CN1148452C - 分泌性融合蛋白的酵母表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在酵母中表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素3(IL-3)的融合蛋白(简称为“MX融合蛋白”)的方法，还涉及生产该融合蛋白的工程菌和所生产的融合蛋白MX。本发明的MX融合蛋白基因十分稳定，可调控表达，且产物为天然氨基酸蛋白序列，无置换突变。

Description

分泌性融合蛋白的酵母表达

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地涉及在酵母中表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素3(IL-3)的融合蛋白(简称为“MX融合蛋白”)的方法，还涉及生产该融合蛋白的工程菌和所生产的融合蛋白MX。

背景技术

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素3(IL-3)是两种在人体中起着重要作用的细胞因子。将两种细胞因子融合在一起所形成融合蛋白(简称为“MX融合蛋白”)，可以具有两者的优点。目前，已有用酵母表达MX融合蛋白的技术方法，但是该方法有以下几方面的缺点：

(1)现有技术中利用DNA质粒转入MX融合蛋白基因，但是引入的融合蛋白基因没有整合入酵母的染色质中。因此，在生长表达过程中MX融合蛋白的基因容易被丢失。

(2)MX融合蛋白的表达无法诱导调控。目前，尚无诱导表达MX融合蛋白的报道。

(3)原始MX融合蛋白产物会被超量糖基化。因而只能在原始基因上进行氨基酸突变置换以避免被超量糖基化。以至最后产物蛋白有数个(6个)置换氨基酸不同于天然产物。

因而本领域迫切需要提供具有天然序列且未被超量糖基化的MX融合蛋白及其生产方法。

发明内容

本发明的目的就是克服现有技术中的上述缺点，提供一种通过酵母稳定高效地表达生产MX融合蛋白的方法，而且该MX融合蛋白中的GM-CSF和IL-3可以具有天然成熟蛋白的氨基酸序列。

在本发明的第一方面，提供了一种表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX的方法，该方法包括：(a)将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的编码序列和白细胞介素3的编码序列融合在一起，形成编码融合蛋白MX的多核苷酸序列；(b)将步骤(a)中编码融合蛋白MX的多核苷酸序列插入到表达载体，形成含有融合蛋白MX编码序列的表达载体；(c)将步骤(b)中含有融合蛋白MX编码序列的表达载体转入酵母细胞；(d)筛选出MX编码序列整合入基因组的转化的酵母细胞；(e)在适合编码MX融合蛋白的条件下，培养步骤(d)中转化的酵母细胞；(f)分离出MX融合蛋白。较佳地，该融合蛋白MX具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了用上述方法制备的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX。较佳地，所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3衍生自人的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3，最佳地，具有成熟的天然人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的氨基酸序列。

在本发明的第三个方面，提供了一种酵母细胞，该酵母的基因组中整合有表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX的多核苷酸，且该核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的融合蛋白。较佳地，该酵母细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoria)。更佳地，该细胞是1999年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为CCTCC No.：M99009的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)MX。

具体实施方式

在本发明中，术语“融合蛋白MX”和“MX融合蛋白”可互换使用，都指由粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素3(IL-3)两种蛋白融合所形成的多肽。所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3可以是衍生自人，也可以衍生自非人的哺乳动物，但较佳地是衍生自人的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3。此外，GM-CSF和IL-3可以具有天然的野生型GM-CSF和IL-3，也可以是突变型的GM-CSF和IL-3(只要突变的GM-CSF和IL-3也具有全部和部分野生型蛋白的活性)。MX融合蛋白中的GM-CSF和IL-3可以带有信号肽序列，但较佳地不具有原信号肽而仅具有成熟蛋白的氨基酸序列。一种融合蛋白MX的例子具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是酵母细胞。更佳地，该宿主细胞是毕赤氏酵母。最佳地是巴斯德毕赤酵母。

在本发明中，编码融合蛋白MX的基因可以通过PCR法或直接人工合成等方法获得。例如，先RT-PCR法分别获得GM-CSF和IL-3的编码序列，然后将它们融合在一起而形成编码融合蛋白MX的基因。

在获得了融合蛋白MX基因之后，可以将其插入到合适的载体中，以便进行转化和或鉴定。适用于本发明的载体包括本领域已知的各种载体，如市售的载体。例如选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列插入到合适的位点，形成能够与酵母基因组发生重组的整合型表达载体。整合型载体是指能够与宿主细胞的基因组发生DNA重组，从而将外源基因整合人宿主细胞基因组中的载体。合适的整合型表达载体的例子包括(但并不限于)：质粒pPIC9、质粒pαADH2等。

有众多已知的常规方法可将含有外源基因的表达载体转入宿主细胞，其中包括(但并不限于)：电穿孔法、溶细胞酶法(lyticase)和化学法。

在将表达载体转入宿主细胞后，可以根据相应的标记基因加以筛选，例如根据在MD培养基上能否生长而进行筛选。

筛选出转化的且在基因组中整合有融合蛋白MX基因的宿主细胞，便可以在适合融合蛋白MX表达的条件下培养该转化的宿主细胞。由于本发明的融合蛋白MX是分泌性的，因此融合蛋白MX被分泌在培养液中。

在获得了含有融合蛋白MX的培养液后，可以用本领域已知的常规方法进行分离纯化，从而获得纯化的融合蛋白MX。合适的分离纯化方法包括：离子交换层析、分子筛层析、蛋白沉淀法、亲和层析、HPLC等。

本发明的生产MX融合蛋白方法和工程菌具有以下优点：

(1)MX融合蛋白基因被整合入酵母染色质中，因而可长期稳定地生长表达不至被丢失。

(2)MX融合蛋白的基因表达可被诱导调控。在本发明的一个实例中，用甲醇来诱导调控。

(3)原始MX融合蛋白产物不会被超量糖基化。因而使用原始未突变的基因作为表达模板。表达出的产物系天然氨基酸蛋白序列，无氨基酸位点被置换。

简而言之，本发明的MX融合蛋白基因十分稳定，可调控表达，且产物为天然氨基酸蛋白序列，无置换突变。

本发明还提供了含有本发明融合蛋白MX的药物组合物，它含有治疗有效量的融合蛋白MX以及药学上可接受的载体或赋形剂。合适载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的融合蛋白MX可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的融合蛋白MX还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的融合蛋白MX被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师能够在技能范围之内加以确定的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

用RT-PCR方法克隆GM-CSF和IL-3 CDNA

将人正常肝细胞株ATCC CCL13生长培养于含有10％小牛血清的DMEM培养液中，在二氧化碳细胞培养箱中37℃，5％CO₂培养。收获1×10⁸个CCL13细胞。用Qiagen公司出品的RNA提取柱对收获的CCL13细胞进行RNA抽提。获得的RNA作为逆向转录(RT)反应的模板。用随机引物(Random Primer)和MMLV逆向转录酶对提取的RNA进行逆向转录。得到的产物作为下一步DNA聚合酶链反应(PCR)的模板。

用下述两对引物，MX-1和MX-2，MX-3和MX-4，

MX-1：

5′GCTCTA GAGGAGGATGTGGCTGCAGA 3′(SEQ ID NO：3)

MX-2：

5′GCG GATCCGCCGCCACCCCCAGATCCACCGCCACCCTCC

TGGACTGGCTCCCAG 3′(SEQ ID NO：4)

MX-3：

5′CGGATCCGCTCCCATGACCCAGACAAC 3′(SEQ ID NO：5)

MX-4：

5′CGGATCCGAACGAGCTGGACGTTGGAC 3′(SEQ ID NO：6)

以上述逆向转录的产物作为模板，分别进行DNA聚合酶链反应(PCR)，以扩增出人GM-CSF和IL-3的编码序列。

实施例2

连接GM-CSF cDNA和IL-3 cDNA形成MX融合基因

对引物MX-1和MX-2的PCR产物(即GM-CSF的编码序列)用内切酶XbaI和BamHI进行消化。对引物MX-3和MX-4的PCR产物(即IL-3的编码序列)用内切酶BamHI进行消化。工作质粒pBluescript用XbaI和BamHI进行消化。

将各自消化的三个产物用T4 DNA连接酶(ligase)在16℃进行连接。连接产物转化大肠杆菌。然后，抽提DNA质粒并进行酶切分析，确定其中形成了连接成一体的GM-CSF和IL-3 DNA，称为PMX融合基因。

实施例3

用PCR法克隆用于酵母表达的MX融合基因

用上述认定的PMX融合基因作为模板，以下述引物1和2进行PCR反应以克隆出用于酵母表达的MX融合基因。

引物1：

5′GCTCGAGAAAAGAGCACCCGCCCGCTCGCCC 3′(SEQ ID NO：7)

引物2：

5′CGGATCCGAACGAGCTGGACGTTGGAC 3′(SEQ ID NO：8)

PCR的产物用内切酶Xho I和BamHI消化，然向插入用Xho I和BamHI消化的工作质粒Bluescript中，经大肠杆菌转化，DNA质粒抽提，内切酶消化分析。含有正确的用于酵母表达的融合蛋白MX基因的质粒，被命名为Bluescript.mx。用Xho I和Not I消化Bluescript.mx，然后将所得的MX融合基因插入酵母质粒pPIC9(Gene 105：205，1991)(该质粒上有许多特定酵母DNA顺序，包括分泌信号，选择基因和重组入酵母染色体位点的序列。)的Xho I和Not I位点，形成质粒P-MX。对P-MX进行DNA顺序测定，确认MX融合基因具有正确的核苷酸序列，如SEQID NO：1所示(不含信号肽序列)。

实施例4

用电击法将MX融合基因转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)

将巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)GS115菌株接种于YPD培养液中，28℃摇动生长过夜。次日，酵母浓度于O.D.600 2-6之间。将酵母和内切酶SalI消化后的质粒P-MX混合在一起，然后置于电击仪中以7500伏特/cm 5-10毫秒进行电击。电击后的酵母涂于MD选择培养基上，放28℃进行培养。3-5天后挑选克隆。将单个克隆生长于MD培养基中，于28℃培养36小时。所选克隆再进行DNA测序，再次确认MX融合基因是正确的。

筛选出的一株阳性克隆于1999年8月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.：M99009，命名为“巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)MX”。

实施例5

MX融合基因产物表达

挑选实施例4的转化后的酵母克隆，接种于25ml BMGY培养液中。在250ml三角烧瓶中以28-30℃，250-300rpm速度摇动培养过夜。次日将酵母离心沉淀，用BMMY培养液重新悬浮酵母使浓度为O.D.600＝1.0。将重新悬浮的酵母液置于三角瓶中继续在上述温度和摇动速度进行培养。每隔24小时加入100％浓度的甲醇进行诱导，使最后浓度为0.5％。在0、24、48、72、96小时各取5ml酵母培养液作为样品。收取的样品给15,000g离心，收取上清，冻于-20℃供分析用。

实施例6

MX融合基因表达产物的分析

SDS-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制12.5％的SDS-聚丙酰胺凝胶，每孔上点70微升各时间的上清样品。电泳后用考马斯亮兰染色。在分子量50,000左右可见一弥散蛋白带。此蛋白带的量随诱导表达时间增长而增加，而且其分子量等于GM-CSF和IL-3分子量之和，因此无超量糖化现象。不带MX融合基因的酵母上清液中无此蛋白带。

免疫印迹试验(Western blot)诱导表达第三天的上清样品25微升上样于12.5％的SDS-聚丙酰胺凝胶。电泳后转移至PVDF膜上。转移后的PVDF膜分别用抗人GM-CSF和抗人IL-3单克隆抗体(R&D System)进行反应。然后用碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG第二抗体(Sigma)进行反应。底物染色后，在MX融合基因转化酵母的表达上清中可见一分别和抗人GM-CSF、抗人IL-3抗体反应的条带。此条带呈弥散状，分子量50,000左右。在对照的酵母表达上清中没有与上述两抗体反应的条带。

体外TF-1细胞物异生长刺激试验TF-1细胞是从白血病人血液中分离建立的一细胞株。此细胞株对于GM-CSF和IL-3有特异生长依赖性。即只有在含有GM-CSF和IL-3的培养液中，TF-1细胞才能分裂扩增。利用此细胞株的生长依赖性，可对GM-CSF和IL-3进行特异性功能测试。

在96孔细胞培养板中，每孔加入50微升基础培养液(1640培养液含2mM L-谷酰胺(L-glutamine)，100单位/ml青板素，100微克/ml链板素和10％小牛血清)。加入25微升测试样品于第一排孔，混匀后取25微升至第二排孔，再照此连续稀释。最后二排孔保留仅为基础培养液，作为阴性对照。各孔加入50微升TF-1细胞混悬液C细胞计数2×10⁵/m于基础培养液)，37℃，5％CO₂培养4-5天。观察计数。用上述方法对MX转化酵母表达上清进行测试。表达第三天的上清经连续33次1∶3稀释即3³³倍稀释后，仍然有特异性刺激TF-1细胞生长作用。而各对照酵母表达上清液无TF-1细胞刺激生长活性。

综合上述实验结果表明，MX融合基因转化的酵母可被甲酵诱导表达，一分子量50,000左右的蛋白。其分子量等于GM-CSF和IL-3分子量之和，因而无超量糖化现象。此表达蛋白质被分泌入培养液中因而易于分离纯化。此酵母表达MX产量高，用70微升原始表达上清即可被考马斯亮兰染色识别表达产物。表达产物可被抗人GM-CSF和抗人IL-3的抗体识别。表明此蛋白同时带有人GM-CSF和人IL-3的抗原性。用体外GM-CSF和IL-3依赖性细胞株TF-1的功能测定表明，此表达产物带有高度特异性TF-1生长刺激活性。表达上清经过连续33次1∶3稀释即3³³倍稀释后，仍有对TF-1细胞的特异生长刺激作用。所有对照的酵母上清都未见上述MX蛋白的特性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

(1)一般信息：

(i)申请人：上海兆安医学科技有限公司

(ii)发明名称：分泌性融合蛋白的酵母表达

(iii)序列数目：

(2)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：816bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：核苷酸

(ix)序列描述：SEQ ID NO.1：

GCA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG CAG CCC TGG GAG CAT GTG AAT   51

 A   P   A   R   S   P   S   P   S   T   Q   P   W   E   H   V   N

GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG AGT AGA GAC ACT GCT GCT  102

 A   I   Q   E   A   R   R   L   L   N   L   S   R   D   T   A   A

GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC CTC CAG GAG  153

 E   M   N   E   T   V   E   V   I   S   E   M   F   D   L   Q   E

CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTG CGG GGC  204

 P   T   C   L   Q   T   R   L   E   L   Y   K   Q   G   L   R   G

AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC CAC TAC AAG  255

 S   L   T   K   L   K   G   P   L   T   M   M   A   S   H   Y   K

CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT ATC ACC  306

 Q   H   C   P   P   T   P   E   T   S   C   A   T   Q   I   I   T

TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCC   354

 F   F   S   F   K   E   N   L   K   D   F   L   L   V   I   P

TTT  GAC  TGC  TGG  GAG  CCA  GTC  CAG  GAG  GGT  GGC  GGT  GGA  TCT  GGG  GGT      402

 F    D    C    W    E    P    V    Q    E    G    G    G    G    S    G    G

GGC  GGC  GGA  TCC  GCT  CCC  ATG  ACC  CAG  ACA  ACG  CCC  TTG  AAG  ACA  AGC      450

 G    G    G    S    A    P    M    T    Q    T    T    P    L    K    T    S

TGG  GTT  AAC  TGC  TCT  AAC  ATG  ATC  GAT  GAA  ATT  ATA  ACA  CAC  TTA  AAG  CAG      501

 W    V    N    C    S    N    M    I    D    E    I    I    T    H    L    K    Q

CCA  CCT  TTG  CCT  TTG  CTG  GAC  TTC  AAC  AAC  CTC  AAT  GGG  GAA  GAC  CAA  GAC      552

 P    P    L    P    L    L    D    F    N     N    L    N    G    E    D    Q    D

ATT  CTG  ATG  GAA  AAT  AAC  CTT  CGA  AGG  CCA  AAC  CTG  GAG  GCA  TTC  AAC  AGG      603

 I    L    M    E    N    N    L    R    R    P    N    L     E    A    F    N    R

GCT  GTC  AAG  AGT  TTA  CAG  AAC  GCA  TCA  GCA  ATT  GAG  AGC  ATT  CTT  AAA  AAT      654

 A    V    K    S    L    Q    N    A    S    A    I    E    S    I    L     K    N

CTC  CTG  CCA  TGT  CTG  CCC  CTG  GCC  ACG  GCC  GCA  CCC  ACG  CGA  CAT  CCA  ATC      705

 L    L    P    C    L    P    L    A    T    A    A    P    T    R    H    P    I

CAT  ATC  AAG  GAC  GGT  GAC  TGG  AAT  GAA  TTC  CGG  AGG  AAA  CTG  ACG  TTC  TAT      756

 H    I    K    D    G    D    W    N    E    F    R    R    K    L    T    F    Y

CTG  AAA  ACC  CTT  GAG  AAT  GCG  CAG  GCT  CAA  CAG  ACG  ACT  TTG  AGC  CTC  GCG      807

 L    K    T    L    E    N    A    Q    A    Q    Q    T    T    L    S    L    A

ATC TTT TGA  816

 I   F   *

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：271氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(ix)序列描述：SEQ ID NO.2：

APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ 50

EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI 100

ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQEGGG GSGGGGGSAP MTQTTPLKTS 150

WVNCSNMIDE IITHLKQPPL PLLDFNNLNG EDQDILMENN LRRPNLEAFN 200

RAVKSLQNAS AIESILKNLL PCLPLATAAP TRHPIHIKDG DWNEFRRKLT 250

FYLKTLENAQ AQQTTLSLAI  F*                             271

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GCTCTA GAG GAGGATGTGG CTGCAGA                    27

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：54碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

GCGGATCCGC CGCCACCCCC AGATCCACCG CCACCCTCCT GGACTGGCTC CCAG  54

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

CGGATCCGCT CCCAIGACCC AGACAAC                        27

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

CGGATCCGAA CGAGCTGGAC GTTGGAC                        27

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

GCTCGAGAAA AGAGCACCCG CCCGCTCGCC C                   31

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

CGGATCCGAA CGAGCTGGAC GTTGGAC                       27

Claims (6)

1、一种表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的编码序列和白细胞介素3的编码序列融合在一起，形成编码融合蛋白MX的多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的融合蛋白；

(b)将步骤(a)中编码融合蛋白MX的多核苷酸序列插入到表达载体，形成含有融合蛋白MX编码序列的表达载体；

(c)将步骤(b)中含有融合蛋白MX编码序列的表达载体转入巴斯德毕赤酵母细胞；

(d)筛选出MX编码序列整合入基因组的转化的巴斯德毕赤酵母细胞；

(e)在适合编码MX融合蛋白的条件下，培养步骤(d)中转化的巴斯德毕赤酵母细胞；

(f)分离出MX融合蛋白。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，该多核苷酸序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3、一种巴斯德毕赤酵母细胞，其特征在于，该酵母的基因组中整合有表达分泌性的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX的多核苷酸，且该核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的融合蛋白。

4、如权利要求3所述的酵母细胞，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

5、如权利要求4所述的酵母细胞，其特征在于，该细胞是巴斯德毕赤酵母Pichia pastoria MX CCTCC No.M99009。

6、一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3的融合蛋白MX，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。