CN1904036A - 基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用转基因大肠杆菌混合培养生产具有生物活性的人α防御素蛋白的新方法。包括：使用人α防御素成熟肽优化编码序列，将该序列构建到适宜的tac型表达载体pGEX4T1中，再将其转化入筛选出的抗细胞毒性的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，从而构建成含外源基因的三种工程菌株PHS1、PHS2、PHS3。它们的特点是均能抵抗表达蛋白对细胞的毒性，从而使表达量显著提高。将三种工程菌进行等量混合培养，经化学诱导表达人α防御素，可同时生产出三种人α防御素蛋白的混合蛋白。用上述方法生产的蛋白可能对病原菌的抗性具有协同的作用。用本法生产α防御素可应用于医药卫生领域。

Description

基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程菌混合培养生产人α防御素的方法，即将经过基因修饰的人α防御素(Human neutrophil peptides，HNP)1、2、3成熟肽编码序列插入融合性原核表达载体，转化大肠杆菌，获得三种转基因工程菌，在混合培养体系中生产三种人α防御素蛋白混合物。本发明提供用于本发明的方法及适用的工程菌。

背景技术

防御素是普遍存在于高等生物体中的一种微生物抗生肽，对病源微生物具有广谱的毒杀效应，是机体免疫防御系统的重要组成部分(Ganc T et al，Eur J Haematol，1990，44：1；张满朝，国外医学分子生物学分册，1994，68：70)。防御素主要由哺乳动物体内参与非特异性免疫的一些吞噬细胞，特别是嗜中性粒细胞(PMN)产生的，其它细胞包括NK细胞、γδ细胞、B细胞和单核/巨噬细胞及某些上皮细胞也能产生此类物质。成熟防御素是分子量为3～4KD的非糖基多肽，一般由29～34个氨基酸组成，分子内的3个二硫键使防御素具有稳定的β-片层结构，在防御素分子间，通过疏水键和氢键的相互作用形成二聚体。目前对防御素的抑菌机理尚无定论。普遍认为，防御素的细胞毒活性和抗微生物活性与其结构特点有关，带正电的防御素与带负电的细菌细胞膜相互吸引，二聚或多聚的防御素穿膜形成跨膜的离子通道，从而扰乱了细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受到抑制以及细胞ATP含量下降，最终使靶细胞死亡。防御素的抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性(Lehrer RI et al，Annu rev Immun，1993，11：105；Lehrer RI etal，J Clin Invest，1989，84：553)。由于这种特殊的作用机理，使防御素具备两个特点：一是抗性谱广，二是目的微生物难以对其产生抗性突变。因此，科学家们对防御素应用前景十分看好。

防御素在人体内广泛分布，包括α防御素β防御素两类。已发现的α防御素有6种之多，有关基因结构已经基本清楚(Sparkes RS et al，Genomic，1989，5：240)。早在1993年，日本科学家就报道防御素在离体情况下可抑制艾滋病毒的复制，但没有证明在体内防御素仍然有效(Nakashima H et al，AIDS，1993，7：1129)。1986年，科学家们观察到人体免疫细胞CD8分泌一些可抑制艾滋病病毒复制的未知因子(Walker CM et al，Science，1986，234：1563)。近来，张林琦等在正常人群和感染HIV 1的长期生存者来源CD8+T淋巴细胞刺激培养液中发现了一族有2个或3个峰的分子，分子量分别为3371.9Da、3442.5Da和3486.5Da。用单克隆抗体识别技术及直接蛋白序列分析技术，最终确定这些小分子是人α防御素1、2和3。这些小分子只能在正常对照和长期生存者中被检测到，在处于进展状态的HIV 1感染者的刺激培养液中没有发现α防御素。实验还证实人工合成α防御素1和2的混合物(1∶1)也对HIV-1病毒具有显著的抑制效应(Zhang et al，science，2002，298：995)。张林琦等的研究揭示了为什么少数感染艾滋病毒的人(约占感染者总数的1％-2％)可以自然存活多年不发病的秘密，同时也提示人三种人α防御素可能具有重要的协同作用。

人α防御素1、2和3的发现和证实，使科学家在了解HIV/AIDS的发病机制方面迈出了一大步。但要想将防御素真正应用于艾滋病治疗，尚有很多工作要做。从人体内提纯的天然防御素具有很强的抗病毒活性，但提取资源有限，成本昂贵。化学合成法虽可方便地对多肽进行修饰，但也存在成本过高的问题。现已获得两个商业化的产品α防御素1和α防御素2，但合成工艺复杂，且与天然提纯品相比纯度不够，包含了许多杂蛋白，抗艾滋病病毒活性较低，仅为提纯的天然防御素的1/10至1/20(Zhang et al，science，2002，298：995)。因此，通过基因和蛋白质工程技术来改善生产效率和产物活性，已成为防御素研究和应用的关键。

防御素在基因工程领域的应用主要表现在两方面：一是研究出高效的细菌或酵母表达系统，大量生产防御素，应用于医学领域；另一个方面是分离动物或昆虫的防御素基因，将之应用于植物抗病基因工程中(傅荣昭等，高技术通讯，1996，3：61)。截止目前，孙勇如等已经分离出兔防御素基因(科学通报，1998，43：1519)，将兔α防御素基因导入小球藻，从转基因小球藻中获得了有活性的兔防御素NP 1，解决了藻类基因工程表达(专利申请号971123446，公开号CN1203278A；专利申请号71121893，公开号CN1203277A)。但目前国内外均尚无应用大肠杆菌系统生产人α防御素的成功报道。1993年，Piers等曾将HNP1、昆虫杀菌肽cecropin/melittin(CEME)杂合肽基因分别与4个不同的载体蛋白相融合，并在S.aureus中进行表达；对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况进行了较为系统的研究，但遗憾的是没得到具有抗菌活性的HNP1蛋白(Piers et al，gene，1993，134：7；孙超等，多肽抗生素研究进展， http：//www.21ray.com/6-tech/10.html)。因此，生产防御素的大肠杆菌高效表达体系还有待于进一步研究。

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用广泛的经典表达系统。自二十世纪七十年代中期Struhl等首次在大肠杆菌中实现了有功能的活性表达以来，以质粒、乳糖操纵子为基础建立的大肠杆菌表达体系不断得到发展和完善。与其他系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目标基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点，因而成为分子生物学研究和生物技术产业化进程中的重要工具(李育阳等，基因表达技术，科学出版社，2001，1-13)。

防御素对大肠杆菌细胞的毒性以及表达产物的活性问题是限制其在原核表达系统表达成功的主要原因。人α防御素在其体内以特殊的机制避免对产生它的细胞本身的损伤。α防御素是先合成前原蛋白，暂时封闭其细胞毒性(Erika V et al，J Clin Invest，1996，97：1624)。另外，成熟的防御素是在嗜天青颗粒中形成，并且很少向外分泌，即使向外分泌，也被胞间液稀释或与其它蛋白结合，从而不表现细胞毒活性。但如同其它多肽抗生素一样，要用大肠杆菌表达系统来生产这些蛋白就比较困难。由于目标蛋白对宿主本身产生杀灭作用，往往造成表达体系表达量低甚至无表达。因此，抑制或克服目标蛋白对大肠杆菌本身毒性就成为首要面对的问题。

采用适宜表达方式以及选择适宜的细菌株系构建工程菌是克服目标蛋白毒性以及成功应用大肠杆菌系统生产人α防御素最重要的方面。对分子量较小且产物有细胞毒性的目标基因进行融合表达或串联聚合表达是比较理想的方式。完整的表达系统由表达载体和宿主菌两部分构成。目前比较成熟的大肠杆菌表达系统包括lac和tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。T7系统以Novagen公司的pET系列载体以及相应的宿主菌(BL21系列)为代表(Robert Mierdorf et al，Newsletter of Novagen，1994，1：1-4)，这类表达系统所用的载体具有可诱导的T7启动子，系统表达量高(可占细菌总蛋白的25％以上)，常用6～10个组氨酸形成融合蛋白，只增加几个氨基酸，对蛋白质结构影响较小，但是往往本底表达(也称渗漏表达)水平较高，和一般菌株匹配不适宜毒性蛋白表达。与pET系列载体匹配的宿主菌主要是BL21系列，包括BL21、BL21(DE3)、BL21TrxB、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE等。BL21系列菌株具有lon和ompT蛋白水解酶缺陷的优点，可提高表达蛋白的稳定性。其中BL21(DE3)pLysS带有质粒pLysS，能编码T7溶酶。T7溶酶可降低T7启动子调控的目的基因的本底表达水平，但不干扰由IPTG诱导的表达水平，适宜毒性蛋白表达。PL和PR表达系统则是以温度敏感性PL和PR启动子为中心构建的表达系统，成本低廉，但是表达蛋白容易降解，表达量低，不适宜毒性蛋白表达。lac和tac表达系统以Amersham公司的pGEX系列载体为代表，在tac启动子、Lac操纵基因及SD序列下游相继是谷胱苷肽巯基转移酶(Glutathione S-transferase Gene Fusion，GST)基因序列以及多克隆位点。克隆的外源基因与GST基因相连，表达产物为GST融合蛋白。带有GST标签的载体选择了大肠杆菌偏爱的密码子，容易表达毒性外源蛋白，并且纯化方便。GST基因序列存在可避免mRNA复杂二级结构的出现，增加转录物稳定性。因此，GST的存在有利于克服因细胞异源蛋白对宿主细胞本身杀灭而致的低效表达或无表达现象。另外，GST属于多功能蛋白，有助于稳定重组蛋白的折叠，可在温和条件下除去，不易破坏目标蛋白的功能及其抗原性(The Recombinant ProteinBook，Amersham，www.apbiotech.com)(Pickett C B,et al，Ann Rev Biochem，1989，58：743)。BL21系列菌株也适用于这类载体。

改善表达产物的活性是利用工程菌成功生产药用蛋白的另一重要方面。以包涵体形式表达目标蛋白产量一般较高，但是融合蛋白复性艰难，活性产物得率很低。因此，在胞内直接表达有生物活性的蛋白质具有重要意义。虽然包涵体形成的理化因素仍然不清楚，但通过低温培养、培养基适宜PH值的选择及在培养体系中添加一些提高渗透压的物质等措施都能有助于形成有活性的蛋白质。例如，Yumiko Shirano等在37℃培养条件下诱导表达3小时，得到没有活性的Lipoxygenase，但在15℃条件下诱导16小时，得到了有活性的可溶蛋白(FEBSLetters，1990，295：10)。25～30℃是常用的培养温度，在此温度下细菌生长缓慢，溶氧水平较高，太低温度则会使降温成本提高。另外，有报道在有甜菜碱的条件下高渗透压有利于形成可溶的有活性蛋白质。

目前，应用大肠杆菌系统生产真核来源药用蛋白已取得了很大进展。据报道，国际上已批准的重组蛋白药物中有34种采用该系统生产，在我国已用该系统生产人生长素、胰岛素、人组织型纤维酶原激活剂、白介素等。国内关于人α防御素的研究也已取得了一些进展。李景鹏等通过化学合成途径获得了人α防御素cDNA克隆(东北农业大学学报，1995，26：383)，刘水平等也克隆了人类防御素基因cDNA片段(湖南医科大学学报，2002，27：17)，但是，目前以大肠杆菌系统为工具生产人α防御素，特别是协同生产三种防御素的技术尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用转基因大肠杆菌混合培养协同生产人α防御素蛋白的方法，包括用于该方法的适宜工程菌，系统部件组合以及主要技术路线。

本发明提供的利用转基因大肠杆菌混合培养生产人α防御素蛋白的方法包括以下步骤：

1.使用由人α防御素成熟肽编码序列经优化后，化学合成获得的是mHNP1、mHNP2、mHNP3序列

mHNP1

1    GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40    CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79    GCA TTC TGC TGC

mHNP2

1         TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40    CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79    GCA TTC TGC TGC

mHNP3

1     GAC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40    CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79    GCA TTC TGC TGC

2.将mHNP1、mHNP2、mHNP3成熟肽编码序列构建到筛选出的抗细胞毒性的tac型原核表达载体pGEX4T1中，构建重组表达质粒分别为pGEX4T1-mHNP1、pGEX4T1-mHNP2、pGEX4T1-mHNP3(见图1、图2、图3)。

3.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)pLysS，构建成mHNP生产工程菌PHS1、PHS2、PHS3；

4.将三种工程菌等量混合，在低温条件下化学诱导混合工程菌表达异源蛋白。它们的特点是能抵抗表达蛋白对细胞的毒性，从而使表达量显著提高。

5.三种工程菌进行等量混合培养，经化学物质异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达人α防御素，可同时生产出三种接近天然的人α防御素蛋白的混合蛋白。

6.α防御素蛋白的混合蛋白，可能对病原菌的抗性具有协同的作用，这种人α防御素可应用于医药卫生领域。

本发明所使用的DNA序列是依据已知三种人α防御素mRNA序列及氨基酸组成(Zhang etal，science，2002，298：995)，经基因优化设计而来，可翻译出正确的人α防御素1氨基酸序列。这种经过修饰的序列用大肠杆菌喜好密码子替换了原序列中的稀有密码子，具有更高的翻译效率。除添加起始密码子ATG外，在三种改造DNA序列中还使用了包括大肠杆菌常用终止密码子TAA在内的双终止子，并配置了有利终止的侧翼序列，TAAG的序列格式将最大限度地防止不良终止效应的发生，为高效表达奠定基础。

本发明在基因修饰和反复筛选的基础上，选择带有tac启动子和GST标签序列的原核类表达载体(pGEX系列载体，Amersham公司产品)，将优化了的基因序列GST基因序列之后BamHI和SalI位点之间，从而构建了高效融合性表达载体。这种构建方式利用了tac启动子的高效性，GST基因对目标蛋白基因转录物的稳定作用以及对目标蛋白活性暂时的“封闭性”，一定程度上抑制和克服了目标蛋白对大肠杆菌细胞本身的毒害作用，使以大肠杆菌为工具进行人防御素生产成为可能。表达的任何蛋白质可经凝血酶切处理，获得单纯的目标蛋白。

本方法将获得的重组蛋白表达质粒转化入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)pLysS内，组成完整的大肠杆菌表达系统。lon和ompT蛋白水解酶缺陷型菌株的使用保证了翻译蛋白的稳定性，BL21(DE3)pLysS菌株可能降低本底转录水平，抑制了异源蛋白对宿主细胞的毒害作用，利于人防御素基因的表达。

本方法将三种可编码人α防御素的工程菌混合在一起，在混合培养体系中化学诱导同时表达三种人α防御素蛋白。这些化学物质包括异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranoside，IPTG)、乳糖等。IPTG诱导效率高，可满足抗体制备、生化性质研究、结构研究等需要，而乳糖诱导法以其安全性适宜于制备用于医疗目的重组人防御素。

本发明首次提供了一种利用基因工程菌生产人α防御素混合物的方法，并提供了适宜该方法的转基因工程菌。与目前应用的化学合成、人工提取人防御素以及藻类生产动物防御素的技术相比，具有如下的优点：

(1)本法提供的转基因工程菌构建过程经过优化筛选，系统结构完好，表达效率高。产物容易加工提纯，开发周期短，适宜于发酵大规模生产。

(2)利用本法可一次性生产三种人α防御素，有利于发挥三种同源蛋白的协调作用，较单一防御素蛋白更适宜于医学研究或临床应用。

(3)本法提供技术产品为人体活性多肽，应用于医学领域时毒副作用可能性小，安全，不易发生人体免疫应答反应及因此而导致的药效降低等现象。

本发明首次提供了应用基因工程菌同时生产三种人α防御素的技术方法，通过低温诱导、融合表达方式生产出了有活性的人防御素，为α防御素的基因工程生产提供了新的途径，将能在一定程度上解决人防御素蛋白来源不足的现状。研究成果可满足生产人防御素生化性质以及制备相应抗体等研究应用的需要，也使人防御素的药用开发和规模生产成为可能。新型药物的大规模生产为目前难以医治的疾病得以有效治疗，特别是对艾滋病的控制和治疗提供了新的思路和方法。

附图说明

图1 pGEX4T1-mHNP1

图2 pGEX4T1-mHNP2

图3 pGEX4T1-mHNP1

图4 mHNP1片段合成示意图

F1、F2为正义链片段，F3、F4为反义链片段。

正义链片段和反义链片段相互错位交搭。

图5 pUCm T-mHNP1阳性克隆PCR鉴定。

1-5及7-10：均为阳性菌落。

6：DNA marker；

图6 pGEX4T1载体图谱

图7 pGEX4T1-mHNP1重组菌落PCR鉴定。

1-5，7，9-10：阳性菌落

6：DNA marker，

8：假阳性菌落

图8由P2、P4引物扩增出的HNP2片段

1：DNA marker；2-7：PCR样本

图9 pGEX4T1-mHNP2重组菌落PCR鉴定

1-4：阳性菌落，5：DNA marker

图10由P3、P4引物扩增出的mHNP3片段

1-4：PCR样本号，5：DNA marker

图11 pGEX-mHNP3工程菌PCR鉴定

1-4：阳性菌落，5：DNA marker

图12 15％SDS-PAGE鉴定人α防御素基因工程菌菌体中目的蛋白表达

1，未诱导转基因菌2h；2，诱导转基因菌2h；3，未诱导转基因菌4h；4，蛋白标准；5，诱导转基因菌4h；6，未诱导转基因菌6h；7，诱导转基因菌6h；8，诱导空载菌6h；9，未诱导空载菌6h。

图13混合培养体系中诱导表达mHNP蛋白对大肠杆菌生长的影响

uninduced sample：未诱导转基因工程菌样本，induced sample：诱导转基因工程菌样本，free-loaded control：空载对照菌。

图14提纯mHNP蛋白的抗菌活性鉴定

Sa：Sta phylococcus aureus，金黄色葡萄球菌；

E coli：E.coli BL21(DE3)，大肠杆菌BL21(DE3)。

具体实施方式

实施例1：人α防御素基因工程菌的制备

1、α防御素(HNP)成熟肽编码序列优化设计与化学合成

从Genbank中查询得知HNP1和HNP2 mRNA序列(NM_004084)、HNP3 mRNA序列(NM_005217)以及HNP1和HNP2成熟肽氨基酸序列(P59665)、HNP3成熟肽氨基酸序列(P59666)，HNP1、HNP2、HNP3成熟肽编码序列仅有个别碱基序列的差异(见表1，斜体表示)，即HNP1前三个碱基为编码甘氨酸的GCC，而HNP2缺少此氨基酸，HNP3序列第一个密码子是编码天冬氨酸的GAC。因此，先合成一个肽的编码序列，其它的序列通过PCR方法扩增获得。

           表1 GENBANK中HNP1、HNP2和HNP3成熟肽的编码序列

HNP1	1  GCC TGC TAT TGC AGA ATA CCA GCG TGC ATT GCA GGA GAA40 CGT CGC TAT GGA ACC TGC ATC TAC CAG GGA AGA CTC TGG79 GCA TTC TGC TGC
		HNP2	1      TGC TAT TGC AGA ATA CCA GCG TGC ATT GCA GGA GAA40 CGT CGC TAT GGA ACC TGC ATC TAC CAG GGA AGA CTC TGG79 GCA TTC TGC TGC
HNP3	1  GAC TGC TAT TGC AGA ATA CCA GCG TGC ATT GCA GGA GAA40 CGT CGC TAT GGA ACC TGC ATC TAC CAG GGA AGA CTC TGG79 GCA TTC TGC TGC

通过序列分析，根据不同生物喜好密码子及其稀有密码子的差异性，对原序列进行修饰改造。即剔除HNP中稀有密码子，将它们替换为大肠杆菌喜好密码子。为达到良好的翻译终止效果，添加了TGA和TAA两个终止密码子，利于目的蛋白在大肠杆菌表达。修饰后HNP1序列见表2。

         表2 HNP1成熟肽原编码序列及重新设计修饰的序列

GENBANK中原编码序列(HNP1)	1  GCC TGC TAT TGC AGA ATA CCA GCG TGC ATT31 GCA GGA GAA CGT CGC TAT GGA ACC TGC ATC61 TAC CAG GGA AGA CTC TGG GCA TTC TGC TGC
		重新设计序列(mHNP1)	1  GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT31 GCA GGC GAA CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC61 TAC CAG GGC CGT CTC TGG GCA TTC TGC TGC

表中斜线部分为替换了的密码子

                      表3 mHNP1寡核苷酸片段的设计

有义链	F1(42bp)：5’GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATTGCA GGC GAA CGT  3’F2(48b)：5’CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGGGCA TTC TGC TGC  3’
		反义链	F3(36b)：3’ACG TAG ATG GTC CCG GCA GAG ACC CGT AAGACG ACG  5’F4(54b)：3’CGG ACG ATA ACG GCA TAA GGT CGG ACG TAA CGT CCGCTT GCA GCA ATA CCG TGG  5’

将重新设计的HNP1成熟肽编码序列(以下简称mHNP1)两条互补链分成4个片段(F1-F4)，互补片段之间相互交搭。交由上海生工生物技术公司，用亚磷酰胺法，分别予以合成上述片段(见表3及图4)。检测纯化后分装，-20℃备用。

合成上述片段后，先对F2、F4两片段进行5’端磷酸化。即取F2片段和F4各200pm，T4多核苷酸激酶40u，10mmol/L ATP5ul，10ul 10倍缓冲液[500mM Tris-HCI(PH 8.0)，100mMMgCI₂，50mM DTT]，加水补足100ul体积，37℃反应2小时，80℃10min后渐冷至室温，用酚液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)抽提，100％和70％乙醇沉淀，溶于20ulTE中。

对F2和F4片段5’端磷酸化处理后，进行4片段(F1-F4)连接反应。将4个片段各200pm，用100ul连接酶缓冲液溶解在一小管中，其中F2和F4己磷酸化，80℃2min后渐冷至室温，加入40ul T4 DNA连接酶，12℃反应24h，连接产物用酚液和乙醇抽提处理。将所得样品加入1.0％琼脂糖点样孔内，同时加入DNA marker，60～80V电泳，紫外透射仪下检测，切下目的条带凝胶，用北京赛百盛基因技术有限公司Ultrapure^TM PCR产物纯化回收试剂盒回收。最后溶解于20ulTE中保存，并命名为mHNP1。

2、合成HNP1序列的克隆

·(1)载体及菌种：

pUCm-T克隆载体购自上海生工公司。大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

·(2)工具酶、marker及试剂盒：

Taq酶、X-gal、IPTG、dNTP、DNA marker购自北京鼎国生物技术有限责任公司。BamHI、SalI等限制性内切酶、DNA Ligase购自大连宝生物工程公司，Ultrapure^TM PCR产物纯化回收试剂盒由北京赛百盛生物工程公司提供，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。测序由上海申友公司完成。

(3)mHNP1的引物

以步骤1中设计的mHNP1序列为模板，利用Oligo6.0软件设计如下一对引物(P1和P4)：

P1    5’GCG  GGA TCC ATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT C    3’

              BamH I

P4    5’CGC  GTC GAC TTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G    3’

              Sal I

下划线部分为酶切位点，斜体为起始密码子或终止密码子。交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

(4)回收PCR扩增产物，连接到T载体上

以步骤1化学合成后连接的mHNP1为模板，经P1、P4引物对扩增，PCR在Flexigene PCR仪[Techne(Cambridge)Ltd生产]上进行，50ul反应体系：Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(各10mM)4.0ul，10倍反应缓冲液5.0ul[200mM Tris-HCI(PH 9.0)，500mM KCI，20mM MgCI₂，1％Triton X-100]，双端引物(F1和F4)各2.0ul，模板(mHNP1)(约含1ng DNA)2.0ul，剩余体积用灭菌双蒸水补足。反应条件为：95℃预变性1min，然后94℃变性30s，55℃30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min补齐末端。

反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，约为110bp，用回收试剂盒纯化回收PCR产物，与pUCmT载体进行连接。10ul连接反应体系组成为：T4 DNA连接酶1ul，回收PCR产物5ul(约0.2pmol)，pUCm T载体1ul，10倍T4连接酶缓冲液1ul[660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI₂，100mM DTT，1mM ATP]，PEG4000 1ul，灭菌水1ul。16℃，过夜连接。产物命名为pUCmT-mHNP1。

按照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2002，p96)中的方法制备DH5α感受态细胞，按常规热激法将上述连接液转化大肠杆菌DH5α。即将连接液8ul加入放置在冰浴上至刚融化的DH5α感受态细胞200ul中，冰浴30min，然后在42℃恒温水浴中精确热激90s，立即取出置于冰浴2min，加入不含任何抗生素的LB培养液，37℃温浴45min使细菌复苏并表达抗生素抗性基因。最后将转化菌液涂在含X-gal和IPTG的氨苄琼脂平板上，培养过夜。

次日进行蓝白班初步筛选。阳性菌落筛选程序是：从转化平皿中挑取白斑多个(20个)，另选少量蓝斑(3个)做对照，接种于含3ml氨苄的LB培养液过夜。次日提取质粒，以蓝斑质粒为对照在白斑质粒中挑选电泳条带大小适合的滞后者，再进行PCR扩增(图5)、BamH I和Sal I双酶切检测，均得到预计的约100bp的DNA片段。最后，挑选一个上述各步鉴定正确的菌落送上海申友公司测序。

序列分析结果表明，克隆中有预期的HNP1编码序列及终止密码子侧翼序列：

1  GCG  GGA TCC ATG GCC TGC TAT TGC CGT ATT

31 CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA CGT CGT TAT

61 GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

91 GCA TTC TGC TGC TGA TAA  GTC GAC GCG

将获得的克隆pUCm T-mHNP1质粒做甘油菌-70℃保存。

3、HNP1表达基因工程菌(PHS1)的制备

·(1)载体及菌种：

重组质粒pUCm-T/HNP1重组质粒；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS、tac启动子载体pGEX4T1(Amersham公司产品，质粒图谱见图6)由东南大学医学院曾宪坤博士惠赠。

·(2)工具酶、marker及试剂盒：

DNA marker购自北京鼎国生物技术有限责任公司。BamHI、SalI等限制性内切酶、T4 DNA连接酶购大连宝生物工程公司，Ultrapure^TM PCR产物纯化回收试剂盒由北京赛百盛生物工程公司提供，PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Molecularweight markers proteins kit(pharmacia 17-0446-01)，购自北京新经科生物技术有限公司。

(3)构建质粒pGEX4T1-mHNP1

用BamHI、SalI酶切已经鉴定的pUCmT-mHNP1重组质粒，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用赛百盛Ultrapure^TM PCR产物纯化回收小片段即mHNP 1片段。用BamHI、SalI酶切pEGX4T1，线性化的载体片段分别与回收的mHNP 1片段在T₄ DNA连接酶作用下16℃过夜，获得质粒pGEX4T1-mHNP1。

连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。挑取转化菌落摇动培养，抽提质粒后PCR扩增(图7)、BamHI和SalI双酶切鉴定，并进行序列测定，鉴定正确后，将该转化菌命名为PHS1。

4、HNP2和HNP3表达基因工程菌(PHS2和PHS3)的制备

·  在对HNP1成熟肽编码序列进行优化设计的基础上，通过PCR技术对HNP2、HNP3成熟肽编码序列也做相似的修饰。修饰后HNP2和HNP3成熟肽编码序列(以下分别简称mHNP2、mHNP3)与原序列差异如下表。

                  表4 mHNP2、mHNP3与相应的成熟肽原编码序列比较

mHNP21  TGC TAT TGC CGT ATT CCA19 GCC TGC ATT GCA GGC GAA37 CGT CGT TAT GGC ACC TGC55 ATC TAC CAG GGC CGT CTC73 TGG GCA TTC TGC TGC	GENBANK中HNP2成熟肽原编码序列1  TGC TAT TGC AGA ATA CCA19 GCG TGC ATT GCA GGA GAA37 CGT CGC TAT GGA ACC TGC55 ATC TAC CAG GGA AGA CTC73 TGG GCA TTC TGC TGC
		mHNP31  GAC TGC TAT TGC CGT ATT19 CCA GCC TGC ATT GCA GGC37 GAA CGT CGT TAT GGC ACC55 TGC ATC TAC CAG GGC CGT73 CTC TGG GCA TTC TGC TGC	GENBANK中HNP3成熟肽原编码序列1  GAC TGC TAT TGC AGA ATA19 CCA GCG TGC ATT GCA GGA37 GAA CGT CGC TAT GGA ACC55 TGC ATC TAC CAG GGA AGA73 CTC TGG GCA TTC TGC TGC

表中斜线部分为替换了的密码子

(1)菌种与质粒：

大肠杆菌BL21(DE3)pLysS、p GEX4T1载体(Amersham产品)均为东南大学医院院遗传中心曾宪坤博士惠赠。

·(2)工具酶及试剂：

限制性内切酶、T₄ DNA连接酶、Taq DNA聚合酶分别购自大连宝生物工程公司、上海生工公司、北京鼎国生物技术有限责任公司。

·(3)引物的设计与合成：

分别以mHNP2和mHNP2为模板设计两对三条PCR引物(即P2-P4，P3-P4)，均由宝生物公司合成。引物序列如下：

P2  5’GCG  GGA TCC ATG TGC TAT TGC CGT ATT CCA G    3’

P3  5’GCG  GGA TCC ATG GAC TGC TAT TGC CGT ATT CC   3’

            BamH I

P4  5’CGC  GTC GAC TTA TCA GCA GCA GAA TGC CCA G    3’

            Sal I

下划线部分为酶切位点，斜体为起始密码子或终止密码子。

4.1 HNP 2基因工程菌(PHS2)的制备

(1)扩增mHNP2片段

除缺少编码第一个氨基酸(甘氨酸)的密码子GCC外，mHNP2基因序列与mHNP1序列完全一致，通过PCR上游引物(P2)设计可以去除该密码子。因此，以重组质粒pUCm T-mHNP1为模板，由P2、P4引物经Termocycler(Biometra公司)PCR仪扩增约0.1kb的mHNP 2(图8)。反应体系为50ul，其中Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(10mM)4.0ul，10倍反应缓冲液[200mM Tris-HCI(PH9.0)，500mM KCI，20mM MgCI₂，1％Triton X-100]5.0ul，P2和P4引物各2.0ul，模板DNA2.0ul(约1ng DNA)，用灭菌双蒸水补足体积。反应条件为：95℃预变性1min，然后94℃变性30s，54℃ 30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min补齐末端。PCR反应后1.5％琼脂糖电泳检测，约为110bp。

(2)回收mHNP2片段

用回收试剂盒纯化回收100ul PCR产物，溶解于20ul灭菌水中。

(3)mHNP2片段与载体的连接：

将回收的mHNP2 PCR产物和pGEX4T1分别以BamH I和Sal I双酶切，酶切后用PCR纯化试剂盒再次进行纯化回收。将酶切后回收的目的基因和pGEX 4T1按体积比5∶1混合进行连接。反应体系为10ul，即加入目的DNA 5ul(0.2pmol)，pGEX4T1 1ul，T4 DNA连接酶1ul，10倍连接缓冲液[660mM Tris-HCI(PH 7.6)，66mM MgCI₂，100mM DTT，1mM ATP]1ul，16℃过夜连接。得到连接产物pGEX4T1-mHNP2。

(4)重组子的提取及鉴定：

将连接产物(pGEX4T1-mHNP2)转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)PlysS。取8ul连接产物加入200ul感受态菌中，0℃冰水浴30min，42℃水浴90s，冰水浴2min，加入800ul LB培养液，37℃振荡培养1h后涂布于含50mg/ml氨苄抗性的LB板上。用PCR鉴定克隆，电泳结果显示，利用P2、P4引物扩增出与预期大小(约0.1Kb)的片段(图9)。将鉴定的阳性克隆抽提质粒，并进行BamH I和Sal I双酶切鉴定。最后，进行测序分析。用DNAMAN软件分析证实克隆序列与设计序列完全一致。将鉴定正确的转化菌命名为PHS2。

4.2 HNP 3基因工程菌(PHS3)的制备

(1)mHNP3片段的扩增

mHNP3基因与mHNP1只是第一个密码子不同，通过PCR上游引物(P3)设计可以改变该密码子。以重组质粒pUCmT-mHNP1为模板，由P3、P4引物经Temocycler(Biometra)PCR仪扩增约0.1Kb的HNP3成熟肽编码序列(图10)。反应体系为50ul，其中Taq酶1.0ul(2u/ul)，dNTPs(10mM)4.0ul，10倍PCR反应缓冲液5.0ul，P3和P4引物各2.0ul，模板DNA(pUCm T-mHNP1)2.0ul，用灭菌双蒸水补足体积。反应条件为：95℃预变性1min，然后94℃变性30s，54℃30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min补齐末端。PCR反应后1.5％琼脂糖电泳检测，约为110bp。

(2)回收mHNP3片段：

用回收试剂盒纯化回收100ul PCR产物，溶解于20ul灭菌水中。

(3)mHNP3片段与载体的连接：

将回收纯化的mHNP3 PCR产物和pGEX4T1分别以BamH I和Sal I双酶切，酶切用PCR纯化试剂盒进行纯化。将酶切纯化的目的基因和pGEX 4T1按体积比5∶1进行连接。反应体系为10ul，即加入目的DNA(mHNP3)5ul，pGEX4T1 1ul，T₄ DNA连接酶1ul，连接缓冲液1ul，16℃，连接过夜。得到连接产物pGEX4T-mHNP3。

(4)重组子的提取及鉴定：

将连接产物(pGEX4T1-mHNP3)转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)PlysS。取8ul连接产物加入200ul感受态菌中，0℃冰水浴30min，42℃水浴90s，冰水浴2min，加入800ul LB培养液，37℃振荡培养1h后涂布于含50mg/ml Amp抗性的LB板上。用PCR鉴定克隆，电泳结果显示，利用P3、P4引物扩增出与预期大小(约0.1Kb)的片段(图11)。将鉴定的阳性克隆抽提质粒，并进行Bam H I和Sal I双酶切鉴定。最后，进行测序分析。用DNAMAN分析证实克隆序列与设计序列完全一致。将鉴定正确的转化菌命名为PHS3。

实施例2：三种人α防御素的混合表达及其活性检测

1、在混合培养体系中化学诱导表达人α防御素混合物

将鉴定正确的人α防御素基因工程菌PHS1、PHS2、PHS3分别制备甘油菌并且在含氨苄的LB固体培养基上划线保存。分别从三种菌板上挑取新鲜的单菌落加入3ml含氨苄的LB培养基中振荡培养过夜。次日取三种菌的过夜培养物，等量混合。混匀后，按1％体积接种到新的LB培养基中，在37℃剧烈振荡培养3h左右至OD₆₀₀≈0.6。向培养菌液中加入1M IPTG，使其终浓度达到1mmol/L，低温诱导(30℃)振荡培养，诱导后2h、4h、6h分别取小样检测蛋白表达，最后离心收集细胞。同时设非诱导对照以及空载菌对照。

在混合培养体系中对HNP(包括HNP1、HNP2、HNP3)生产工程菌进行IPTG诱导表达，表达菌处理后进行SDS-PAGE检测。结果见图12。其中各泳道样本为：1，未诱导转基因菌2h；2，诱导转基因菌2h；3，未诱导转基因菌4h；4，蛋白标准；5，诱导转基因菌4h；6，未诱导转基因菌6h；7，诱导转基因菌6h；8，诱导空载菌6h；9，未诱导空载菌6h。从图12可见，有pGEX4T1-mHNP重组质粒(pGEX4T1-mHNP1、pGEX4T1-mHNP2、pGEX4T1-mHNP3)的BL21(DE3)PlysS菌(三种菌体混合物)经IPTG诱导2-6小时后，菌体裂解物增加了一条约29.5kDa的蛋白电泳条带(分别见第2、5、7泳道)，和预计的蛋白质分子量相符(GST蛋白分子量约为26KD，HNP成熟肽约3.5KD)，并且在诱导后2h就有了比较高的表达量，4h达到基本达到最大表达量。诱导的空载对照样(第8泳道)也表达一个比融合蛋白略小的蛋白(总分子量28.2KDa，其中GST 26.0Kda，另加2.2KDa的多克隆位点序列编码的段肽)。上清液中以及未诱导对照、空载对照样中均无蛋白分子量大小适合的蛋白条带。

诱导表达时间-光密度曲线见图13。取PHS1、PHS2、PHS3三种菌等量混合接种含氨卞青霉素的100ml LB培养基，37℃振摇培养到OD600≈0.6。然后，将菌一分为二，一半加1M IPTG(至终浓度1mmol/L)诱导，一半不加IPTG作处理对照菌。然后在低温条件下(30℃)振摇培养，分别于1h、2h、4h、6h取3ml菌液测其OD₆₀₀值并记录数据。实验同时设置空载质粒转化菌(未诱导)作样本对照。

结果表明，与转基因工程菌未诱导对照细菌生长曲线相比，诱导样诱导开始时的OD₆₀₀值与对照一致；经IPTG诱导1h后，诱导样中的大肠杆菌生长基本没有受到太大影响，说明此时期还没有HNP融合蛋白产生；2h后，急剧下降，以后基本再没有升高，说明在诱导2-4 h期间，大量产生HNP融合蛋白。上述结果提示HNP与GST基因融合表达，产生的融和蛋白仍具有一定的抑菌活性。

2、人α防御素混合物的活性检测

(1)融和蛋白的提取和纯化

I、目的蛋白的诱导表达以及细胞抽提物制备

将HNP基因工程菌PHS1、PHS2、PHS3菌株分别接种于含Amp的LB培养基37℃活化过夜。次日按1％扩大培养至OD₆₀₀≈0.6时等量混合，然后在混合培养菌液中加IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h(30℃)。于4℃5000g离心15min收获细菌。经15％SDS-PAGE电泳检测以及亚细胞定位方法(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。分子克隆实验指南(第三版)。科学出版社，2002，p1244)确定目的蛋白主要存在于可溶性胞质中。

制备细菌抽提物的方法也参照《分子克隆》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译。科学出版社，2002，p1247)。将每100ml培养菌液离心收获的菌体沉淀重悬浮在4ml PBS溶液中，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min。加入10ml 0.2％Triton X-100，剧烈振荡混匀。加入Dnase和Rnase至终浓度5ug/ml，4℃振动温育10min。4℃3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清(细胞裂解物)转移到一新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。上清液用0.45um滤膜过滤后进行亲和层析。

II、融和蛋白的亲和层析

用GST琼脂糖凝胶FF柱(北京卓冠群科技有限公司产品)在AKTA Prime层析仪(Amershanbiosciences产品)上进行亲和层析，提取融合蛋白。

缓冲液组成如下：

缓冲液1(20mM pH7.4的PBS溶液)：0.2M NaH2PO₄ 19ml，0.2M Na2HPO₄ 81ml加水至1000ml。缓冲液2(50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0)：0.1M Tris 50ml，0.1M盐酸29.2ml，3070mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。

亲和层析基本步骤如下：

A、GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7×2.5cm，柱床体积为1ml

B、用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min

C、将10ml细胞破碎液酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min

D、用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min

E、用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰

III、融合蛋白的裂解以及进一步处理

在用BCA法测定融合蛋白的含量后，用凝血酶(Novagen产品)将目的蛋白从GST融合蛋白切下(裂解条件是20℃下16小时)。最后，再次进行亲和层析把GST和凝血酶去除，而得到纯的目标蛋白。有关操作按照产品说明书进行。纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定，冻干，命名为mHNP并于-80℃保存。

(2)抗菌实验

A、菌种及材料

金黄色葡萄球菌(Sta phylococcus aureus)

大肠杆菌(E.coli BL21(DE3))

mHNP溶液配制：纯化mHNP蛋白混合物用0.01％乙酸分别配置成50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml的浓度。

B、琼脂糖弥散抗菌实验

按照Jeffrey Turner等(Antimicrobial Agents And Chemoththerapy，1998，42(9))以及刘文超等(第四军医大学学报。1997：18(6)525-527)进行。取对数生长期E.coli(BL21(DE3))以及金黄色葡萄球菌各3×10⁶CFU，各加入16ml 42℃灭菌琼脂培养基中(含营养肉汤粉4.8mg，低电渗琼脂糖160mg，0.02％TWEEN 20，以1mmol/L PH7.4 PBS配制)。混匀后分别倒入两个直径为14.5cm培养皿中，  用打孔器在胶上打孔(直径为3mm)，分别加入不同浓度的样品5ul，浓度分别为HNP为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、500μg/ml。阴性对照孔加0.01％乙酸。将平皿放入37℃温箱中温育3h，再铺以16ml 42℃灭菌琼脂培养基，于37℃继续温育18h。以考马斯亮蓝染色(考马斯亮蓝R250 2mg，甲醇27ml，甲醛15ml，水63ml)24h，活菌着蓝色，死菌不着色。观察以加样孔为中心的杀菌环大小。

C、结果

用琼脂糖弥散抗菌实验检测mHNP的杀菌活性。杀菌环大小表示其杀菌活性的强弱。结果见图14。纯化后的mHNP在50ug/ml的浓度就表现出较高的杀菌活性，随着浓度增加而活性增强。不同菌株对防御素的敏感性有差异，对大肠杆菌的作用比对金黄色葡萄球菌的作用略强。

                        SEQUENCE LISTING

<110>甘肃亚盛盐化工业集团有限责任公司

<120>基因工程菌混合培养生产三种人α防御素的方法

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>90

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

gcctgctatt gccgtattcc agcctgcatt gcaggcgaac gtcgttatgg cacctgcatc    60

taccagggcc gtctctgggc attctgctgc                                     90

<210>2

<211>87

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

tgctattgcc gtattccagc ctgcattgca ggcgaacgtc gttatggcac ctgcatctac    60

cagggccgtc tctgggcatt ctgctgc                                        87

<210>3

<211>90

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

gactgctatt gccgtattcc agcctgcatt gcaggcgaac gtcgttatgg cacctgcatc    60

taccagggcc gtctctgggc attctgctgc                                     90

Claims (6)

1.一种利用转基因大肠杆菌混合培养生产具有生物活性人α防御素蛋白的方法，其中包括：使用人α防御素成熟肽优化编码序列，将该序列构建到适宜的tac型表达载体pGEX4T1中，再将其转入到筛选出的抗细胞毒性的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中，从而构建成含外源基因的三种工程菌株PHS1、PHS2、PHS3，并将上述菌体混合培养来生产人α防御素蛋白。

2.根据权利要求1所述，使用由人α防御素成熟肽编码序列经优化后获得的是mHNP1、mHNP2、mHNP3序列

mHNP1：

1   GCC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40  CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79  GCA TTC TGC TGC

mHNP2：

1       TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40  CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79  GCA TTC TGC TGC

mHNP3：

1   GAC TGC TAT TGC CGT ATT CCA GCC TGC ATT GCA GGC GAA

40  CGT CGT TAT GGC ACC TGC ATC TAC CAG GGC CGT CTC TGG

79  GCA TTC TGC TGC

3.将权利要求2所述序列构建到筛选出的抗细胞毒性的tac型原核表达载体pGEX4T1中所获得的重组表达质粒pGEX4T1-mHNP1、pGEX4T1-mHNP2、pGEX4T1-mHNP3。

4.将权利要求3所述的pGEX4T1-mHNP1、pGEX4T1-mHNP2、pGEX4T1-mHNP3分别转入到抗细胞毒性的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中所获得的三种工程菌株PHS1、PHS2、PHS3，它们的特点是能抵抗表达蛋白对细胞的毒性，从而使表达量显著提高。

5.将权利要求4所述三种工程菌进行等量混合培养并经化学物质异丙基硫代半乳糖苷的诱导表达的人α防御素，所述的人α防御素为三种接近天然的人α防御素蛋白的混合蛋白。

6.根据权利要求5所述的α防御素蛋白的混合蛋白，在医药卫生领域的应用。

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