DK173445B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et enzym fra Serratia spp., hybridplasmid med indsat DNA-fragment fra Serratia spp. og ba - Google Patents

Description

DK 173445 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym fra Serratia spp.. hvilken fremgangsmåde omfatter dyrkning af en bakterie, som ikke er Serratia spp.. hvilken bakterie indeholder et hybridplasmid, som indeholder DNA fra Serratia spp. kodende for et 5 Serratia spp. enzym, idet Serratia spp. enzymet udskilles af bakterien i dyrkningsmediet, og enzymet høstes fra kulturen. Opfindelsen angår endvidere et hybridplasmid, som omfatter et indsat DNA-fragment fra Serratia spp.. som koder for et ekstracellulart Serratia sno, enzym, hvilket DNA-fragment vælges blandt et DNA-fragment, der koder for en 10 Serratia spp.nuklease og et DNA-fragment, der koder for en Serratia spp. phospholipase samt en bakterie, som ikke er Serratia spp.. indeholdende et sådant hybridplasmid, hvilken bakterie er i stand til at udtrykke det i plasmidet indsatte DNA-fragment fra Serratia spp. . der er anvendelige til denne fremgangsmåde. Ét af de fremstillede 15 enzymer, nuklease, er nyttig til fjernelse af nukleinsyre fra et biologisk materiale.

Serratia spp. har vist sig ot producere et antal hydrolytiske enzymer, som udskilles til dyrkningsmediet. Dette er i modsætning til andre gram-negative bakterier, fra hvilke proteiner fortrinsvis udskilles til det periplasmiske rum, fremfor til det omgivende medium. Sådanne periplasmiske proteiner har tendens til at sive ud i dyrkningsmediet, specielt når cellerne dyrkes til store tætheder.

DNA, der koder for ekstracellulære Serratia spp.enzymer (dvs. eks-2o tracellulære, når de udtrykkes i Serratia) er isoleret, og mikroorganismer, der er velegnede til industriel produktion af genprodukter og som indeholder Serratia DNA'et, er dyrket og har vist sig at producere Serratia-enzymer.

Det har også vist sig, at når hybride plasmider, der indeholder indsat DNA kodende for et ekstracellulært Serratia spp. enzym, blev indsat i en anden mikroorganisme, som i sig selv ikke noi'raalt udskiller sine genprodukter til dyrkningsmediet, fx E. coli, blev Serratia-enzymet i nogen grad udskilt fra E. coli til dyrkningsmediet (jfr. eksemplerne 1 og 6). Det er derfor muligt delvist at oprense en del af Serratia-enzymet udskilt til dyrkningsmediet fra E. coii-cellerne på en relativ simpel måde, fx ved filtrering, hvor E. coli-cellerne fjernes, og fældning af enzymerne fra filtratet, fx med ammoniumsulfat. I denne sammenhæng skal udtrykket "udskille" forstås som en transport af et genprodukt gennem i det mindste cellens cytoplasmiske membran.

2 DK 173445 B1

Et aspekt af opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym fra Serratia spp., omfattende dyrkning af en bakterie, som ikke er Serratia spp., hvilken bakterie indeholder et hybrid-plasmid, som indeholder DNA fra Serratia spp. kodende for et Serratia 5 spp. enzym, idet Serratia spp. enzymet udskilles af bakterien i dyrkningsmediet, og enzymet høstes fra kulturen.

I en speciel udførelsesform angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af Serratia spp. enzymer, der i det væsentlige er fri for andre bakterielle proteiner.

10 Dyrkningen af mikroorganismer udføres fortrinsvis i et flydende dyrkningsmedium, der indeholder næringsstoffer og mineraler, der er nødvendige for den optimale vækst af mikroorganismen. Enzymet kan isoleres på en allerede kendt måde. Som nævnt ovenfor, kan oprensningen af enzymet udfores ved filtrering, hvor værtscellerne 15 fjernes, og udfældning af enzymet fra filtratet. Normalt opløses præcipitatet derefter i en velegnet puffer, fx Tris-EDTA, med efterfølgende dialyse til fjernelse af fældningsmiddel.

Eksempler på hydrolytiske enzymer, der produceres af Serratia spp. er en nuklease, som hydrolyserer nukleinsyrer til nukleotider, oligonu-kleotider eller mindre nukleinsyrefragmenter, og en lipase og en phospholipase, som hydrolyserer fedtsyrer fra lipider og phospho-lipider.

25 Bakterien er fortrinsvis en gram-negativ bakterie. Det er normalt ikke ønskeligt at anvende Serratia spp. til produktion af Serratia spp. enzymer, da Serratia spp. er opportunistiske patogene bakterier, hvilket kan begrænse deres anvendelighed som produktionsmikroorganismer. Endvidere producerer Serratia spp. en ekstracellulær protease, som kan kontaminere det ønskede produkt. De foretrukne gram-negative 3Q bakterier til anvendelse som produktionsmikroorganismer til produktion af Serratia spp. enzymerne er bakterier, der generelt anvendes til produktion af genprodukter, såsom B. coli.

35 3 DK 173445 B1

Opfindelsen angår også et hybridplasmid, som indeholder DNA fra Ser-ratia spp. kodende for et ekstrncellulært Serraria spp. enzym, som beskrevet ovenfor.

5 Plasmtder, der er anvendelige som vektorer til fremstillingen af enzymerne ifølge opfindelsen, kan være en hvilken soin helst type plasmid, normalt anvendt til dette formål, og som er i stand til at replikere i den pågældende bakterie. PIasmider, som kan anvendes til produktion af store mængder af de pågældende enzymer, er fx 10 de såkaldte runaway-plasmider. dvs. plasmider ined et kondiciohelt ukontrolleret replLkationsopforsel. Plasmider, der udviser denne opforsel, er beskrevet i fx USA-patentskrift nr. 4,495,287 og europæisk offentliggorelsesskrift nr. 0L09150.

Bakterielle nukleaser er enzymer, som har betydelig værdi ved oprensning af fx proteinprodukter, fremstillet ved fermentering af bakterier, såsom produkter fremstillet ved fermentering af celler, der er modificeret ved rekombinante DNA teknikker, og som producerer produkter, der ikke naturligt er knyttet til den 20 pågældende celle. Et vigtigt trin i oprensningen af disse produkter er at separere proteinprodukterne fra nukleinsyren, der stammer fra cellerne. Denne oprensning, der når den udføres med kemiske standardbehandlinger, såsom udfældning af nukleinsyrerne, medfører en risiko for tab af det ønskede produkt produceret af cellerne, hvilket 25 skyldes den høje viskositet af materialet, der indeholder det ønskede produkt, hvilket gør separationen deraf vanskelig, hvorimod nedbrydningen af nukleinsyrerne ved hjælp af nuklease ikke medfører noget væsentligt tab af det ønskede produkt. Den effektive og fuldstændige fjernelse af nukleinsyrer fra produkterne er også vigtig, fx når 30 produkterne skal anvendes til indgift i mennesker, idet det er et krav fra sundhedsmyndighederne i visse lande, at produktet ikke må indeholde hybridiserbart DNA fra cellerne, der er anvendt til at producere det pågældende produkt.

Et højst interessant enzym, produceret af Serraria spp., er derfor nuklease, som har vist sig at være meget virkningsfuld, og som er af , DK 173445 B1 4 stor Industriel vigtighed til fjernelse af nukleinsyrer fra et biologisk materiale. 1 nærværende sammenhæng skal udtrykket "fjernelse af nukleinsyrer" betyde, at lange nukleinsyresekvenser nedbrydes til korte fragmenter eller oligonukleotider eller i visse tilfælde til 5 mono- eller dinukleotider. Dette betyder, at produkterne, der resulterer fra indvirkningen af nuklease, er forholdsvis nemme at fjerne ved konventionel 1 p separat i onsnieroder.

Ved en foretrukket udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er 10 det fremstillede enzym en bakteriel nuklease, som er en Serratia spp· nuklease med følgende aminosyresekvens (udledt fra DNA-sekvensen ved en i og for sig kendt metode om omfattende det N-terminale signalpeptid) :

MetArgnieAsnAsnLyBMetLeuAl&LeuValAlaLeuLeuRieAlaAlaGlnALaSerAlaAsp 15

ThrLeuGluSerlleAspAsnCysAlaValGlyCysProThrGlyGlySerSerAsnValSerlleValArg HisAlaTyrThrLeuAsnAsnA snSerThrlhrLysftieAlaAsnTr pValAlaTyrHielleThrLysAsp ThrProAlaSerClyLysThrArgAsnTrpLysThrAspProAlaLeuAsnProAlaAspThrLeuAlaProAla 20

AspTyrThrGlyAlaAsnAlaAlaLeuLysValAspArgGlyHisGlnAlaProLeuAlaSerLeuAlaGly ValSerAspTrpGluSerLeuAsniyrLeuSerAsnUeThrProGlnLysSerAspLeuAsnClnGlyAla TrpAlaArgLeuGluAspGlnGluArgLysLeuIleAspArgAlaAsplleSerSerValTyrThrValThr 25 ClyProLeuTyrGluArgAspMetGlyLysLeuProGlyThrGlnLysAlaHisThrlleProSerAlaTyr TrpLysValUe PheUeAsnAsnSerProAlaValAsnHiBTyrAlaAlaPheLeuFheAspGlnAsnThr ProLysGlyAlaAspPheCysGlnFheArgValThrValAspGluUeCluLysArgThrGlyLeuIleUe

TrpAlaClyLeuProAspAepValGlnAlaSerLeuLysSerLyeProAlaSerCyeArgSejf

JU

Til specielle anvendelser, såsom når cn nuklease skal anvendes til at fjerne residuale nukleinsyrer Fra et ellers i det væsentlige oprenset 35 5 DK 173445 B1 bio syn te ti. sk produkt (som er beskrevet mere detaljeret nedenfor).

. skul enzvmet fortrinsvis være i en i det væsentlige ren form. For at opnå et i det væsentlige rent enzym, kan en rå enzympræparation blive deLvis oprenset ved ultrafiltrering eller fældning med, fx ammonium-5 sulfat og derefter underkastet yderligere oprensning ved. fx chroma* tografi (såsom ionbvtningschromatografi eller affinitetschromato-grafi) eller præparativ gelelektroforese. I nogle tilfælde vil det være en fordel at tilvejebringe enzymet i immobiLiseret form på en velegnet matrix, da det kan lette fjernelsen af nukleasen efter brug 10 og også muliggøre, at enzymet kan anvendes endnu en gang. Eksempler på sådanne matrixmaterialer er dextran- eller agarosegeler eller et uorganisk materiale, såsom siliciumholdigt materiale, fx silicium-dioxid eller* kiselsyre og derivater deraf. Immobiliseringen kan foretages på i og for sig kendt måde.

15

Et andet potentielt interessant enzym er phospholipase, der produceres af Serratia spp. derfor en Serratia spp. phospholipase, der kodes af følgende DNA-sekvens: 20 25 30 35 6 DK 173445 B1

ATC^CTATÆCTriAACrimCCTCTCX^CTATCæCCCTCGCCCX^TCCCTACaiCTCOCCCCCCrOCCCAGACCXCCACCC 5 IACTCAIAOX]AAATTCAAMTQGAGACCTCAIACCCOCCACCCCCCCTAGOGATCCGGACCGCCCCGACCCCTCTCCCCCTCCC

cgccgaccctcccgcacgccggcaaatccccgcccgtgocctctccctctcagaacaccctgaacgcgcagaatctcttgaaiac CX^GCTCCGACGCCCrrGCGGCCGTTlAGCCCCCCCCACCCCAGACCXlAGAGTCrorrGCCACrrCCCCCTCrTACACAACTTATCi GCTCCTCCGCGATAT CTCAGCCGCGGCACCGACCCC(XCC(^(XCCCG(XXX71XACGCCCGGCCAGCAA'rCGCA(XlAOCGOGAT OGACCAGCCCCTAIA GAffrcCCCGCCGTCGCTGCCCCCCCCCrCGCGCCCCGCACTCCGCCCCCGTCGTtACX^CTCCrCCCCCrA.

TATGCl^TGCCCCTCTITrGGCCAACGACCTT TACrCACTCMTGCCCACCGCGCCGCCGC(7rri^CCCCCT(^CCGAC>CCCCrC ATACGCAACCCCGACAACCCGTICCTCCAA ATGAGTGAGTEACCGCTrCCCGCCGCCGCCCAAGTTGGCGGACTCCXrrGTGCCGAO

CTCGCITTCiX^TCGATXrCCCCCAGCCTGCACGACCCGGGCAGCGGT^TCCCAGGCTGGGATTTACAGCAAC^CAAACACTAT

15 GACCCAMCCCCTAGCIAGGGCCGTCGGACGTGCTGCGCCCCTCC CXlAAACGCrCCGACCCTAAATGTCGTTGCTCITIXriX>iA

GTCrrGGCCTTCGCCGGCACCAACGACTCCCCGCGATrGGCTXIAGCAACGTGCGCCAGGC GACGGGCTATGACGATGTGCAGTAC CACAACCGCAAGCCGCCCTGGTrCCrGACCGGCGdAACCGACTCGTrGCACGCCGTCCG CTGCCCGATACTGCTACACGTCATG

AATCAGGCGGXTGCCGCTGCCAAAAGCCGCCAAGGCGGCCTTCGGCGATGCGCTGCTGATCCJCCGGCCATrCGCr TGGCGCTGCT TTAGTCCGCCAACGGCGACGGmTCCCCGGTTCCGCCGGAAGCCGCTACGCGACCACIAGCGGCCGCTAAGCGA ACCGCCACCA

20

CTGGCGGCCACCGCCGCCCTCGCGACCCGCACCGTCCCGGTCACCTrCAACGCGCCCGGGGTCTCGGATTACACCCTGAATCGCCT

GACCGCCCGTCCCGCCGCGACCCCTGGCCGTCGCAGCGCCAGTGGAACTrTGCGCCCGCCCCAGAGCCTAATCTrCCGACTTACCGGA

gcgcatcgatcccgccccagcgaagaaagatgccgaagccgcccgcattcgcccteacagcgaccaatatgacatgctgaccacca

CCCC lAGCTAGGCCCCCGTCGCTTCTTTCIACGCOTCGGCCOCCGTAACCGCCATGTCCCTCCTXATACTGTACGACrCGTCGT

25

CCCAGGAGTCGACCTCGCrGATCCCGGATGCCATCCGCCACAACATCACCCTGGCCAACAACGATACCCTGACCCXiCATCCATGA COTCCTCACaCGAGCGA CTAGCCCCTACGCTAGCCCGTCrTGXACTCGGACCCGITCrrCCTATGGCACTCGCCGXAGCTACI

CTGCCGGCCGACCAAACATCTCGATCCCACCCTCACCCCCCACCCCATCGACAAGCrGAXAAGCrCGATCCOCGAACAAAAGCCC GACCæCCCCTCGTnmGACCIAGCGTCGGAC TCCCCCCTCCCGTAGCTGTTCCACTATrCGAGCTACCCCCrTGTTriCGGC

TCCGACCCGAACOCCAATGCCtrC^ 30 accctccgcttcccctiaccgact

Det ifølge opfindelsen fremstillede Serratia spp. nuklease er nyttig i en komposition til fjernelse af nukleinsyrer fra et biologisk materiale. I denne sammenhæng skal udtrykket "biologisk 35 materiale" forstås som ethvert materiale, i hvilket mindst én komponent er af biologisk oprindelse. Udtrykket har derfor til hensigt at inkludere en opløsning af nukleinsyrer alene (fx stammende 7 DK 173445 B1 fra iu vitro laboratoriearbejde), ot fermenteringsmedium indeholdende en cellekultur, der producerer et biosyntetisk produkt, et fevinen-teringsmedium, i hvilket en cellekultur, der producerer et biosyntetisk produkt, har været dyrket (og som derfor kan indeholde dette 5 produkt såvel som nukleinsyrer stammende fra en spontan cellesprængning) eller en resuspension af en cellekultur, som producerer et biosyntetisk produkt, efter at cellerne er blevet hostet fra mediet, fx ved centrifugering, hvilken cellekultur består af enten hele eller lyserede celler.

10

Udtrykket "biosyntetisk produkt" skal forstås som et produkt, som kan være et protein, polypeptid, glycolipidcarbonhydvat eller en forbindelse med lav molekylvægt. Nukleinsyrer er specielt betydningsfulde kontaminanter, når det biosyntetiske produkt ikke udskilles fra cel-.jg len, hvilket nodvendiggorer cellelyse for at kunne høste produktet, idet de meddeler cellelysatet viskositet i en sådan udstrækning, at oprensningen af produktet bliver vanskelig. For at reducere viskositeten i et cellelysat er det derfor fordelagtige at anvende en komposition, som indeholder en nuklease såsom en Serratia spp. nuklease 20 fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Nukleasen kan fx have en aminosyresekvens, som vist ovenfor. Nukleasekompositionen må fortrinsvis være i det væsentlige fri for proteolytisk aktivitet, da tilstedeværelsen af proteaser i en komposition af denne art ville være en særdeles væsentlig grund til nedbrydning af proteinprodukterne, der gg er produceret af cellekulturen. Nukleasen, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og hvor genet, der koder for denne, stammer fra en Serratia spp. organisme, har faktisk vist sig at være i det væsentlige fri for proteolytisk aktivitet (se eksempel 2); det skal nævnes, at en i det væsentlige proteasefri komposition er 20 særdeles vigtig, når kompositionen skal anvendes til fjernelse af residuale nukleinsyrer fra et ellers oprenset proteinprodukt, idet den proteolytiske aktivitet af lysatet i sig selv langt vil overskride en eventuelt proteolytisk aktivitet, der måtte være tilbage i nukleasekompositionen, når nukleasen tilsættes til et uoprenset cel-__ lelysat. Den i det væsentlige proteasefri nukleasekomposition er

Us) 8 DK 173445 B1 derfor specielt fordelagtig at anvende (naturligvis i en i det væsentlige ren form) sammen med proteinprodukter, som allerede har været igennem flere oprensningstrin.

g Eksperimenter har vist, at selv når et overskud af nuklease tilsættes til et cellelysat (mere end der skal til for at sikre en reduktion af den viskositet, der kan tilskrives nukleinsyrekomponenterne i lysa-tet), kan en mindre fraktion af nukleinsyrer blive tilbage og kon-taminere proteinproduktet. Dette menes at være resultatet af en 1Q "maskering” af nukleinsyrerne, fx i form af interaktioner mellem nukleinsyrex-ne og membranen og/eller proteinkomponenterne i lysatet.

Fuldstændig fjernelse af nukleinsyrer (defineret som manglende tilstedeværelse af nukleinsyrer, der er hybridiserbare med DNA- eller RNA-prober) er imidlertid ofte krævet af sundhedsmyndighederne i ig flere lande (fx FDA), når de biosyntetiske produkter fremstillet ved hjælp af rekombinante DNA-teknikker eller ud fra vævskulturer skal anvendes til medicinske formål. Når sådanne produkter skal anvendes til andre formål, hvor tilstedeværelsen af selv små mængder af nukleinsyrer kan lægge hindringer i vejen for det onskede resultat, 2q ar den fuldstændige fjernelse af residuale nukleinsyrer også i hoj grad ønskelig. Nærværende opfindere har fundet, at sådanne residuale nukleinsyrer fuldstændig kan fjernes, når visse detergenser eller proteindenatureringsmidlpr tilsættes sammen med nukleasen. Til anvendelser, hvor den fuldstændige fjernelse af nukleinsyrer er 25 påkrævet, er det derfor fordelagtigt, at kompositionen omfatter en nuklease, såsom en Serratia spp. nuklease, sammen med et detergens og/eller et chaotropisk middel. Det’ergenset kan fx være et ikke-ionisk detergens, såsom en polyoxyethylenalkohol, fx Brij· 58, eller en octoxynol, fx Triton· X-100, eller et ionisk 2Q detergens, såsom natriumdodecylsulfat (SDS) eller et deoxycholat, såsom natriumdeoxycholat. Det chaotropiske middel kan vælges blandt urinstof, thiourinstof eller et salt af thiocyansyre.

Endvidere er Serratia spp. nuklease fremstillet ifølge opfindelsen nyttig i en fremgangsmåde til fjernelse af nukleinsyrer fra et biologisk 35 DK 173445 B1 9 materiale (som defineret ovenfor), ved hvilken en Serratia sop. nukle-ase sættes til det biologiske materiale. Fremgangsmåden er specielt anvendelig i forskellige situationer, hvor kontaminering med nukleinsyrer er et problem, såsom hvor det biologiske materiale omfatter en 5 affaldsopløsning eller -suspension af nukleinsyrer, som stammer fra fx in vitro eksperimenter med nukleinsyrer og kontamination af laboratorieudstyr; hvor det biologiske materiale omfatter et fermenteringsmedium indeholdende en cellekultur, der producerer et biosyntetisk produkt (som defineret ovenfor), i hvilket tilfælde nukleasen 10 kan tilsættes før eller efter cellelysen i en tilstrækkelig mængde til at sikre fjernelse af størstedelen af nukleinsyrerne i materialet; hvor det biologiske materiale omfatter et fermenteringsmedium, i hvilket en cellekultur producerende et biosyntetisk produkt har været dyrket, og fr« hvilket cellerne derefter' ex* blevet fjernet, i hvilket 15 tilfælde mediet kan indeholde en vis mængde af nukleinsyrer, der skyldes spontan cellesprængning og eventuelt et biosyntetisk produkt, der udskilles fra cellerne til mediet; og hvor det biologiske materiale omfatter en resuspension af en cellekultur, der producerer et biosyntetisk produkt efter fjernelsen af fermenteringsmediet, i 20 hvilket tilfælde nukleasen kan tilsættes før eller efter cellelyser-ing. Nukleasen kan være den, hvis aminosyresekvens er vist ovenfor.

Opfinderne har fundet, at specielt fordelagtige resultater kan opnås, når nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen tilsættes til det biologiske materiale før cellelysering. Eksperimenter har vist, at en høj grad af 25 reproducerbarhed med henblik på elimination af viskositeten af lysater af fx E. coli (såsom optøede frosne lysater-og fransk-presse lysater) opnås, når nukleasen tilsættes til cellekulturen (opslæmmet eller i medium) før cellelyseringen. Det har også overraskende vist sig, at en kortere tidsperiode (i størrelsesordenen minutter i stedet 30 for timer) og et lavere temperaturniveau er nødvendigt til opnåelse af en vis relativ viskositet, end når nukleasen tilsættes efter cellelyse, hvilket resulterer i et højere udbytte af det biosyntetiske produkt (fx mindre nedbrydning af et proteinprodukt under fjernelse af nukleinsyrer).

Mange sundhedsmyndigheder kræver, at rekombinante organismer skal dræbes inden de lukkes ud fra det lukkede fermenteringssystem. 1 35 10 DK 173445 B1 mange tilfælde finder dette sted ved tilsætning af phenol og toluen under den sidste fase af fermenteringen. Det har vist sig, at nukleasen fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse bibeholder sin aktivitet i nærværelse af de mængder af phenol og toluen, der kræves for at slå cellerne ihjel i fermentoren.

Når nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen sættes til et biologisk materiale for at reducere viskositeten af materialet, indeholder slutproduktet af nukleasebehandlingen forskellige størrelser af nukleinsyrefrag-menter og oligonukleotider, frem for kun mono- eller di-nukleotider.

Til visse formål, fx når det er ønskeligt at fremstille et slutprodukt af stor renhed, fra hvilket alle hybridiserbare nukleinsyrer er fjernet, anbefales det at sætte enzymet til et produkt, som allerede er blevet renset, fx i det mindste hovedsagelige skilt fra andre ^ komponenter i det biologiske materiale.

Som omtalt ovenfor har det vist sig, at residuale nukleinsyrer, fx nukleinsyrer som forbliver i et biologisk materiale efter en begrænset nebrydning (hvor nuklease er tilsat i et sådant overskud for at reducere viskositeten af materialet, at ingen yderligere tilsæt- 20 ning af nuklease vil reducere mængden af nukleinsyrer yderligere), udgører en ganske lille fraktion, faktisk mindre end 0,1% af den totale mængde af nukleinsyrer i et givent biologisk materiale og repræsenterer nukleinsyrer, som normalt er utilgængelige for nukleasen på grund af interaktioner med membrankomponenter og/eller proteiner, 25 som diskuteret ovenfor. Det har vist sig, at hvis nukleasebehandlin-gen finder sted i tilstedeværelse af et detergens og/eller et chao-tropisk middel, kan de residuale nukleinsyrer nedbrydes.

30 Nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen er endvidere nyttig i en fremgangsmåde til fjernelse af residuale nukleinsyrer fra et biosyntetisk produkt, ved hvilken nukleasen tilsættes i nærværelse af et detergens og/eller et chaotropisk middel for at bedbryde nukleinsyrer, der er til stede som oligonukleotider eller nukleotider, som ikke kan opdages ved hybridisering. Detergenserne og de chaotropiske midler fungerer sandsyn-35 ligvis ved at modarbejde de hydrofobiske og elektrostatiske kræfter, som er ansvarlige for dannelsen af en complex struktur, i hvilken segmenter af nukleinsyrer forbliver utilgængelige for nukleasen.

DK 173445 B1 11

Detergensevne og de chaotropiske midler der vælges, skal være nogle som Ikke permanent beskadiger den sekundære og tertiære proteinstruktur af et hvilket som helst af de ønskede proteinprodukter, der er til stede i det biologiske materiale, fx et stof som kan 5 fjernes efter, at nukleasen har virket i nærværelse deraf til fjernelse af residuale nukleinsyrer på en sådan måde, at den-korrekte struktur af produktet opnås. Sådanne detergenser og chaotropiske midler kan fx være dem, der er omtalt ovenfor. Når et detergens eller et chaotropisk middel anvendes, må det påses, at sådanne stoffer ikke 10 inkorporeres i sådanne mængder, at nukleaseaktiviteten vil svækkes eller endog fjernes. Når detergenset er et ikke-ionisk detergens, tilsættes det sædvanligvis i en mængde på 0,2-1,5%, specielt arikring 0,4-1,0%, af det biologiske materiale. Når det er et ionisk detergens, tilsættes det generelt i en mængde på 0,01-1,0% af det bio-15 logiske materiale. Det chaotropiske middel tilsættes sædvanligvis i en mængde på 2-8 M (ca. 10-50 vægt/volumenprocent af det biologiske materiale).

Fra at opnå et produkt, som er fuldstændi fri for nukleinsyrer, kan det 20 være en £°rdel først at anvende nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen i et tidligt trin af fremstillingsprocessen, for at reducere viskositeten af cellelysatet og for at fjerne størstedelen af nukleinsyrerne, deler til stede deri. I et efterfølgende trin i oprensningsproceduren, kan den oprensede nuklease anvendes i opløsning eller i immobiliseret 2g tilstand for at fjerne alle residuale nukleinsyrer fra produktet.

Det påtænkes endvidere, at en nuklease-indeholdende sammensætning kan anvendes til fjernelse af de enfektiøse dele af infektiøse agentier, enten som et middel til at sikre fjernelse af selve den infektiøse del, eller som et middel til at genvinde sådanne 30 komponenter fra disse agentier, som kan være ønskede til fremstilling af vacciner eller diagnostiske midler. 1 denne sammenhæng skal udtrykket "infektiøse agentier" forstås som et levende eller ikke-levende agens, hvis infektiøse del kan tilskrives nukleinsyrekom- ponenter. Disse nukleinsyrekomponenter kan kode for RNA-arter og/ eller proteiner, der er essentielle for den infektiøse del (de kan fx være nødvendige for formeringen), eller de kan spille en ren strukturel rolle i det infektiøse agens. Infektiøse agentier kan således 35 12 DK 173445 B1 inkludere plasinider, vira, bakterier, prioner og parasitter.

Den infektiøse del af disse agentier kan i nogle tilfælde ødelægges ved hjælp af kemikalier, men det kan i mange tilfælde være en fordel _ at anvende en nuklease til dekontamineringsformål. Frie DNA-molekyler 5 såsom plasmider, der frigives fra celler under vækst, kan fx let nedbrydes ved hjælp af nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen, hvilket også er tilfældet med potentielt infektiøst DNA, der er til stede i affaldsmaterialet fra laboratorieforsøg. Som en sikkerhedsforanstalt* ^ ning kan det ofte også være ønskeligt at fjerne nukleinsyrer fra affaldsmaterialet, der er dannet ved industriel produktion af biosyntetiske produkter ved rekombinant DNA-teknikker. Hvis nuklein-syrekomponentei'ne i de infektiøse agentier, der er til stede i sådant affald, ikke er tilstrækkelig tilgængelige for nukleasen ifølge op- findelsen, kan den samtidige tilsætning af et detergens eller et 15 chaotropisk middel anbefales, som beskrevet ovenfor, for at fjerne alle de tilstedeværende nukleinsyrer.

En yderligere påtænkt anvendelse af nukleasen fremstillet ifølge op-20 findelsen er i produktionen af antigener og vacciner. 1 øjeblikket anvendes svækkede bakterie- og virusstammer normalt til at fremkalde en immunologisk reaktion over for mere virulente medlemmer af den samme art, hvor en betydningsfuld fordel af bevarelsen af fuldstændigheden af komplicerede antigene strukturer på overflade af eller inde i det infektiøse agens under den begrænsede periode af udbredelsen af midlet in vivo. Ved 25 brug af nukleasen fremstillet ifølge opfindelsen vil det være muligt at bevare den antigene kompleksitet, der tillader at en immunologisk reaktion vendes mod alle stærke antigene determinanter, der er knyttet til det pågældende infektiøse agens, samtidig med at risikoen for vaccinationssequelae undgås, hvilket lejlighedsvis ses i forbindelse 30 med levende vacciner, hvor svækkede organismer anvendes. Nukleasen ifølge opfindelsen kunne bruges til fjernelse af nukleinsyrekom- ponenter fra sådanne infektiøse agentier, eventuelt sammen med et detergens og/eller et chaotropisk middel, der gør nukleinsyrerne tilgængelige for nukleasen, hvor detergenset eller det chaotropiske 35 middel og koncentrationen, i hvilken de anvendes, vælges således, at det ikke griber ind i den pågældende antigene struktur.

13 DK 173445 B1

Det har vist sig at de Serratia spp. hydrolytiske enzymer, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, expresseres sent i vækstfasen af bakterierne, der producerer enzymerne, uanset om disse var Serratia spp. eller E, coli. Soni vist i eksemplerne er 5 denne sene ekspression et resultat af det genekspressionsregulerende mønster i en regulatorisk region, fra hvilken ekspressionen af de pågældende gener initieres. Under størstedelen af kulturens eksponentielle vækst fremstilles der således lidt eller intet hydro-lytisk enzym, hvorimod en høj genekspressionshastighed forekommer, 10 når cellerne går ind i den sene eksponentielle vækstfase. I den forbindelse skal udtrykket "regulatorisk region" forstås som en molekylær sekvens, der er involveret i transkriptionskontrollen af et gen, der omfatter sådanne sekvenser som promotoren, alle bindingssteder for regulatoriske proteiner (der regulerer genekspres-15 sionen), fx cyclisk AMP-bindende protein (CAP), og sekvenser med endnu ukendte funktioner i transkriptionskontrollen, men som ved deletionskortlægning er fundet at være vigtige for transkriptionskontrollen.

2Q Dette regulatoriske pi'incip kan anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse til tilvejebringelse af et plasmid, der omfatter en regulatorisk region, fra hvilken ekspression af et gen, der er placeret nedstrøms for den regulatoriske region, er initieret eller forøget i en sen vækstfase af bakterien, der indeholder plasmidet. Genet kan være et, som ikke naturligt er tilknyttet den regulatoriske region.

En regulatorisk mekanisme som beskrevet ovenfor, hvor genekspressionen initieres eller forøges i en sen vækstfase for bakterien, er ofte fordelagtig og ønskelig for produktionskulturer. I en 30 fermenteringsproces er en høj celletæthed, der forekommer sent i fermenteringen, således den potentielt mest produktive periode for kulturen og under denne periode, kan det være af stor værdi at have en høj genekspressionshastighed. Dette opnås normalt ikke ved anvendelse af kendte promotorer, idet deres aktivitet sædvanligvis følger 35 kulturens væksthastighed og derfor er minimal på det trin, hvor celletætheden er højest. Det specielle mønster for de regulatoriske regioner fundet hos Serratia spp. gener kan også være af speciel 14 DK 173445 B1 værdi i tilfælde, hvor produkterne, der skal fremstilles af kulturern, er toxiske for den pågældende bakterie, idet bakterien kun vil fremstille det toxiske produkt, når væksten allerede eller næsten er stoppet.

5

Plasmidet ifølge opfindelsen kan omfatte en regulatorisk region, fra hvilken ekspression af et gen placeret efter den regulatoriske region initieres eller forøges i en sen fase af væksten fra mikroorganismen, der indeholder plasmidet. En sådan regulatorisk region er specielt anvendelig 10 ved regulering af ekspressionen af et gen, der ikke naturligt er tilknyttet den regulatoriske region, såsom når plasmidet, der indeholder den regulatoriske region skal anvendes som klonings- eller produktionsvektor med det formål, at der ved fermenteringen af bakterien, der indeholder plasmidet, opnås mange forskellige 15 biosyntetiske produkter til tekniske og medicinske anvendelser. Eksempler på sådanne biosyntetiske produkter er polypeptider og proteiner eller fragmenter deraf, enzymer og ikke-proteinprodukter fra enzymreaktioner med en forbindelse i næringsmediet, produkter med lav molekylvægt såsom hormoner og nukleinsyrer; produkter, som forventes 20 at være af speciel interesse, er produkter af eucaryote, specielt mammale gener og som nævnt ovenfor produkter, som er toxiske for bakterien, i hvilken de produceres.

Den regulatoriske region kan være en, der findes i Serratia spp. gener, selv om det forventes, at lignende regulatoriske regioner også kan findes i andre organismer. De regulatoriske regioner er specielt en nuklease- eller phospholipase-regulatorisk region fra Serratia spp,, eksempler på hvilke er vist på henholdsvis fig. 7, position 1-385 og fig. 9, position 201-415.

30

En regulatorisk region, som beskrevet ovenfor, kan indsættes i en hver kendt eller ny klonings- eller produktionsvektor ved hjælp af rekombinant DNA-standardteknikker.

Specielt interessante plasmider, der er anvendelige som klonings-35 eller produktionsvektorer, og som indeholder den ovenfor nævnte type 15 DK 173445 B1 af regulatorisk region, er de såkaldte runaway-plasmider, dvs. plas-mider med et konditionelt ukontrolleret replikationsmønster. PIas-mider, der udviser dette mønster er omhandlet i fx USA-patent nr.

4,495,287 og europæisk offentliggørelsesskrift nr. 0109150.

5

Styrken af pi'omotoren, der er indeholdt i den regulatoriske region af fx nukleasegenet, er ikke altid tilstrækkelig til visse produktionsformål, og derfor kan den regulatoriske regions evne til at give vækstfaseafhængig ekspi*ession af et gen, der er placeret nedstrøms ^ for den regulatoriske region, blive yderligere udnyttet ved at erstatte den tilstedeværende promotor med en stæi'kere konstitutiv promotor på en sådan måde, at den vækstfaseafhængige ekspression er bevaret.

Ud over anvendelsen af det regulatoriske område til ekspressionen af 15 et biosyntetisk produkt, er en speciel interessant anvendelse af den regulatoriske region at anvende den til øget transkription af et gen, der er placeret neden for den regulatoriske region, hvilket gen er involveret i replikationskontrollen af det bakterielle plasmid og derved forårsager ukontrolleret plasmidreplikation (såkaldt runaway- 20 replikation) i en sen vækstfase af celler, der indeholder plasmidet.

De fleste hidtil beskrevne runaway-replikationsvektorer (jfr. fx europæisk offentliggørelsesskrift nr. 0109150) kræver en ydre ændring af vækstbetingelserne, fx en forøgelse i temperatur, for at initiere ukontrolleret replikation. Ved at anvende de regulatoriske regioner, 25 som er beskrevet ovenfor, til regulering af plasmidreplikation, er en ny fremgangsmåde blevet mulig, nemlig initieringen-af runaway-replikation som en funktion af vækstfasen af celler, der indeholder plasmidet. Denne fremgangsmåde er fordelagtigt set fra tre synsvinkler.

For det første er det ikke nødvendigt at ændre de ydre vækstbe-30 tingelser, for det andet er det ikke nødvendigt for initieringen af runaway-replikationen, at værtscellerne har specielle egenskaber, og for det tredje initieres den ukontrollerede replikation på et tidspunkt, hvor den mikrobielle kultur går ind i den sene eksponentielle vækstfase, dvs. når effekten af det forøgede kopiantal af et gen, der 35 skal ekspresseres, er størst. En foretrukken regulatorisk region til initiering af runaway-replikation i den sene eksponentielle vækstfase er den phospholipase regulatoriske region, grundet dens dobbelte DK 173445 B1 16 kontrolsystemer. Ét regulatorisk system sikrer, at ekspressionen af et gen, der kontrolleres af den phospholipase regulatoriske region, er begrænset til den sene eksponentielle vækstfase; det andet regulatoriske system er i stand til at tilsidesætte det første kontrol-5 system og omfatter et glucoserepressionssystem.

I den praktiske udnyttelse af den regulatoriske region, der er beskrevet ovenfor, kan et DNA-fragment, der bærer begge regulatoriske systemer fra den phospholipase regulatoriske region, indsættes i ^ plasmidet opstrøms for et replikationsregulatorisk gen eller gener, plasmidet kan transformeres til en egnet værtsmikroorganisme, og ti'ansformanter kan selekteres i nærværelse af glucose. Når disse transformanter suites for glucose, vil de udvise runaway-replika-tionsfænotype i den sene eksponentielle vækstfase. Et gen, der ekspresserer et ønsket biosyntetisk produkt, kan derefter indsættes i 1 o de således fremstillede plasmider, og de resulterende hybridplasmider kan transformeres til en egnet værtsmikroorganisme, og værtscellen kan dyrkes til opnåelse af en kultur af produktionsstørrelse, enten i mangel på glucose eller i nærværelse af glucose i en sådan mængde, at gø det er forbrugt af cellerne, før de går ind i den sene eksponentielle vækstfase; i hvert tilfælde vil ukontrolleret replikation initieres i den sene eksponentielle vækstfase, grundet den øgede transkription fra det regulatoriske område. Det biosyntetiske produkt høstes fra kulturen efter en passende tidsperiode for at sikre en tilstrækkelig 2^ produktion af produktet. Bortset fra specifikationerne givet ovenfor, foretages dyrkningen hensigtsmæssigt ved brug af konventionelle teknikker, hvilket inkluderer konventionelle næringsmedier, som vides at være optimale for de bakterier, der anvendes som værtscellen. Høstningen af det biosyntetiske produkt foretages også i overensstemmelse med velkendte metoder, der er tilpasset det specielle biosyntetiske produkts 30 identitet og egenskaber, værtscellens egenskaber osv.

I fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes en bakterie, der indeholder et plasmid, som bærer et regulatorisk område som ovenfor specificeret. En sådan bakterie er typisk en gramnegativ bakterie, og foretrukne gramnegative bakterier er sådanne, 35 17 DK 173445 B1 som almindeligvis anvendes til produktion af biosyntetiske produkter, fx E. coli.

Det forventes endvidere, at sekvensen, der koder for den N-terminale del af nukleasen, hvilken sekvens er angivet som kodende for et sig-5 nalpeptid, der er nødvendigt for transport af nukleasen gennem membranen, kan anvendes til opnåelse af udskillelse af et genprodukt. En sekvens, der koder for et ønsket biosyntetisk produkt, kan kombineres direkte med sekvensen, der specificerer den C-terminale ende af .jQ nukleasens signalpeptid og derved tillade, at det ønskede protein udskilles, og signalpeptidet fjernes under processen. Til praktiske formål kan sekvensen, der koder for signalpeptidet (jfr. fig. 7), isoleres sammen med det nukleaseregulatoriske område som et DNA-fragroent, der udstrækker sig fra position 1-448, idet sidstnævnte ^ position svarer passende til genkendelsesstedet for AJialll og svarer præcist til den sidste codon af signal peptidet (inkluderende sig-nalpeptidase genkendelsesstedet). DNA-fragmentet kan efterfølgende indsættes i en velegnet vektor og ligeres i det "udfyldte" (ved hjælp af Klenow-polymerase) A/jaIII-sted til en sekvens, der koder for et ' 2Q produkt, der skal udskilles. Endvidere vil den eventuelle tilstede- ----- værelse af det nukleaseregulatoriske område tillade, at ekspressionen begrænses til de sene stadier af vækstfasen.

Opfindelsen forklares yderligere nedenfor med henvisning til tegningerne , hvor 25 fig· 1 viser et lineært restiktionsenzym- og genetisk kort over hy-bridplasmidet pNU121-nuc+, der bærer nukleasegenet (Nuc) nf Serratia marcescens W225, De anvendte symboler er: strukturelgener ; o- -promotorer. Ap - ampicillinresistens; Tc - tetracyclinresistens; Cj -30 λ-repressor-gen, XpR - λ-promotor. P - PstI; El *= EcoRI; E5 - EcoRV; F2 = FnuDII.

Fig. 2 viser tidsforløbet for nukleasebehandlingen af X-PRESS-lysat af E. coli. Ordinat: Relativ viskositet (H2O ved 0eC som reference).

2^ Abscisse: Antal timers inkubation ved 0®C efter X-PRESS-lyse.

Fig. 3 viser tidsforløbet for nukleasebehandling af fransk presse lysat af E. coli. Ordinat: Relativ viskositet (H2O ved 0°C som DK 173445 B1 18 reference). Abscisse: Antal timers inkubation ved 0°C efter fransk presselyse.

Fig. 4 viser tidsforløbet for nukleasebehandling af fransk pres-

selysat af E. coli. Venstre søjle viser koncentrationen af den til-O

satte nuklease (U/inl) før eller efter cellelyse. Seks prøver- blev enkeltvis fulgt i tidsforløbeksperimenterne (antal minutters inkubation ved 0eC); tiden 0 svarer til frigivelsen fra den franske presse. Viskositeten blev vurderet visuelt og fandt sted fra 0-70 minutter, ,|Q som vist i hver linje, jfr. symbolerne der er anført over linjerne.

Den relative viskositet (H2O ved 0°C som reference) blev målt efter henholdsvis 70 minutters og 15 timers inkubation ved 0*C.

Fig. 5 viser forholdet nellem relativ viskositet (H20 ved 0°C som reference) (ordinat), koncentrationen af nuklease (abscisse), og in-15 kubationens varighed ved 0eC. Figurerne er en fremstilling af de data, der er angivet i fig. 4. Bemærk at abscissen er logaritmisk.

Fig. 6 viser agarosegelelektroforese-mønsteret af ikke-nedbrudt nukleinsyre til stede i det nedbrudte lysat, når viskositeten på 20 sædvanlig måde vurderes til "vandig". Prøver blev udtaget fra de lysater, der er vist i fig. 4.

Fig. 7 (der består af 7a og 7b) viser nukleotidsekvensen af det 1,3 Kb DNA-fragment (F2-fragment vist i fig. 1), der inderholder 22 nukleasegenet fra Serratia W225.

Fig. 8 viser et lineært restriktionsenzym- og genetisk kort af hy- bridplasmidet pNU121-ph2+, der består af 4,5 Kb vektoren, pNUl21, og en indsættelse af 3,2 Kb Serratia spp. Al DNA, der indeholder genet for phospholipaseoperonen. o- angiver geitets promotor og tran-30 skriptionsretningen, * angiver et strukturelt gen, Ap og Tc betegner henholdsvis generne for ampicillin- og tetracyclinresistens, Cj betegner λ-repressorgenet. Restriktionsenzymer: E^ «-FcoRI, E5 -FcoRV, P = Ps ti, Sj - Sal 1, Sin = Smal, N - Na ri. H3 - HindlU, Bc =

Bell, Bj - BamHI.

Fig. 9 (der omfatter 9a og 9b) viser nukleotidsekvensen af 1,6 Kb DNA fra 3,2 Kb Serratia spp. Al DNA'et, der indeholder phospholipase 35 DK 173445 B1 19 (phl) genet. Positionerne af nogle få restriktionssteder er angivet, CAP med understregede sekvenser angiver positionen af det formodede katabolitaktivatorbindingssted og pliospholipasegenets regulatoriske område, S.D. angiver positionen af en Shine-Dalgarno-homologi for 5 ribosom-bindingsstedet. Genet starter ved position 416 og ender ved position 1372.

MATERIALER OG METODER

10 Escherichia coli K-12 stammerne og Serratia marcescens W225 er angivet i tabel 1. De anvendte plasmider og bakteriofager er angivet i tabel 2.

^ Anvendte bakteriestammer

Bakteriestammer Genotype Reference/kilde 20 E. coli K-12 MT102 thi, ara-levΔ7679, ara D139, 2acAx74, gaiU, galK, rpsL, hsdR.

E. coli K-12 CSH50 hpro-lac, rpsL J. Miller: Experi- 25 ments in molecuiar gejietics. CSH Lab.,

Cold Spring Harbor.

1972.

30 35 20 DK 173445 B1

Tabel 1 fortsat

Anvendte bakteriestammer

Bakteriestammer Genotype Reference/kilde 5 E. coli K-12 W3110 tna rtp S.G. Shogman & J.E.

Sjostrom, J. Gen.

Microbiol. 130, 1984^ 1Q s. 309-321.

£. coll K-12 JM103 Alac pro, chi, strA J. Messing, Nucl.

supE, endk, sbcB15 Acids Res. 9, 1981, hsdR4, F'tra D36, s. 309-321.

proAB, 2acI^zAM15 15 E. coli K12 S17 thi, pro. hsdR, hscfM+, R. Simon, Bio/ recA Technology, November 1983

Serratia marcescens Tc^ U. Winkler, Molec.

20 gen. Genet. 124, 1973, s. 197-206.

25 Tabel 2

Anvendte plasmider og bakteriofager

Navn Relevant fænotype Reference/kilde 30 -—--- pNU121 Ap^·, pBR322-derivat B. Nielsson: Nncl.

Acids Res. II, 1983, s. 8019-8030.

35 pOU57 RI "runaway replication” J.E.L. Larsen, derivat, Ap^ Gene 28, 1984, s. 45-54.

DK 173445 B1 21

Tabel 2 fortsat

Anvendte plasmider og bakteriofager

Navn Relevant fænotype Reference/kilde 5 pGV403 CmR, pBR322-derivat Amershani Ltd.

pACYcl77/cI857 KanR, derivat af Chang & Cohen, J.

^ pACYC177, der bærer Bacteriol. 134, lcI857 1978, s. 1141-1156.

pLc28 ApR, pBR322-derivat E. Remaut et al.,

Gene 15, 1981, s.

81.

15

Ml3 mp8 og mp9 Fag M13-derivater Amersham og J.

til DNA-nukleotid- Messing, Nucl.

sekventering Acids Res. 9, 1981, s. 309-321.

20

Alle anvendte eksperimentelle teknikker er standardteknikker, der er beskrevet i T. Maniatis: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, og J. Miller: Experiments in Molecular Genetics, ^ Cold Spring Harbor, 1972.

Alle celler blev dyrket i LB-medium (Bertani, J. Bact. 62. 1951, s.

293) eller i A+B minimalmedium (Clark og Maaloe, J. Mol. Biol. 23, 1967, s. 99), med tilsætning af vitaminer og aminosyrer. Plader til 30 dyrkning af bakterier indeholdt LB-medium og 1,5% agar med eller uden antibiotika: Tetracyclin 8 pg/ml, ampicillin 50 pg/ml, chloramphenicol 20 pg/ml. Plader til screening for nukleaseaktivitet indeholdt DNase testagar (Difco) til bestemmelse af DNase-aktivitet.

35 22 DK 173445 B1 EKSEMPEL 1

Fremstilling af chromosomalt DNA fra Serratia marcescens W225 5 En kultur af Serratia marcescens W225 er deponeret i DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, Vesttyskland) den 8. maj 1985 med deponeringsnr. 3308. Kulturen voksede natten over i LB-medium og blev høstet ved centrifugering (8000 omdr./minut i 5 minutter). Cellerne blev vasket to gange i TEN-puffer 10 (10 mM Tris, MCI, pH 8, ImM EDTA, 100 mM NaCl) og resuspenderet i 20 ml TEN-puffer indeholdende 1 mg/ml lysozym og 0,1 mg/ml RNase. Cellerne blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter, og 20%'s SDS blev tilsat til en slutkoncentration på 1%. Efter 60 minutter ved 37"C (til opnåelse af total lyse) inkuberedes lysatet ved åeC natten over. Næste 15 dag blev celleresterne fjernet ved centrifugering (18.000 omdr./minut i 25 minutter). Supernatanten blev overført til et nyt rør indeholdende 2 ml 3M natriumacetat og 2 volumener isopropanol. Ved forsigtig rystning fældedes DNA'et i tråde, som blev taget op ved hjælp af en bøjet glasnål. Det fældede DNA blev vasket to gange i 80%'s ethanol 20 og resuspenderet i TEN-puffer. DNA'et blev yderligere renset ved "buoyant density" gradientcentrifugering, og blev efter passende fortynding ekstraheret med phenol og dialyseret mod TE-puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA). Til sidst blev DNA'et testet for manglende tilstedeværelse af nuklease ved inkubering ved 37°C med 25 restriktionsenzym-puffer.

Konstruktion af en genbank fra Serratia marcescens W225

Kloningsvektorplasmidet, pNUl21, blev anvendt i forbindelse med kon-30 struktionen af en genbank fra Serratia marcescens W225. Plasmidet er et pBR322 derivat, der koder for både ampicillinresistens og tetra-cyclinresistens, men hvor promotoren for tetracyclinresistensgenet er erstattet med fagX-promotoren, XpR, og da λ-repressorgenet, Cj, også er til stede på pNU121, bliver tetracyclinresistensen normalt ikke 35 udtrykt. Resistensen udtrykkes imidlertid, hvis Cj-genet ødelægges ved indsættelse af DNA i Cj-genet.

23 DK 173445 B1

Derfor blev pNU121 DNA, der har et unikt EcoRI-sted i Cj-genet, skåret med restriktionsenzymet EcoRI og blandet med Serratia marce-scens DNA partielt skåret med EcoRI. DNA'et blev ligeret natten over ved 15°C med T4 ligase og transformeret til E. coli-stammen MT102.

5 Selektion blev foretaget ved 37°C på LB-plader indeholdende 8 pg/ml tetracyclin, således at kun celler indeholdende pNU121 med indsat DNA vil danne kolonier. Ca. 2500 kolonier repræsenterende en genbank fra Serratia marcescens W225 blev isoleret ved denne fremgangsmåde.

Isolering af et nukleasegen fra Serratia marcescens W225

Genbanken fra Serratia marcescens W22S blev replikaudpladet på DNase-indikatorplader (se materialer og metoder) og efter vækst ved 37®C i 2 dage, blev pladerne fremkaldt med 0,1N HC1. DNase-positive kolonier 15 var omgivet af en klar zone. Én positiv klon, pNUl21-mio+, blev reisoleret fra masterpladen og testet for tilstedeværelsen af andre gener kodende for ekstracellulære enzymer. (Escherichia coli MT102/ pNU121-nuc+blev deponeret i DSM den 8. maj 1985 under deponeringsnr.

3309). Det blev fundet, at klonen også udtrykte RNase, men ingen an-20 dre ekstracellulære enzymer blev udtrykt fra klonen. EcoRI-fragmentet indeholdende nukleasegenet blev også indsat i runaway-kloningsvek-toren pBEU50, hvilket resulterede i plasmidet pBEU50-nuc+. (Escherichia coli C600/pBEU50-nuc+ blev deponeret i DSM den 8. maj 1985 under deponeringsnr. 3310).

25

Restriktionsenzymkortlægning af nukleasegenet

Plasmid DNA fra E. coli-stammen MT102 indeholdende nukleasegenet blev fremstillet og skåret med henholdsvis restriktionsenzymerne EcoRI, 30 PstI og EcoRV. De skårne fragmenter blev analyseret ved agarosegel-elektroforese, hviket resulterede i kortet vist på fig. 1. DNA’et, der var skåret med Pstl, blev religeret med T4 DNA-ligase og transformeret til stammen MT102. Selektion fandt sted på DNase indikatorplader indeholdende 8 pg/ml tetracyclin. Efter inkubering blev pla-35 derne fremkaldt, og alle kolonier viste en nuklease positiv fænotype.

Når DNA, der var skåret med EcoRV, blev religeret og transformeret til MIT102, var alle transformanter nukleasenegative ved selektion 24 DK 173445 B1 for ampicillinresistens. Derfor er nukleasegenet indeholdt i et 2 Kb Psrl-£coRI- Fragment, som vist på fig. 1.

Til yderligere subkloning blev plasmid DNA'et skåret med både PstI og ^ £coRI, og efter elektroforese blev PstI-£coRl-fragmentet bærende nukleasegenet oprenset fra gelen. DNA'et var delvis skåret med restriktionsenzymet FnuDII (et 4-basers stumpendet restriktionsenzym med adskillige skæringssteder i nukleasegenet) og blandet med DNA fra plasmid pGV403, som var skåret med restriktionsenzymet Smal. Det blandede DNA blev ligeret med T4 ligase og transformeret til MT102.

Selektion fandt sted på LA-plader indeholdende 20 pg/ml chloramphenicol (resistensen hos pGV403), og transformanterne blev replikaudpladet på DNase-indikatorplader. 20 nukleasepositive kolonier blev isoleret, og plasmid DNA fremstillet. Det mindste 15 plasmid havde 1,3 Kb DNA indsat, og det indsatte DNA blev kortlagt med hensyn til £coRV-stedet, som vist på fig. 1. Dette plasmid blev betegnet pGV403-SD2/10. Et plasmid bærende det samme indsatte DNA men i modsat orientering med hensyn til de unikke £coRI og /fincflll genkendelsessteder bos pGV403 blev betegnet pGV403-SD2/14.

20

Nukleasegenets nukleotidsekvens

Maxam og Gilberts fremgangsmåde blev anvendt (Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 1977, s. 560-64), idet sekventeringsvektoren plasmid pGV403 (Amersham) blev anvendt. DNA'et, der skal sekventeres, indsættes i vektorens Smal-sted. Smal-stedet er flankeret af to restriktionssteder for restriktionsenzymet ΓίτΜΙΙΙ, hvilket giver forskellige 5-mærke overlappende ender, og da enzymet spalter assymmetrisk, kan DNA'et sekventeres direkte efter mærkning med ^P.

30

Derfor isoleredes 1,3 Kb nukleasefragmentet, der oprindelig var klonet i pGV403*s Smal-sted, fra en agarosegel efter skæring af hy-bridplasmidet med Τ’ir/i 1111. DNA-fragmentet blev skåret med et af restriktionsenzymerne FmiDlI eller ffaelll og ligeret til pGV403 DNA, der var spaltet med Smal, og dephosphoryleret. DNA'et blev transfor-35 meret til MT102 og selektionen fandt sted på LA-plader indeholdende 20 pg/ml chloramphenicol. Plasmid DNA fra transformanterne blev 25 DK 173445 B1 prspareret og analyseret. På denne måde blev en serie af pGV403 hy-bridplasmider konstrueret med indsættelse af DNA i størrelsesordenen 200-400 bp dækkende hele 1,3 Kb-fragmentet, og sekventering af disse plasmider i begge strenge gav nukleotidsekvensen, som vist ovenfor.

5

Analyse af nukleotidsekvensen vist på fig. 7 indikerer, at nukleasen er kodet fra position 386 til 1165. For det første er der en åben læseramme gennem hele dette område, hvilken ville kode for et protein på 30.000 dalton. For det andet er der et perfekt ribosombindingssted i position 374-78, dvs. lige før initieringskodonen. For det tredje er sekvenser, som kan udgøre et regulatorisk område, til stede i position 330-336 ("-10 sekvens") og position 306-313 ("-35 sekvens").

For at bekræfte at nukleasen faktisk indkodes af den angivne sekvens, fremfor af en lang åben læseramme til stede på den komplementære streng, blev indsættelserne i pGV403-SD2/10 og pGV403-SD2/14 fjernet ved dobbelt skæring med EcoRI og Hindi II. Det må bemærkes, at orienteringen af indsættelserne er modsatte i forhold til de to restriktionssteder på pGV403-vektoren. De fjernede fragmenter blev ligeret til pPLl95, som var blevet dobbelt skåret med EcoRI og Hindlll. Vek- 20 toren pPLl95 er afledt fra pLc28 ved indsættelse af en polylinker indeholdende EcoRI og HindiII genkendelsessteder nedstrøms for XpL- promotoren. Efter transformation til E. coli NF1 og selektion ved 30®C for Ap^, isoleredes to plasmider, pPL195-SD2/10 og pPL195-SD2/ 14. I den førstnævnte er XpL-promotoren placeret før det formodede 25 nukleasekodende område, afbildet ovenfor, imens XpL-promotoren i det sidstnævnte plasmid er placeret på en sådan måde, At den komplementære streng vil blive transkriberet. E. coli NF1 er lysogen for en ufuldkommen λ kodende for den temperatur-sensitive X-repressor indkodet af c!857 genet. Ved 30eC er cl-repressoren aktiv, og pro-30 motorer, der reguleres af repressoren, såsom XpL til stede på pPL195, bliver således represseret. Ved temperaturer over 37°C er repressoren inaktiv, og transkriptionen fra XpL i pPL195 vil fintfe sted. Når nukleaseaktiviteten ved 30®C og 42eC blev sammenlignet, fremkaldte pPL195-SD2/10 men ikke pPL195-SD2/14 temperaturindusibel 35 nukleasesyntese, indikerende at orienteringen af det nuklease-kodende område i forhold til λ-promotoren er korrekt i pPL195-SD2/10.

26 DK 173445 B1

Endvidere blev et hej t niveau af (teinperaturinducerbart) nukleasesyntese opnået, når det formodede nuklease-kodende område blev sat direkte sammen med λ-promotoren. Et iteal-ffindlll-fragment fra pGV403-SD2/10 dækkende området fra position 357-1295 (fig. 7) 5 blev ligeret til pPL195 skåret med Smal og Jfindlll, hvorved det kodende område er placeret som i pPL195-SD2/10 i forhold til λ-promotoren. Dette plasmid blev betegnet pPL195-SD2/RI.

Nukleotidsekvensen svarende til den aminoterminale ende af nukleasen ^ er blevet bekræftet ved aminosyresekvensanalyse af det partielt oprensede protein. Nukleotidsekvensen svarende til den carboxyter- minale ende af nukleasen og er blevet bekræftet ved nukleotidsekven- tering af området ved hjælp af en alternativ sekventeringsmetode, dideoxynukleotidsekventeringen ifølge Sanger et al., Proc. Nat:. Acad.

Sci. USA 74, s. 5463-5467.

15

Nukleasens formodede aminoterminale sekvens angiver tilstedeværelsen af et 20 aminosyrers signalpeptid, som ender med en genkendelsessekvens for en signalpeptidase ved position 448.

20

Nukleasens enzymaktiviteter

Kulturer af Serratia marcescens stamme W225 og E. coli C600 indeholdende plasmidet pBEU50-nuc+ voksede eksponentielt i LB-medium ved 30°C. På forskellige tidspunkter blev 1 ml prøver udtaget til be-25 stemmelse af OD^^q og nukleaseaktivitet. Nukleaseaktivitet blev bestemt ved tilsætning af 100 pi chloroform til frigivelse af enzymer fra periplasmaet. Efter centrifugering ved 10.000 omdr./minut i 15 minutter, blev 25 pi af supernatanten udtaget til bestemmelse af nukleaseaktivitet. Prøven indeholdende nuklease blev tilsat til 0,5 Ί0

ml laksesperma DNA (1 mg/ml) opløst i 0,05M Tris (pH 8,0) + 0,01M

MgCl2, og blandingen blev inkuberet ved 37°C i 1 time. Derefter blev 0,5 ml 4% PCA (perchlorsyre) tilsat og stod på is i 30 minutter.

Bundfaldet af ikke nedbrudt DNA blev fjernet ved centrifugering, og OD260 (absorption af UV-lys ved bølgelængden 260 nm) blev målt på et 35 spektrofotometer i en kvartskuvette. Aktiviteterne fremlagt i tabel 3 er OD26Q-værdier målt på denne måde fra prøver af kulturen voksende 27 DK 173445 B1 ind i den stationære fase. Det fremgår, at enzymet i begge "kulturer fortrinsvis fremstilles i den sene vækstfase.

Tabel 3 5

Nukleaseaktivitet

Celletæthed Ekstracellulær

Stamme (OD^q) nukleaseaktivitet 10 - C600/(pBEU50-nuc+) 0,265 0 0,448 0,005 0,628 0,075 0,800 0,135 15 0,940. 0,222 1,28 0,447 1,63 1,04 2,50 1,78 3,15 2,87 20 4,20 3,90 4.80 5,90 5,10 7,70 5,95 12,1 6.80 14,2 25 7,45 15,9 8,08 ' 35,2 30 35

Tabel 3 fortsat 28 DK 173445 B1

Nukleaseaktivitet

Celletæthed Ekstracellular 5

Stamme (OD^^q) nukleaseaktivitet W225 0,240 0 10 0,386 0 0,608 0 0,865 0 1,01 0 1,48 0 15 2’03 0 2,56 0 3,51 0,047 4,30 0,555 7,10 2.1 2q 9,50 4,6 10,60 5,0 11,4 6,7 14,0 7,0 14,7 7,1 25 ---- 1 et sideløbende eksperiment, blev fordelingen af lfuklease mellem periplasma og vækstmedium målt ved at dele kulturprøverne i to dele: Én indeholdende rent cellefrit vakstmedium, og den anden indeholdende materiale fra både periplasma og vækstmedium (chloroformbehandling 30 som beskrevet ovenfor). Resultaterne er vist i tabel 4.

35

Tabel 4 29 DK 173445 B1

Nukleaseaktivitet

Stamme Periplasma Vækstmedium 5

Serratia marcescens W225 1,0 45,8 10 C600/pBE050-nuc+ 1,5 1,23

Som vist ovenfor, er så godt som al nuklease totalt udskilt i Serra-tia marcescens W225, hvorimod kun ca. 50% er udskilt fra E. coli.

EKSEMPEL 2

Oprensning af nuklease 20

Efter 16-20 timer i den stationære vækstfase blev fermenteringsmediet fra 25 liters kulturer af E. coli HT102 indeholdende plasmid pGV403- SD2 (beskrevet i eksempel 1) hestet ved ultrafiltrering gennem en 0,45 pm membran med efterfølgende koncentrering ved ultrafiltrering gennem et filter med en molekylvægtgrænse på 10,000 dalton. Efter 25 dialyse mod 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, blev præparationen filtreret gennem et glasfilter og et 0,45 og 0,22 pm filter.

Enzympræparationen blev testet for forskellige parametre i et stan-dardassay, som kan opsummeres som folger: 30 400 pi puffer indeholdende 50 mM Tris (pH 8,2), 1 mM MgCl2» 50 pg/ml BSA, 100 ml DNA-opløsning (5 mg/ml laksesperma DNA i vand) og 25 pi fortyndet enzympræparation i den ovenfor nævnte puffer (uden DNA) inkuberes i 60 minutter ved 37eC. Til reaktionsblandingen tilsattes 400 pi 4% kold perchlorsyre, Reaktionsblandingen stod på is i 30 minutter og centrifugeredes derefter ved 15.000 g i 5 minutter. Absorptionen blev målt ved 250 nm. 1 enhed defineres som den aktivitet, 30 DK 173445 B1 som i standardassay frigører én OD250 opløseligt materiale pr. ml DNA i 1 time.

Til bestemmele af pH-optimum blev pH i standardassay-pufferen varieret og målt efter tilsætning af DNA. Det optimale område for 5 n .

nukleaseaktivitet er 7,5-9,6 med et maksimum ved pH 8,5-9,2. Mg^ optimum blev bestemt ved at variere koncentrationen af MgCl2 i stan-dardassayet fra 0-100 mM. Der er et relativt klart defineret optimum i området 0,1-1 inM MgC^. Enzymet bibeholdt imidlertid omkring 40% af sin aktivitet uden tilsætning af MgCl2. Optimumkoncentrationen af monovalente kationer blev bestemt ved at variere koncentrationen af NaCl og KCl i standardassayet. Aktiviteten faldt hurtigt med stigende Na+-koncentrationer. Enzymet blev vist at være aktivt ved 0-50 mM KCl (der var ingen fald i aktiviteten), hvilket er vigtigt da cellelyse-ring, specielt af E. coli, giver en forholdsvis høj mængde af K+, idet den intracellulære koncentration er 100-150 mM . Korttids-enzymstabilitet blev bestemt ved præinkubering af enzymet i standard-assaypufferen uden DNA ved 4, 23 og 37®C i henholdsvis 1, 4 og 18 timer. Ved tilsætning af DNA blev enzymaktiviteten bestemt i stange dardassayet. Tabel 5 nedenfor viser den observerede værdi for absorbtion ved 250 nm i standardassayet. Et stabilt enzym vil vise de samme værdier i hver søjle.

Tabel 5 25

Præinkubering 4®C 23®C 37®C

1 time 0,389 0,445 0,442 30 4 timer 0,415 0,485 0,403 18 timer 0,455 0,505 0,298

Det fremgår af tabel 5, at ved 4®C og 23®C er enzymet stabilt i 18 35 timer i pufferen. Ved 37®C er der et fald i aktiviteten ved inkuber-ing i en længere tidsperiode.

31 DK 173445 B1

Effekten af denatureringsmidler blev bestemt ved at teste aktiviteten af enzymet i tilstedeværelsen af urinstof, ikke-ioniske detergenser (Brij* 58, Triton· X-100) og ioniske detergenser (SDS og natrium-deoxycholat). Disse stoffer blev i forskellige koncentrationer tilsat 5 præparationen i standardassayet. Enzymet blev fundet at være aktivt i 1-8M urinstof, faktisk viste enzymet en øget aktivitet ved 4-8M med et maksimum ved AM urinstof. Enzymet var også fuldstændig aktivt ved tilstedeværelsen af ikke-ioniske detergenser såsom Brij* 58 (1%) og Triton· XIOO (0,4%). Med hensyn til ioniske detergenser fører en SDS-10 koncentration på mere end 0,01% til en fuldstændig inhibering af enzymaktivitet, mens ca. 40%'s aktivitet bibeholdes ved tilstedeværelsen af 1% natriumdeoxycholat.

Renheden af enzymet blev analyseret ved hjælp af en standard-de-^ naturerende SDS-PAGE. Enzympræparationen indeholdt et antal proteinbånd. I området svarende til nukleasens tilnærmede molekylvægt (30.000) var der et tydeligt bånd, der skønnedes at repræsentere 5-10% af den totale præparation.

Proteaseaktivitet i nukleasepræparationen blev estimeret ved for- 20 skellige assays. For det første blev 50 pi nukleaseprøver dryppet i vand på protein (skummetmælk) agarplader (20% mælk i puffer). Der blev ikke observeret nogen dannelse af en klaringzone (nedbrydning af mælkeproteinei-ne på pladen) efter 24 timer ved 37 “C og 48 timer ved 23°C.

25

For det andet blev der ikke observeret nogen målbar nedbrydning af azocasein ved inkubering af 20 pi af enzymet med 1 mg af azocasein (puffer: 50 tnM Tris (pH 8,0), 10 mM MgCl2)) ved 0, 16 og 30°C i 12 timer, nedbrydningen fulgtes ved måling af syreopløselig azofarve ved 30 A370· For det tredje blev nuklease, der var inkuberet ved 37°C i tilstedeværelsen af 5 mM MgC^i analyseret ved SDS-PAGE. Ingen ændring i mønsteret af de omkring 20 proteiner til stede i nukleasepræparationen, fx ingen autoproteolyse, blev observeret, hvilket indikerer manglen af proteaser. Dette betyder, at i en praktisk anven-35 delse af nukleasen, vil et muligt lavt indhold af proteolytisk aktivitet i en enzympræparationen være minimal sammenlignet med det totale indhold af protease i cellelysatet, der skal behandles.

32 DK 173445 B1

Nukleasens evne til at nedbryde DNA og RNA i tilstedeværelsen af organiske opløsningsmidler blev bestemt. To alikvoter af et FTL-lysat af E. coli MT102 (1 volumendel celler til 1 volumendel Tris-EDTA-puffer, til hvilken 12.000 nukleaseenheder pr. ml før cellelysering 5 var tilsat, jfr. eksempel 3 nedenfor) blev yderligere tilsat phenol (1%), toluen (1%), chloroform (1%), ethanol (5%) eller EDTA (0,25M).

Efter inkubering ved 20*0 i 4,5 timer, blev prøverne analyserede ved agarosegel-elektroforese. Prøven, til hvilken EDTA var tilsat, fungerede som en kontrol, idet nukleasen er så godt som inaktiv ved 10 denne EDTA-koncentration. Tilsætningen af forskellige organiske opløsningsmidler påvirkede ikke nukleasens aktivitet, når der sammenlignes med en prøve, til hvilken ingen organiske oplcsningsroidler var tilsat, og 95% af DNA'et blev nedbrudt til fragmenter på 200 bp eller mindre.

15 EKSEMPEL 3

Viskositetsreduktion i et cellelysat

Enzymet produceret i eksempel 2 blev sat til et højviskost FTL (lysozym-fryse-tø) lysat af 0,27 g E. coli i et totalt volumen på 500 yl ved henholdsvis ca. 2,6 x 102 og 2,6 x 10^ enheder. Til én serie af prøver var der ikke tilsat Mg2+, imens 10 mM Mg2+ var tilsat til en anden serie prøver. Prøverne blev inkuberet ved 0°C eller 24"C.

25

Tabel 6 nedenfor viser tiden, ved hvilken cellelysatet var "vandigt", dvs. tilsyneladende med en viskositet, der nærmede-sig vand (bestemt ved opsugning af en prøve af lysatet i en pipette og observerende, om lysatet forlader pipetten som separate ikke-viskose dråber).

30 35

Tabel 6 33 DK 173445 B1

Tid efter enzymtilsætning (minutter)

Temperatur Mg^+ 2,6 x 10^ enheder 2,6 x 10^ enheder 5

OeC - 72 12 + 10 mM 55 8 10 24eC 55 5 + 10 mM 40 3

Det må imidlertid bemærkes, at betydelige variationer observeredes i 15 forsøgene, der involverede forskellige lysater. Fx, når FP (fransk presse) lysater blev anvendt, opnåedes en vis grad af forskydning af nukleinsyrerne. Denne lysattype blev fundet at være et bedre substrat for enzymet, hvilket formodentlig skyldes den mindre tæt pakkede gelstruktur af FP-lysatet. Viskositeten af et FP-lysat (15 ml) dannet 20 fra 7,5 g E. coli W3110 (våd vægt) blev reduceret til "vandig" ved inkubering af lysatet ved 0eC med 24 enzymenheder/ml i 40 minutter.

Tilsætning af nuklease før cellelyse 25 A. Til 0,25 g E. coli MC1000 (våd vægt) resuspenderet i 0,25 ml TE (TE = 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA) blev tilsat 12 enheder af nukleasen produceret i eksempel 2. Suspensionen blev udsat for FTL-lysering ifølge standardprocedure (3 omgange fryse-tøning). Viskositeten måltes visuelt, idet forekomsten af "vandige" dråber ved 30 pipettering blev opfattet som en angivelse af en reduktion af lysa-tets viskositet. Efter den sidste FTL-cyclus, inkuberedes lysatet ved 0'C. Efter 5 minutter ved O'C var lysatet blevet "vandigt".

Dette forsøg viste ganske uventet den fordelagtige effekt ved tilsæt-gg ning af enzymet før celleødelæggelse, idet kun 24 enzymenheder pr. ml er påkrævede til at reducere viskositeten i løbet af 5 minutter, hvis nukleasen tilsættes før lyse sammenlignet med et krav på 5200 enheder 34 DK 173445 B1 pr. ml lysat i løbet af 12 minutter, hvis nukleasen tilsættes efter lysering.

B. Til opnåelse af en bedre kvantificering af viskositetsreduktionen,

blev denne fremgangsmåde afprøvet på E. coli lysater lavet ved X-O

PRESS (Biotec), hvilken kombinerer fryse-tø-effekter og højt lyseringstryk .

7,5 g F, coli MCIOOO (våd vægt) blev resuspenderet i 7,5 ml TE. MgCl2 blev tilsat til 2 mM og nuklease til 25 enheder/ml. Suspensionen blev ^ frosset i X-PRESS'en og udsat for fem trykomgange ved -20°C. Homoge-natet blev optøet ved 0°C i løbet af 2 timer. Visuelt var viskositeten blevet reduceret under optøningen (dvs. "vandige" dråber ved pipettering), men det forlængede optøningstidsrum gjorde det vanskeligt at fastsætte et starttidspunkt, før hvilket nukleasen ikke er 15 aktiv. 24 enheder pr. ml lysat er derfor anvendeligt til reducering af viskositeten af X-PRESS'es lysater, hvis nukleasen er tilsat før lyse.

Homogenatet blev fortyndet til 37,5 ml med TE (O’C), og viskositeten 20 blev målt (Ostwald viskosimeter) i de efterfølgende 24 timer. Nukle-asenedbrydningen fortsattes i viskosimeteret, som blev inkuberet ved O'C. På det i fig.2 (abscissen) angivne tidspunkt, blev viskositeten bestemt. Ordinaten i fig. 2 viser den observerede viskositet i forhold til viskositeten af vand ved 0°C, Reaktionsbetingelserne var 9,6 25 enheder nuklease pr. ml lysat. Den relative viskositet falder hurtigt i løbet af de første 10 minutter efterfulgt af et stadigt fald i løbet af de efterfølgende timers inkubering ved 0°C. Efter 24 timer var den relative viskositet 1,5.

2Q C. 7,5 g E. coli MCIOOO (våd vægt) blev resuspenderet i 7,5 ml af TE.

MgCl2 blev tilsat til 6 mM og nuklease til 24 enheder/ml. Bakterier plus enzym blev ført gennem en fransk pressecelle ved 10.000 psi.

Lysatet blev straks inkuberet ved 0'C. Tiden 0 blev fastsat til tidspunktet for frigivelse fra pressen. Efter frigivelse gav lysatet g,, "viskose" dråber ved pipettering, hvilke imidlertid ændrede sig til "vandige" dråber inden for 5 minutters inkubering ved 0®C.

35 DK 173445 B1 24 enheder af lysat er derfor også anvendelige til at reducere viskositeten af FP-lysater.

Efter 5 minutter blev lysatet fortyndet til 30 ml ned TE) (Q°C), og g viskositeten blev målt i Ostwald-viskosimeteret på forskellige tidspunkter (fig. 3, abscissen). Resultatet er angivet som den relative viskositet (ordinat), idet viskositeten af vand ved 0°C anvendes som reference. Reaktionsbetingelserne i viskosimeteret var: 12 enheder nuklease pr. ml lysat fra 0,25 g E. coli MC1000 pr. ml, temperatur — 10 °β°·

Til illustration af de fordelagtige effekter ved tilsætning af nukleasen før lyse, blev det følgende forsøg udført. Lysatei* blev fremstillet som ovenfor beskrevet. Til 15 ml prøver af en E. coli W3110 (7,5 g celler) suspension tilsattes varierende mængder nuklease 15 til slutkoncentrationer på 0,24 til 240 enheder pr. ml (linje 1-5 i fig. 4). Efter fransk presselysering blev lysaterne inkuberet ved 0®C, og viskositeten blev fulgt visuelt, dvs. ved pipettering. Klassificeringen er vist i fig. 4.

20 Ved 240 enheder nuklease pr. ml (linje 5) var lysatet "vandigt" efter frigivelse fra pressen, mens tilstedeværelsen af nuklease i en koncentration på 2,4 enheder pr. ml (linje 2) gav "vandige" dråber efter ca. 20 minutter ved 0eC. Ved 0,24 enheder pr. ml (linje 1) var resultatet efter 70 minutter "glycerol-lignende" dråber, som ændredes 25 til "vandige" dråber i løbet af de efterfølgende 15 timers inkubering ved 0eC.

Den relative viskositet af 2,5 ganges fortyndinger af de ovenfor nævnte prøver blev bestemt efter 70 minutters og 15 timers inkubering 2Q ved 0eC. Linje 2-5 viser, at de visuelle indtryk "vandige" dråber udstrækker sig i et område fra 1,5 til 2,1 i relativ viskositet i dette forsøg. Med et overskud af enzym (linje 5) er den mindste opnåede værdi 1,5. Dette minimum er formodentlig opnået ved 70 minutter, hvilket angiver, at den komponent i viskositeten, der kan til-gg skrives nukleinsyrer, er blevet fjernet.

For at opnå viden om den nukleasemængde, der er nødvendig til speci- . fikke anvendelser, blev forholdet mellem den tilsatte enzymmængde og 36 DK 173445 B1 viskositeten ved 70 minutter og ved 15 timer plottet (fig. 5).

Tilsætning af 3600 enheder nuklease gav omtrent den samme værdi efter 70 minutters og 15 timers inkubering ved 0'C, nemlig henholdsvis 1,52 og 1,47. Værdien 1,50 kan derfor betragtes som den mindste værdi for 5 den relative viskositet af det pågældende lysat.

Efter inkubering i 70 minutter ved 0eC er den den relative viskositet proportional med log(tilsat enzym) eller log(enzymkoncentration). Ved ekstrapolering ses, at tilsætning af 1500 enheder (100 enheder pr.

,|q ml) fuldstændig ville eliminere den viskositetskomponent i lysatet, der kan tilskrives tilstedeværelsen af nukleinsyrer, dvs. tilsætning af enzym ud over 1500 enheder eller forlængelse af inkubationstiden ville ikke give nogen yderligere reduktion i den relative viskositet, for hvilken den mindste værdi er 1,5.

15

Det fremgår af figuren, at en 10 ganges l'eduktion i den tilsatte enzymmængde kræver en 10 gange længere inkubation ved 0'C for at opnå den samme viskositet (fx 36 enheder/70 minutter versus 3,6 enheder/15 timer, 360 enheder/70 minutter versus 36 enheder/15 timer).

20 Til sammenligning af den nye strategi, hvor nuklease tilsættes for cellesprængning, med den traditionelle fremgangsmåde, hvor nuklease tilsættes efter lyse af cellerne, blev et 15 ml lysat fremstillet som ovenfor, men der tilsattes ingen nuklease før cellesprængning. Efter fransk pi-esselyse blev 360 enheder nuklease tilsat til en slutkon-25 centration på 24 enheder pr. ral, og lysatet blev inkuberet ved 0'C.

Linje 6 i fig. 4 viser den trinvise eliminering af viskositeten med tilsynekomsten af "vandige" dråber efter 40 minutter. Den relative viskositet efter 70 minutter var sammenlignelig med den fra prøven vist i linje 3 (8 enheder pr. ml tilsat før lysering), selv om 30 begyndelseshastigheden for reduktion af viskositeten klart er forskelligt. Det vurderes, at tilsætning af ca. 1,5 enheder nuklease pr. ml før cellelyse ville give et fridsmønster, der er identisk til det i linje 6, men den resulterende relative viskositet ville klart være højere, i området 2,13-2,53. Udbyttet (udtrykt som enzymbehov) kan 35 således enten blive en faktor 3 eller en faktor 20 afhængig af de kriterier, der anvendes i definitionen af "reduktion af viskositet".

37 DK 173445 B1

Prøver udtaget fra lysaterne vist på fig. 4, linje 2-6, når det "vandige" stadie netop var nået, blev udsat for agarosegel (1%) elek-troforese og efterfølgende farvning med ethidiumbromid. 1 alle baner udgør det farvede residuale produkt en udstrakt plet ("smear") ud-5 strækkende sig fra en 21 kbp markør til det bromphenolblå bånd, med aftagende mængder af langsomt vandrende materiale i prøver med højere nukleasekoncentration. Dette materiale omfatter fra mindre end 1 til få procent af nukleinsyren, der er til stede før nukleasebehandlingen (fig. 6).

10 EKSEMPEL 4

Eliminering af residuale nukleinsyrer

Fra gelelektroforeseanalyser af begrænsede nedbrydninger* af bakterielle lysater, blev det konkluderet, at omkring 0,1% af de tilstedeværende nukleinsyrer i et lysat ikke er tilgængelige for nukleasens virkning. Det antoges, at tilstedeværelsen af residuale nukleinsyrer kan tilskrives den beskyttende maskering af specifikke 2Q sekvenser, måske et membrantilknyttet område på genomet, idet kun små —— fraktioner af den totale aminosyremængde bibeholdes efter behandling med nukleasen.

For at fjerne de residuale nukleinsyrer blev cellelysater behandlet med nukleasen i tilstedeværelsen af forskellig proteindenaturerings-^ midler.

FTL-Lysater af 0,25 g E. coli (våd vægt) i et totalt volumen på 0,6 ml blev behandlet med 240 enheder nuklease i tilstedeværelsen af 1-12M urinstof. Lysaterne blev inkuberet ved 30°C i 1 time eller 18 30 timer. Efter inkubering blev 5 μΐ af residualet analyseret ved aga-rosegelelektroforese og farvet med ethidiumbromid.

Efter 18 timers nedbrydning blev en opsigtsvækkende positiv effekt af 2-4M urinstof observeret, specielt tilstedeværelsen af 4M urinstof __ resulterede i fjernelse af alt farvbart materiale, som var til stede på gelen.

DK 173445 B1

3B

FTL-Lysater af 0,68 g E. coli (våd vægt) i et totalt volumen på 2,5 ml TE blev behandlet med 2,6 x 10 enheder nuklease i Ih timer alene ved 16eC, i næi~værelse af 0,1% SDS eller 0,6% Triton* ΧΊΟΟ. Gelelektroforetiske analyser angav, at residual nukleinsyre kunne 5 nedbrydes af nukleasen, hvis detergens var til stede.

Ud fra disse forsøgsresultater fremgår det, at begge typer detergenter og proteindenatureringsmidler gør residualet, maskerede nukleinsyrer i et lysat, tilgængelige for nukleasens virkning.

10 EKSEMPEL 5

Isolering af Serratia spp. Al

Bakterier blev høstet fra en rådden agurk og udsået på DNase -15 testagar. En koloni, der udviste et højt niveau af exonukleaseak-tivitet, blev yderligere analyseret. Gramfarvning viste, at den er gram-negativ. En foreløbig identificering angav, at den isolerede organisme er Serratia 1iquefaciens. Indtil klasseficeringen er fuldstændig, er den imidlertid forsøgsvis kaldt Serratia spp. Al, idet 20 der er mange indikationer af, at den tilhører Serratia-gruppen. Organismen er resistent over for tetracyclin og ampicillin, og den viser det samme exoenzymmønster som Serratia marcescens. (Serratia liquefaciens Al blev deponeret i DSM den 8. maj 1985 under depo- neringsnr. 3307).

25

Fremstilling af chromosomalt DNA fra Serratia spp. Al

En kultur af Serratia spp. Al voksede natten over i LB-medium og blev høstet ved centrifugering (8000 omdr./minut i 5 minutter). Cellerne 30 blev vasket to gange i TEN-puffer (10 mM Tris, HC1, pH B, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) og resuspenderet i 20 ml TEN-puffer indeholdende 1 mg/ml lysozym og 0,1 mg/ml RNase. Cellerne blev inkuberet ved 37eC i 30 minutter, og 20% SDS blev tilsat til en slutkoncentration på 1%.

Efter 60 minutter ved en temperatur på 37”C (til total lyse), blev 35 * lysatet inkuberet ved A°C natten over. Næste dag blev cellerester fjernet ved centrifugering (18.000 omdr./minut i 25 minutter).

Supernatanten blev overført til et nyt rør indeholdende 2 ml 3M

39 DK 173445 B1 natriumacetat og 2 volumener isopropanol. Efter forsigtig rystning, fældedes DNA'et i tråde, som blev opsamlet ved hjælp af en bøjet glasnål. Fældet DNA blev vasket to gange i 80% ethanol og resuspen-deret i TEN-puffer. DNA'et blev yderligere oprenset ved "buoyant 5 density” gi-adient-centrifugering, og efter passende fortynding blev der ekstraheret med phenol og dialyseret imod TE-puffer <10 mM Tris-HC1, pH 8, 1 mM EDTA). Til slut blev DNA'et testet for mangel af nuklease ved inkubering ved 37*C med restriktionsenzympuffer.

Konstruktion af en genbank fra Serratia spp. Al

Kloningsvektoren plasmid pNUl21 blev anvendt til konstruktion af en genbank fra Serratia spp. Al. Plasmidet er beskrevet i eksempel 1.

pNU121 DNA med et unikt EcoRI-sted i Cj-genet blev skåret med restriktionsenzymet EcoRI og blandet med Serratia spp. Al DNA, der var partielt skåret med EcoRI. DNA'et blev ligeret ved 15°C natten over med T4 DNA-ligase og transformeret til E. coli MT102. Selektion fandt sted ved 37°C på LB-plader indeholdende 8 pg/ml tetracyclin, 2ø således at kun celler indeholdende pNU121 med indsat DNA, vil danne kolonier. Ca. 8000 kolonier repræsenterende en genbank af Serratia spp. Al blev isoleret ved denne procedure.

Screening for lipaseaktivitet 25 E. coii MT102-celler blev transformeret med genbanken af Serratia spp. Al, og celler indeholdende hybridplasmider selekteredes på LB-plader med tetracyclin. Kolonier blev udtaget med tandstikkere og overført til mikrotiter-plader, hvert hul indeholdende A+B-medium + 2Q 1% casaminosyrer + thiamin og 200 mg/ml streptomycin og 8 pg/ml tetracyclin. Celler voksede natten over ved 37”C, og i*eplika blev lavet fra pladerne. Substratet for lipaseenzymet, p-nitrophenyl-palmitat, blev først suspenderet i isopropanol i en koncentration på 6 mg/ml. 10 ml af suspensionen tilsattes til 90 ml 0.05M phosphat-2^ puffer, pH 8,0 indeholdende 207 mg natriumdeoxycholat. 0,5 ml af denne opløsning tilsattes til hvert hul i pladerne. Gul farve i et hul indikerer tilstedeværelsen af lipaseaktivitet. Én sådan klon blev 40 DK 173445 B1 fundet. DNA blev fremstillet og anvendt til transformation af E. coli CSH50. Transformanter var lipasepositive. Én sådan klon blev isoleret, og DNA blev fremstillet. Den udvalgte klon udviste ikke protease- , phospholipase- eller nukleaseaktivitet.

5

Det lipase-bærende plasmid pNU121-Iip+

Plasmid DNA isoleret fra den lipasepositive klon bestod af pNU121 med et indsat EcoRI-fragment på ca. 8,4 Kb. Hybridplasmidet er betegnet 10 pNU121-Iip+. (Escherichia coli CSH50/pNU121-1ip+ blev deponeret i DSM den 8. maj 1985 under deponeringsnr. 3313).

Lipasens enzymaktiviteter 15 Aktionen af lipaseaktivitet på substratet p-nitrophenylpalmitat kan følges spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 410 nm (OD^^q). Både når E. coli/pNU121-2ip+ og Serratia spp. Al voksede eksponentielt i A+B-medium + 1% casaminosyrer og thiamin, viste det sig, at enzymet var til stede i kulturmediet.

20 EKSEMPEL 6

Fremstilling af chromosomalt DNA fra Serratia spp. Al

En kultur af Serratia spp. Al (se eksempel 5) vokede natten over i LB-medium og blev høstet ved centrifugering (8000 omdr./minut i 5 minutter). Cellerne blev vasket to gange i TEN-puffer (10 mM Tris, HC1, pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) og resuspenderet i 20 ml TEN-puffer indeholdende 1 mg/ml lysozym og 0,1 mg/ml RNase, Cellerne blev 2Q inkuberet ved 37°C i 30 minutter, og 20% SDS blev tilsat til en slutkoncentration på 1%. Efter 60 minutter ved en temperatur på 37®C (til total lyse), blev lysatet inkuberet ved 4DC natten over, Næste dag blev cellerester fjernet ved centrifugering (18.000 omdr./minut i 25 minutter). Supernatanten blev overført til et nyt rør indeholdende g,. 2 ml 3M natriumacetat og 2 volumener isopropanol. Efter forsigtig rystning, fældedes DNA'et i tråde, som blev opsamlet ved hjælp af en 41 DK 173445 B1 krum glasnål. Fældet DNA blev vasket to gange i 80% etlianol og vesuspenderet 1 TEN-puffer. DNA'et blev yderligere oprenset ved "buoyant density" gradient-centrifugering, og efter passende fortynding blev der ekstraheret med phenol og dialyseret imod TE-puffer (10 mM Tris-5 HC1, pH 8, 1 mM EDTA). Til slut blev DNA'et testet for mangel af nuklease ved inkubering ved 37’C med restriktionsenzympuffer.

Konstruktion af en genbank fra Serratia spp. Al 10 Kloningsvektoren plasmid, pNU121 (jfr. eksempel 1) blev anvendt til konstruktion af en genbank fra Serratia spp. Al (jfr. eksempel 5).

pNUl21 DNA med et unikt EcoRI-sted i C^-genet blev skåret med restriktionsenzymet EcoRI og blandet med Serratia spp. Al DNA, der var partielt skåret med EcoRI. DNA'et blev ligeret ved 15°C natten over med T4 DNA-ligase og transformeret til E. coli - stamme MT102.

Selektion fandt sted ved 37°C på LB-plader indeholdende 8 pg/ml tetracyclin, således at kun celler indeholdende pNU121 med indsat DNA, ville danne kolonier. Ca. 8000 kolonier repræsenterende en gen-2Φ bank af Serratia spp. Al blev isoleret ved denne procedure.

Screening for phospholipase-positive kloner E. coli MT102 celler blev transformeret med genbanken af Serratia 2g spp. Al, og celler indeholdende hybridplasinider blev selekteret på LB-plader med tetracyclin, kolonier blev replikaudpladet på æggeblommeplader med tetracyclin. En klaringszone rundt om en hvid udfældning på toppen af en koloni indikerer phospholipaseaktivitet.

15 sådanne kolonier blev isoleret, DNA blev fremstillet og anvendt til transformering af CSH50. Den anvendte phospholipaseklon var sådan vv en klon. Den selekterede klon pNU121-p/iI+ udviste kun phosphol i-paseaktiviteten. (Escherichia coli MT102/pNU121-phl+ blev deponeret i DSM den 8. maj 1985 under fremskaffelsesnr. 3311).

35

De phospholipasebærende plasmider pNU121-phl+ og pOU57-phI+ 42 DK 173445 B1

Plasmid DNA'et isoleret fra den phospholipase-producerende klon, pNU121-phI+, bestod af pNU121 med et 3,2 Kb EcoRI-fragment indsat i 5 Cj-genet (fig. 8). Dette fcoRI-fragment blev klonet i runaway-plas-midet pOU57. Dette runaway hybridplasmid ρΟΙ^-ρΛΙ"1' overførte phos-pholipasefænotypen til andre E. coli-stammer, og en forhøjet ekspression af phospholipase blev observeret ved tilstedeværelse i SerraCia-stammer. (Escherichia coli S17-l/pOU57-p/iI+ blev deponeret i _IQ DSM den 8. maj 1985 under deponeringsnr. 3312). Phospholipaseekspres-sionen blev forhøjet ved en temperaturforøgelse fra 30-40*C i de testede stammer.

Phospholipasens enzymaktiviteter 15 Når E. coli-celler indeholdende plasmidet pNU121-phl+ voksede i A+B-medium + 1% casaminosyrer og thiamin, eller i LB-medium, kunne phos-pholipasen kun opdages i kulturmediet, efter at kulturen havde nået en celletæthed svarende til 0,7 OD450 enheder. Overlevelsen af E.

2q coli-stammen var overhovedet ikke påvirket af tilstedeværelsen af plasmidet.

Assayet for phospholipaseaktivitet er baseret på reaktion med æggeblomme. Aktiviteten er afprøvet i 2%'s agarosegeler indeholdende æggeblomme og chloramphenicol, som inhiberer vækst af celler og pro-^ teinsyntese i gelerne.

Der blev lavet små fordybninger i gelen, i hvilke 5 pi prøver af supernatant (cellerne var fjernet ved centrifugering) af den voksende kultur var pipetteret.

30

Enzymreaktionen med æggeblommen producerede en klaringszone i den uklare gel. Enzymdiffusionshastigheden, dvs. mm^ klaringszone pr. tidsenhed anvendes som et mål for enzymaktiviteten. Målinger af phospholipaseaktivitet fra voksende kulturer af E. coii/pNUl21-p/il+ og Serratia spp. Al er vist i tabel 7.

Phospholipaseaktiviteter 43 DK 173445 B1

Tabel 7

Eks trace1lulær 5

Celletæthed phospholipaseakti-

Kulrur vitet: mm^/time MT102/pNU121-phl+ 0,1 0 10 0,5 0 0,7 0,4 0,9 0,7 1.0 0,9 1.3 1,3 15 1,4 1,5 1.5 1,8

Serratia spp. Al 0,1 0 0,5 0 20 0,7 0,02 0,9 0,10 1,2 0,35 1,8 0,90 2.0 1,1 25

Det fremgår, at E. coli-kulturen udskiller enzymet til kulturmediet mere effektivt end Serratia. I begge stammer kommer enzymet til syne i medierne i den sene eksponentielle vækstfase og fortsætter ind i 30 den stationære fase. Tilstedeværelse af 1% glucose i medierne blokerer syntesen af enzymet effektivt i begge værter (ikke vist). En mindre mængde detergens i kulturmedierne (0,5% Tween· 80) har en stimulerende effekt på udskillelse (ikke vist).

35 DNA-Sekventering af phospholipaseklonen 44 DK 173445 B1 3,2 Kb EcoRI restriktionsfragraentet indeholdende phospholipasegenet blev sekventeret under anvendelse af "shot-gun" kloningsmetoden givet g af Messing et al. (Nuci. Acid Res. 9, 1981, s. 309) på M13 fagderivaterne Mp8 og Mp9 og dideoxy-kædetermineringsteknikken givet af Sanger et al. (Proc. Nad. Acad. Sci. USA 74, 1981, s. 5463). I sub-kloning af fragmentet blev mange forskellige restriktionsenzymer anvendt: Sau3A, TaqI, AIuI, Rsal, Sall, Smal, PstI, EcoRI, Pvul, BssHII og EcoRV. Hele sekvensen blev tilvejebragt ved forening af samlingen af små (100-300 baser) stykker DNA-sekvens. Det meste af sekvensen blev bestemt for begge strenge,

Sekvensen (fig. 9) viser en lang læseramme, som starter i den venstre ende af fragmentet, ved position 416, passerer Sall-stedet og ender i 15 position 1372.

Opstrems for rammen er* en Shine-Dal garno-homologt (Shine, Dalgarno,

Nature 254, 1975, s. 34) AAGGAG ved position 405 umiddelbart opstrøms for ATG-startkodonen. Opstrøms for læserammen findes et promotorom-20 råde bestående af en -35 sekvens CTGCC ved position 351 og en -10 sekvens TATTTA ved position 374. Opstrøms for -35 sekvensen findes et potentielt CAP-bindingssted fra position 306-336.

Sekvensen indikerer tilstedeværelsen af et gen, som koder for et 319 aminosyre-protein med en forventet molekylvægt på 34.056 dalton.

Indsættelse af DNA-fragmentet fra position 0 til Ps.rl-stedet ved 441 opstrøms for iac-generne indikerer tilstedeværelsen af en funktionel promotor i dette DNA-fragment. Denne promotor initierer lac-ekspres- sionen ved én OD^sn på 0,7 i en voksende population af celler. Denne 30 promotor var endvidere ikke-funktionel ved en hver celletæthed, når glucose var til stede indikerende catabolitrepression formodentlig formidlet via det indikerede CAP-bindingssted.

Ved subkloning er det blevet verificeret, at den nødvendige genetiske 35 information for den ekstracellulære phospholipaseaktivitet er - placeret inden for 1,2 Kb-fragmentet fra position 360 til Fspl-stedet.

45 DK 173445 B1 ved position 1551. Det blev også fundet i overensstemmelse med sekvensinformation, at det var nødvendigt at klone dette fragment foran en promotor for at opnå phospholipaseaktivitet i E. coll-celler. På denne måde blev orienteringen af genet også verificeret. Transkrip-5 tionsretningen af genet er fra det venstre EcoRI-sted til Fspl-stedet i overensstemmelse med sekvensdata. Den anvendte promotor var det temperaturindusible system af c!857 og XpR, Ved 30#C var syntesen af phospholipase i E. coii-celler meget lav, bedomt ud fra normale plade.assays. Ved temperaturer over 37eC var der en stor produktion af 10 enzym. Genproduktet af dette 1,2 Kb DNA-fragment er blevet identificeret både in vivo og in vitro ved inkorporering af radioaktivt mærket methionin. Ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese er størrelsen af genproduktet bestemt til 34 Kdalton, og det er blevet vist, at i dette gelsystem vandrer phospholipaseaktiviteten sammen med det 15 radioaktivt mærkede 34 Kdaltonprotein.

20 25 30 35

Claims (18)

46 DK 173445 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et enzym fra Serratia spp., omfattende dyrkning af en bakterie, som ikke er Serratia spp., hvilken bakterie indeholder et hybridplasmid, som indeholder DNA fra Serratia 5 spp. kodende for et Serratia spp. enzym, idet Serratia spp. enzymet udskilles af bakterien i dyrkningsmediet, og enzymet hestes fra kulturen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det fremstillede enzym fra Serratia spp. er i det væsentlige fri for andre bakterielle 10 proteiner.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Serratia spp. enzymet er et hydrolytisk enzym.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at Serratia spp. enzymet er en Serratia spp. nuclease.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at Serratia spp. nucleasen er Serratia spp. nuclease (inkluderende det N-terminale signalpeptid) med følgende aminosyresekvens: HetArglheAsnAsnLysMetLeuAlaLeuValAlaLeuLeuFheAlaAlaGlnAlaSerAlaAsp ThrLeuCluSerLLeAspAsnCy&AlaValGlyCysProThrGlyGlySerSerAsnValSerLleValArg HieAlaTyrThrLeuAsnAsnAsnSerThrThrlysPheAlaAsnTrpVaLAlaTyrHisUeThrLysAsp ThrProAlaSerGlyLyslhrArgAsnTrpLysThrAspProAlaLeuAsnProAlaAspThrLeuAlaProAla AspTVrThrGlyAlaAsnAlaAlaLeuLysValAspArgClyHisGlnAlaProLeuAlaSerLeuAlaGly ValSerAspTrpGluSerLeuAsnTyrLeuSerAsnlleThrProGlnLysSerAspLeuAsnGlnGlyAla TrpAlaArgLeuGluAspGlnGluArgLysLeuIleAspArgAlaAspIleSerSerValTyrThrValThr GlyProLeuTyrGluArgAspMetGlyLysLeuProGlyThrGlnlysAlaHisThrlleProSerAlaTyr TrpLysVallle FhelleAsnAsnSerProAlaValAsnHisTyrAlaAlaFheLeuPheAspClnAsnThr ProLysGlyAlaAspPheCysGlnPheArgValThrValAspGluUeGluLysArgThrGlyLeuIlelle TrpAlaClyLeuProAepAspValGlnAlaSerLeuLysSerLysProAlaSerCysArgSeij 47 DK 173445 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at Serratia spp. nucleasen er i en i det væsentlige ren form.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at Serratia spp. enzymet er immobiliseret på en matrix.

8. Fremgangsmåde ifølge krav i eller 2, kendetegnet ved, at Serratia spp. enzymet er et Serratia spp. phospholipaseenzym.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at Serratia spp. phospholipasen er en Serratia spp. phospholipase kodet for af den følgende DNA-sekvens: ATGAGTATGCCTTTAAgnnACCTCTGCACT!ATCCCOGGrCGCCOCGåTCCCTACOCCTCCCGCCGCTOCCGåGACOCGGACCG XACTCATACXXLAMTTC^AMTCGAGACCniATAGCGGCCACCGGCCCtAGGGATQXGACCCCGGCC^CCCCTCTGCCCCTGCC CGGCGAGCCFCCCCCACCCCGCCAAATCCCCGCCGGrGOCCTCTCCCTCTCAGAACACCCTGAACCOGCAGAATCTGTTGAATAC CCCCCTCGGACOæ(7rCCC^CGTmCCCCCCGCCACCCGACAG0GAGAGTCTTCTGCCACITGCGCCTCTXACACAACrTATO GCTGGTCGGCGATAT CTCACCOGCGGCACCGACGGCCGCGGCAGCGCCGOGCGTGACGCGGCGGCAOCAATCCCAGGAOCGOCAT CGACCAGCCGCTATA GACTCOCCGCCGTCGCTGCCGCCCCCCTCGCGGCCCGCACTGCGCCCCCGTCGTTAGCGTCCTCCCCCTA TATGCGTTOGCGCTGTTGGCCAAGGACCrr TACTCACTCAATGGCCAGGGCGCCGCCGGGTTCAAC(XCCrGAGCGACACOCCTG AIACGCAACCGCGACAACCCCITCCTGCAA ATGAGTGAGTrACCGGTCCCGCGGCGGCCCAAGTTGGCGCACTCGCTGTGGCGAO ciccmrcGt^TC(UTrrf:cccAcarrt^cGACCxxxxxaccGgnTCCCA(Xxnw^TTi^GCAAC(^c^(^c^T GAGCCåAACCCGTACCTACCGCGGTCGGACGTGCTGCGCCCGTCG ttAAAGGCTCCGACCCTAMTGTCGTTGCT(»ITTCTCAXA GTCTTGCCGTTCCCCGGCACCAACGACTGGCCGCGATTGGCTGAGCAACGTGCGGCACGC GACGCGCXATGACGATCTOCACXAC CACAACCGCAACCGGCCGTGGTTGCrGACCGGCGCTAACCGAClCGnGCACGCCGTCCG CTGCCCGATACTGCIACACGTCATG AATCAGGCGGTTGCCGCTGCCAAAAGCCGCCAAGGCGGCCTTCGGCGATGCGCTGiTr^ATCGCCGGCCATTCGCT TGGCGGTGGT TEAGTCCGCCAACOGCGACGGTnTCGGCGCTrTCOGCCGGAAGCCGCTACX^GACCACTAGCCGCCCCEAACCGA ACCGCCACCA CTCGCGCCCACCCCCGCGCTGGCGACCGGCACCGTCGCGGTCACCITCAACGCGGCCGGGGnrCTCGGATrACACCCTGAATCGCCT GACCGCCGGTGGCGGCGCGACCGCTGGCCGTGGCAGCGCCAGTGGAAGITGCGCCGGCCCCAGAGCC'tAATtTrGGGACTTAGCGGA GGGC atcgatccggcggcagcgaagaaagatgccgaagccggcggcattcgccgtacagcgagcaatatgacatgctgaccagca CCCG XAGCTAGæoæCGTCGCTTCTITCTACGGCTXCGæCæCGTAAGCGGCATGTCGCTCGTIAXACTGXACGACTCCTCGT CCCAGGACTCGACCTCGCTGATCCXXXiATGCCATCGGCCACAACATCACCCTGGOCAACAACGATACCCrGACCGGCATCGATGA GGGTCCTCAGCTGGAGCGA CTAGGGCCXACGGTAGCCGGTGTTGXAGTGGGACOGGXTGTTGCtATGGCACTGGCCiTEAGCXACX CTGGCGGCCGAGCAAACATCTGGATCGCAGCCTCACGGCGCACGGCATCGACAAGGTGATAAGCTCGATGGCGGAACAAAAGCCG GACCGCCtmtXnTKTtAGACCIAGCGXCGGAC TCXCGCGTGCCGTAGCTGTTCCACTATTCGAGCXACCXSCCTrGTTTTCGGC TGGGAGGCGMGCCCAATCCC^G^ ACCCTCCGCTTCCGGTlAGGGACT 48 DK 173445 B1

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, kendetegnet ved, at bakterien er en gram negativ bakterie.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at den gram negative bakterie er E. coli.

12. Hybridplasmid omfattende et indsat DNA-fragment fra Serratia spp., som koder for et ekstrace 1 lulaert Serratia spp. enzym, hvilket DNA-fragment vælges blandt et DNA-fragment, der koder for en Serratia spp. nuclease og et DNA-fragment, der koder for en Serratia spp. phospholipase.

13. Hybridplasmid ifølge krav 12, kendetegnet ved, at DNA-fragmentet fra Serratia spp., som koder for en ekstracellulær Serratia spp. nuclease er et 1,3 kb DNA-fragment med en nucleotidsekvens som vist i fig. 7.

14. Hybridplasmid ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det er et 15 plasmid med en konditionelt ukontrolleret replikationsopførsel.

15. Bakterie, som ikke er Serratia spp., indeholdende et plasmid ifølge krav 13 eller 14, hvilken bakterie er i stand til at udtrykke det i plasmidet indsatte DNA-fragment fra Serratia spp.

16. Bakterie ifølge krav 15, kendetegnet ved, at genproduktet af

20 Serratia spp. DNA i plasmidet, som indeholdes af bakterien, udskilles fra bakterien til dyrkningsmediet.

17. Bakterie ifølge krav 16, kendetegnet ved, at den er en gram negativ bakterie.

18. Bakterie ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den er E. coli.