CN86104387A - 细菌酶 - Google Patents

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Abstract

发现沙雷氏菌胞外酶被另一种革兰氏阴性生物分泌，该生物含有一种质粒，这种质粒携有由沙雷氏菌得到的具有这种酶的编码的DNA，这种生物，例如大肠杆菌因此被用来产生这种酶。沙雷氏菌胞外酶的一些特例是核酸酶、脂肪酶和磷脂酶，核酸酶可用来除去生物质中的核酸。

Description

本发明涉及生产细菌酶的方法以及制备用于该方法的杂交质粒和微生物，本发明进一步涉及到利用上述酶中的一种，核酸酶，从生物物质中去除核酸，还涉及用于启动基因表达的调节区。
人们发现沙雷氏菌属的细菌（Serratia    Spp.）产生一些分泌到培养基质中的水解酶。与其它格兰氏阴性细菌不同，它们倾向于将蛋白质分泌到外周胞质中而不是周围的基质中。这种外周胞质蛋白有渗漏到培养基质去的趋势，特别是当细菌生长到密度很高的时候。
根据本发明，分离得到了编码沙雷氏菌胞外酶的DNA，当然，此胞外酶是在细菌内表达的，而且已培养出适于基因产品的工业生产并含有沙雷氏菌DNA的微生物，并发现它们能产生沙雷氏菌的酶。
还发现如果含有编码沙雷氏菌胞外酶的插入DNA的杂交质粒被另一个本身通常不向培养基质分泌基因产品的微生物，如大肠杆菌（E.Coli）所包含时，那么大肠杆菌则也能在一定程度上向培养基质中分泌沙雷氏菌的酶（参见实例1和6）。因此，有可能以一个比较简单的方法对由大肠杆菌的细胞分泌到培养基质中的沙雷氏菌酶进行部分纯化，例如，简单地通过过滤除去大肠杆菌细胞，并在滤液中用例如硫酸铵来沉淀酶。在本文中，术语“分泌”应理解为基因产物的转移至少要通过细胞的细胞质膜。
于是，本发明的一个方面涉及到一种生产细菌酶的方法，它包括在培养基质中培养一种包含具有编码沙雷氏菌胞外酶的沙雷氏菌DNA的杂交质粒的细胞，以及从培养基质中收集这种酶。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种生产基本上不含有其它细菌蛋白质的沙雷氏菌酶的方法，在该方法中，该酶的一部分由微生物分泌到培养基质中，并从这些培养基质中收集。
该微生物的培养最好在含有此微生物的最佳生长所需养分和无机物的液体培养基中进行。可以用本身是已知的方法来收集酶，如上所述，可以由过滤除去宿主细胞来纯化酶，并从滤液中沉淀出核酸酶。通常，然后把沉淀物溶于适当的缓冲液中，例如Tris-EDTA中，然后由透析法除去沉淀剂。
沙雷氏菌产生的水解酶中包括一种将核酸水解为核苷酸、寡核苷酸或较小核酸片段的核酸酶，以及一种水解脂类中的脂肪酸和磷脂的脂酶和磷脂酶。
所用微生物是一种典型的细菌，最好是革兰氏阴性菌。通常不希望使用沙雷氏菌来生产沙雷氏菌酶，因为沙雷氏菌是一种机遇病原菌，这可能限制人们利用它作为生产用的微生物。此外，沙雷氏菌还产生一种可能污染所需产品的胞外蛋白酶。用于生产沙雷氏菌酶的微生物，最好是象大肠杆菌这样的通常用于生产基因产品的革兰氏阴性菌。
本发明还涉及带有沙雷氏菌DNA的杂交质粒，这种DNA编码一种如上所述的沙雷氏菌胞外酶。
生产本发明的酶时，作为载体使用的质粒可以是通常用于这一目的的任何质粒，它在有关微生物中能够进行复制。可用来产生大量上述酶的质粒包括所谓的失控质粒，就是说它具有不受条件控制的复制特性。具有这种特性的质粒已在例如美国专利4，495，287和公开号为0109150的欧洲专利申请中公开了。
细菌核酸酶在纯化用微生物发酵制备的蛋白产品中有重要价值，这样的蛋白产品有用经过DNA重组技术改造的细胞发酵制备的产品，这些细胞能产生该种的天然细胞不能产生的产品。在这些产品的纯化中，一个重要的步骤是从这些由细胞产生的核酸中分离出蛋白产品。如果使用象核酸沉淀这样的常规化学处理进行纯化，由于含有所需产品的物质具有较高的粘度而难于分离，可能引起所需产品的损失，而用核酸酶分解核酸则不会引起所需产品的任何重大损失。并且，从产品中有效地完全除去核酸是很重要的，例如当产品用于人类时，一些国家的卫生管理当局规定，产品中不应含有来自用于生产有关产品的细胞的任何可杂交的DNA。
因此，沙雷氏菌产生的很重要的酶中包括一种已发现是很有效的核酸酶，它能从生物物质中除去核酸，因而具有很重要的工业价值。在本文中，术语“除去核酸”意指把长的核酸序列降解为较短的片段或寡聚核苷酸或在某些情况下降解成为单核苷酸或二核苷酸。这意味着由核酸酶作用产生的产物可以相当容易地通过常规方法除去。
因此，本发明还涉及一种细菌核酸酶，它是具有下列氨基酸序列的沙雷氏菌核酸酶，（根据已知方法由DNA序列推定，并包括了N-端信号肽）：
Figure 86104387_IMG7
该酶可用上述方法进行生产。为了特殊的应用，例如当用核酸酶除去基本上纯化的生物合成产品中的剩余核酸时（下面将要进一步描述），该酶应该最好基本上是纯化的形式。为了获得这种基本上是纯化的酶，可以把粗的酶制品通过超滤或者硫酸铵沉淀进行初步纯化，然后通过例如色层分离法（诸如离子交换色层分离法或亲和色层分离法）或制备凝胶电泳进一步纯化。在某些场合下，将酶固定在一种合适的基质上是较为有益的，这样可以在使用之后很容易地除去核酸酶，并且使得该酶可能得到两次使用。这样的基质材料有葡聚糖或琼脂糖凝胶或无机材料，诸如二氧化硅和硅酸及其衍生物等含硅材料。酶的固定可以用本身是已知的方法进行。
另一个有重要意义的酶是由沙雷氏菌产生的磷脂酶。本发明因此还涉及到一种由下列DNA序列（编码链）编码的沙雷氏菌磷脂酶：
Figure 86104387_IMG8
在另一方面，本发明还涉及一种从生物物质中去除核酸的组合物，该组合物包括一种沙雷氏菌核酸酶。在本文中，术语“生物物质”应理解为至少有一种组分是生物来源的任何一种物质。因此，该术语意欲包括一种核酸溶液（例如从离体试验中得到的）;一种含有能产生生物合成产品的细胞培养物的发酵基质;一种已培养了能产生生物合成产品的细胞培养物的发酵基质（并且，它可能因此含有该产品和因自发的细胞破裂而产生的核酸）;或者一种能产生生物合成产品的细胞培养物的悬浮液，该细胞培养物是通过离心从基质中收集的，其中含有完整细胞或溶解细胞。
术语“生物合成产品”应理解为本身可以是一种蛋白质、多肽、糖脂碳水化合物或低分子量化合物的一个产品。如果生物合成的产品不是从细胞中分泌出来而必须溶解细胞才能得到，则核酸是特别重要的杂质，因为它们给细胞溶胞产物带来很高的粘性，使得产品的纯化发生困难。因此，为了降低溶胞产物的粘性，提供一种含有本发明的沙雷氏菌核酸酶这样的组合物是很有益处的。这种核酸酶可以具有如前面所示的氨基酸序列。本发明的核酸酶组合物最好应当基本上没有蛋白水解活性，因为在一种具有此特性的组合物中如果存在蛋白酶，则此蛋白酶将是导致细胞培养物产生的蛋白产品降解的最主要的原因。事实上，发现由本发明方法所制备的从沙雷氏菌获得的核酸酶基本上没有蛋白水解活性（见实例2）。应当指出，将一种基本上没有蛋白酶的组合物用于从一种基本是纯化的蛋白产品中除去残酸是特别重要的，因为当核酸酶加入到一个不纯的细胞溶胞物中时，溶胞产物本身的蛋白水解活性远远超过该核酸酶组合物中残存的任何的蛋白水解活性。因此，这种基本上没有蛋白酶的核酸酶组合物尤其适用于（当然是用基本上纯化的形式）已经经过一些纯化步骤的蛋白质产品。
实验表明，即使将过量的核酸酶加入到细胞溶胞产物中（此过量是对于降低溶胞产物中的核酸造成的粘度而言），仍可能残留少量核酸污染该蛋白质产品。这可能是由于核酸与溶胞产物中的膜和/或蛋白质组分相互作用而引起的核酸的“屏蔽”作用造成的。可是，要将DNA重组技术或组织培养产生的生物合成产品用于医药目的时，一些国家（例如FDA）的卫生管理当局常常要求全部除去核酸（即不存在可被DNA或RNA探针杂交的核酸）。当这样的产品被用于微量核酸会干扰所希望的结果的其它场合时，除去残余核酸也是极其重要的。发明人已经发现，当与核酸酶一起加入某种洗涤剂或蛋白变性剂时，可以完全除去这种残余核酸。因此，对于需要完全除去核酸的应用来说，本发明的组合物中除了含有一种核酸酶（如沙雷氏菌核酸酶）以外，最好还含有一种洗涤剂和/或一种促溶剂。洗涤剂可以是聚氧乙烯醇例如Brii（商品名），或Octoxynols例如Triton    X-100（商品名）等非离子型洗涤剂;或者是十二烷基磺酸钠（SDS）这样的离子型洗涤剂;或者一种脱氧胆酸盐如脱氧胆酸钠。促溶剂可以从脲、硫脲或硫氰酸中选择。
在另外一方面，本发明涉及一种从生物物质中（如上面定义的）除去核酸的方法，在该方法中，将沙雷氏菌核酸酶加入到该生物物质中。更具体地说，本发明的方法在各种具有核酸污染问题的情况下是有用的，例如这种生物物质中包含了核酸的废弃溶液或悬浮液的情况，它们是由于使用了核酸及不洁净的实验设备进行离体实验时产生的;例如这种生物物质包括了含有一种能产生生物合成产品（如前面定义的那样）的细胞培养物的发酵基质的情况，在这种情形中，核酸酶可以在细胞充分地发生溶胞作用之前或之后加入，都能保证去除该物质中大量的核酸;例如这种生物物质包含了一种产生生物合成产品的细胞培养物已在其中培养的发酵基质的情况，而且这些细胞已随后从发酵基质中除去，在这种情况下，这种基质中可能含有一定数量的核酸，它们是由于自发的细胞破裂而产生，还可能含有偶而由这种细胞分泌到基质中的一种生物合成产物;以及例如这种生物物质包含一种除去了发酵基质后的能产生生物合成产品的细胞培养物的悬浮液的情况，在这种情况中，核酸酶可以在细胞发生胞溶作用之前或之后加入。核酸酶可以具有上面所示的氨基酸序列。发明人已发现，在细胞发生溶胞作用之前将本发明的核酸酶加入到该生物物质中会获得特别有益的结果。实验已经表明，当核酸酶在细胞发生溶胞作用之前加入到细胞培养物中（悬浮着的或在基质中的）时，可以使例如大肠杆菌溶胞产物（如冷冻-熔化溶胞产物和French    Press溶胞产物）的粘度的消除具有高度重复性。而且出人意料地发现，比起在发生溶胞作用之后加入核酸酶，为了达到某一相对粘度所需时间更短（以分钟而不是以小时计），所需温度也更低，而生物产品的产率却更高（例如，在除去核酸时被降解的蛋白产品较少）。
按照本发明在生物物质中加入核酸酶以降低它的粘度时，核酸酶作用的最终产品包括不同大小的核酸片段和寡核苷酸而不仅仅是单核苷酸或双核苷酸。许多卫生管理当局要求，在开放封闭的发酵系统之前必须杀死重组生物体。在许多场合下，这是通过在发酵的最后阶段加入苯和甲苯而实现的。已发现本发明的核酸酶在有大量用于杀死发酵罐中细胞所需要的苯和甲苯存在时仍保持活性。为了某种目的，例如希望产生除去了所有可杂交核酸的高度纯化的终产品时，建议把酶加到一个已被提纯的产品中，该产品至少已经基本上与该生物物质的其它组分分离开来。
如前所述，已经发现残余核酸，即在极限降解（为了降低该物质的粘度，加入如此过量的核酸酶以至于再进一步加入核酸酶也无法进一步降低核酸含量）之后仍存在于生物物质中的核酸，只构成很微小的一部分，事实上不到所给生物物质核酸总量的0.1%，这部分核酸由于前面述及的与膜成分和/或蛋白质的相互作用，使核酸酶通常无法对其进行降解。业已发现，如果存在洗涤剂和/或促溶剂时，用核酸酶处理能降解这种残余核酸。
于是，本发明还涉及一种从生物合成产品中除去残余核酸的方法，在这种方法中，在有洗涤剂和/或促溶剂的情况下加入核酸酶，将存在的核酸降解为用杂交法检测不到的寡核苷酸或核苷酸。洗涤剂和蛋白变性剂的作用机理很可能是消除了用于形成复合物结构的疏水力和静电力，而存在于此复合结构中的核酸片段不会受到核酸酶的作用。
所选择的洗涤剂和蛋白变性剂应当不会永久性地破坏生物物质中任何所需要蛋白质的二级和三级结构，也就是说应当是这样一种物质：核酸酶在它的存在下除去残余核酸后，它也能够被去掉，并同时得到具有合适结构的产品。这样的洗涤剂和蛋白变性剂可以是前面提到的那些。在采用洗涤剂或促溶剂时应注意不要将这些物质加得太多，不然会使核酸酶的活性削弱甚至于消失。如果洗涤剂是一种非离子型洗涤剂，通常以该生物物质的0.2～1.5%的量加入，特别是0.4～1.0%左右。当采用离子型洗涤剂时，通常以该生物物质0.01～1.0%的量加入。促溶剂通常以2～8M的量（大约是该生物物质重量体积比的10%～50%）加入。
为了获得一个完全没有核酸的产品，最好在生产过程的早期就先使用本发明的核酸酶，从而除去存在于其中的大量核酸，降低由于溶胞产物引起的粘度。在随后的纯化过程中可以采用溶液形式或固相形式的核酸酶，并要采用纯化的形式，以便从该产品中除去所有残存的核酸。
另外，本发明中含有核酸酶的组合物还可用于除去感染剂的感染潜力，可以作为确保消除感染能力本身的手段，也可以作为恢复可能为生产疫苗或诊断剂所需要的感染剂组分的手段。在本文中，“感染剂”这一术语应理解为一种其感染能力取决于核酸成份的有生命的或非生命的药剂。这些核酸成分可能编码了对感染潜力来说至关重要的RNA和/或蛋白质（对于繁殖来说它们可能是必需的）。或者它们在感染剂中可能纯粹起结构上的作用。因此感染剂可能包括有质粒、病毒、细菌、Prions和寄生虫。
这些感染剂的感染潜力在一些情况下可能受到化学试剂的破坏，但在许多情形中，可能最好用核酸酶来去除污染。在细胞生长期间释放出的游离DNA分子，例如质粒，可以很容易地借助于本发明的核酸酶进行降解，对于存在于实验废物中有感染潜力的DNA也同样如此。作为一个安全的防范措施，常常希望从用DNA重组技术工业化生产生物合成品而产生的废物中除去核酸。如果存在于此废物中的感染剂的核酸成分无法单独用本发明的核酸酶降解的话，为了除去所有的核酸，如前所述，建议可以同时加入一种洗涤剂或促溶剂。
本发明的核酸酶另一个意想得到的用途是用于生产抗原和疫苗。目前，细菌和病毒的减毒株经常用来引起对于同种的更多病毒的免疫学反应。它的一个重要的优点是，感染剂在体内的一定的繁殖期间内保持了它在表面或内部的复杂的抗原结构的完整性。使用本发明的核酸酶就可能维持该抗原结构，使得抗体只与所述感染剂的所有强抗原决定簇起免疫反应，因而避免了因使用减毒生物的活疫苗而偶然发生的接种后遗症的危险。本发明的核酸酶可用来除去这样一些感染剂中的核酸成份，也可同时与洗涤剂和/或促溶剂一起使用，使得核酸对于核酸酶来说是能够作用的，所选择的洗涤剂或促溶剂及其使用的浓度应保证它们不会干扰所述抗原的结构。
已发现由本发明方法生产的沙雷氏菌水解酶，是在产生这种酶的微生物的生长周期的晚期表达，沙雷氏菌或大肠杆菌都是如此。如实例1所示，这种延迟表达是调节区域调节基因表达的结果，表达或所述基因即从此调节区域启动的。因此，在大多数培养物的指数生长期间，没有或只有少量水解酶合成，而当细胞进入指数生长晚期时就出现了高速率的基因表达。在本文中，术语“调节区域”应理解为一个有关基因转录控制的分子序列，该基因包含的序列如启动子，调节蛋白（由调节基因表达）的所有结合位点、例如环状AMP结合蛋白（CAP）以及在转录控制中还不知功能但根据缺失定位法看对转录控制起重要作用的序列。
这种调节原理可以根据本发明得到应用，以提供一种包含调节区域的质粒，从而使包含该质粒的微生物在生长周期的后阶段启动或加强位于该调节区下游的基因的表达。这种基因可能与调节区没有天然联系，调节区与这样的基因结合的可行性在实例中将予以阐述。
如上所述的在微生物生长周期的后阶段启动或加强基因表达的一种调节机制，对于生产培养物有好处并且是理想的。于是，在发酵过程中，在发酵后期出现高细胞密度时大概是培养物最高产的时期，在这一时期，具有较高的基因表达速率可能具有很大的意义。用已知的启动子通常是达不到这一点的，因为它们的活性通常随培养物的生长速率而变化，因此，当细胞密度最高时其活性最小。沙雷氏菌中的调节区的特殊性质在培养物产生的产品对所用微生物有毒的情形中也是特别有意义的，因为当微生物的生长已经或接近停止时，该微生物才会合成这种有毒产品。
因此，本发明还涉及到一种质粒，它包括一个调节区，在包含该质粒的微生物生长周期的后阶段，所述调节区启动或加强在其下游的基因的表达。这样一种调节区对于调节与其没有天然联系的基因的表达是特别有用的，例如带有该调节区的质粒被用作为一个克隆或生产载体时，可通过包含该质粒的微生物发酵得到大量用于技术或医学的生物合成品。这样一些生物合成产品包括多肽和蛋白质或它们的片段、酶及酶与营养基质中的化合物反应的非蛋白质产品、低分子量产品如激素、以及核酸;预想得到具有重要意义的产品有真核细胞的产品，特别是哺乳动物的基因以及如前所述对产生它的微生物有毒的产品。
该调节区可以是在沙雷氏菌中发现的调节区，虽然可以预想得到在其它生物中也会发现类似的调节区。更具体地说，这种调节区是来自沙雷氏菌的核酸酶或磷脂酶的调节区，图7的1-385位置和图9的201-415位置分别给出了此调节区域的例子。
一个如前所述的调节区可通过常规的DNA重组技术插入到任何一个已知的或新的克隆或生产载体中。
可用作克隆或生产载体的、含有上述类型调节区的特别有意义的质粒即所谓失控质粒，就是说它具有不受条件控制而复制的特性。具有这种特性的质粒在例如美国专利4495287和欧洲专利公开0109150中被公开。
核酸酶基因的调节区中的启动子强度对于某些生产目的并不总是足够的，因此，通过用一个更强的构成启动子代替现有启动子，并同时保留其依赖于生长期的表达特性，则可以进一步利用调节区域的能力，使调节区域的下游基因进行相关于生长期的表达。
除了利用调节区来表达一个生物合成产品外，调节区特别有意义的另一种应用是将它用来加强位于调节区下游的、与控制一个细菌质粒复制有关的基因的转录作用，从而在包含该质粒的细胞生长的后阶段引起不受控制的质粒复制（所谓的失控复制）。至今所描述过的大多数失控复制载体（参照例如欧洲专利申请，公开号0109150）都需要对其生长条件进行外来操纵，例如提高温度，才能启动不受控制的复制。利用前面所述的调节区来调节质粒的复制，一种新的方法就成为可能，即失控复制的启动为包含该质粒的细胞的生长期的函数。这一方法从三方面看是有利的，首先，不需要对生长条件进行外部操纵，第二，启动失控复制不需要宿主细胞具有专门的性质，第三，不受控制的复制是在微生物培养物达到指数生长阶段后期，也就是当有待表达的基因的拷贝数的增加效应最强的时候启动的。用于在指数生长阶段后期启动失控复制的最好调节区是磷脂酶调节区，因为它具有双重控制系统。一个调节系统保证由磷脂酶调节区控制的基因表达被限制于指数生长阶段后期;另一个调节系统能够压倒第一种控制系统，它包括一个葡萄糖阻遏系统。
在实际利用上述的调节区时，具有磷脂酶两种调节系统的DNA片段可插入到质粒的复制调节基因或基因的上游，可将该质粒转化到一个合适的宿主微生物里，并可在有葡萄糖存在的情况下选择转化株。当这些转化株被剥夺了葡萄糖，它们在指数生长阶段后期就会表现出失控复制型。然后，将表达所需生物合成产品的基因插入到这样产生的质粒中去，形成的杂交质粒可被转化到一个合适的宿主微生物里，在不存在或存在葡萄糖的情况下将该宿主发展成生产规模的培养物，存在葡萄糖时其量要使得在进入指数生长阶段后期前被细胞耗尽。无论在哪一种情况下，在指数生长阶段后期，由于调节区加强了转录作用，则启动了失控复制。在保证充分生产该产品的适当时间后，从培养物中收集该生物合成产品。除了上面给出的细节之外，培养适于用常规的方法进行，包括常规的已知对于用作宿主的微生物是最佳的营养基质。而且，生物合成产品的收集是按照适于具体生物合成产品的种类和性质、宿主的性质等的公知方法进行的。
本发明还提供了一个包含携有上述调节区域的质粒的微生物。最典型的微生物是一种细菌，如革兰氏阴性细菌，革兰氏阴性细菌是一般用于生产生物合成产品的革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。
还可以预料得到，编码核酸酶N-端部分的序列可以用来获得一个基因产品分泌物，这种N-端部分已表明编码了对于核酸酶的透膜转移来说不可缺少的信号肽。编码所需生物合成产品的序列可以直接与编码核酸酶信号肽C-端的序列结合，这样就能分泌出所需的蛋白质，信号肽在该过程中被除去。为了实用起见，为信号肽编码的序列（参见图7）可与核酸酶调节区域一起被分离出来，该调节区即从1到448位置的DNA片段，它对应于AhaⅢ识别位点，而且它准确地对应于该信号肽的最后的密码子（包括信号肽识别位点）。然后，该DNA片段可以插入到任何一个合适的载体中，并在AhaⅢ的“插入”位点与编码待分泌产品的序列相连接。非强制的核酸酶调节区的存在还能使表达被限制在细胞生长的后期阶段。
下面参照附图来进一步解释发明，在这些附图中，
图1显示了一个线性限制性酶和携带Serratia marcescens W225核酸酶基因（Nuc）的杂交质粒pNU121-nuc+的基因图。所用的符号如下：结构基因 O→＝启动子，AP＝氨苄青霉素抗性;TC＝四环素抗性;C1＝λ阻遏物基因，λpR＝λ启动子，P＝PstⅠ;E1＝EcoRⅠ;E5＝EcoRⅤ;F2＝FnuDⅡ。
图2显示了大肠杆菌X-Press溶胞产物用核酸酶处理的时间过程。纵座标：相对粘度（以0℃的水为参照），横座标：在X-Press溶胞作用后，在0℃下培养的小时数。
图3显示了大肠杆菌的French    Press溶胞产物用核酸酶处理的时间过程。纵座标：相对粘度（以0℃的水为参照），横座标：French    Press溶胞作用后在0℃下培养的小时数。
图4显示了大肠杆菌的French    Press溶胞产物用核酸酶处理的时间过程，左面一列表示在细胞发生溶胞作用之前或之后加入的核酸酶的浓度（单位/毫升）。分别跟踪了六个样品的时间过程实验（在0℃下培养的分钟数），零时相应于French    Press释放的起始。在0-70分钟里，对粘度进行视觉估计，它们被表示在每一线条中，线条下面给出了参见符号。相对粘度（以0℃的水为参照）是在0℃下培养70分钟和15小时后测量的。
图5显示了相对粘度（以0℃的水为参照）（纵座标）、核酸酶的浓度（横座标）和0℃下的培养时间之间的关系。这些图代表了图5中给出的数据。注意横座标是用的对数座标。
图6显示了当粘度目测为“液状”时存在于降解液中未降解的核酸的琼脂糖凝胶电泳图谱。从图5中所示的降解液进行取样。
图7表示1.3KB DNA片段（F2一片段示于图1）的核苷酸序列，它携有来自沙雷氏菌属W225的核酸酶基因。
图8表示一种线性限制性酶和由4.5Kb载体pNU121和3.2Kb沙雷氏菌属的A1DNA插段所组成的杂交质粒pNU121-ph1+的基因图，该3.2Kb沙雷氏菌属的A1DNA含有磷脂酶核纵子基因，O→表示基因启动子和转录方向。图1中的 表示结构基因，Ap和Tc分别表示氨苄青霉素和四环素抗性的基因，C1表示λ阻遏基因。限制性酶：E1＝EcoRⅠ，E5＝EcoRⅤ，P＝PstⅠ，Sa＝SalⅠ，Sm＝SmaⅠ，N＝NarⅠ，H3＝HindⅢ，Bc＝BclⅠ，Ba＝BamHⅠ。
图9表示含有磷脂酶核纵子的3.2Kb沙雷氏菌属的A1DNA中的1.6KbDNA核苷酸序列。並标出了几个限制位点，用线条标出的CAP序列表示假定的磷脂酶的调节区域的位置。S·D·表示用于核糖结合的Shine-Dalgarno同源区的位置，基因开始于416位置，结束于1372位置。
表1列出了大肠杆菌K-12和粘质沙氏杆菌W225的菌株。表2中列出了所用的质粒和噬菌体。
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Figure 86104387_IMG12
Figure 86104387_IMG13
Figure 86104387_IMG14
所用的全部实验技术都是常规技术，如T.Maniatis：molecular    Cloning，Cold    Spring    Harbor    Laboratory.1982和J.Miller：Experiments    in    molecular    Cenetics，Cold    Spring    Harbor    1972.中所描述的技术。
所有细胞都是在LB培养基（Bertani.J.Bact    62.1951.P293）或A+B基本培养基（Clark和Maalφe    J.Mol.Biol.23.1967.P99）中培养的，并在培养基中加入了维生素和氨基酸。细胞培养平板含有LB培养基和1.5%琼脂，具有或不具有抗菌素：四环素8μg/ml，氨苄青霉素50μg/ml，氯霉素20μg/ml。用于筛选核酸酶活性的平板含有测试DNase活性的DNase试验琼脂（Difco）。
实例1
由粘质沙氏杆菌W225制备染色体DNA
粘质沙氏杆菌W225的培养物于1985年5月8日寄存于DSM（Deutsche    Sammlung    Von    MiKoorganismen.Grisebach    Strasse    8，D-3400    Goettingen、West    Germany）登记号为D-3308，将该培养物在LB培养基中过夜培养后通过离心收集（800转/分，5分钟）。用TEN-缓冲液将细胞洗涤2次（10mM    Tris-HC1.PH8，1mM    EDTA，100mM    NaCl），並重新悬浮在20ml含有1mg/ml溶菌酶和0.1mg/ml    RNase的TEN-缓冲液中。将该细胞在37℃下保温30分钟，加入20%SDS使最终浓度为1%。在37℃下保持60分钟后（使其彻底溶解），再使该溶菌液在4℃下保温过夜。第二天，离心去除细胞碎片（18000转/分，25分钟）。将上清液转移到另一个试管中，其中含有2ml    3M醋酸钠和2倍体积的异丙醇。在缓慢搅拌下，DNA呈丝状沉淀出，将其用弯曲的玻璃针取出。用80%的乙醇将DNA沉淀洗涤两次，並在TEN-缓冲液中重新悬浮。用飘浮密度梯度离心法进一步纯化DNA，在适当稀释后用酚萃取，並用TE-缓冲液渗析（10mM    Tris-HCL，PH8，1mM    EDTA）。最后，在没有核酸酶的情况下，于37℃用限制性酶缓冲液保温以测试DNA。
粘质沙氏杆菌W225基因库的建成
利用克隆载体质粒pNU121建成粘质沙氏杆菌W225的基因库。该质粒是pBR322的衍生物，编码氨苄青霉素抗性和四环素抗性，但是，四环素抗性的启动基因被噬菌体λ启动子λPR所取代，因此λ阻遏物基因C1也存在于pNU121中，因此四环素抗性通常得不到表达。然而，如果DNA插入到C1基因中而破坏了C1基因的话，抗性也可表达出来。因此，具有在C1基因中唯一EcoRⅠ切点的pNU121DNA被限制性酶EcoRⅠ降解，並和被EcoRⅠ部分降解的粘质沙氏杆菌DNA混合。该DNA在15℃下与T4连接酶保温过夜使其连接。然后转化大肠杆菌菌株MT102。在37℃下，在含有8μg/ml四环素的LB平板上进行选择，这样，能够形成菌落的只有包含具有插入DNA的pNU121的细胞。利用此方法，可分离出代表粘质沙氏杆菌W225基因库的大约2500个菌落。
从粘质沙氏杆菌W225中分离核酸酶基因
通过平板复制，将粘质沙氏杆菌W225的基因库复制在DNase指示平板上（参见前面），在37℃下培养两天后，用0.1N HCl使平板显色。DNase阳性菌落被澄清区域所环绕。从原始板重新分离一个阳性菌落pNU121-nuc+，並测试是否存在编码其它胞外酶的基因，大肠杆菌MT102/pNU121-nuc+于1985年5月8日寄存于DSM，登记号为3309，发现克隆也能表达RNase，但不能表达其它的胞外酶。携带核酸酶基因的EcoRⅠ碎片也被插入失控克隆载体pBEU50中，从而产生质粒pBEU50-nuc+，大肠杆菌C600/pBEU50-nuc+于1985年5月8日寄存于DSM，登记号为3310。
核酸酶基因的限制性酶定位
从包含有核酸酶基因的大肠杆菌菌株MT102中制备质粒DNA，並分别用限制性酶EcoRⅠ，PstⅠ和EcoRⅤ降解。用琼脂糖凝胶电泳分析降解碎片，产生图1所示的图谱。被PstⅠ降解的DNA用T4DNA连接酶重新连接，並转化形成菌株MT102，在含有8μg/ml四环素的DNase指示平板上进行选择。使平板保温显色，所有菌落都显示出核酸酶阳性表型。当用EcoRⅤ降解的DNA重新连接並转化形成MT102时，选择氨苄青氯霉素抗性，所有的转化细胞都是核酸酶阴性。因此，核酸酶基因携带在22Kb的PstⅠ-EcoRⅠ碎片上，如图1所示。
为了进一步亚克隆，用PstⅠ和EcoRⅠ降解质粒DNA，进行电泳以后，从凝胶中纯化携带有核酸酶基因的PstⅠ-EcoRⅠ碎片。用限制性酶FnuDⅡ（一种4碱基平端限制性酶，它在核酸酶基因中有几处切点）部分降解DNA，並与来自质粒pGV403的DNA混合，该DNA已用限制性酶SmaⅠ降解。混合DNA用T4连接酶连接，並转化形成MT102。在含有20μg/ml氯霉素（pGV403具有此抗性）的LA平板上进行选择，转化细胞被复制在DNase指示平板上。分离出了20个核酸酶阳性菌落，並制备出质粒DNA。最小的质粒有1.3Kb的DNA插段，插段中的EcoRⅤ位点，如图1所示。这种质粒定名为pGV403-SD2/10。携有相同但反向的DNA插段的pGV403质粒定名为pGV403-SD2/14，它只有一个EcoRⅠ和HindⅢ识别位点。
核酸酶基因的核苷酸序列
利用Maxam和Gilbert的方法（Proe，Natl，Acad.Sci.USA.74.1977.PP560-64），即利用序列测定载体质粒pGV403进行（Amersham）。有待序列测定的DNA插入到载体的SmaⅠ位点中。SmaⅠ位点两侧接上限制性酶TthⅢ1的识别位点，这样可产生不同的5-引物突出末端，由于酶是以非对称形式切开的，因此，用32p标记后，可直接测定DNA序列。
因此，用TthⅢ1降解杂交质粒后，可从琼脂糖凝胶中分离出最初克隆到pGV403中SmaⅠ位点的1.3Kb的核酸酶片段。用限制性酶FnuDⅡ或HaeⅢ降解DNA片段，然后与用SmaⅠ切开的pGV403DNA连接并脱去磷酸。然后，用此DNA转化形成MT102，在含有20μg/ml的LA平板上进行选择。由转化细胞制备质粒DNA並进行分析。通过这种方法建成一系列pGV403的杂交质粒，它们携有来自整个1.3Kb片段中任意的200-400bp的DNA插段，对这些质粒的两条链进行序列测定产生如上所示的核苷酸序列。
图7所示的核苷酸序列分析表明，核酸酶的编码位置位于386-1165。首先，开放读码系统扩展的区域可编码一个30000道尔顿的蛋白质。第二，在374-78有一个完整的核蛋白体结合位点，它刚好位于启动密码的上游。第三，在330-336（″-10序列）和306-313（″-35序列）有可以构成调节区域的序列。
为了证实核酸酶实际上是根据指定序列编码，而不是存在于互补链上的一个长的开放读码系统中，利用EcoRⅠ和HindⅢ双重降解切开的pGV403-SD2/10和pGV403-SD2/14中的插段。应当注意，插段的定向与pGV403载体的两个限制性位点相反。被切开的片段与已经用EcoRⅠ和HindⅢ进行过双重降解的pPL195相连接。pPL195载体是从pLC28产生的，是通过将含有EcoRⅠ和HindⅢ识别位点的多核苷酸连接物插入到λpL启动子的下游而得到的。将它转移入大肠杆菌NF1并在30℃下选择APR后，分离到两种质粒，pPL195-SD2/10和pPL195-SD2/14，前者中λPL启动子位於上述假定的核酸酶编码区的上游，而后者质粒中λPL启动子以这样一种方式定位，使互补链将被转录。大肠杆菌NF1对於由於C1857基因编码的温度敏感的λ阻遏物的编码缺限λ是溶原性的。C1阻遏物在30℃具有活性，因此，受pPL195中的如λPL阻遏物调节的启动子受到抑制。在温度大於37℃时，阻遏物是非活性的，pPL195中的λPL将进行转录。当比较30℃和42℃时的核酸酶活性时，pPL195-SD2/10在提高温度时能诱导核酸酶合成，pPL195-SD2/14不行，这就证明在pPL195-SD2/10中核酸酶编码区的定位相对于λ启动子来说是正确的。
因此，当上述核酸酶编码区直接与λ启动子结合时，可得到高水平的（温度诱导）核酸酶合成物，来自pGV403-SD2/10的区域由357-1295位置的（图7）的RsaⅠ-HindⅢ片段与用SmaⅠ和HindⅢ降解的pPL195连接，相对於λ启动子，编码区的定位与在pPL195-SD2/10中一样。这种质粒定名为pPL195-SD2/R1。
通过部分纯化蛋白的氨基酸序列分析，已证实了相应于核酸酶氨基端的核苷酸序列。利用另一种序列分析方法，已确定了相应于核酸酶羧基端的核苷酸序列，此方法即Sanger等人的双脱氧核苷酸序列分析法，Proc.Nat.Acad.Sci    USA74.PP5463-5467。
对核酸酶的氨基端序列进行推定表明，在氨基端存在有一个20氨基酸的信号肽，它终止于448位置的一个信号肽酶的识别序列处。
核酸酶活性
在30℃，在LB培养基中，将粘质沙氏杆菌菌株W225和包含有质粒pBEU50-nuc+的大肠杆菌C600的培养至指数增长期。在不同时间内取1ml样品测定OD450和核酸酶活性。核酸酶活性测定是将100ml氯仿加入到外周胞质释放的酶中。以10000转/分离心15分钟后，取25μl上清液测定核酸酶活性。将含有核酸酶的样品加入到0.5ml溶解在0.05M Tris（PH8.0）+0.01M MgCl2的大麻哈鱼精子DNA（1mg/ml）中，将该混合物在37℃下保温1小时，再加入0.5ml    4%PCA（过氯酸），在冰上存放30分钟。离心去除未降解的DNA沉淀，以石英容器，用分光光度计测量OD260（波长260nm处的紫外光吸收）。表3中给出的活性是以此法测定的稳定期培养物样品的OD260值。此结果似乎表明，两种培养物都在生活周期的后期具有更大的酶合成活性。
表3
核酸酶活性
胞外酶
菌株    细胞密度（OD450）    核酸酶活性
C600/（pBEU50-nuc+） 0.265 0
0.448    0.005
0.628    0.075
0.800    0.135
0.940    0.222
1.28    0.447
1.63    1.04
2.50    1.78
3.15    2.87
4.20    3.90
4.80    5.90
5.10    7.70
5.95    12.1
6.80    14.2
胞外酶
菌株    细胞密度（OD450）    核酸酶活性
7.45    15.9
8.08    35.2
W225    0.240    0
0.386    0
0.608    0
0.865    0
1.01    0
1.48    0
2.03    0
2.56    0
3.51    0.047
4.30    0.555
7.10    2.1
9.50    4.6
10.60    5.0
11.4    6.7
14.0    7.0
14.7    7.1
在平行试验中，将培养物样品分成两份，测定外周胞质和生长基质之间核酸酶的分布：一份只含有无细胞的生长基质，而另一份含有由外周胞质和生长基质（如上所述氯仿处理）产生的物质，结果列于表4。
表4
核酸酶活性
菌株    外周胞质    生长基质
粘质沙氏杆菌W225    1.0    45.8
C600/pBEU50-nuc+1.5 1.23
如上所示，在粘质沙氏杆菌W225中，几乎全部核酸酶都分泌出来，而大肠杆菌只分泌了大约50%。
实例2
核酸酶的纯化
在16-20小时的稳定生长期后，通过0.45μm薄膜超滤收集由含有质粒pGV403-SD2（实例1中描述的）的25升大肠杆菌MT102培养物产生的发酵基质，然后通过超滤作用而浓缩，所用超滤膜只能透过分子量低于10000道尔顿物质。用10mM    Tris-HCl（PH7.5），1mM    EDTA渗析后，制剂通过一个玻璃过滤器和一个0.45，0.22μm过滤器过滤。
用下述常规测定方法测定酶制剂的各个参量：
将由50mM Tris（PH8.2），1mM MgCl2，50μg/ml BSA，100ml DNA溶液（水中含有5mg/ml，大麻哈鱼精子DNA）组成的400μl缓冲液和在此缓冲液稀释的25μl酶制剂（无DNA），在37℃下保温60分钟。向反应混合物中加入400μl4%的冷过氯酸。並将该反应混合物置於冰上30分钟，然后以15000Xg离心5分钟。于250nm下测量光吸收，在此常规测定方法中，在1小时内每ml    DNA释出OD260值为1的可溶物质，定义活性为1个单位。
为确定最佳pH值，改变标准测定缓冲液的pH值，並在加入DNA后进行测量。核酸酶活性的最佳范围是7.5-9.6，在pH8.5-9.2具有最大活性。根据常规测定方法，从0到100mM改变MgCl2的浓度以确定Mg2+的最佳值。在0.1-1mM MgCl2的范围内明显有一个相对最佳值。然而在没有加入MgCl2时，只保留了它的全部活性的大约40%。根据此常规测定方法，改变NaCl和KCl的浓度，以测定一价阳离子的最佳浓度。Na+浓度增加时活性迅速降低。在0-50mM KCl（活性不降低）时酶呈现出活性，这一现象很重要，因为当胞内K+浓度为100-150mM时，细胞溶解，尤其是大肠杆菌的溶解，将产生大量的K+。分别在4、23和37℃下预先保温不含有DNA的酶的标准缓冲液1、4和18小时，以此测定酶的短期稳定性。加入DNA后以此常规测定法测定酶活性。表5列出了通过此方法测定的250nm处的吸收值，从每行数据中看出稳定酶具有相同的值。
表5
预保温    4℃    23℃    37℃
1小时    0.389    0.445    0.442
4小时    0.415    0.485    0.403
18小时    0.455    0.505    0.298
从表5中可以看出，在4℃和23℃时，酶在缓冲液中可保持18小时的稳定性。在37℃时，较长时间的保温使酶活性有所降低。
测定有尿素、非离子型去污剂（Brij
Figure 86104387_IMG15
58，Triton
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X-100）和离子型去污剂（SDS和脱氧胆酸钠）存在时酶的活性，以确定变性剂的效应。将这些物质以不同的浓度加入到此常规测定法的制剂中，发现酶在1-8M尿素中呈活性，在4-8M尿素中酶活性有所增加，在4M尿素中具有最大活性。在有Brij 58（1%）和Triton X-100（0.4%）之类的非离子型去污剂存在时，酶也具有它的全部活性。至于离子型去污剂，SDS浓度大於0.01%将导致酶活性完全抑制，而在1%的脱氧胆酸钠存在时只保持约40%的活性。
通过常规的变性SDS-PAGE分析酶的纯度，酶制剂含有许多蛋白质带，在相当於核酸酶的表观分子量（30000）的区域内，有一个明显带，估计相当于整个制剂的5-10%。
采用不同的测定方法估计核酸酶制剂中蛋白酶的活性。首先，将50μl核酸酶样品置於蛋白质（一薄层牛奶）琼脂平板（缓冲液中20%牛奶）上的水中，在37℃下，24小时后;23℃48小时后没有发现澄清区域（板上牛奶蛋白质的降解）的形成。
第二，在0、16和30℃保温20μl具有1mg偶氮-酪蛋白的该酶（缓冲液：50mM Tris PH8.0 10mM MgCl2）12小时，随后在A370处测量酸溶性偶氮染料，没有观察到偶氮-酪蛋白的可测程度的降解，第三，于37℃，在有5mM MgCl2存在下保温核酸酶，用SDS-PAGE分析，没有观察到核酸酶制剂中大约20种蛋白质的电泳图谱发生变化。即没有发生蛋白质自我分解的作用，因此，表明不存在蛋白酶。这就是说，在核酸酶的实际应用中与有待处理的溶胞产物中含有的总蛋白酶相比，酶制剂中可能含有的很低的蛋白分解活性将达到最低限度。
测定在有机溶剂存在下核酸酶降解DNA和RNA的能力。向等分的大肠杆菌MT102的FTL-溶菌液中（取一份细胞，在其中加入一份Tris-EDTA缓冲液，该缓冲液在细胞溶解之前已加入每毫升12000单位的核酸酶，参见下面的实例3）进一步加入酚（1%），甲苯（1%），氯仿（1%），乙醇（5%）或EDTA（0.25M），20℃下保温4.5小时后，利用琼脂糖凝胶电泳分析样品，样品中加入的EDTA起控制作用，因为，在这种EDTA浓度下，核酸酶基本上没有活性。与没有加入有机溶剂的样品相比较，加入各种有机溶剂对核酸酶的活性没有影响，95%的DNA被降解成200bp或更小的片段。
实例3
溶胞液粘度的降低
将实例2中生产的酶约2.6×102和2.6×103单位分别加入到0.27g大肠杆菌的高粘度FTL（溶菌酶-冰冻-熔化）溶胞液里，总体积为500μl。一些样品中加入Mg2+，而另一些样品加入10mM Mg2+，在0℃或24℃下保温。表6列出溶胞液保持“液状的”的时间，即，其粘度明显接近于水的粘度（通过将溶胞液吸到一个移液管里而测定，观察从移液管中滴出的溶胞液是否是分开的非粘性液滴）。
表6
酶加入后的时间（分）
温度 Mg2+2.6×102单位 2.6×103单位
-    72    12
0℃    +10mM    55    8
-    55    5
24℃    +10mM    40    3
然而应当注意，在不同的溶胞液试验中，可观察到有很大的不同，例如，使用FP（French    Press）溶胞液时，可获得在一定程度上被剪切的核酸。发现这种溶胞液为酶提供了一种较好的底物，这大概是由于FP溶胞液中填充的凝胶结构较为松弛。由7.5g大肠杆菌W3110（湿重）所获得FP溶胞液（15ml）的粘度，在0℃时与24个酶单位/毫升的溶液保温40分钟后，将被降低并变为“液状的”。
细胞溶解前核酸酶的加入
A.将0.25g大肠杆菌MC1000的（湿重）重新悬浮于0.25ml    TE〔TE＝10mM    Tris（PH8.0），1mM    EDTA〕中，加入12个单位的实例2中生产的核酸酶。根据常规方法（冷冻-熔化过程循环3次），使悬浮物进行FTL溶解。以目视监测粘度变化，当移液管中有“液状”液滴出现时，即表明溶胞液的粘度被降低了。在最后一个FTL循环后，将溶胞液在0℃下保温，5分钟后，溶胞液即变为“液状的”。这个试验出乎意料地表明了在细胞碎裂之前加酶的有益效应，即如果在溶解之前加入核酸酶，只需要24单位酶/毫升在5分钟即可降低粘度，而如果在溶解后加入核酸酶，每毫升溶胞液需要5200单位的酶和12分钟的时间才能降低粘度。
B.为了使粘度降低的幅度更大，可以在用X-Press（Biotec）产生的大肠杆菌溶胞液上试验这种方法，X-Press技术将冷冻一熔化效应和高压溶解结合在一起。
将7.5g大肠杆菌MC1000（湿重）在7.5ml的TE中重新悬浮，加入2mM的MgCl2和25个单位/毫升的核酸酶。将该悬浮物在X-Press中冷冻，并在-20℃进行5次压力循环。使均浆物在0℃下熔化2小时。以目测观察，粘度在熔化时已被降低了（即移液管中有“液状”体滴下），但是，熔化的持续，使得难以确定核酸酶在那之前无活性的时间零点。因此，如在溶解之前加入核酸酶24个单位/毫升的溶胞液对於降低X-Press溶胞液产物的粘度是有用的。
用TE（0℃）将均浆物稀释到37.5ml，在随后24小时中监测粘度变化（Ostwald粘度计）。在0℃保温时核酸酶在粘度计中继续降解。在图2中标明的时间点上（横座标）确定粘度。图2中纵座标表明了观察到的相对於0℃水的粘度，反应条件是9.6个单位核酸酶/毫升溶胞液。在最初10分钟时相对粘度迅速降低，随后在0℃保温数小时中呈稳态降低，24小时时相对粘度为1.5。
C.在7.5ml TE中重新悬浮7.5g大肠杆菌MC1000（湿重），加入6mM MgCl2和24单位/毫升的核酸酶。让细菌和酶在10000Ψ下通过French压力室，然后立即在0℃下对该溶胞液进行保温，时间零点取为从压力室排出的时间。在排出时，溶胞液从移液管中产生“粘性”液滴，然而，在0℃保温5分钟后就变成“液状”液滴。
因此，24个单位的溶胞液对於降低FP溶胞液的粘度也是有用的。
在5分钟时，用TE（0℃）将溶胞液稀释到30ml，用Ostwald粘度计测定不同时间的粘度（图3横座标）。结果以相对粘度给出（纵座标），利用0℃水的粘度做为参照。粘度计中的反应条件为：每毫升来自0.25g大肠杆菌MC1000的溶胞液12单位核酸酶，温度＝0℃。
为了说明在溶解之前加入核酸酶的有益效应，进行如下试验。按照上述方法制备溶胞液。在15ml大肠杆菌W3110的悬浮液样品中（7.5克细胞），加入不同数量的核酸酶，使最终浓度达到每毫升0.24至240单位（图4中1～5线）。用French    Press溶解后，溶胞液在0℃保温，利用移液管对粘度进行目测，图4中描述了粘度类别。
在240个单位的核酸酶/毫升（线5）时，在压力下排出的溶胞液是“液状的”，而有2.4单位/毫升的核酸酶存在时（线2），在0℃下20分钟后产生“液状”液滴。在0.24单位/毫升时（线1），在70分钟时的结果是“甘油状”液滴，随后在0℃保温15小时后变成“液状”液滴。
在0℃保温70分钟和1.5小时后，测定以上样品稀释2.5倍后的相对粘度，线2-5表明，在此试验中，目测的“液状”液滴的相对粘度的范围为1.5-2.1。用过量的酶（线5）可获得的最小值是1.5。估计这个值在70分钟时可达到，这表明形成粘性的核酸成分已经被排除。
为了提供特殊应用中所需核酸酶数量的信息，绘出了（图5）酶加入量与在70分钟和15小时时粘度之间的关系。加入3600单位的核酸酶产生的粘度值与0℃下保温70分钟和15小时的值相同，即分别为1.52和1.47。因此1.50这个值可认为是所述溶胞液的相对粘度的最小值。
在0℃保温70分钟后，相对粘度与对数（加入的酶）或对数（酶浓度）成正比。利用外插法，加入1500单位（100单位/毫升）将完全消除溶胞液的粘性成分，此粘性可能是由於核酸存在而导致，即加入过量的1500个单位的酶，或保温期的延长，对於相对粘度都不会进一步产生降低，最小值为1.5。
从图中可以看到，如果获得相同的粘度，加入酶的量减少10倍，在0℃下保温的时间则需要延长10倍（即36单位/70分钟对3.6单位/15小时，360单位/70分钟对36单位/15小时）。
为了将细胞碎裂前加入核酸酶的新方法与细胞溶解后加入核酸酶的传统方法进行比较，如上述方法制备15ml溶胞液，但细胞碎裂之前不加入核酸酶。通过French压力溶解后，加入360个单位的核酸酶，使最终浓度为24单位/毫升，将该溶胞液在0℃下保温。图4中线6表明在40分钟时，随着“液状”液滴的出现，粘度逐渐消失。70分钟时的相对粘度可与线3所示样品的粘度（溶解前加入8单位/毫升）相比较，虽然粘度降低的初始速率完全不同。估计在细胞溶解前加入大约1.5单位核酸酶/毫升将产生一个与线6相同的时间图形。但产生的相对粘度显然较高，范围为2.13-2.53。因此，根据在定义“粘度降低”中所用的标准，增益因子（以酶的要求而言）可能为3，或20。
从溶胞液中取出的样品示於图4线2-6，当刚好达到“液状”的状态时，进行琼脂糖凝胶（1%）电泳，随后用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓着色。在所有的带中，可染色的残留产物构成一模糊区带，它从21Kbp的标记扩展到溴苯酚兰带，在核酸酶浓度较高的样品中泳动缓慢的物质量减少。这种物质包括核酸酶处理之前的核酸的从小於百分之一到百分之几的片段（图6）。
实例4
残余核酸的去除
根据细菌溶胞产物极限降解液的凝胶电泳分析结果，可以断定溶胞产物中有大约0.1%的核酸不会受到核酸酶的作用。有人认为残余核酸的存在是由于特殊序列的保护性掩蔽所致，它们也许是基因组中与膜结合的一部分，用核酸酶处理后剩余核酸只占核酸总量的很小一部分。
为了去除残余的核酸，细胞溶胞产物可在各种蛋白变性剂的存在下用核酸酶进行处理。
总体积为0.6毫升的0.25克大肠杆菌（湿重）FTL溶胞产物在1-12M的尿素存在下用240个单位的核酸酶进行处理。使溶胞产物于30℃下保温1小时或18小时。保温以后，用琼脂糖凝胶电泳分析5微升残余物，並用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色。
经18小时的降解作用后，能观察到2-4M尿素的显著阳性效应，特别是4M尿素存在时，能除去所有进入凝胶的可染色物质。
总体积为2.5毫升的0.68克大肠杆菌（湿重）的FTL溶胞产物用2.6×103单位的核酸酶仅仅在16℃下处理24小时，其中还加有0.1%的SDS（十二烷基磺酸钠）或0.6% Triton
Figure 86104387_IMG19
X100。凝胶电泳分析结果表明当有洗涤剂存在时残余核酸能被核酸酶降解。
根据这些实验结果可以看出，洗涤剂和蛋白变性剂两者都能使溶胞产物中的残余的掩蔽核酸受到核酸酶的作用。
实例5
沙雷氏菌属A1菌株的分离
通过平板培养，将从腐烂的黄瓜中采集的细菌培养于DNase测试琼脂上。进一步分析一个显示出高核酸外切酶活性的菌落。革兰氏染色呈现阴性。初步鉴定表明分离出来的生物是Serratia    Liquefaciens。然而，直到分类法完备以后，因为它有许多特性是属于沙雷氏菌属的，所以才试探性地将其命名为沙雷氏菌属A1菌株。该生物抗四环素和氨苄青霉素，而且与粘质沙氏杆菌一样，也表现出同样的胞外酶。（Serratia    Liquefaciens    A1于1985年5月8日寄存于DSM，登记号3307）。
由沙雷氏菌属A1菌株制备染色体DNA
沙雷氏菌属A1菌株在LB培养基中培养过夜，並用离心法（8000转/分，5分钟）进行收集。细胞用TEN-缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH8，1mM    EDTA，100mM    Nacl）洗涤两次，再悬浮于含1毫克/毫升溶菌酶和0.1毫克/毫升RNase的20毫升TEN-缓冲液中。细胞于37℃下保温30分钟並加入20%的SDS，使其最终浓度为1%。在37℃下保持60分钟后（使之完全溶解），溶胞产物于4℃下保温过夜。次日用离心法（18，000转/分，25分钟）除去细胞碎片，将上清液转移到盛有2毫升3M醋酸钠和2倍体积异丙醇的另一试管中。轻轻混合后，用一只弯曲的玻璃针挑出线状沉淀的DNA。用80%的乙醇两次洗涤DNA沉淀，然后重新悬浮于TEN-缓冲液中。利用飘浮密度梯度离心进一步纯化DNA，在适当稀释后用苯酚萃取並以TE-缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH8，1mM    EDTA）进行渗析。最后，用限制性酶缓冲液在37℃保温，在没有核酸酶的存在下对DNA进行检测。
由沙雷氏菌属A1菌株建成基因库
利用克隆载体质粒pNU121建成沙雷氏菌属A1菌株基因库，质粒的说明见实例1。
在C1基因中具有唯一的EcoRⅠ位点的pNU121DNA用限制性酶EcoRⅠ进行降解，再和用EcoRⅠ部分降解的沙雷氏菌属A1菌株DNA混合，DNA于15℃下与T4DNA连接酶过夜连接並转化形成大肠杆菌MT102，于37℃下在含8微克/毫升四环素的LB培养基上进行选择，这样只有包含了带有插入DNA的pNU121的细胞才能够形成菌落。通过这种方法，可以分离出近8000个代表沙雷氏菌属A1菌株基因库的菌落。
脂酶活性的筛选
用沙雷氏菌属A1菌株基因库转化大肠杆菌MT102细胞，而带有杂交质粒的细胞是在LB培养基上用四环素筛选的。将挑选出的菌落转移到微量滴定板上，每个滴孔中都含有A+B基质、1%酪蛋白氨基酸、硫胺素以及200毫克/毫升链霉素和8微克/毫升的四环素。细胞于37℃下生长过夜並在板上进行复制，脂酶的底物，对-硝基苯基棕榈酸酯首先以6毫克/毫升的浓度悬浮于异丙醇中。取该悬浮液10毫升加到含有207毫克脱氧胆酸钠的pH8.0的90毫升0.05M磷酸盐缓冲液中。再各取这种溶液0.5毫升分别加到微量滴定板上的各个小孔里，孔中出现黄色即表示脂酶活性的存在。于是就获得了这样一个克隆。制备DNA並用于转化大肠杆菌CSH50。转化株为脂酶阳性，分离这种克隆並制备DNA。所选择的克隆不表现蛋白酶、磷脂酶或核酸酶活性。
携有脂酶的质粒pNU121-Lip+
由脂酶阳性克隆分离出来的质粒DNA由具有约8.4Kb的EcoRⅠ插入片段的pNU121组成。杂交质粒被定名为pNU121-Lip+。（大肠埃希氏杆菌CSH50/pNU121-Lip+于1985年5月8日寄存于DSM，登记号3313）
脂酶的酶活性
脂酶对于底物p-硝基苯基棕榈酸酯上的作用活性，可以通过分光光度法以OD410进行监测。当大肠杆菌/pNU121-Lip+和沙雷氏菌属A1菌株两者在A+B基质、1%酪蛋白氨基酸和硫胺素中培养到指数生长期时，可以观察到培养基中有酶的存在。
实例6
由沙雷氏菌属A1菌株制备染色体DNA
将沙雷氏菌属A1菌株（参看实例5）培养在LB培养基中生长过夜，並用离心法（8，000转/分，5分钟）收集。用TEN-缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH8，1mM    EDTA，100mM    NaCl）洗涤两次，然后重新悬浮于含1毫克/毫升溶菌酶和0.1毫克/毫升RNase的20毫升TEN-缓冲液中，细胞于37℃下保温30分钟后加入最终浓度为1%的20%SDS，于37℃下保温60分钟后（使其完全溶解），溶胞产物再于4℃下保温过夜，次日用离心法（18，000转/分，25分钟）除去细胞碎片。上清液转移到另一只盛有2毫升3M醋酸钠和2倍体积异丙醇的试管里。轻轻混合后，用弯曲的玻璃针挑出呈线状沉淀的DNA。DNA沉淀用80%的乙醇洗涤两次，然后再悬浮于TEN-缓冲液中。采用飘浮密度梯度离心法进一步将DNA提纯，适当稀释后用苯酚萃取並以TE-缓冲液（10mM    Tris-HCl，pH8，1mM    EDTA）进行渗析。最后，在没有核酸酶存在下用限制性酶缓冲液于37℃下保温以检测DNA。
由沙雷氏菌属A1菌株建成基因库
利用克隆载体质粒pNU121（参见实例1）构建沙雷氏菌属A1菌株基因库（参见实例5）。
在C1基因中具有唯一EcoRⅠ位点的pNU121DNA用限制性酶EcoRⅠ降解，然后和用EcoRⅠ部分降解的沙雷氏菌属A1菌株DNA混合。用T4DNA连接酶于15℃下过夜连接，然后转化大肠杆菌MT102。于37℃下在含有8微克/毫升环素的LB培养基上进行选择，这样只有包含了具有插入DNA的pNU121的细胞才能够形成菌落。通过这种方法，能分离出近8，000个代表沙雷氏菌属A1菌株基因库的菌落。
磷脂酶阳性克隆的筛选
用沙雷氏菌属A1菌株的基因库转化大肠杆菌MT102细胞，在LB培养基上用四环素选择带有杂交质粒的细胞并在具有四环素的蛋黄培养基上进行复制。菌落周围园形澄清区及菌落顶部白色沉淀的出现表明磷脂酶活性的存在。分离出15个这样的菌株制备DNA，並且转化CSH50。所用的磷脂酶克隆就是这样的克隆。选择出的克隆pNU121-phl+仅只表现出磷脂酶活性。（大肠杆菌MT102/pNU121-phl+于1985年5月8日寄存于DSM，登记号为3311）
携有磷脂酶的质粒pNU121-phl+和
pOU57-phl+
从产生磷脂酶的克隆pNU121-phl+中分离出质粒DNA，它是由在C1基因中（图8）插入了3.2Kb的ECoRⅠ片段的pNU121组成的。这种EcoRⅠ片段在失控质粒pOU57中进行克隆。失控质粒pOU57-phl+赋于其它的大肠杆菌菌株以磷脂酶表型，并可以观察到，当有沙雷氏菌属的菌株存在时，磷脂酶的表达得以提高（大肠杆菌S17-1/pOU57-phl+于1985年5月8日寄存在DSM，登记号3312）。将温度从30℃提高到40℃时，测试菌株中的磷脂酶的表达得到加强。
磷脂酶的活性
当含质粒pNU121-phl+的大肠杆菌细胞在A+B+1%酪蛋白氨基酸和硫胺素，或LB培养基上培养时，只有当培养物的细胞密度相当于OD450为0.7时才检测磷脂酶。大肠杆菌菌株的存活力一点儿也不受质粒存在的影响。
磷脂酶活性的检测是根据蛋黄反应进行的。检测活性是在能抑制细胞生长和凝胶中蛋白质合成的2%琼脂糖凝胶中进行的，其中含有蛋黄和氯霉素。
在凝胶中做成一些小孔，用滴管向其中加入5微升培养物的上清液，（细胞已通过离心去除）。
酶和蛋黄的反应能使混浊的凝胶中产生澄清区。酶的扩散速度，即单位时间内平方毫米澄清区的形成，被用作衡量酶活的尺度，大肠杆菌/pNU121-phl+和沙雷氏菌属Al菌株的培养物的磷酸酶活性测定结果列于表7中。
表7
磷脂酶的活性
培养物    细胞密度    胞外磷脂酶活性
OD450 mm2/小时
MT102/pNU121-phl+0.1 0
0.5    0
0.7    0.4
0.9    0.7
1.0    0.9
1.3    1.3
1.4    1.5
1.5    1.8
沙雷氏菌属Al菌株    0.1    0
0.5    0
0.7    0.02
0.9    0.10
1.2    0.35
1.8    0.90
2.0    1.1
可以看出，大肠杆菌培养物向培养基中分泌酶的效率比沙雷氏菌更高。在两种菌株中，基质中酶的出现是在指数生长后期並延续到稳定期。基质中有1%的葡萄糖就能有效地阻断酶在两种宿主中的合成（未列出）。培养基中只要有很少一点洗涤剂（0.5%吐温80）就能产生对分泌的刺激效应（未列出）。
磷脂酶克隆的DNA序列分析
采用Messing等人（Nucl、Acid    Res.9，1981，P.309）用于M13噬菌体衍生物Mp8和Mp9上的“Shotgun”克隆法和Sanger等人（proc、Natl、Acad、Sci、USA74，1981，P.5463）的双脱氧链终止法对含有磷脂酶基因的3.2Kb的EcoRⅠ限制性片段进行序列分析。在片段的亚克隆中，使用了许多不同的限制性酶：Sau3A、Taql、AluⅠ、RsaⅠ、SalⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、PvuⅠ、BssHⅡ和EcoRⅤ。完整序列的确定是通过将一些小段DNA序列（100-300碱基）拼凑起来而完成的。两条单链中的大部分DNA序列都已经确定。
该序列（图9）显示出一个主要读码区，它从片段左端的416位置起始，穿过Sal位点到1372位置终止。
在该区的上游405位置，即紧靠ATG起始密码的上游，有一个Shine-Dalgarno同源区AAGGAG（Shine，Dalgarno，Nature.254，1975，P.34）。读码区的上游是启动子区，它由351位置的-35序列CTGCC和374位置的-10序列TATTTA组成。-35序列的上游从306到336位置是一潜在的CAP结合位点。
该序列表明存在一个为319个氨基酸的蛋白编码的基因，该蛋白质的预测分子量为34，056道尔顿。
在lac基因的441上游，从O位置到PstⅠ位点插入了DNA片段表明，在此DNA片段中存在着功能性启动子。当细胞群体生长至OD450为0.7时，该启动子启动lac基因的表达。而且，该启动子在有葡萄糖存在时，不论细胞密度为多少都是非功能性的，这表明代谢产物阻遏可能是通过已指出过的CAP结合位点进行的。
通过亚克隆已经证实，表达胞外磷脂酶活力的必要的遗传信息位于1.2Kb片段中，即从360位置到1551位置的FspⅠ位点为止。还发现，与所获的序列信息一致，为了在大肠杆菌细胞中得到磷脂酶活力，必须将此片段克隆到启动子之前。通过这种方法，基因的定向也得到了确定。基因转录方向与序列数据一致是从左边的EcoRⅠ位点到FspⅠ位点。所用启动子是C1857和λpR的可用温度诱导的系统。30℃温度下用大肠杆菌细胞合成磷脂酶从常规的平板检测来判断是很低的。温度高于37℃时，就会有大量的酶产生。通过导入放射性标记的蛋氨酸的方法，在离体的活体试验中，都得到了此1.2KbDNA片段的基因产物。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，确定该基因产物的大小为34仟道尔顿，同时还表明，在这种凝胶体系里，磷脂酶活性与放射性标记的34仟道尔顿的蛋白质一道泳动。

Claims (55)

1、一种生产细菌酶的方法，它包括在一种培养基中培养一种含有一种杂交质粒的微生物，该杂交质粒中含有来自沙雷氏菌(Serratia)的编码一种沙雷氏菌胞外酶的DNA，以及从培养物中收集这种酶。
2、按照权利要求1所述生产基本上不含有其它细菌蛋白的细菌酶的方法，其中，酶是由微生物分泌到培养基中並从培养基中收集。
3、按照权利要求1或2所述的方法，其中沙雷氏菌酶是一种水解酶。
4、按照权利要求1或2所述的方法，其中沙雷氏菌酶是一种沙雷氏菌的核酸酶。
5、按照权利要求1或2所述的方法，其中沙雷氏菌酶是沙雷氏菌脂酶。
6、按照权利要求1或2所述的方法，其中沙雷氏菌酶是沙雷氏菌磷脂酶。
7、按照权利要求6所述的任何一种方法，其中微生物是细菌。
8、按照权利要求7所述的方法，其中微生物是草兰氏阴性细菌。
9、按照权利要求8所述的方法，其中革兰氏阴性细菌是大肠杆菌（E.Coli）。
10、一种含有来自沙雷氏菌的插入DNA的杂交质粒，该DNA编码了一种沙雷氏菌胞外酶。
11、按照权利要求10所述的杂交质粒，其中沙雷氏菌DNA是编码沙雷氏菌核酸酶的DNA片段。
12、按照权利要求10所述的杂交质粒，其中沙雷氏菌DNA是编码沙雷氏菌脂酶的DNA片段。
13、按照权利要求10所述的杂交质粒，其中沙雷氏菌DNA是编码沙雷氏菌磷脂酶的DNA片段。
14、按照权利要求10～13中任一项所述的杂交质粒，该质粒具有不受条件控制而进行复制的特点。
15、一种微生物，它含有权利要求10～14中任一项所要求的质粒。
16、按照权利要求15所述的微生物，其中，该微生物所包含的质粒中的沙雷氏菌DNA的基因产品，是由该微生物分泌到培养基中的。
17、按照权利要求16所述的微生物是一种细菌。
18、按照权利要求17所述的微生物是一种革兰氏阴性细菌。
19、按照权利要求18所述的微生物是大肠杆菌。
20、一种包括N-端信号肽的细菌核酸酶，它是具有下列氨基酸序列的沙雷氏菌核酸酶。
Figure 86104387_IMG1
21、按照权利要求20所述的酶，该酶基本上是纯化形式的酶。
22、按照权利要求20或21所述的酶，该酶被固定在一种基质上。
23、一种磷脂酶，它是一种沙雷氏菌的磷脂酶，该磷脂酶由下列DNA序列（编码链）所编码：
Figure 86104387_IMG2
24、一种从生物材料中去除核酸的组合物，该组合物包括沙雷氏菌核酸酶。
25、按照权利要求24所述的组合物，其中沙雷氏菌核酸酶是权利要求20所述的核酸酶。
26、按照权利要求24或25所述的组合物，该组合物基本上没有水解蛋白的活性。
27、一种组合物，它包括一种核酸酶和一种洗涤剂和/或促溶剂。
28、按照权利要求27所述的组合物，其中，洗涤剂选自非离子型洗涤剂如聚氧乙烯醇，例如Brij
Figure 86104387_IMG3
58;或Octoxynols，例如Triton
Figure 86104387_IMG4
x-100，或离子型洗涤剂例如十二烷基磺酸钠或脱氧胆酸盐如脱氧胆酸钠。
29、按照权利要求27所述的组合物，其中促溶剂选自尿素、硫脲或硫氰酸盐。
30、按照权利要求27～29中任一项所述的组合物，其中核酸酶是沙雷氏菌核酸酶。
31、按照权利要求30所述的组合物，其中沙雷氏菌核酸酶是按权利要求20所述的核酸酶。
32、一种从生物材料中去除核酸的方法，该方法是在生物材料中加入沙雷氏菌核酸酶。
33、按照权利要求32所述的方法，其中所述的生物材料包括一种核酸溶液。
34、按照权利要求32所述的方法，其中所述的生物材料包括一种能产生生物合成产品的细胞培养物的发酵基质。
35、按照权利要求32所述的方法，其中所述的生物材料包括一种其中已培养了能产生生物合成产品的细胞培养物的发酵基质。
36、按照权利要求32所述的方法，其中所述的生物材料包括一种能产生生物合成产品的细胞培养物的悬浮液。
37、按照权利要求34或36所述的方法，其中的核酸酶是在细胞溶解之前加入到生物材料中。
38、按照权利要求32～37中任一项所述的方法，其中沙雷氏菌核酸酶是按权利要求20所述的核酸酶。
39、一种从生物合成产品中去除剩余核酸的方法，其中核酸酶与洗涤剂和/或促溶剂一起加入。
40、按照权利要求39所述的方法，其中的核酸酶是沙雷氏菌核酸酶。
41、按照权利要求40所述的方法，其中沙雷氏菌核酸酶是按权利要求20所述的核酸酶。
42、按照权利要求39～41中任一项所述的方法，其中洗涤剂选自非离子型洗涤剂如聚氧乙烯醇，例如Brij
Figure 86104387_IMG5
58，或oetoxynols，例如Triton
Figure 86104387_IMG6
X-100，或离子型洗涤剂如十二烷基磺酸钠或脱氧胆酸盐如脱氧胆酸钠。
43、按照权利要求41所述的方法，其中非离子型洗涤剂加入量为生物合成产品的0.2-1.5%，最好为0.4-1.0%左右。
44、按照权利要求42所述的方法，其中离子型洗涤剂加入量为生物合成产品的0.01-10%。
45、按照权利要求39～41中任一项所述的方法，其中蛋白变性剂选自尿素、硫脲或硫氰酸盐。
46、按照权利要求45所述的方法，其中蛋白变性剂加入量为2～8M。
47、一种质粒，它包括一个调节区，一个位于所述调节区下游的基因的表达被该调节区启动并加强，这种启动和加强是在含有该质粒的微生物生长周期的后阶段进行的。
48、按照权利要求47所述的质粒，其中所述的基因是一种与该调节区没有天然联系的基因。
49、按照权利要求47所述的质粒，其中所述的基因包含质粒的复制调节基因。
50、按照权利要求47～49中任一项所述的质粒，其中所述的调节区是从沙雷氏菌中获得的。
51、按照权利要求50所述的质粒，其中所述的调节区是沙雷氏菌的核酸酶或磷脂酶调节区。
52、一种按照权利要求47～51中任一项所述的包含一种质粒的微生物。
53、按照权利要求52所述的微生物是一种细菌。
54、按照权利要求53所述的微生物是一种革兰氏阴性细菌。
55、按照权利要求54所述的微生物是大肠杆菌。
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