonuklease og dekstra-naser. Antibiotika omfatter edein^i og —gi, bacitracin A, gramicidin A, tyrocidin og butirosin B.
Foreliggende eksempel beskriver bruken av <p3T-bakteriofag. Andre egnede bakteriofager omfatter SP02 (se Gene, 7, (1971), s. 51-58) og Rholl (pil) (se J. Virol., 20 (1976), s. 509-519).
Videre kan den rekombinante bakteriofagen som inneholder gener som koder for en ønsket egenskap, innføres i en vertsmikroorganisme av slekten Bacillus som allerede inneholder den genetiske informasjonen for den ønskede egenskapen og derved fremstille en vertsmikroorganisme som inneholder flere genetiske kopier av genet, dvs. flere gener for den samme egenskapen. F.eks. kan en rekombinant bakteriofag (p3T som inneholder a-amylasegener B. amyloliquefaciens H innføres i en B. subtilis som inneholder et virksomt B. subtilis a-amylasegen, og derved fremstilles en B. subtilis som produserer to a-amylaser, en kodet for av B. amyloliquefaciens H-gener og en av B. subtilis-gener.
Som referert til tidligere, medfører rekombinant teknikk rettet mot utnyttelse av rekombinante bakteriofager som omfatter innføring av gener for hvilke det ikke eksisterer primær seleksjon, store problemer under utvelgelsen av de ønskede transformanter.
Dersom en transformasjonsfremgangsmåte anvendes, f.eks. med et gen som en primær seleksjonsteknikk ikke eksisterer for, må hver enkelt celle undersøkes for å påvise mulige transformanter. Omfanget av undersøkelsene er formidabelt. I et kloningsforsøk kan i alt 10<8> til IO<9> celler vokse opp. Vanligvis kan omtrent 100 celler dyrkes for undersøkelse på en enkelt petriskål. Det vil følgelig kreve dyrking og undersøkelse av mikroorganismer på opp til 10.000 petriskåler for å undersøke for alle mulige transformanter. Foreliggende metode omfatter derimot en kloningsfremgangsmåte som drastisk reduserer undersøkelsesoppgaven. I stedet for de 10<8> cellene beskrevet ovenfor, tillater foreliggende fremgangsmåte en reduksjon til en størrelsesorden på f.eks. 10<*> til 10^ celler. Disse cellene kan så dyrkes for undersøkelse på 10 til 200 petriskåler, noe som reduserer en nærmest umulig undersøkelsesoppgave til en lett gjennomførbar oppgave.
I de følgende eksempler er forskjellige mikroorganismer angitt å ha et ATCC-nummer. Hver mikroorganisme som er angitt på den måten, er deponert hos American Type Culture Collec-tion, Rockville, Maryland, og en kultur av hver er tilgjengelig for allmenheten uten restriksjoner.
Eksempel 1
A. Fremstilling og isolering av gen som koder for a-amylase.
Kromosomalt DNA med genetisk informasjon for a-amylase innkodet ble erholdt fra B. amyloliquefaciens H RUB 500 (ATCC 31592) som beskrevet nedenfor. (Se J. Virol., 14 (1972), s. 1013-1016).
B. amyloliquefaciens H ble dyrket i 50 til 100 ml av et peptonmedium. Etter omtrent 18 timers inkubering med rysting ved 37"C ble cellene isolert ved sentrifugering og vasket to ganger og resuspendert i 10 ml av en buffer som besto av 0.15M trihydroksymetylaminometanhydroklorid, og 0,1M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved en pH på 8,0. Celle-suspensjonen ble på nytt sentrifugert og lysert ved å suspendere den i 5 ml av den ovenfor nevnte bufferoppløsning, som i tillegg inneholdt krystallinsk eggehvitelysozym (1 mg pr. ml) i 30 minutter ved 37°C. Et protein-nedbrytende enzym (1 mg/ml) ble tilsatt og kulturen inkubert ved 50°C i 10 minutter og så ved 37°C i 50 minutter. Det cytoplasmatiske membranprotein-komplekset ble fjernet fra DNA'et ved behandling med en blanding av vaskemidler laget av natrium-laurylsulfat og et kommersielt tilgjengelig vaskemiddel ("Sarkosyl NL-97"). Sluttkonsentrasjonen av vaskemiddel var omtrent 2% vekt/volum sammensatt av like deler av de ovennevnte vaskemidler.
Inkubasjonen ble fortsatt ved 50°C inntil total oppløsning av de cytoplasmatiske membraner oppsto. DNA ble deretter ekstrahert tre ganger med redestillert fenol mettet med en buffer lager av 0,1M "Trizma Base" ved en pH på 8,0. DNA ble utfelt ved tilsats av 0.1M NaCl 1 10 ml kald 95* etanol, viklet opp på en glass-stav, vasket i tre suksessive oppløsninger av 7056 etanol og oppløst på nytt i lOmM "Trizma Base" inneholdende ImM EDTA ved en pH på 7,5- DNA ble lagret ved 4°C over kloroform.
Det isolerte DNA ble deretter behandlet med restriksjons-enzymet B. globigii (Bgl 11) for å hydrolysere DNA. Bgl 11-enzymet ble deretter inaktivert ved å varme opp blandingen til 68°C i 15 minutter.
B. Fremstilling og isolering av bakteriofagen cp3T.
Bakteriofagen som ble brukt var (p3T, først isolert av Tucker som beskrevet i J. Gen. Virol., 4 (1969), s. 489-504. Den anvendte cp3T ble oppnådd ved å dyrke bakteriestammen RUB 830 (cp3T) som beskrevet nedenfor. RUB 830 <p3T er beskrevet tidligere (J. Virol., 21 (1977), s. 522-529), og er tilgjengelig fra den private samlingen til Wilson og Young.
Store mengder RUB 830 (cp3T) ble oppnådd ved å dyrke RUB 830 i et vekstmedium (beregnet M) ved 32°C til en densitet på 50 Klett-enheter (Klett-Summerson kolorimeter, filter nr. 66) og indusere med mitomycin C (sluttkonsentrasjonen 0,5 pg/ml). M-medium Inneholdt: 10 g kasein nedbrutt med enzymer fra bukspyttkjertel; 5 g gjærekstrakt, 9,9 g NaCl; og 1000 ml destillert vann. Blandingen ble autoklavert og en steril oppløsning av 5 ml IM MgCl2 og 0,IM MnClg tilsatt.
Bakteriofagen RUB 830 (<p3T) ble deretter behandlet med Bgl 11 restriksjonsenzym for å hydrolysere DNA. Enzymet Bgl 11 ble deretter inaktivert ved å varme opp blandingen til 60°C i 15 minutter.
DNA fra B. amyloliquefaciens H og <p3T ble blandet og koblet sammen som beskrevet nedenfor. (Se J. Bacteriol., 121 (1975), s. 354-362).
C. Fremgangsmåte ved sammenbinding.
Sammenbindingsreaksjonen ble utført i et sluttvolum på 100 pl. DNA isolert fra B. amyloliquefaciens H og bakteriofagen (p3T ble blandet sammen, plassert på is og det følgende tilsatt: 50mM MgCl2 (10 pl), 0, IM ditioerythriol (10 pl), 0,5mM adenosintrifosfat (10 pl), vann (20 pl) og DNA-ligase (1 U/mg DNA). Reaksjonsblandlngen ble inkubert på is i 12 timer ved 14°C.
Den sammenbundne blanding som inneholdt rekombinantmolekyler, ble inkubert med kromosomalt DNA fra en B. subtilis mikroorganisme homolog med verten, men prototrof for en vekstbetingelse for hvilken verten Bacillus er auxotrof, for å fremstille en bakteriofagvektor.
100 pl av blandingen som inneholdt rekomblnantmolekylene fra C. ovenfor ble inkubert med 100 pl (1 mg) DNA fra B. subtilis RUB 200 (ATCC 31593). 200 er en stamme som er prototrof for treonin (Thr<+>) og uvirksom i a-amylase biosyntese (Arny-). D. Transformasjon og utvelging av rekombinant bakteriofag.
Hele den ovenfor nevnte blanding (200 pl) ble inkubert med 100 pl av en vertsstamme av B. subtilis RUB 201 (ATCC 31594). Verten RUB 201 er auxotrof for treonin (Thr~) og lysogen for bakteriofag (p3T (som forklart senere). Inkubasjonen ble utført ved 37° C i Vt time med lufting.
Prøver (0,1 ml) av den inkuberte verten ble fordelt på plater med Splzlzens minimal agar (tilsatt 22mM glukose, 20 jig/ml av hver av de aromatiske aminosyrene tryptofan, fenylalanin og tyrosin, 1* oppløselig stivelse, men ikke inneholdende treonin) for å anrike for celler transformert til a-amylase biosyntese (Amy<+>) og treonin uavhengighet. Celler transformert fra Thr" til Thr<+>, dvs. treonin uavhengighet, har blitt transformert ved å inkorporere DNA. Blant disse cellene vil et visst antall også ha tatt opp DNA-f ragmenter som a-amylasegenet (Amy<+>).
Det ble oppnådd omtrent IO<5> celler som var levedyktige i fravær av treonin. Celler som ikke var blitt transformert til Thr<+>, var ikke levedyktige i fravær av treonin og overlevde ikke. Transformantene ble så undersøkt for a-amylaseproduksjon ved en vanlig teknikk som omfattet å overskylle petriskålene med 12-oppløsning. Tilstedeværelsen av a-amylaseproduserende mikroorganismer ble indikert ved fremkomsten av en klar sone rundt slike celler. B. subtilis RUB 201 ble transformert til B. subtilis RUB 204 (ATCC 31595) som inneholder den rekombinante bakteriofagen cp3T som har inkorporert den genetiske informasjonen for Amy<+>.
Det ble funnet at blant de omtrent 10<5->cellene transformert til Thr<+>, var mindre enn 10 celler også omdannet til a-amylaseproduserende celler. Den beskrevne fremgangsmåte er reproduserbar. Det beskrevne eksempel ble gjentatt og lignende resultater oppnådd. Omtrent 7 Thr<+->transformanter med evne til å biosyntetisere a-amylase ble oppnådd.
cp3T bærer et gen som koder for tymidylatsyntetase (thyP3) som kan brukes som "markør". Markøren kan brukes for å vise at det klonede a-amylasegen er "bundet" til cp3T-genet og at de to er overført sammen.
En serie forsøk ble utført ved å bruke donor-DNA fra B. subtilis og RUB 204 som koder for a-amylase (Amy<+>), bakteriofag <p3T og B. subtilis RUB 205 som vertsbakterie. Det ble funnet at alle transformantene som inneholdt Amy<+>, inneholdt bakteriofagen cp3T som var Thy<+>, dvs. produserer tymidylatsyntetase. Dette er viktig fordi det viser at Amy<+ >og Thy<+> "følges ad", dvs. er på det sammen DNA-f ragment. Innføringen av bakteriofag cp3T-f ragmentet i en vert vil derfor øke sannsynligheten for å "medbringe" den ønskede Amy<+->egenskap til verten. Sagt på en annen måte, så "heftes" det fremmede DNA, f.eks. Amy<+>, til cp3T-bakteriofagen og cp3T-bakteriofagen "trekker" Amy<+> inn i vertsbakterien.
Det ble ovenfor angitt av verten B. subtilis RUB 201 var lysogen for <p3T-bakteriofagen. Dessuten er den transformerte vertsbakterien, som inneholder den rekombinante bakteriofagen q>3T ATCC 31595-B1, dvs. den transformerte verten, lysogen for den rekombinante bakteriofagen (p3T. Dette betyr at den transformerte verten inneholder den rekombinante bakteriofagen <p3T i en hvilende tilstand (men koder for Amy<+> og q>3T-bakteriofag-DNA). Den rekombinante bakteriofag cp3T kan utvinnes fra den transformerte vert ved induksjon etter kjente teknikker (J. Virol., 24 (1977), s. 522-529). Induksjon av den transformerte verten konverterer den rekombinante bakteriofag <p3T fra hvilestadiet til den vegetative reproduksjonssyklusen. Den rekombinante bakteriofag kan følgelig erholdes og replikeres ved dyrking. Videre kan den rekombinante bakteriofagen brukes til å infisere en ny Bacillus mikroorganismevert som beskrevet nedenfor.
Eksempel 2
Fem B. subtilis RUB 204 transformanter som inneholdt genet som koder for a-amylase, fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble indusert med mitomycin C og B. subtilis rekombinant bakteriofag (p3T erholdt.
Hver av de fem rekombinante bakteriofagene ble brukt til å infisere en kultur av B. subtilis RUB 200. Infeksjonen av
RUB 200 ble fulgt av inkubering av RUB 200 med B. subtilis rekombinant bakteriofag cp3T ved en temperatur på 37° C i 30 minutter med lufting.
Prøver av den inkuberte RUB 200 ble utplatet på et peptonmedium av tryptose-blod-agar-plater og undersøkt for infiserte steder, dvs. plaques ved konvensjonell teknikk. (Se J. Virol., 21 (1977), s. 522-529).
Lysogener (bakterieceller som inneholder bakteriofag) ble erholdt fra plaque-sentrene og dyrket på et medium som inneholdt stivelse og deretter testet for produksjon av a-amylase ved stivelse-^ testen beskrevet tidligere. De dannede lysogener forårsaket en klar sone som indikerer nærværet av a-amylaseproduksjon, som igjen indikerte at den rekombinante bakteriofagen var vellykket innført i bakterieverten.
Claims (1)
- Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder a-amylasegenet til heterolog transformasjon av en vertsmikroorganisme Bacillus subtilis RUB 201 (ATCC 31594) hvor transformasjonen innbefatter inkubering av verten Bacillus subtilis med en bakteriofag som er fremstilt ved å a) tilveiebringe genetiske fragmenter som koder for a-amylase fra B. amyloliquefaciens H, b) isolere DNA-f ragmenter fra en bakteriofag, (p3T, c) sammenholde DNA-fragmentene erholdt 1 trinn a) med DNA erholdt i trinn b) for å fremstille en blanding som inneholder en rekke rekombinante molekyler, d) inkubere blandingen fra trinn c) med DNA isolert fra en annen mikroorganisme, Bacillus subtilis, som ikke inneholder DNA-fragmentene erholdt i trinn a), idet den andre mikroorganismen av slekten Bacillus i det vesentlige er genetisk homolog med vertsmikroorganismen av slekten Bacillus og er prototrof for en vekstbetingelse, e) inkubere blandingen fra trinn d) med vertsmikroorganismen av slekten Bacillus, idet verten av slekten Bacillus er lysogen for bakteriofagen fra trinn b) og auxotrof for den nevnte vekstbetingelsen, for å fremstille en blanding som inneholder en transformert vert av slekten Bacillus som er prototrof for den nevnte vekstbetingelsen, lysogen for den nevnte, ønskede rekombinante bakteriofag og som inneholder den ønskede arvelige egenskap i bakteriofagen, f) selektere for den transformerte verten av slekten Bacillus ved å dyrke blandingen på et vekstmedium som ikke inneholder den nevnte vekstbetingelsen og bestemme nærværet av den ønskede arvelige egenskap, og g) erholde derfra den rekombinante bakteriofagen, (p3T (ATCC-3195-B1), som Inneholder den ønskede arvelige egenskap ved å indusere den prototrofe verten av slekten Bacillus, under betingelser som er egnet for å tillate innføring av den nevnte bakteriofagen i verten Bacillus, slik at heterolog transformasjon bevirkes.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11004280A | 1980-01-07 | 1980-01-07 | |
| NO803779A NO159863C (no) | 1980-01-07 | 1980-12-15 | Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO860456L NO860456L (no) | 1981-07-08 |
| NO160525B true NO160525B (no) | 1989-01-16 |
| NO160525C NO160525C (no) | 1989-04-26 |
Family
ID=40278915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO86860456A NO160525C (no) | 1980-01-07 | 1986-02-10 | Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder alfa- amylasegenet, til hetorolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten bacillus. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO160525C (no) |
-
1986
- 1986-02-10 NO NO86860456A patent/NO160525C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO860456L (no) | 1981-07-08 |
| NO160525C (no) | 1989-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4469791A (en) | Genetically engineered microorganisms for massive production of amylolytic enzymes and process for preparing same | |
| Ishikawa et al. | Regulation of a new cell wall hydrolase gene, cwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis | |
| Ragkousi et al. | Identification of a New Gene Essential for Germinationof Bacillus subtilis Spores withCa2+-Dipicolinate | |
| Gilmore et al. | Production of muramic δ-lactam in Bacillus subtilis spore peptidoglycan | |
| Fukushima et al. | A polysaccharide deacetylase gene (pdaA) is required for germination and for production of muramic δ-lactam residues in the spore cortex of Bacillus subtilis | |
| JPH11514219A (ja) | 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素 | |
| DK173445B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et enzym fra Serratia spp., hybridplasmid med indsat DNA-fragment fra Serratia spp. og ba | |
| JPH04507346A (ja) | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 | |
| US11655464B2 (en) | Alkaline protease mutant, and gene, engineered strain, preparation method and application thereof | |
| NO159863B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling og seleksjon av en rekombinant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme. | |
| EP0057976A2 (en) | A process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
| US4801541A (en) | Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism | |
| DK161105B (da) | Bakteriophag samt fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
| Martin et al. | The mmsA locus of Streptococcus pneumoniae encodes a RecG‐like protein involved in DNA repair and in three‐strand recombination | |
| US4464471A (en) | Biologically engineered plasmid coding for production of β-glucosidase, organisms modified by this plasmid and methods of use | |
| Rashid et al. | Bacillus subtilis mutant deficient in the major autolytic amidase and glucosaminidase is impaired in motility | |
| Masai et al. | DnaA-and PriA-dependent primosomes: two distinct replication complexes for replication of Escherichia coli chromosome | |
| JPH099958A (ja) | スクロース代謝突然変異体 | |
| NO160525B (no) | Anvendelse av en rekombinant bakteriofag som inneholder alfa- amylasegenet, til hetorolog transformasjon av en vertsmikroorganisme av slekten bacillus. | |
| NO170594B (no) | Fremgangsmaate for heterolog kloning av gen i bacillus mikroorganisme | |
| US4886754A (en) | Recombinant bateriophage for heterologous cloning of bacillus microorganisms and method for its production | |
| JPH11514527A (ja) | バキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用の陽性選択ベクター | |
| JPS6253150B2 (no) | ||
| SK278079B6 (en) | Microorganism of race escherichia coli or pseudomonas putida, method of its growing and recombinant dna | |
| DK170735B1 (da) | Plasmid, mikroorganisme indeholdende samme samt anvendelse deraf ved fremstilling af amylaser |